JPH08503121A

JPH08503121A - 中和反応性ヒト抗−ｇｐ１２０組換え抗体、それをコードするｄｎａおよびその使用

Info

Publication number: JPH08503121A
Application number: JP5511177A
Authority: JP
Inventors: マラスコ，ウエイン・エイ; ソドロウスキ，シヨーゼフ・ジー; ポスナー，マーシヤル・アール; ヘイゼルチン，ウイリアム・エイ
Original assignee: デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート; ニユー・イングランド・デイーカニス・ホスピタル・コーポレイシヨン
Priority date: 1991-12-10
Filing date: 1992-12-10
Publication date: 1996-04-09
Also published as: EP0618970A1; AU3325993A; AU668374B2; WO1993012232A1; US5852186A; CA2125396A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質上の不連続なエピトープに結合し、ｇｐ１２０とＣＤ４受容体との結合を阻害し、広範囲のＨＩＶ単離物を中和する組換えヒトモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、本発明の組換えモノクローナル抗体の再配列したＨおよびＬ鎖の主要ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列、ならびにエンベロープ糖タンパク質とＣＤ４受容体との結合を阻害する抗体のスクリーニング法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】中和反応性ヒト抗−ＧＰ１２０組換え抗体、それをコードするＤＮＡおよびその使用産業上の利用分野本発明は、ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質上の不連続なエピトープに結合し、ｇｐ１２０とＣＤ４受容体との結合を阻害し、広範囲のＨＩＶ単離物を中和する組換えヒトモノクーナル抗体に関する。本発明はまた、本発明の組換えモノクーナル抗体の再配列したＨ鎖およびＬ鎖の主要ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列、ならびにエンベロープ糖タンパク質とＣＤ４受容体との結合を阻害する抗体のスクリーニング法に関する。発明の背景ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ１−：ＨＴＬＶ−III、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ −III／ＬＡＶともいう。）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連疾患の病因物質である［Barre-Sinoussi，et al.，Science，220：868-871（198 3）；Gallo，et al.，Science，224：500-503（1984）；Levy，et al.，Science ，225：840-842（1984）；Popovic，et al.，Science， 224：497-500（1984）；Sarngadharan，et al.，Science，224：506-508（1984 ）；Siegal，et al.，New England Journal ofMedicine，305：1439-1444（1981 ）］。この病気は無症候期間が長く、その後、免疫系および中枢神経系の機能低下が進行することを特徴とする。そのウィルスの研究から、複製がかなり制御されること、およびＴ−リンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセットの潜在的な溶解感染が組織培養に生じることがわかっている。また、感染した患者におけるウィルスの発現は、発症の全期間中に感染ウィルスの力価が低い状態に制御されていると考えられる。ＨＩＶ−１の複製およびゲノム構成に関する分子的研究から、ＨＩＶ−１が多数の遺伝子をコードしていることがわかる［Ratner，et al.，Na ture，313：277-284（1985）；Sanchez-Pescador，et al.，Science，227：484- 492（1985）；Muesing，et al.，Nature，313：450-457（1985）；Wain-Hobson ，et al.，Cell，40：9-17（1985）］。３個の遺伝子、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は全てのレトロウィルスに共通する。また、そのゲノムは、ほとんどのレトロウィルスで共通しない他の遺伝子、すなわちｔａｔ、ｒｅｖ（以前はａｒｔと称された）、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ遺伝子もコードする［Sodroski，et al.，Science，231：1549-1553（1986）；Ary a et al.，Science，229：69-73（1985）；Sodroski et al.，Nature，321：412 -417（1986）；Feinberg et al.，Cell，46：807-817（1986）；Haseltine，Jou rnal ofAcquired Immune Deficiency Syndrome，1：217-240（1988）；ohen，et al.，Nature，334：532-534（1988）；Wong-Staal，et al.，AIDS Res．and Hu man Retro Viruses，3：33-39（1987）］（これらは全て参考として本明細書中に取り入れる。）。他のレトロウィルス、特にＨＩＶ−２および同様の免疫不全ウィルスであるＳＩＶ（以前はＳＴＬＶ−IIIと称された）のウィルスゲノムのヌクレオチド配列も、ｅｎｖならびにｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆなどの調節配列を含む構造遺伝子を含む［Guyader，et al.，Nature，326：662-669（1987）；Chakrabarti，et al.，Nature，328：543-547（1987）］（これらは参考として本明細書中に取り入れる。）。これら３種類のＨＩＶウィルスは、配列に変動があるとしても、同様の遺伝子構成を有する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶのｅｎｖ遺伝子は全て、エンベロープ糖タンパク質を産生し、それは切断されて一部が外部ウィルスエンベロープタンパク質のサブユニットとなる。これをｇｐ１２０と称する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶウィルスと細胞との結合および融合は、このｇｐ１２０ウィルスエンベロープタンパク質の外部サブユニットと標的細胞表面上のＣＤ４受容体との間の特定の相互作用により仲介される［Berger et al.，PNAS，85：2357-2361（1988）］。ＨＩＶによる感染の第一段階は、ｇｐ１２０、すなわちエンベロープ糖タンパク質とその細胞受容体であるＣＤ４分子との特異的結合である［Dalgleish，et al.，Nature，312：763-767（1984）；Klatzmann，et al.，Nature，312：767-7 68（1984）］。ＨＩＶによる感染は、ほとんどの場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数および機能の漸次的低下を招き、その結果、日和見感染症および悪性疾患、すなわちＡＩＤＳなどの細胞性免疫不全が臨床的に発現する［Fauci et al.，Ann．Int ．Med.，100：92-99（1984）］。ＨＩＶ−１ｇｐ１２０と反応する血清抗体は、分子上のいくつかの部位に結合することによってウィルス感染を中和することができる［Haigwood，et al.， Vaccines，90：313-320（1990）；Steimer，et al.，Science，254：105-108（1 991）］。ヒト抗体の最も早い中和反応は、ｇｐ１２０の第三超可変部におけるエピトープ、すなわちジスルフィド結合によって形成されるループ内に含まれる主要中和ドメインに特異的である［Rusche，et al.，PNAS，85：3198-320 2（1988）；Goudsmit et al.，PNAS 85：4478-4482（1988）；Palker，et al.， 85：1932-1936（1988）］。これらの抗体は株に特異的である場合が多い［Kang ，et al.，PNAS，88：6171-6175（1991）］。線状エピトープ内およびエピトープ外の両方でエンベロープ糖タンパク質が変化すると、ウィルスは、これらの抗体による中和を逃れることができる［McKeating，et al.，AIDS，3：777-783（1 989）；Looney，et al.，Science，241：357-360（1988）］。ＨＩＶ感染が末期になるほどより広範囲に中和する抗体が現れる［Ho，et al.，J．Virol.，61：2 024-2028（1987）］。患者の血清中に低濃度で存在するこれらの広範囲に中和する抗体の大フラクションは、ｇｐ１２０上の立体構造に敏感なエピトープに特異的である［Nara，et al.，J．Virol.，61：3173-3180（1987）；Goudsmit，et a l.，Vaccine，6：229-238（1988）］。患者の血清に存在する広範囲に反応する抗体のサブセットは、ｇｐ１２０とＣＤ４との結合を阻害する［Steimer，et al .，supra；Rusche，et al.，supra；McDougal，et al.，J．Immunol.，137：293 7-2944 （1986）；Ardman，et al.，J．AIDS，3：206-214（1990）；Schnittman，et al .，J．Immunol.，141：4181-4186（1988）］。これらの抗体はＣＤ４結合領域を含むｇｐ１２０上の不連続エピトープと反応すると考えられる［Oleshevsky，et al.，J．Virol.，64：5701-5707（1990）；Thali，et al.，J．Viro.，65：618 8-6193（1991）。このｇｐ１２０の領域は、不変ではないけれども、よく保存されている。そのような抗体の一つであるモノクローナル抗体（Ｍａｂ）はＦ１０５と称するＩｇＧ１ＫＭａｂであり、多数の異なるＨＩＶ−１単離物を中和し、ＨＩＶ −１／ｇｐ１２０上のＣＤ４−結合部位内にあるかまたはその部位に位置的に近いと思われる立体構造的に規定されたエピトープと反応する。さらに、Ｆ１０５はＨＩＶ_{III B}とＨＴ−Ｈ９細胞との結合を阻止することが報告されており、適切な濃度でこれらの細胞の感染を防ぐ［Thali，et al.，supra；Posner，et al. ，J．Immunol.，88：6171-6175（1991）］。しかし、この抗体は、ハイブリドーマから単離されただけである。すなわち、入手できるのはほんの少量で、しかも純度が低い。そのような抗体が組換えＤＮＡ法によって生産されるならば有益である。そうすれば、その抗体をコードする組換えＤＮＡが利用でき、より抗原親和性の大きい抗体の変異種の生産が可能になるであろう。さらに、この抗体の結合親和力の増大が可能であり、その抗体によって中和されるＨＩＶおよびＳＩＶ株が増加するようにこの抗体を作製することができるならば望ましい。また、この抗体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を知ることも望ましい。免疫不全疾患の診断および治療に対しては、ｇｐ１２０のＣＤ４結合ドメインまたはその付近に特異的である中和域の広いヒト抗体の分子的性質を理解することが重要である。発明の概要本発明により、本発明者らは、ｇｐ１２０のＣＤ４結合ドメインまたはその近傍において結合活性を有する組換えモノクローナル抗体の作製を行った。また、本発明の組換えモノクーナル抗体の再配列したＨ鎖およびＬ鎖の主要ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列も開示する。本発明の組換え抗体は、種々のＨＩＶおよびＳＩＶ単離物、特にＨＩＶ−１単離物を広範囲で中和する。好ましくは、ＨＩＶ−１／ｇｐ１２０上の立体構造的に規定された（理論に縛られたくはないが、ＣＤ４−結合部位と場所的に近いと思われる）エピトープと反応する。また、哺乳動物、特にヒトの免疫不全疾患を治療したり最小にする方法も開示する。この方法は、治療に有効な量の本発明の抗体を投与してＨＩＶ感染を予防するか、および／または進行を抑えることを含む。本発明の別の態様は、本発明の組換えモノクローナル抗体の接合体および細胞毒成分（例えば、イムノトキシン）に関する。別の態様によれば、本発明は、患者およびボランティアの病気の進行を、ＤＮＡのスクリーニングによって診断および研究するための簡単なアッセイ法を可能とする。本発明はまた、ｇｐ１２０エピトープに対する結合親和力の程度が異なる他の抗体をスクリーニングし、クローン化するための簡単なアッセイ法を可能にする。好ましくは、ｇｐ１２０エピトープがＣＤ４−結合部位またはその付近のものである。図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、免疫グロブリン遺伝子およびＰＣＲプライマーの位置を示す図である。免疫グロブリン遺伝子のＨ鎖（図１Ａ）およびＬ鎖（図１Ｂ）は、指示したＶ、ＤおよびＪセグメントならびに不変領域で示す。また、ＣＤＲ領域も示す。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用プライマーは、ＦｖおよびＦａｂの両方の遺伝子増幅に対して示す。図２は、Ｖ_HおよびＶ_L遺伝子をｐＥｔｐｅｌＢベクター内にクローン化するための方法を示す図である。図３は、Ｖ_HおよびＶ_Lを単一のベクターから発現する方法およびその一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）発現体の構築を示す図である。図４Ａ〜４Ｃは、ｐＥＴｐｅｌＢベクター（ｒＦ１０５Ｆａｂ）を使用したＦ１０５Ｆａｂ抗体断片の調製を示す。プラスミドｐＥＴｐｅｌＢＴａｇ（Ｆ１０５の再配列したＶ_HおよびＶ_L遺伝子を含む）をＢＬ２１（ＤＥ３）に移入して形質転換し、Ｏ．Ｄ．₆₀₀が０．６に達した後、１ｍＭのＩＰＴＧで誘発した（コントロールはＩＰＴＧを含まない）。３７℃で２時間インキュベーションした後、バクテリアを採取した。図４Ａは、全細胞溶解物の１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色を示す図である。図４Ｂは、ウサギ抗−Ｖ_H−４ＦＲ１〔Silve rman，et al.，Eur．J.Immunol.，20：351-356（1990）〕（Dr．Gregg Silverma n，University of California，San diegoからの供与）をプローブとするＦ１０５Ｖ_H−ｔａｇ融合タンパク質のウェスタンブロットを示す図である。高レベルのＶＨタンパク質は、ＩＰＴＧで誘発した後にのみ、このプラスミド／宿主系で誘導された。ｐＥＴｐｅｌＢベクターを含みＶＨ遺伝子は挿入しなかったコントロールのＢＬ２１（ＤＥ３）バクテリアのウェスタンブロットにおいては、たとえＩＰＴＧ誘発後でも、特定のタンパク質は検出されなかった（データは示さず）。ウサギ抗−アンギオテンシン（anti-angiotension）Ｉ（抗−ｔａｇ）を主要抗体として使用すると、同一の結果が得られた（データは示さず）。図４Ｃは、ヤギ抗−Ｋ鎖抗体（ Souther Biotechnology Associates）をプローブとするＦ１０５Ｖ_Lタンパク質のウェスタンブロットを示す図である。上方のバンドは、ｐｅｌＢシグナルペプチドが切断される前の前駆体タンパク質を表し、他の構築物にも見られる（Gl ockshuber，et al.，Biochem.，29：1362-1367（1990）〕。図５は、ＢＬ２１（ＤＥ３）で産生されたｒＦ１０５Ｆａｂとのｇｐ１２０の結合活性の検出を示す。ＩｍＭのＩＰＴＧによる誘発の２時間後、ペリプラズム細胞下画分が、Ｆ１０５Ｆａｂカセットを含むｐＥＴｐｅｌＢｔａｇベクターによって形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）から得られた。次いで、ペリプラズム画分の濃縮試料を、ｒｇｐ１２０で被覆したＥＬＩＳＡプレート（American Biotechnology，Inc.，Cambridge，MA）上でインキュベートした。Ｆ１０５Ｆａｂ（パパインの分解によって得た）およびｒＦ１０５Ｆａｂ両者のｇｐ１２０に対する結合は、ヤギの抗Ｋ鎖抗体により検出され、次いで、酵素としてアルカリ性ホスファターゼを使用した免疫検出を行った。図６は、ｒＦ１０５Ｆａｂ抗体断片のアフィニティーカラム精製の結果を示す。Ｆ１０５Ｆａｂカセットを含むｐＥＴｐｅｌＢｔａｇベクターによって形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）のペリプラズム調製物をｇｐ１２０アフィニティーカラムに通した。結合したｒＦ１０５Ｆａｂをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離し、次いで、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。次いで、プールした画分を図５のようにｇｐ１２０を被覆したプレート上でＥＬＩＳＡにより分析した。図７は、ｓＦｖとして表されるランダムな組み合わせライブラリーを直接的に生成するために使用する方法を示すものである。逆方向Ｊ_Hプライマーおよび正方向Ｖ_Kプライマーの５’末端は、互いに完全に相補的であり、鎖間のリンカー配列（Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ）₃をコードする４５個のヌクレオチドから成る。また、鎖間のリンカーの内部制限部位ＢｓｐＥＩが導入され、Ｊ_HおよびＶ_Kプライマーの境界には、後のリンカー交換実験を容易にするためにＢｓｔＥIIおよびＳａｃＩ部位を含む。Ｈ鎖およびＬ鎖は個々にＰＣＲ法で増幅し、ＢｓｐＥＩで消化し、ＢｓｐＥＩ付着末端によってフレーム内で連結する。こうすることにより、鎖間のリンカーを加える必要がないと同時に、ｓＦｖのランダムな組み合わせライブラリーの生成が容易になる。７５０ｂｐ産物（ｓＦｖ）はゲル精製し、適当な酵素で消化した後、ｐＥＴｐｅｌＢ発現ベクターまたは中間の二重鎖ｆｄ−ｔｅｔファージ抗体発現ベクター内に直接クローン化する。図８は、単一段階のクローン化によるＦ１０５ｓＦｖの産生を示す図である。Ｈ鎖およびＬ鎖ＰＣＲ断片を各々ＮｏｔＩ／ＢｓｐＥＩおよびＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化して連結すると、Ｆ１０５ｓＦｖのｐＳＬ１１８０でのクローン化が成功した。次いで、このカセットをＮｏｔＩ／ＢｇｌIIで消化することによって取り出し、小さいｐＥＴｐｅｌＢ発現ベクター内にクローン化した。なお、このＦ１０５ｓＦｖ構築物の場合、ＮｃｏＩ部位の代わりに５’Ｖ_H ＮｏｔＩ部位を含むＰＣＲプライマーを使用し、ＮｏｔＩクローニング部位を含む対応のｐＥＴｐｅｌＢシグナル配列を使用した。図９Ａ〜９Ｃは、ｐＥＴｐｅｌＢベクター（ｒＦ１０５ｓＦｖ）を使用したＦ１０５ｓＦｖ抗体断片の産生を示す。プラスミドｐＥＴｐｅｌＢ（Ｆ１０５ｓＦｖ遺伝子を含む）をＢＬ２１（ＤＥ３）に移入して形質転換し、Ｏ．Ｄ．₆₀₀ が０．６に達すると１ｍＭのＩＰＴＧによる誘発を行った（コントロールはＩＰＴＧを含まない）。バクテリアは３７℃で２時間インキュベートした後、採取した。図９Ａは全細胞溶解物の１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのクーマシーブル一染色を示す図である。図９Ｂは、ウサギ抗Ｖ_H ＦＲＩ抗血清をプローブとするＦ１０５ｓＦｖタンパク質のウェスタンブロットを示す図である。図９Ｃは、ヤギ抗Ｋ鎖抗体をプローブとするＦ１０５ｓＦｖタンパク質のウェスタンブロットを示す図である。図１０は、ｒＦ１０５ｓＦｖ抗体断片のアフィニティーカラム精製の結果を示す。Ｆ１０５ｓＦｖカセットを含むｐＥＴｐｅｌＢベクターによって形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）のペリプラズム調製物をｇｐ１２０アフィニティーカラムに通した。結合したｒＦ１０５ｓＦｖをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離し、次いで、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。次いで、プールした画分をｇｐ１２０を被覆したプレート上でＥＬＩＳＡにより分析した。図１１は、階層的およびランダムな組み合わせのライブラリーの増幅のための、Ｆ１０５から誘導される鎖間リンカープライマーの設計を示す。この態様では、Ｆ１０５ｓＦｖを、フランキング５’Ｊ_H枠組み配列および３’Ｖ_K枠組み配列を含む（Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ）₃鎖間リンカーのＰＣＲ増幅のために使用する。図１２は、Ｊ_Hからの５’フランキング配列およびＶ_Kからの３’フランキング配列を含む、Ｆ１０５ｓＦｖから誘導される鎖間リンカーのＰＣＲ増幅を示す。図１３は、ファージ抗体の生成を示す説明図である。複製−コンピテントｆｄファージをコードするｆｄ−ｔｅｔプラスミドは、突然変異誘発のための一本鎖ＤＮＡの生成に使用される。ＫｐｎＩおよびＥａｇＩ部位をバクテリアＦ線毛への付着のための吸収タンパク質をコードする遺伝子IIIに、遺伝子IIIのアミノ酸コード配列を変えることなく導入する。枠内の一本鎖ｓＦｖ遺伝子と遺伝子IIIとの連結部を導入する合成オリゴヌクレオチドをＫｐｎＩおよびＥａｇＩ部位に挿入する。次いで、ｓＦｖ挿入物の残りは、ＸｈｏＩおよびＰｖｕII部位を使用してｓＦｖ中にクローン化する。図１４は、ＨＩＶ−１感染患者ＨＩＶ−５１のＰＢＬからの階層的およびランダムな組み合わせの免疫グロブリン遺伝子のＰＣＲ増幅を示す。Ｖ_H階層的ライブラリーは、Ｖ_H７１−４およびＨｕｍｖｋ３２５リーダー配列プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって作製するが、Ｈ鎖遺伝子の場合は、縮退Ｖ_Hプライマーを使用するＰＣＲ増幅によってランダムな組み合わせのライブラリーを作製する。この実験では、ＰＣＲサイクルを３０回とし、５％のｃＤＮＡを使用した。プライマー＝ＡＶ_H ７１−４リーダー、Ｊ_H ＢｓｓＨ IIプライマー；ＢＶ_H ＮｏｔＩリーダー、Ｊ_H ＢｓｓＨ IIプライマー；ｃＤＮＡ＝ＤＩｇＧ、ＨｉｎｇｅｃＤＮＡ、ＥオリゴｄｔｃＤＮＡ。図１５は、ＨＩＶ−１感染患者ＨＩＶ−５１のＰＢＬからの階層的およびランダムな組み合わせの免疫グロブリン遺伝子のＰＣＲ増幅を示す。Ｖ_Lライブラリーは、Ｈｕｍｖｋリーダー配列プライマーを使用して作製する。プライマー＝ＡＨｕｍｖｋ３２５リーダー、ＣＫＢａｍＨＩプライマー；ｃＤＮＡ＝ＢＣｋｃＤＮＡ、ＣオリゴｄｔｃＤＮＡ。発明の詳細な説明本発明は、組換え技術により生産されるモノクローナル抗体に関する。例えば、Ｈ鎖またはＬ鎖の可変ドメインをコードする再配列遺伝子は、例えばクローン化または遺伝子合成を行い、適当な発現ベクターに組み込むことにより得ることができる。次いで、その発現ベクターを使用して受容可能な宿主細胞を形質転換し、それを培養して免疫グロブリンまたはその断片を発現させ、好ましくは分泌させる。当業者であれば一本鎖クローニング法または二本鎖法を使用することができるが、一本鎖法が好ましい。本発明によれば、可変領域のＨ鎖および可変領域のＬ鎖を再配列したＦ１０５をコードするｃＤＮＡをクローン化し、それらのヌクレオチド配列および推測されるアミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３およびＳＥＱＩＤＮＯ：４として配列表に記載する。Ｆ１０５のＨ鎖またはＬ鎖可変領域（各々、Ｖ_HおよびＶ_L）のクローン化に使用できる方法の一つは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の合成またはスクリーニングを行うことである。その後、プロモータに作動可能に連結したＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：３を含むＤＮＡセグメントを作製し、その配列を選択した原核および／または真核細胞宿主で発現させる。該プロモータは、当業者であれば、当業者が宿主として使用しようとする特定の宿主細胞に応じて容易に選択することができる。例えば、ｚ１０またはＳＶ４０などのウィルスプロモータが好ましい。好ましくは、そのＤＮＡセグメントがＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の両方を含む。ＳＥＱＩＤＮＯ：５（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃などの可撓性リンカーペプチドを使用することもできる。ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３は同一のプロモータに作動可能に連結することができ、あるいは別のプロモータに作動可能に連結してもよい。そのようなＤＮＡセグメントの作製法の一つは、下記要素を組み合わせたものである［Huse，et al.，Science，246：1275-1281（1989）］：１．免疫範囲の実質的部分を含む核酸の単離；２．免疫グロブリンのＶ_Hおよび／またはＶ_L領域の遺伝子を含むポリヌクレオチドセグメントをクローン化するためのポリヌクレオチドプライマーの作製；３．その免疫範囲由来の複数の異なるＶ_HおよびＶ_L遺伝子を含む遺伝子ライブラリーの作製。その後、Ｖ_Hおよび／またはＶ_Lのポリヌクレオチドは原核および真核細胞宿主などの適当な宿主で発現させることができる。宿主細胞は異なっても別々でも同一でもよく、発現ベクターも同じでも異なっていてもよい。そして、発現させたポリペプチドを予め選択した活性（例えば、ｇｐ１２０に対する親和結合性、ＨＩＶ（および／またはＳＩＶ）単離物に対するｉｎｖｉｔｒｏ中和能力）に対してスクリーニングし、スクリーニング工程で同定されたＶ_Hおよび／またはＶ_Lをコードする遺伝子を分離する。上記の親和性および中和アッセイを以下で詳細に述べる。その免疫遺伝子範囲の実質的部分を含む核酸は、不均一集団の抗体産生細胞、すなわちＢ−リンパ球（Ｂ細胞）、好ましくは、ＨＩＶもしくはＨＩＶワクチンに感染した、またはＨＩＶもしくはｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質で免疫感作もしくは部分的に免疫感作した脊椎動物の循環または脾臓にある再配列Ｂ細胞から単離することができる。そのようなリンパ球としては、例えば末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が挙げられる。本発明によれば、好ましくは、免疫グロブリンをコードするＤＮＡ配列をモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離する。そのようなハイブリドーマは、公知の利用できる方法により容易に得ることができる［Kohler，et al. ，Nature，256：495（1975）］（これは参考として本明細書中に組み入れる）。典型的には、抗体産生細胞とミエローマ細胞などの不死化細胞系との融合に関連する。一具体例では、マウスにｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質を免疫感作させることによりハイブリドーマを得ることができる。マウスは、十分な量のペプチドにより腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫感作することができる。次いで、直ちに、例えばシクロホスファミド／水のｉ．ｐ．注射を行うことができる。シクロホスファミド処理は、最初の注射の１日および２日後に繰り返す。免疫感作の約２週間後、マウスに再び十分な量のペプチドを注射し、次いで、さらに２週間休止する。第二注射の４日後、その動物を屠殺し、第一融合のために脾臓を取り出した。ハイブリドーマは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法によりＳＰ２／０ミエローマ細胞を、典型的な方法により例えば免疫感作したマウス由来の細胞と融合することにより作る。細胞は免疫感作したマウスから無菌的に取り出し、脾臓細胞の単細胞懸濁物は脾臓を無血清培地（例えば、ＤＭＥ）と予め融合することにより得る。脾臓細胞とミエローマ細胞とを例えば５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）の比で混合する。次いで、遠心分離を行ってその上清を吸引により取り除く。次いで、常法により細胞を培地内で増殖させる。融合操作後に増殖したハイブリドーマは、次いで、細胞溶解物に対するＥＬＩＳＡ法により、ｇｐ１２０エピトープに特異的な抗体の分泌に対してスクリーニングを行う。陽性結果が得られたハイブリドーマは限界希釈法により増殖・クローン化して、その細胞および得られる抗体が実際にモノクローナルであることを確認する。所望のｇｐ１２０エピトープの一つに対する抗体の存在が陽性であるハイブリドーマコロニーは、培地中で、例えば５個のハイブリドーマ細胞／ｍｌの濃度まで希釈する。コロニーが成長したら、再びｇｐ１２０エピトープに対する抗体の存在に関してその上清をテストする。ＥＬＩＳＡ法でテストした結果が陽性である場合は、コロニーを再度限界希釈法によりクローン化する。好ましい態様によれば、抗体の産生を引き出すためにＨＩＶ−１またはＨＩＶ −２のｇｐ１２０を使用する。ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の使用が好ましい。好ましい態様では、ＥＢＶ形質転換細胞を非分泌型ヒト−マウスメラノーマ類似体であるＨＭＭＡ２．１１ＴＧ／０細胞系と融合することにより誘導されるＦ１０５ハイブリドーマからＤＮＡを得る［Posner，et al.，J．Immunol.，88：6 171-6175（1991）］。本発明の免疫グロブリン遺伝子は、可変領域を発現する遺伝子を含むゲノム材料または可変領域の転写を表すメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から単離することができる。再配列していないＢ−リンパ球以外から得たゲノムＤＮＡを使用する場合は、その配列がイントロンにより分離しているので、可変領域をコードする配列の位置付けには注意すべきである。これは、当業者であれば本明細書の記載に基づいて容易に行うことができる。適切なエキソンを含むＤＮＡ断片を単離し、イントロンは切り取って適正な順序および方向でスプライシングする。再配列したＢ細胞を使用する別の方法は、ＣＤおよびＪ免疫グロブリン遺伝子領域が隣接するように移動しているので好ましく、その結果、配列は可変領域全体に対して連続している（イントロンを含まない）。ｍＲＮＡを使用する場合、ＲＮＡｓｅを阻害する条件下で細胞を溶解しなければならない。ｍＲＮＡは他のＲＮＡからオリゴ−ｄＴクロマトグラフィーにより分離することができる。次いで、相補鎖であるｃＤＮＡを、ｍＲＮＡを鋳型にし、逆転写酵素および適当なプライマーを使用して合成し、ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖を得ることができる［Gubler，et al.，Gene，25：263-269（1 983）］。第二のＤＮＡ鎖は、いくつかの方法により作ることができ、例えば、ｍＲＮＡ鎖のＲＮＡ断片（ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロニ本鎖をＲＮＡｓｅとともにインキュベートすることにより得る）をプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼを使用するか、あるいは、最初のＤＮＡ鎖の３’末端に対してアニールする合成オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼを使用して作る。上記ｄｓｃＤＮＡを作る場合は、ＣＨ１ドメイン（Ｈ鎖可変ドメインの場合）またはＣＧもしくはＣＸドメイン（Ｌ鎖可変ドメインの場合）にある配列に対してアニールする正方向プライマーを使用することができる。これらのプライマーは、標的とする配列に十分接近して位置してその配列をクローン化することができ、本明細書の記載から容易に決定することができる。逆方向（back）プライマーは、ＶＨ１、ＶＸまたはＶＧドメインのＮ末端にある配列に対してアニールするものであればよい。逆方向プライマーは、公知の種々のファミリーのＶＨ１、ＶＸまたはＶＧ配列に対して相補的であるように設計された種々の配列を有する多数のプライマーから構成されてもよい。あるいは、逆方向プライマーが全ての可変領域遺伝子ファミリーから得られる認識配列を有する単一プライマーであってもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは、特定の標的配列に関して使用するために、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１および／またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のような配列に基づいて特定的に設計してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を使用してＶＨおよびＶ_LをコードするＤＮＡ相同体を増幅するためには、増幅すべき核酸の各々のコーディング鎖に対して２個のプライマーを使用しなければならない。第一のプライマーは、一部が非センス（マイナスまたは相補的）鎖になり、免疫レパートリー内のＶ_H（プラス）鎖間で保存されるヌクレオチド配列とハイブリッドする。従って、Ｖ_HをコードするＤＮＡ相同体を得るには、第一プライマーを、免疫グロブリン遺伝子のＪ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域内の保存領域とハイブリダイズする（すなわち、相補的である）ように選択する。Ｊ、ＣＨ１およびヒンジ領域に対するプライマーが好ましい。Ｖ_LをコードするＤＮＡ相同体を得るには、第一プライマーを、Ｊ領域内の保存領域または免疫グロブリンＬ鎖遺伝子の不変領域とハイブリッド形成するように選択する。Ｖ_HをコードするＤＮＡ相同体を得るには、第二プライマーを、例えばリーダーまたは第一枠組み領域をコードする領域におけるような、Ｖ_Hをコードする免疫グロブリン遺伝子の５’末端で保存されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成するように選択する。Ｖ_HおよびＶ_LをコードするＤＮＡ相同体の増幅では、第二プライマーの保存される５’ヌクレオチド配列が、Loh，et al. ，Science，243：217-220（1989）に記載されているように、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して外因的に付加した配列と相補的であってもよい。第一および第二プライマーの一方または両方は、エンドヌクレアーゼ制限部位を規定するヌクレオチド配列を含むことができる。その部位は、増幅される免疫グロブリン遺伝子に対して異種であってもよく、典型的にはそのプライマーの５’末端またはその付近に位置する。制限部位を有するプライマーを使用すると、５’または３’に突出するヌクレオチドを残すＤＮＡを少なくとも１個の制限酵素で切断することができるという利点を有する。そのようなＤＮＡはベクター上の対応する部位に組み込むことにより、その方法から直接得られる平滑末端を有する断片よりも容易にクローン化される。そのサイクルの最後に得られる二本鎖ｃＤＮＡは、本明細書の記載に基づいて経験的に選択できる適切な制限酵素を使用してクローニングベクターに容易に挿入することができる。好ましくは、その遺伝子によってコードされる免疫グロブリンまたはその断片が発現される発現ベクターにおいてｄｓｃＤＮＡが直接クローン化されるように制限部位を選択する。好ましくは、Ｈ鎖プライマー対がＶ_HプライマーおよびＪ_H プライマーから成り、各々がクローニングに都合の良い制限部位を含む。例えば、免疫グロブリンに関するKabatのデータベース［Kabat，et al.，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，4th Ed．（U．S．Department of H ealth and Human Services）（1987）］を使用すると、６組の別個のヒトＶ_Hファミリーに見られるアミノ酸およびコドン分布を分析することができる。例えば、３５塩基対の５’Ｖ_Hプライマーは、４箇所で２個の異なるヌクレオチドが縮退するように設計した。ＮｏｔＩ部位は増幅したＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ＶＨ遺伝子の第一コドンのすぐ隣の５’側に位置する。図１Ａを参照。同様に、３５塩基対のＪ_H領域のオリゴヌクレオチドは、Ｈ鎖可変遺伝子の３’末端で逆方向プライマーとなるよう設計することができる。６種類のヒトＪ_H領域のミニ遺伝子のヌクレオチド配列に基づくと、このプライマーは、３個の縮退位置を含み、各箇所に２個のヌクレオチドを有する。Ｊ領域の最後のアミノ酸を決定するコドンのすぐ隣の３’側にあるＢｓｓＨII部位は、Ｖ_H遺伝子の３’末端でのクローン化に都合が良い。同様の方法を使用して、ヒトＬ鎖可変領域遺伝子用のＰＣＲプライマーを設計することができる。図１Ｂ参照。ヒトＫ（Ｖ_K／Ｊ_K対）またはＧ（Ｖ_G／Ｊ_G対）のＬ鎖遺伝子の増幅用プライマーは、例えば、指針としてKaba tのデータベースを使用して合成する。ＫのＬ鎖領域のプライマーに関しては、４組のヒトＶＫ遺伝子ファミリーがあるため、５’Ｖ_Kプライマーが３箇所で退縮（各々２個のヌクレオチド）するのが好ましく、上述したＶ_H領域のプライマーと同様の位置にＮｏｔＩ部位を含む。５個のヒトＪ_Kミニ遺伝子の配列から設計した３９対の逆方向Ｊ_Kプライマーは、３箇所で退縮（各位置で２個のヌクレオチド）するのが好ましく、Ｊ_Kをコードする領域のフランキング位置にＢａｍＨＩ部位を含む。同一の制限エンドヌクレアーゼ部位が、ＧのＬ鎖遺伝子用プライマー上に存在する。プライマーは、アニールされる標的配列に対して正確に相補的である配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの変化または制限酵素部位の導入のため、違いが生じる可能性がある。アニーリング混合物の条件は、アニーリング条件をあまり厳しくしないことによりプライマーがｄｓ核酸にアニールできるように調節することができる。これは、当業者の力量内で十分である。この方法で使用するＤＮＡポリメラーゼは周知のＤＮＡポリメラーゼであれば何でもよく、例えば市販のものがある。各ポリメラーゼに対して使用する条件は周知である。ポリメラーゼ反応は４種類のヌクレオシド三リン酸の存在下で行われる。これらおよびポリメラーゼ酵素は試料にすでに存在していてもよく、または各サイクルごとに新しく供給してもよい。ＤＮＡ鎖の変性は公知のどんな方法で行ってもよく、例えば試料を加熱して行う。加熱を使用して方法をコントロールする場合、加熱の適切なサイクルは、約９５℃で約１分の変性、３０〜６５℃で約１分のアニーリングおよび約７５℃で約２分のプライマー伸長を含む。伸長および再生を確実に完全に行うには、最終サイクル後の混合物を約６０℃で約５分保持するのが好ましい。生成した二本鎖ｃＤＮＡはその混合物から、例えばアガロースゲルを使用するゲル−電気泳動により分離することができる。しかし、所望により、二本鎖ｃＤＮＡを未精製のままで使用し、常法によって適当なクローニングまたは発現ベクターに直接挿入してもよい。これは、プライマーが制限酵素認識部位を含む場合は特に容易に行われる。増幅されたＶ_HおよびＶ_L断片は、これらの配列のバクテリア発現用に設計したベクター（ｐＥＴｐｅｌＢプラスミドなど）に組み込んで個々にクローン化することができる。図２および３参照。ｐＥＴｐｅｌＢベクターは、ｚ１０プロモータ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの場合）およびＴ７バクテリオファージ由来のＴｚ転写終結シグナルとともに図２に示す［Rosenberg，et al.，Gene，56：125-1 35（1987）］。シグナルペプチド切断部位を含むシグナル配列［Lei，et al.，J ．Bact.，169：4379-4383（1987）］は、「ｐｅｌＢシグナルペプチド」と命名し、これは、ＮｃｏＩ（またはＮｏｔＩ）部位にクローン化されるＮ末端可変遺伝子上に融合される。ｐｅｌＢシグナル配列のすぐ上流は、大腸菌において翻訳するためのリボソーム結合部位である。このベクターによって発現されるいくつかのタンパク質のＣ末端上に融合されるのは「ｔａｇ」配列であり、抗ｔａｇ血清によって認識されるアンギオテンシンＩ由来の小さいペプチドである［Ward， et al.，Nature，341：544-546（1989）］。ベクター中へのＨ鎖遺伝子のクローン化はＰＣＲプライマーのＮｃｏＩ（またはＮｏｔＩ）およびＢｓｓＨII部位を利用し、一方Ｌ鎖のクローン化は同じくＮｃｏＩ（またはＮｏｔＩ）と３’ＢａｍＨＩ部位を利用する。なお、この方法を使用すると、Ｈ鎖のみがｔａｇ配列に融合される。Ａｍｐ＝アンピシリナーゼ遺伝子；ｏｒｉ＝大腸菌複製起点。わかりやすくするために、すべてのセグメントが一定の比率で描かれているわけではない。抗体遺伝子断片のバクテリア発現に関するこのプラスミドの特徴を以下に述べる。クローン化のために、ｐＥＴｐｅｌＢベクターは単一の５’ＮｏｔＩ部位および単一の３’部位（Ｖ_H遺伝子に対してはＢｓｓＨIIであり、Ｖ_L遺伝子に対してはＢａｍＨＩ）を含む。このプラスミドを使用する場合は、ＰＣＲ増幅遺伝子をＮｏｔＩおよびＢｓｓＨII（またはＢａｍＨＩ）で消化した後、低融点アガロースゲルから精製し、ベクター中にクローン化するのが好ましい。クローン化された可変領域配列のＤＮＡ配列を得るには、ジデオキシＤＮＡのシークェンスをするためのプライマーとして、挿入物の隣のベクター配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用する［Sanger，et al.，PNAS，74：5463-5467（1977）］。プラスミド挿入物の両鎖の配列は３個の独立したクローンに対して決定してシークェンス誤差またはＰＣＲアーチファクトを最少にすることができる。図３はＶ_HおよびＶ_L発現のための方法ならびに一本鎖Ｆｖ発現ベクターの構築を示す。Ｌ鎖発現ベクター（図２）から得られるＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ III断片は、ＳｐｅＩ−Ｈｉｎｄ IIIで消化したＨ鎖ベクター中にクローン化される。というのは、ＸｂａＩおよびＳｐｅＩが５’端に適合する突き出た一本鎖を残すからである。すなわち、単一のプラスミドを使用してＨ鎖およびＬ鎖の両方を単一のバクテリアでdicistronicメッセージにより発現することができる。ＲＩＢＩＳＩ＝リボソーム結合部位。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）発現ベクターを作るには、Ｖ_H ／Ｖ_L発現ベクターを、各々、Ｈ鎖遺伝子の３’端およびＬ鎖遺伝子の５’端内で切断するＢｓｔＥIIおよびＳａｃＩで消化する。合成リンカーを挿入するとＶ_H の３’端およびＶ_Lの５’端が再構成され、可撓性リンカーペプチド（Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）によって二つの鎖を連結することができる。すなわち、ｐｅｌＢシグナル配列、Ｖ_Hセグメント、リンカーペプチドおよびＶ_Lセグメントを含む１個のタンパク質がｚ１０プロモータの制御下で合成される。ムテイン（mutein）もこの方法により得ることができる。例えば、これは、少なくとも一個のプライマーとして関連オリゴヌクレオチドプライマーの混合物を使用することにより達成することができる。好ましくは、プライマーの中央部が特に可変であり、５’端および３’端が比較的保存されたプライマーである。プライマーの両端が可変ドメインの枠組み領域に相補的であり、プライマー中央部の可変領域がＣＤＲの全部または一部をカバーするのが好ましい。好ましくは、正方向プライマーを第三ＣＤＲを形成する部分で使用する。その方法をそのようなオリゴヌクレオチドの混合物を使用して行う場合、産物は可変ドメインをコードする配列の混合物になるであろう。いくつかの突然変異を誘発するヌクレオシド三リン酸を混合すると配列の置き換えが生じ、その結果、点突然変異が標的領域全体に散在する。あるいは、増幅サイクルを多くすることによっても点突然変異が導入されるが、ＤＮＡポリメラーゼの自然のエラー率のため、特に高濃度のヌクレオシド三リン酸を使用すると誤差が増幅される。以下で述べるように、そのようなムテインは、スクリーニングすることにより、標準Ｍａｂ（例えば、ｒＦ１０５Ｍａｂ）と比較して、発現する抗体の結合親和力を増大させるかどうか、または抗体の中和力に影響を及ぼすかどうかをみることができる。本発明のＤＮＡセグメントを有する発現ベクターは容易に作ることができる。例えば、ＤＮＡセグメントが二本鎖ｃＤＮＡの場合は、発現ベクター中に直接クローン化することができる。宿主は原核生物でも真核生物でもよいが、バクテリアが好ましい。好ましくは、プライマーおよびベクターの制限部位ならびにベクターの他の特徴を選択することにより機能性免疫グロブリンまたはその断片を発現させる。例えば、ムテイン遺伝子の発現では、プライマーを、少なくとも全部で３個のＣＤＲ配列を含む標的配列のクローニングが可能であるように選択する。クローニングベクターは、好ましくは、シグナル配列（分泌用）ならびに第一枠組み領域のＮ＝末端、クローニング用の制限部位および最後（第四）の枠組み領域のＣ−末端をコードする配列をコードし、全ての配列は好ましくは連結している。ＤＮＡセグメントは、プロモータに連結して発現を可能にする。Ｈ鎖の可変ドメインは、個々のドメインとして、または相補的なＬ鎖の可変領域とともに発現する場合は抗原結合部位として発現することができる。好ましくは、二つの鎖を同一の細胞で発現するか同一の細胞から分泌し、そのタンパク質は非共有的に会合させてＦ_v断片を形成する。相補的な配列をコードする２個の遺伝子は、縦列に配置して、２組の制限部位を有する単一のベクターから発現させることができる。好ましくは、遺伝子を順次導入する。例えば、Ｈ鎖の可変ドメインを最初にクローン化し、次いでＬ鎖の可変ドメインをクローン化することができる。あるいは、２個の遺伝子を一段階でベクターに導入する。これは、例えば、ＰＣＲ法を使用して、本明細書およびIanとFreed，Hybridoma Technology in theBioscienc es of Medicine，103-115（1985）の方法により、必要な介在配列とともに各々の遺伝子を結合させることにより行う。二つの鎖はまた、上記と同様のベクター（例えば、ｐＥＴｐｅｌＢ）を使用することにより連結タンパク質として発現させて、一本鎖Ｆｖ断片（ｓＦｖ）を得ることもできる。さらに別の方法としては、２個の遺伝子を２種類のベクター（例えば、一方のベクターがファージベクターで、他方がプラスミドベクター）に組み込んでもよい。また、クローン配列を発現ベクターに挿入して融合タンパク質として発現させることもできる。可変ドメインをコードする配列は直接、またはリンカー配列を介して、タンパク質エフェクター分子（毒素、酵素、ラベルまたは他のリガンドなど）をコードするＤＮＡ配列に連結することができる。可変ドメイン配列はまた、バクテリアまたはファージの外側のタンパク質に連結することもできる。うまく形質転換された細胞は、抗原に対する免疫グロブリンの結合を検出するための適当な周知技術によって同定することができる。好ましいスクリーニング法は、抗原と免疫グロブリン生成物との結合が検出可能なシグナルを直接または間接的に生じる方法である。そのようなシグナルとしては、例えば、複合体の産生、触媒反応生成質の形成およびエネルギーの放出または取り込みなどが挙げられる。Ｈ鎖およびＬ鎖の両方からＤＮＡ配列が得られると、Ｖ_H、Ｄ、Ｊ_HおよびＶ_K 、Ｊ_K再配列の詳細な遺伝分析を行うことができる。Ｈ鎖およびＬ鎖のサブグループ分類は、その配列をデータバンク（例えばKabatデータベース［Kabat，et a l.，上掲］）で利用できるものと比較することにより行うことができる。再配列した完全Ｖ_H遺伝子の生成に使用される確認可能な生殖系（germline）の可変領域遺伝子は決定することができる。また、選択したＤ領域遺伝子およびＪ領域遺伝子のファミリーを同定することもできる。Ｖ_HおよびＶ_L遺伝子の発現ベクター（例えば、ｐＥＴｐｅｌＢ）内へのクローニングは、機能的抗体断片のバクテリア内での発現を可能にする。ｐＥＴｐｅｌＢベクターは本発明者らにより設計されたものであり、Dr．F．William Studier （Brookhaven National Laboratory）［Rosenberg，et al.，supra］から得たｐＥＴベクターから誘導される。これらのベクターはともにｐＢＲ３２２プラスミドから得られ、バクテリアの複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含み、原核生物および真核生物源の広範囲のＤＮＡを発現することができる。図２参照。転写はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ用の強力なｚ１０プロモータおよびＴｚ転写ターミネータによって制御される。発現に使用する大腸菌株、ＢＬ２１は、溶原性バクテリオファージＤＥ３を含み、後者は、ｌａｃＵＶ５プロモータおよびｌａｃｉリプレッサーの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）をＢＬ２１（ＤＥ３）溶原菌に添加すると、ｌａｃＵＶ５プロモータが誘発され、高レベルのＴ７ＲＮＡポリメラーゼが発現される。これらの高レベルのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現は、次いで、ｚ１０プロモータ〔Rosenberg，上掲〕の制御により問題遺伝子の高レベル転写を指示する。プラスミドｐＥＴｐｅｌＢＴＡＧＦ１０５ＦａｂおよびｐＥＴｐｅｌＢＦ１０５ｓＦＶは、１９９２年３月３日、ブタペスト条約下でAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に寄託し、各々、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．７５２０９および７５２０８を受けた。ｐＥＴｐｅｌＢなどの発現ベクターを使用すると、独立した転写ユニットからＶ_HおよびＶ_L遺伝子を発現することができる。さらに、Ｖ_HおよびＶ_Lタンパク質の両方は、ｐｅｌＢタンパク質のシグナル配列（バクテリア抽出物でのＦａｂ又はＦｖ産生をモニターするシグナルを含む）に由来するＮ末端を有する融合タンパク質として合成することができる。「ｔａｇ配列」（ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６））はヒトのアンギオテンシンＩに由来し、市販の高力価抗血清（Peninsula Labs，Inc．）によって認識される。ＰＣＲ増幅したＶ_HおよびＶ_L遺伝子は、図２に示し、上述したように、ｐＥＴｐｅｌＢ中にクローン化される。Ｖ遺伝子を５’ＮｏｔＩ部位で連結すると、ｐｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列とともに枠組み内に位置する遺伝子が得られ、組換え産物を得ることができる［Lei，et al.，上掲］。図１に示すように、異なる逆方向３’プライマーを使用すると、ＦｖまたはＦａｂ組換え断片を産生することができる。Ｆｖ断片を産生するためのプライマーは上述したが、Ｆａｂ断片を産生するための逆方向プライマーは、ヒンジ領域にちょうどＮ−末端がある不変域を含むように設計することができる。個々にクローン化したら、ｐｅｌＢシグナル−Ｖ_H−ｔａｇおよびｐｅｌＢシグナル−Ｖ_L融合蛋白の遺伝子を単一のプラスミドに導入することができ、その結果、それらは、dicistronicメッセージの使用により単一のバクテリアで発現させることができる。図３を参照。［Skerra and Pluckthun，Science，240：1038 -1041（1988）；Huse，et al.，supra；Glockshuber，et al.，上掲］。また、発現系におけるＶ_HおよびＶ_L遺伝子の方向はバクテリアでの一本鎖Ｆｖ断片（ｓＦｖ）の合成を容易にしている。ｓＦｖ断片の産生は、Ｖ_HおよびＶ_L断片の有効で永続性のある会合を可能にし、それらは鎖間リンカー、例えば、可撓性が最大になるように設計された（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）によって連結される。このリンカーを使用することにより、抗原に対する結合親和力を明白に変えることなく、Ｖ_H断片のＣ末端がいくつかの無関係な抗体のＶ_L断片のＮ末端に連結されている［Huston，et al.，PNAS，85：5879- 5883（1988）；Glockshuber，et al.，上掲］。リンカーは、得られる抗体を妨害しない限り、どれでも使用できる。他の一般的な鎖間リンカーは、Ｖ_L鎖のＣ末端がＶ_H鎖のＮ末端に結合する方向で研究されてきた［Bird，et al.，Science ，242：423-426（1988）］。Ｖ_HおよびＶ_L鎖の両方を発現するｐＥＴｐｅｌＢプラスミドからＢｓｔＥII−ＳａｃＩ断片を取り除き、合成ＤＮＡ断片で置き換えると、鎖間リンカーを含む一本鎖Ｆｖ断片を産生することができる。図３を参照。Ｆａｂ、ＦｖまたはｓＦｖ断片は、バクテリアのペリプラズムに分泌させることができ、あるいは、より遅い速度では培地に分泌させることができる［Skerra and Pluckthum，et al.，supra；Huse，et al.，上掲；Glockshuber，et al.，上掲； Bird，et al.，supra；Huston，et al.，上掲］。ｔａｇ配列（またはｓＦｖの場合は鎖間リンカー）に対する抗原を含むアフィニティーカラムを使用すると精製された抗体断片を得ることができる。例えば、ＣＤ４結合に対して活性型のＨＩＶ−１ｇｐ１２０糖タンパク質は市販されており（American BioTechnology ，Inc．またはCelltech，Ltd．）、容易にアフィニティーカラムに詰めることができる。後者の場合は、マトリックスに結合したｇｐ１２０が患者血清の広範囲に反応する中和活性を吸収する能力を保持することが示された方法を使用することが重要である［Haigwood，et al.，上掲］。バクテリアにより産生されたＦａｂ、ＦｖまたはｓＦｖ断片は、ｇｐ１２０に対する結合親和力を精製モノクローナル抗体と比較してテストすることにより、ＰＣＲ増幅で生じたと考えられる突然変異か、または使用した特定の構築法が結合親和力を変えたかどうかを決定することができる。結合親和力を低下させる突然変異を使用しないのは明らかである。親和力は、American Biotechnology，In c．またはCelltech，Ltd．から得られるｇｐ１２０をBolton-Hunter法によりヨウ素化して使用することにより測定することができる［McCarthy and Markowitz，Clin．Chim．Ata.，132-277-286（1983）］。結合したｇｐ１２０と遊離のｇｐ１２０とを分離するために、免疫沈降法［Huston，et al.，上掲］または多洞型ミクロ透析チャンバ［Skerra and Pluckthum，上掲］を使用した平衡結合測定法を使用することができ、会合定数は、例えばスキャッチャードプロットまたはシップス（Sips）プロット［Scatchard，et al.，Ann．N．Y．Acad．Sc i.，51：660-672（1949）；Smith，et al.，Biochemistry，9：331-337（1970）］から計算することができる。さらに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはＦＩＴＣに結合したｇｐ１２０は、American Biotechnology，In c．から入手できる。また、これらの分子はＣＤ４結合能を保持しており、抗体断片−ｇｐ１２０結合を評価するための半定量的固相ＥＬＩＳＡの確立に利用される。所望により、免疫グロブリンあるいはＨＩＶ単離物を中和し、および／またはＨＩＶｇｐ１２０によるＣＤ４結合に影響を及ぼすのに十分なその断片をコードする遺伝子を突然変異させて、発現するドメインの性質（例えば、抗体の親和性もしくは特異性またはその中和力の増加）を改善することができる。そのような突然変異は、単一の点変異、多重点変異またはより広い変化を含むことができ、種々の組換えＤＮＡ法、例えば遺伝子合成、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ法により導入することができる。突然変異誘発に使用すべき特定の発現プラスミドは、改変すべき抗体断片がＦａｂ、ＦｖまたはｓＦｖ断片であるかどうかに依存する。どの抗体断片を使用するかの選択は、上記したｇｐ１２０に対する相対親和性の測定値に依存する。もし、ｓＦｖ断片が少なくともモノクローナル抗体に匹敵する親和性を示すならば、公知実施例［Huston，et al.，上掲；Ward，et al.，上掲；Glockshuber，et al.，上掲］の場合のように、突然変異の研究にこれらを使用することができる。そうでなければ、部位特異的突然変異誘発に使用されるＦａｂまたはＦｖ断片が好ましい。突然変異誘発および表現型分析で選択されるベクターは、大腸菌複製起点（ＣｏｌＥ１）およびアンピシリナーゼ遺伝子または他の抗生物質マーカーを含むのが好ましい。また、発現プラスミドは、好ましくは、ｆ１ファージ起点を含んで、ヘルパーファージ（Ｍ１３）感染による一本鎖ＤＮＡの救出を可能にすべきである。突然変異を誘発すべき遺伝子は、上記ｚ１０プロモータなどのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモータの制御下におくことができる。こうすると、野性型または突然変異型の抗体断片をＢＬ２１（ＤＥ３）宿主でＩＰＴＧ−誘導型発現することができる。これらの望ましい特徴を有する発現ベクターは、図３に示すプラスミド上でｆ１ファージ起点をクローン化することにより容易に作製することができる。あるいは、後者プラスミド由来の転写ユニットをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Stratagene）［He lseth，et al.，J．Virol.，64：2416-2420（1990）；Olshevsky，et al.，上掲；Kowalski，et al.，PNAS，86：3346-3350（1989）］に組み込んでクローン化してもよい。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドはＩＰＴＧ−誘導型ｌａｃＺプロモータ／オペレータ（ｌａｃｉリプレッサーの制御下）および多重クローニング部位の上流方向のＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する。ＦｖまたはＦａｂ断片の突然変異誘発には、Ｖ_HおよびＶ_Lセグメントを個々の転写ユニット上に位置させるか、またはdicistronicメッセージを使用して産生することができる。一態様では、抗体断片の発現およびｇｐ１２０−結合力の測定のための二つの方法を、野性型抗体遺伝子を使用して試みることにより、これらの方法の実用性および適合性を比較することができる。例えば、第一法では、ＥＬＩＳＡ法を使用して固定化抗体に対するｇｐ１２０結合を検出する。まず、ＥＬＩＳＡプレートを抗−ｔａｇまたは抗−Ｆａｂ抗体で被覆する。市販のヤギおよびウサギ抗−ヒトＦａｂ抗体を使用すると、それらが組換え野性型タンパク質を認識するかどうかを測定することができる。例えば０．２５Ｍの尿素の存在下、ｓＦｖが支持抗体に結合する条件を使用すると、ｓＦｖ断片は、可溶性抗原の検出においてＦａｂ断片と同様に有効であるはずである。バクテリアのペリプラズム抽出物または上清（好ましくは一部精製する）は、固定化抗体に結合する。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したｇｐ１２０（American BioTechnology，Inc．）は、ｇｐ１２０に結合可能な抗体断片を検出するために使用することができる。バクテリア発現に無関係な抗体断片（例えば、抗−ｔａｔＦｖ）由来の抽出物はコントロールとして使用できる。第二法では、抗体断片産生のためのｉｎｖｉｔｒｏ転写−翻訳系を使用する［Cohen，et al.，Nature，supra；Salfeld，et al.，EMBO J.，9：965-970（19 90）；Cohen，et al.，J．AIDS 3：11-18（1990）］。後者の方法の場合、ｓＦｖ遺伝子は１個のプラスミドから発現されるが、ＦａｂまたはＦｖ遺伝子の場合は、Ｖ_HおよびＶ_L遺伝子セグメントが個々のプラスミド上に位置する。ｐｅｌＢシグナル配列は、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系では切断されないので、これらの構築物から取り除く。抗体遺伝子セグメントは、Ｔ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼに反応するプロモータを使用して発現させることができる。Ｖ_HおよびＶ_L遺伝子を含む等モル量のプラスミド（またはｓＦｖ遺伝子含む１個のプラスミド）は線状化し、Ｔ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎｖｉｔｒｏで転写し、ＲＮＡはキャップして、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳混合物中で使用する。標識抗体断片のｇｐ１２０結合能は、抽出物を種々の量のｇｐ１２０とともにインキュベートし、抗−ｇｐ１２０抗体とともにその混合物を沈降させることにより評価することができる。多数の抗− ｇｐ１２０ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が利用でき、目的のモノクローナル抗体と競合しないことがわかっいてるものを使用する。あるいは、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳混合物を上記のＥＬＩＳＡ法で使用することもできる。機能的野性型抗体断片が発現されることが確認されると、一本鎖ＤＮＡを作り、Kunkelら，Meth．Enzymology，154：367-382（1987）に記載されているように、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発用の鋳型として使用する。この方法により、二本鎖ハイブリッドＤＮＡの突然変異誘発を受けていない鎖は選択しないで、所望の突然変異を含むコロニー（ベクターとしてファージを使用する場合はプラーク）を高い割合で得ることができる。突然変異誘発すべき一本鎖の標的ＤＮＡをｄｕｔ−ｕｎｇ−バクテリアで合成すると標的ＤＮＡにウラシルを導入することができ、これによりムテインの選択が有利になる。このウラシル含有鎖は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとしＤＮＡポリメラーゼで処理することによる、ウラシルを含まない突然変異体鎖のｉｎｖｉｔｒｏ合成の鋳型として使用される。その結果得られる二本鎖ＤＮＡは、野性型ウラシル含有鎖を不活性化するウラシルＮ−グリコシラーゼによって細胞内に形質転換される。突然変異鎖は、プラスミドまたはファージとして複製され生き残る。プラスミドベクターを使用する一本鎖ＤＮＡの合成は、Ｍ１３ファージ系を使用する場合よりも時間がかかるが、所望のセグメントを含む一本鎖ＤＮＡのストックが一旦得られると、突然変異体（ムテイン）は非常に急速に産生することができる。抗体遺伝子発現プラスミドからの一本鎖ＤＮＡの合成はファージの助けを借りて行うことができ、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼとともに完成されて、大腸菌の形質転換に使用される。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）はウラシルＮ−グリコシラーゼの受容能を有し、ＩＰＴＧ−誘導Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するので、表現型の特徴からバクテリアでの発現を選択する場合は適切な宿主として使用することができる。アンピシリンに関して選択される個々のバクテリアコロニーは、プラスミドＤＮＡ合成に使用され、突然変異の存在がＤＮＡシークェンシングにより確認される。好ましくは、独立して単離した所望の突然変異を含む３個のコロニーについて、その抗体発現およびｇｐ１２０結合を評価し、観察される表現型に寄与する所望の突然変異とは別に自然に起こる突然変異の可能性を最少にする。突然変異抗体のｇｐ１２０結合能は、バクテリア抽出物またはｉｎｖｉｔｒｏ翻訳混合物において発現された突然変異タンパク質の量に対して規格化する。発現レベルが十分であることがわかると、抽出物を泳動したＳＤＳ−アクリルアミドゲルをクーマシーブルーまたは銀染色すれば十分に定量できる。抗体断片発現のレベルが低い場合は、抗−ｔａｇ抗血清または市販のヤギおよびウサギ抗−ヒトＦａｂ抗体（後者は、野性型断片と反応することが示された場合）を用いたウェスタンブロット法または免疫沈降法により規格化することができる。これらのポリクローナル抗体は、組換え分子上の多重エピトープに対する反応性がより良好であることを示すと考えられ、ときどき見られる、組換え抗体断片がバクテリアによるタンパク質分解の後、二次的に「ｔａｇ」配列を失うという問題は回避されるであろう［Ward，et al.，上掲］。抗体断片産生のレベルが評価されると、突然変異抗体断片のｇｐ１２０結合能を上記野性型断片に対して記載したように測定する。ＥＬＩＳＡ法では、固定化に使用した抗体により認識される突然変異抗体断片のレベルを免疫沈降法により独立して測定する。すなわち、固定化抗体により結合された突然変異断片のレベルの相違が、ｇｐ１２０結合において認められる低下の原因ではないことが保証される。ｇｐ１２０結合において認められる低下のいくつかは、突然変異の結果としての抗体構造の全体的な立体構造上の変化により説明できるだろう。これは、問題になるほどのものではない。なぜならば、抗体ＣＤＲループなどのタンパク質上の露出したターンにおけるアミノ酸のほとんどの変化は、タンパク質コアにおける疎水性残基での変化に比べてタンパク質の立体配座に対する影響が少ないからである［Creighton，″Proteins：Structureand Molecular Principals″ （Freedman and Company，New York（1984）］。最後に、Ｆ１０５イディオタイプに対して特異的な立体配座依存性のモノクローナル抗体（例えば、抗−イディオタイプモノクローナル抗体）は、突然変異タンパク質の立体配座の妥当性の評価に使用することができる。例えば、ｇｐ１２０に対して高い親和性を示すかより強い中和作用を有し、あるいは異なる範囲のＨＩＶ単離物を認識してそれに結合するＦ１０５突然変異抗体の同定ができれば、治療目的のため、およびｉｎｖｉｖｏでのそのような反応性の発生を研究するための決定的試薬を提供するために大いに好ましいであろう。抗体の結合、例えば選択した抗原（例えば、ＨＩＶｇｐ１２０）に対するｓＦｖ断片の結合を選択し、１０６以上のタンパク質の出発集団から所望の抗体を同定するために、ある系を使用することができる［McCaffer ty，et al.，Nature，348：552-554（1990）］。例えば、ｓＦｖとウィルス遺伝子 III表面タンパク質との融合タンパク質を運ぶ繊維状バクテリオファージの産生に関与する系を使用する（「ファージ抗体」）。遺伝子 IIIタンパク質は、そのファージが標的バクテリアのＦ線毛に付着することに関与している［Korn berg，″DNA Replication″（Freeman，San Francisco）（1980）］。しかし、遺伝子IIIタンパク質は、Ｎ末端付近に挿入されたポリペプチド（抗体のｓＦｖ断片を含む）の存在を機能の損失なしに許容することができる［Smith，et al. ，Science，228：1315-1317（1985）；Parmley and Smith，Gene，73：305-318 （1988）；Scott and Smith，Science，249：386-390（1990）；Devlin，et al. ，Science，249：404-406（1990）］。すなわち、表面に機能的抗体の可変領域を示す複製−コンピテントファージを産生することができる。所望の表現型の機能的抗体断片を含むファージは、アフィニティークロマトグラフィーを繰り返すことにより濃縮することができる［McCafferty，et al.，上掲］。この方法による最初の段階は、突然変異誘発の効率が高く、野性型ｓＦｖ抗体断片を遺伝子 IIIタンパク質との融合タンパク質として発現するのに適した繊維状ファージの産生である。McCaffertyら（上掲）によるファージ抗体の産生で以前に使用されたｆｄファージの使用が好ましい。まず、ｆｄ−ｔｅｔベクター（American Type Culture Collection）をｄｕｔ−ｕｎｇ−大腸菌（例えば、ＣＪ２３６、ＲＺ１０３２）にトランスフェクションすることにより一本鎖のファージＤＮＡを作製する。ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発［例えば、Kunkel，et a l.，上掲の方法］を使用して１６１１および１６３１の位置に単一のＫｐｎＩおよびＥａｇＩ部位を作る（図１１参照）。これらの変化は遺伝子 IIIコード配列に影響を及ぼさない。合成オリゴヌクレオチドをＫｐｎＩ／ＥａｇＩで消化したｆｄ−ｔｅｔＤＮＡでクローン化して欠損したｐ IIIコード配列を再構成し、ｓＦｖ遺伝子の枠内セグメントを挿入する。ｓＦｖ遺伝子のこれらのフランキングセグメントはｓＦｖ遺伝子内にＸｈｏＩおよびＰｖｕII部位を含み、完全なｓＦｖカセットをｐＥＴベクターからクローン化することができる。その結果、ｆｄ−ｔｅｔ−ｓＦｖベクターになる。これは、（Ｎ末端からＣ末端へ）ｐ IIIタンパク質シグナル配列（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕシグナルペプチターゼ切断部位を含む）、ｓＦｖ、および残りのｐ III配列を含むｐ I II−ｓＦｖ融合タンパク質をコードする。ファージは、ｆｄ−ｔｅｔ−ｓＦｖベクターを大腸菌ＴＧ１にトランスフェクションすることにより産生され、次いで、テトラサイクリン選択を保持しながらこれらのバクテリアで増殖する。コントロールファージは、ｆｄ−ｔｅｔプラスミドのトランスフェクションにより産生される。高力価のファージの上清は、ポリエチレングリコールで沈降させ、最初の容量の約１／１００に再懸濁した後、残留バクテリアおよび凝集ファージを遠心分離により取り除くことができる。ｓＦｖファージおよびコントロールファージのｇｐ１２０との結合能を、McCaffer tyら（上掲）の記載のように、濃縮ファージストックを使用してＥＬＩＳＡにより試験する。簡単に述べると、ｇｐ１２０を被覆したプレートを２％のスキムミルク粉末を含むリン酸緩衝塩水中で約２×１０¹⁰ファージとともにインキュベートする。プレートを０．５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、次いでＰＢＳで洗浄し、結合ファージをヒツジ抗−Ｍ１３抗血清（密接に関連するｆｄファージと交差反応することが知られている）およびホースラディッシュペルオキシダーゼを結合した抗−ヒツジ血清（sigma）により検出する。牛血清アルブミンを被覆したプレートをコントロールとして使用し、認められる反応性がｇｐ１２０に特異的であるかどうかを確かめる。ファージ抗体が野性型ｓＦｖ遺伝子挿入配列により産生できることが確証されたら、半ランダム突然変異ライブラリーを、例えば高親和性および／または特異性に関して選択することができる。ｇｐ１２０に対する全体的な結合親和性に対する各ＣＤＲループおよびそのループ内の特定の残基の相対的な寄与に関する情報は、上記のプラスミド発現ベクターを使用した部位特異的突然変異誘発の研究から得ることができる。ファージ抗体の半ランダム突然変異誘発では、ＣＤＲループ全体のコード配列をランダムに突然変異誘発しようとするよりもむしろ選択的にこれらの領域が変えられるように標的が設定される。この方法では、出発点がすでにｇｐ１２０上の所望の標的に結合している抗体であるという点で最大の利点を有する。この結果、全体的にランダムなＣＤＲループを使用し、選択操作のみに頼る方法に対して、親和性がより高い抗体を同定できるという確実性が数段増す。ｓＦｖ遺伝子挿入体の変更は、例えば突然変異体を濃縮するためのKunkelら（上掲）の方法を使用して、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により行われる。選択した各ＣＤＲループの突然変異誘発に対しては、１組の縮退オリゴヌクレオチドが生じる。各組のオリゴヌクレオチドは、ｎ／２バッチから成り、ｎは突然変異誘発のために選択したＣＤＲループ中のアミノ酸の数である。オリゴヌクレオチドの各バッチは、ＣＤＲアミノ酸を特定化する２個の隣接する内部コドンの縮退を除いて、ＣＤＲコード領域およびすぐ隣の枠組み配列と同一の配列を有する。これら２個のコドンは、ＮＮＳＮＮＳ（ＮはＧ、Ａ、ＴおよびＣの混合物であり、ＳはＧおよびＣの混合物である。）の配列を有する。ＮＮＳコドンは、２０個全てのアミノ酸をコードするが、３個の終結コドンの１個のみを生じる。一度に各組のオリゴヌクレオチドを使用して突然変異体を生成させると、導入できる置換は、ＣＤＲループ内で一度に高々２個のアミノ酸に限られる。最初のスクリーニングで、所望の特徴を有する突然変異体ファージ抗体が生成されないことが示されると、突然変異誘発のランダム度を下記１および２により増加することができる。１．異なるＣＤＲ残基の組み合わせに影響を及ぼす突然変異が生じるように、異なる組のオリゴヌクレオチドを一本鎖の鋳型とともにアニーリング反応に同時に導入する；および２．縮退領域の長さを２個から３または４個のコドンに増加する。親和性の高い抗体断片の生成にＣＤＲ同志の相互作用が必要であるならば、前者の方法が重要であると考えられる。ファージ複製のためのＦ’、ウラシル−Ｎ −グリコシラーゼ−コンピテントバクテリア宿主（例えば、ＴＧ−１、ＭＶ１１９０）を使用するこの方法は、組換えファージのほとんどが突然変異体ｓＦｖタンパク質を発現するように選択圧力を与えるものである。高力価ストックは、ファージ抗体が下記：ａ）ｇｐ１２０に対する高い親和性；およびｂ）ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはＳＩＶ−１感染をｉｎｖｉｔｒｏで中和する能力の二つの表現型に関してスクリーニングできるように増殖させる。ｇｐ１２０に対する親和性が野性型ファージ抗体よりも高い突然変異ファージ抗体の同定には、いくつかの方法を使用することができる。抗原を結合することができるファージ抗体を選択するためにアフィニティークロマトグラフィーが使用されている［McCafferty，et al.，上掲］が、親和性の高い抗体の選択にはＥＬＩＳＡ法を使用するのが好ましい。McCaffertyら（上掲）に記載されているＥＬＩＳＡ法は、この選択のために野性型ファージ抗体を使用して改良し、選択条件を確立することができる。ＥＬＩＳＡプレートに先の研究で示したｇｐ１２０試料を、量を減少させていきながら被覆し、抗体断片を結合させる。ウェルを、増大する濃度の競合物としての精製したモノクローナル抗体またはＦａｂ断片の存在下または非存在下で、２％スキムミルク粉末／緩衝液に入れた野性型ファージ抗体とともにインキュベートする。次いで、ウェルを、トリエチルアミンによりｐＨが９．０から９．５まで高められた緩衝液で順次洗浄し、最後に１００ｍＭのトリエチルアミンで溶離する。洗浄液および溶離液の両方を０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で中和し、バクテリア上で滴定する。野性型ファージ抗体を使用する滴定は、野性型ファージ抗体がほとんど、または全く検出されない最小緊縮条件（ｇｐ１２０濃度、競合モノクローナル抗体および洗浄条件）を示すことができる。また、あまり緊縮でない条件を使用して、野性型ファージ抗体を、無関係なｓＦｖ断片（例えば、認識リゾチーム［McCafferty，et al.，上掲］）を発現するコントロールファージの大集団から選択することができるかどうかをテストすることもできる。これにより、ファージ抗体は、ウィルスストックにおける濃度が低くても確実に選択することができる。次いで、野性型ファージ抗体が全く選択されない条件を使用する選択系を突然変異体ファージ抗体のプールに適用する。選択したウィルスを増殖し、次いで、２回目、必要であれば３回目の選択を行う。選択回数は、選択したファージ抗体集団の多様性により決定することができる。これは、突然変異誘発の標的であるｓＦｖ断片におけるクローン化したファージのＰＣＲシークェンシングにより求めることができる。多様性が高い場合は、より緊縮した選択条件（競合抗体の濃度の増加、洗浄回数の増加、ｇｐ１２０濃度の減少）を使用して最大親和性を有するファージ抗体を選択することができる。選択したｓＦｖ断片はシークェンスし、バクテリアで発現し、ｇｐ１２０に対する親和性を測定して、上記の野性型ｓＦｖと比較することができる。これらのより親和性の高いｓＦｖ断片は、突然変異体の最初の発生で標的とならなかったＣＤＲループの他の要素に特異的な突然変異誘発のための出発点として有用である。出発物質である「野性型」タンパク質として高親和性突然変異体を使用し、突然変異誘発および選択を多数回行うと、さらに親和性が高まる可能性がある。いくつかのより親和性の高いｓＦｖ断片に対しては、シンシチウム（syncytiu m）生成を阻害する能力をテストすることができる。複製−コンピテント実験および野性型ＨＩＶ単離物を使用する中和測定法も行うことができる。これらの目的に対しては、選択したｓＦｖ変異種をバクテリア内で発現させる。それは、抗 −ｔａｇまたは抗Ｆａｂ抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによる最終的な精製のために多量に増殖させることができる。これらの遺伝子の一つのヌクレオチド配列がわかると、哺乳動物での抗体の存在に対してスクリーニングし、そのレベルを定量することができる。そのようなスクリーニング法を使用すると、ＨＩＶ感染患者の病気の進行を診断・研究するとともに、試験的ワクチン接種ボランティアの免疫反応を研究することができる。例えば、ＰＣＲに基づくアッセイ方法は、患者のＰＢＬ試料における抗体の有無および転写量を測定することができる。そのようなスクリーニング法は、Ｖ_H７１−４Ｈ鎖およびＨｕｍｖｋ３２５Ｌ鎖の両遺伝子のリーダーペプチド由来の５’ＰＣＲプライマーならびにＫ鎖の不変領域またはＨ鎖のＪ領域にアニールする非特異的３’プライマーを使用して行うことができる。そのようなプライマーは、組織または体液、好ましくは体液に添加できる。体液としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、正常細胞溶解物の上清、感染した細胞の溶解物の上清、好ましくはＴ細胞溶解物が挙げられる。５％のｃＤＮＡについてＰＣＲを３０回行った結果を図１４に示す。そのような診断テストは、使用するＰＣＲプライマーを改変することによってより特異的にすることができる。例えば、３’プライマーは、ＣＤＲに相補的であるように設計することによりより特異的にすることができる。例えば、ＣＤＲ３の３’端に３’プライマーを置くと、より特異的なＰＣＲ増幅産物を得ることができる。あるいは、５’プライマーも、このＰＣＲプライマーをＣＤＲ１に対して相補的にすることにより、より特異的にすることができ、従って、ＣＤＲ１とＣＤＲ３との間のＤＮＡ配列を増幅することができる。この増幅はＨ鎖およびＬ鎖の両方に対して行うことができる。シグナルの相対的な量および／またはシグナルの有無はＰＣＲによって測定することができる。本発明の抗体は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２および／またはＳＩＶのｇｐ１２０エピトープに対する結合活性を有し、細胞のウィルス感染を予防または最小にするために使用することができる。より好ましくは、抗体がＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に対して結合活性を有する。さらに好ましくは、ＨＩＶ−１に対して結合活性を有する。好ましくは、細胞がヒトの細胞である。この方法は、治療上有効な量の抗体をウィルスを有することが疑われる哺乳動物の体液または細胞の試料に投与して、ウィルスが細胞に結合して入り込むのを阻止することを含む。好ましくは、体液試料を使用する。体液としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、正常細胞の溶解物の上清、感染した細胞の溶解物の上清、好ましくはＴ細胞溶解物が挙げられる。好ましくは、哺乳動物が霊長目の動物であり、より好ましくはヒトである。ｉｎｖｉｖｏ治療に使用する場合は、本発明の抗体を、ウィルスが他の細胞に入り込む能力を消去し、または低下させる量で患者に投与する。抗体は、ｇｐ１２０タンパク質の結合部位をブロックし、ウィルスが細胞に入って再生する能力を低下させるように作用する。抗体は、多くの方法で投与することができる。例えば、非経口注射（筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．））、経口投与または周知の他の投与ルートのいずれかにより投与することができる。非経口投与が好ましい。使用量は、典型的には、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。抗体は、好ましくは単位投与形態に製剤化する。例えば、経口投与に使用できる固体投与形態としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒状が挙げられる。そのような固体投与形態では、活性成分、すなわち抗体またはペプチドをショ糖、乳糖または澱粉などの少なくとも一種の不活性担体と混合する。また、そのような投与形態は、不活性希釈剤以外の他の物質、例えばステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含むことができる。さらに、カプセル、錠剤および丸剤の場合の投与形態は、緩衝剤を含んでもよい。また、錠剤、カプセルおよび丸剤は徐放性コーティングを含むことができる。非経口投与の場合は、典型的には、滅菌水溶液または非水溶液、医薬的に許容されうる非経ロビヒクルと会合した懸濁液またはエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒またはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油などの植物油、ゼラチンならびにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルがある。また、これらの投与形態は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含むことができる。それらは、抗体を不活性にしないよう注意を払う限り、例えば、バクテリア保持フィルターによる濾過、滅菌剤の組成物への混入、組成物への照射などにより滅菌することができる。また、それらは、使用する前に滅菌水または他のいくつかの注入可能な滅菌媒体で希釈して作ることもできる。さらに、これらのビヒクルの例としては、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームも担体として使用することができる。また、等張性および化学的安定性を高める物質などの添加物質、例えば緩衝液および保存剤を使用してもよい。該ビヒクルにおける活性成分の好ましい範囲は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度である。より好ましくは、約３ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。また、これらの抗体は担体として使用してイムノトキシンを形成してもよい。それらをそのようなものとして使用すると、ｇｐ１２０上のエピトープに所望の化学的または細胞障害性部分を送達することができる。イムノトキシンの細胞障害性部分は、細胞障害薬または酵素的に活性なバクテリア、真菌または植物起源の毒素、またはそのような毒素の酵素的に活性なポリペプチド鎖または断片（「Ａ鎖」）であってもよい。酵素的に活性な毒素およびその断片が好ましく、例えば、ジフテリアトキシンＡ断片、ジフテリアトキシンの非結合活性断片、エキソトキシンＡ（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、アルファサルシン（alphasarcin）、ある種のAleur ites fordiiタンパク、ある種のDianthinタンパク、Phytolacca americanaタンパク（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Momordicacharantia阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、Saponaria officinalis阻害剤、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictoci n）、フェノマイシン（phenomycin）、およびエノマイシン（enomycin）が挙げられ、リシンＡ鎖、緑膿菌外毒素ＡおよびＰＡＰが好ましい。モノクローナル抗体と該細胞障害性部分との接合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作ることができる。そのような物質としては、Ｎ −スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、ジメチルアディピミデート（dimethyladeipimidate ）・ＨＣｌなどのイミドエステルの二官能性誘導体、スベリン酸ジスクシンイミジルなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなどのビス−アジド化合物、トリレン２，６−ジイソシアネートなどのジイソシアネートおよび１，５−ジフルオロ− ２，４−ジニトロベンゼンなどのビス−活性フッ素化合物が挙げられる。本発明のイムノトキシンの酵素的に活性なポリペプチドは、組換え技術により作製できる。組換え技術により作製したリシン毒素Ａ鎖（ｒＲＴＡ）は、１９８５年８月１５日公開のＰＣＴＷＯ８５／０３５０８に開示された方法により作製できる。組換え技術により作製したジフテリア毒素Ａ鎖およびその非結合活性断片も１９８５年８月１５日公開のＰＣＴＷＯ８５／０３５０８に開示されている。また、これらの抗体を使用すると、これらの部位の一つでｇｐ１２０を切断する、すなわちその結合部位を欠失させるであろう酵素を送達することができる。別の態様では、これらの抗体を使用して、その部位または隣接部位をキャップする分子を送達することができる。ｇｐ１２０とＣＤ４受容体との結合を妨害するどんな分子を使用してもよい。以下の実施例により本発明をさらに説明する。以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。実施例１Ｆ１０５ハイブリドーマからのＦ１０５免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅ＥＢＶ形質転換体をＨＭＭＡ２．１１ＴＧ／０細胞系の非分泌ヒト−マウスミエローマ類似体［Posner，et al.，上掲］と融合させることによりＦ１０５ハイブリドーマを誘導した。全ＲＮＡを、Chomczynakiら［Analytical Biochemisty ，162：156（1987）］の方法により、ハイブリドーマから採取した。第一ｃＤＮＡ鎖を、Gublerら（上掲）の方法に従って、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（４００Ｕ）を使用して、全ＲＮＡ５μ ｇから２５μｌの反応物中で合成した。第一ｃＤＮＡ鎖の５〜１０％を使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに使用した温度は、融解：９４℃、１分；プライマーのアニーリング：５２℃、２分；プライマー伸長：７２℃、２分であった。ランプ（ramp）時間は、アニーリングと伸長との間を２分とした以外は１分を使用した。臭化エチジウムで染色した２％のアガロースゲルを使用してＰＣＲ断片を分離した。適切なバンドを切り取り、遺伝子を洗浄し（Bio 101，La Jolla，CA ）、クレノウ修復して、制限酵素で消化し、ＳＵＲＥバクテリア（Stratagene，LaJolla，CA）を宿主として使用することによりｐＳＬ１１８０（Pharmacia LKB Biotech．Inc.，Piscataway，N J）内にクローン化した。少なくとも３個の別個の形質転換体について、正方向および逆方向の両方のシークェンスプライマーを使用し、Sangerら（上掲）の方法により塩基配列の決定を行い、シークェンスおよびＰＣＲアーチファクトを最少にした。ヌクレオチドの配列を配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３として示す。シークェンシングプライマーは、ｐＳＬ１１８０のポリリンカー配列に相補的であるように設計した。Ｈ鎖対は、Ｖ_HプライマーおよびＪ_HまたはＣ_H1プライマーから成り、各々、クローニングに都合の良い制限部位を含む。免疫グロブリンに関するKabatのデータベースを使用して、６個の別個のヒトＶ_Hファミリーのアミノ酸およびコドン分布を分析した［kabat，et al.，上掲］。この分析に基づいて、３５塩基対の万能な５’Ｖ_Hプライマーを設計した。すなわち、ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡ（Ｇ／Ａ）ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０）である。これは、２箇所で２つの異なるヌクレオチドが縮退しており、ＦＲＩ配列の５’端にアニールする。５’ＮｏｔＩ部位（左側下線部）は増幅したＤＮＡをクローン化するために導入したものであり、Ｖ_H遺伝子の第一コドンの５’側に位置する。内部ＸｈｏＩ部位も同様に導入した（右側下線部）。同様に、Ｊ_H領域のオリゴヌクレオチドを、Ｈ鎖可変域遺伝子の３’ 端で逆方向プライマーとなるよう設計した。すなわち、ＴＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４）である。６個のヒトＪ_H領域のミニ遺伝子のヌクレオチド配列に基づくと、このプライマーは２個の縮退位置を含み、各位置に２個のヌクレオチドを有する。Ｊ領域の最後のアミノ酸を決定するコドンの３’側ですぐ隣接したＢｓｓＨII部位（左側下線部）は、Ｖ_H遺伝子の３’端でのクローン化に都合が良い。内部ＢｓｔＥII部位（右側下線部）も同様に導入した。Ｊ_H領域の公平な配列データを得るために、逆方向ＩｇＧ₁ Ｃ_H1プライマーを、ヒンジエキソンの第一システインコドンのちょうど３’で終結するように設計した。すなわち、ＴＴＡＧＣＧＣＧＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）［Kabat，et al.，上掲］である。ＢｓｓＨII部位も同様にクローン化のために導入した。得られた遺伝子産物（Ｈ断片）は、ＩｇＧ₁ イソタイプのＦｄに対応することを意図したものであり、Ｈ−Ｌジスルフィド結合を保存している［Mullinax et al.，PNAS，87：8095-8099（1990）］。ＩｇＧ₁ Ｃ_H1のアミノ酸１８３〜１８９に対応するプライマー：ＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）は、ＤＮＡシークェンシングのために使用した。同様の方法を使用して、ヒトＶ_K鎖可変域の遺伝子に対するＰＣＲプライマーを設計した。ヒトＶ_K遺伝子は４ファミリーである。ＦＲ１配列の５’端にアニールする５’Ｖ_Kプライマー：ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＣＴＣ（Ｇ／Ｃ）（Ｔ／Ａ）Ｇ（Ａ／Ｃ）ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３およびＳＥＱＩＤＮＯ：２４）は、３箇所で縮退があり（各２個のヌクレオチド）、Ｖ_H領域と同様の位置にＮｏｔＩ部位（左側下線部）を含む。また、内部ＳａｃＩ部位も含む（右側の下線部）。５個のヒトＪ_K ミニ遺伝子の配列から設計した３９塩基対の逆方向Ｊ_Kプライマー：ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣＧＴＧＡＴＣＴＣＣＡ（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ）ＴＴＧＧＴＣＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７およびＳＥＱＩＤＮＯ：２８）は、３箇所で縮退があり（各位置に２個のヌクレオチド）、Ｊ_Kコード領域のすぐ隣に内部ＭｌｕＩ部位（右側下線部）を含み、その後ろに２個の停止コドンおよびＢａｍＨＩクローニング部位（左側下線部）を含む。Ｊ_K領域の公平な配列データを得るために、２個の逆方向Ｋ不変領域プライマーを設計した。第一プライマーであるＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）は、Ｋ不変領域の最も５’端にアニールし、Ｊ_Kプライマーと同様のフランキング配列構造を有する。第二プライマーであるＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）は、Ｋ不変領域の最も３’側のヌクレオチドにアニールするように設計し、その領域の後ろに２個の停止コドンおよびＢａｍＨＩクローニング部位が続いた。Ｆ１０５Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子の両方に対する主要なヌクレオチド配列を決定し、生殖系遺伝子を同定した後、ＶＨ７１−４［Lee，et al.，上掲］およびＨｕｍｖｋ３２５［Radoux et al.，J．Exp．Med.，164：2119-2124（1986）］生殖系遺伝子のリーダー配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計した。ＶＨ７１− ４リーダープライマー：ＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）およびＨｕｍｖｋ３２５リーダープライマー：ＧＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）はともに５’ＮｃｏＩ部位（下線部）を含む。これらのリーダープライマーは、ＰＣＲ増幅実験のための各々のＣ領域プライマーとともに使用した。実施例２Ｆ１０５Ｆａｂ抗体のクローニングおよび発現Ｆ１０５Ｆａｂ断片を実施例１と同じプロトコールを使用してｐＥＴｐｅｌＢ発現ベクター中でクローン化した。ＰＣＲ増幅に対しては、Ｈ鎖ヒンジプライマーおよび最も３’側のＫ領域プライマーを３’プライマーとして使用した。図１参照。５’プライマーは実施例１で使用したものと同じであった。実施例１と同じアニーリングおよびＰＣＲ条件下でＰＣＲ増幅産物が得られた。ｐＥＴｐｅｌＢベクターはｚ１０プロモータ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの場合）およびＴ７バクテリオファージ由来のＴｚ転写終結シグナルを有する［Rose ngerg，et al.，上掲］。シグナルペプチド切断部位［Lei，et al.，上掲］を含むシグナル配列は図２では「ｐｅｌＢシグナルペプチド」と命名し、ＮｃｏＩ（またはＮｏｔＩ）部位内にクローン化した可変遺伝子のＮ末端上で融合される。ｐｅｌＢシグナル配列のすぐ上流は大腸菌で翻訳するためのリボソーム結合部位である。それは、このベクターで発現したいくつかのタンパク質のＣ末端上で融合する「ｔａｇ」配列であり、抗−ｔａｇ血清によって認識されるアンギオテンシンＩ由来の小さいペプチドである［Ward，et al.，上掲］。そのベクターでのＨ鎖遺伝子のクローン化は、ＰＣＲプライマーからのＮｃｏＩ（またはＮｏｔＩ）およびＢｓｓＨII部位を利用し、Ｌ鎖のクローン化は、同じくＮｃｏＩ（またはＮｏｔＩ）および３’ＢａｍＨＩ部位を利用する。このベクターを使用すると、Ｈ鎖のみがｔａｇ配列に融合する。Ｆ１０５Ｈ鎖のクローン化の場合は、ＰＣＲ産物を２％の低融点アガロースゲルにより精製した。適切なバンドを切り取り、ＮｏｔＩおよびＢｓｓＨIIによる制限酵素消化を行い、ＮｏｔＩおよびＢｓｓＨIIで消化してあるベクターｐＥＴｐｅｌＢ内にクローン化してＨ鎖ベクターを得た。図２参照。得られたプラスミドを使用して、ＳＵＲＥバクテリア（Stratagene，La Jolla ，CA）を形質転換した。個々のコロニーのプラスミドミニ調製物（mini preps）をクローン化で使用した制限酵素により消化して適切な挿入物の確認を行った。Ｆ１０５Ｌ鎖のクローン化に対しても同じ方法を使用したが、ＰＣＲ産物はＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化してあるベクターｐＥＴｐｅｌＢでクローン化してＬ鎖ベクターを得た。Ｌ鎖ベクターをＸｂａＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化すると、適切なフランキング配列を有するＬ鎖断片が得られた。図３参照。次に、Ｈ鎖ベクターをＳｐａＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化してＬ鎖断片と連結した。ＸｂａＩおよびＳｐａＩは付着末端を有するので、dici stronicメッセージを生成することができた。次いで、得られたベクターをＳＵＲＥバクテリアに移入して形質転換し、dicistronicカセットが適切にクローン化されたことを確認した。得られたプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に移入して形質転換し、適切な条件下、３７℃で培養し、Ｏ．Ｄ．₆₀₀が０．６に達した後、１ｍＭのＩＰＴＧで細胞を誘発した（コントロールはＩＰＴＧを含まない）。３７℃で２時間インキュベートした後、バクテリアを採取した。図４に示すように、Ｆ１０５Ｆａｂ抗体断片（ｒＦ１０５Ｆａｂ）のＢＬ２１（ＤＥ３）での発現は、ＩＰＴＧ誘発後、ＳＤＳ−アクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色（図４Ａ）およびウェスタンブロット（図４Ｂおよび４Ｃ）の両方により容易に情報が得られる。タンパク質を検出するために、全細胞溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離した。全細胞抽出物のクーマシーブルー染色では、各々、Ｖ_L およびＶ_H−ｔａｇ融合タンパク質に対応する２２ｋＤおよび２５ｋＤに２個のタンパク質のバンドが見られる。ウェスタンブロットの場合、ウサギ抗Ｖ_H４−ＦＲ１［Silverman，et al.，Eur．J．Immuno.，上掲］またはＶ_H ＩＶ枠組みペプチドに対する抗血清のいずれかを使用し、次いでアルカリ性ホスファターゼを酵素として使用するVector Labs免疫検出キットを使用した。高レベルのＶ_Hタンパク質は、ＩＰＴＧによる誘発後のみ、このプラスミド／宿主系で誘発された。Ｖ_H遺伝子の挿入がないｐＥＴｐｅｌＢベクターを含むコントロールＢＬ２１（ＤＥ３）バクテリアのウェスタンブロットでは、たとえＩＰＴＧ誘発の後でも特定のタンパク質は検出されなかった（データは示さない）。ウサギ抗アンギオテンシン（抗−ｔａｇ）を第一抗体として使用すると、同一の結果が得られた（データは示さない）。図４のパネルＣはヤギ抗−Ｋ鎖抗体でプローブしたＦ１０５Ｖ_Lタンパク質のウェスタンブロットを示す（Southern Biotechn ology Associates）。両方のパネルとも、上方のバンドはｐｅｌＢシグナル切断前の前駆体タンパク質を表す。図５は、ＢＬ２１（ＤＥ３）で産生したｒＦ１０５Ｆａｂによるｇｐ１２０結合活性の検出を示す。１ｍＭのＩＰＴＧによる誘発の２時間後、Ｆ１０５Ｆａｂカセットを含むｐＥＴｐｅｌＢｔａｇベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）からサブ細胞性（sub-cellular）のペリプラズム断片を得た。次いで、濃縮したペリプラズム断片の試料を、ｒｇｐ１２０を被覆したＥＬＩＳＡプレート（Amer ican Biotechnology，Inc.，Cambridge，MA）上でインキュベートした。Ｆ１０５Ｆａｂ（パパインの分解により作製）およびｒＦ１０５Ｆａｂのｇｐ１２０への結合を、ヤギ抗−Ｋ鎖抗体、次いでアルカリ性ホスファターゼを酵素として使用する免疫検出により検出した。図６は、ｒＦ１０５Ｆａｂ抗体断片のアフィニティーカラムによる精製結果を示す。Ｆ１０５カセットを含むｐＥＴｐｅｌＢｔａｇベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）からのペリプラズム試料をｇｐ１２０アフィニティーカラムに通した。結合したｒＦ１０５Ｆａｂをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離し、次いで、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。次いで、プールした画分を、上述したｇｐ１２０を被覆したプレート上でＥＬＩＳＡにより分析した。実施例３Ｆ１０５−本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）のクローニングおよび発現Ｆ１０５一本鎖Ｆｖをクローン化するために、逆方向Ｊ_Hプライマーおよび正方向Ｖ_K ＰＣＲプライマーの５’末端を、互いに完全に相補的であり、鎖間リンカー配列（Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ）₃をコードする４５個のヌクレオチドを有するように設計した。そのプライマーを表１に示す。また、内部鎖間リンカーの切断部位ＢｓｐＥＩを導入し、Ｊ_HおよびＶ_Kリンカーの境界には、この後に行うクローン化を容易にするためにＰｓｔＥ_IIおよびＳａｃＩ部位を含めた。これらの伸長アームを有するＦ１０５Ｈ鎖およびＬ鎖の増幅を可能にするアニーリング条件を確立した。これらの条件は、アニーリング温度を５０℃に拘束することのみに関与した。Ｈ鎖およびＬ鎖は個々にＰＣＲ法で増幅し、ＰＣＲ産物を消化した。Ｈ鎖のＰＣＲ産物はＮｏｔＩおよびＢｓｐＥＩで消化し、Ｌ鎖のＰＣＲ産物はＢｓｐＥＩおよびＸｂａＩで消化した。これら２個の産物は、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化してあるプラスミドベクターｐＳＬ１１８０を使用し、３片連結してクローン化した。図８の左パネルは、Ｆ１０５ｓＦｖのクローニングがうまく達成されたことを示す。これは、ＮｏｔＩ／ＢｓｐＥＩ（Ｈ鎖）およびＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩ（Ｌ鎖）（図８、右パネル、図８Ａ）による消化により確認した。このＦｖ一本鎖抗体構築物を制限酵素消化により取り出し、ｐＥＴｐｅｌＢ発現ベクター内に直接クローン化した。得られたプラスミドを使用して、Ｆ１０５一本鎖Ｆｖを発現するためのＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。図９に示すように、Ｆ１０５ｓＦｖ抗体断片（ｒＦ１０５ｓＦｖ）のＢＬ２１（ＤＥ３）における発現は、ＩＰＴＧ誘発後、ＳＤＳ−アクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色（図９Ａ）およびウェスタンブロット（図９Ｂおよび９Ｃ）の両方により容易に情報が得られる。プラスミドｐＥＴｐｅｌＢ（Ｆ１０５ｓＦｖ遺伝子を含む）をＢＬ２１（ＤＥ３）で形質転換し、適切な条件下、３７℃で培養した。Ｏ．Ｄ．₆₀₀が０．６に達した後、１ｍＭのＩＰＴＧで細胞を誘発した（コントロールはＩＰＴＧを含まない）。３７℃で２時間インキュベートした後、バクテリアを採取した。タンパク質を検出するために、全細胞溶解物を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離した。全細胞抽出物のクーマシーブルー染色では、ｒＦ１０５ｓＦｖタンパク質に対応する２８ｋＤに強いタンパク質のバンドの出現が見られる。ウェスタンブロットの場合は、ウサギ抗Ｖ_H４−ＦＲ１またはヤギ抗−ヒトＫ抗血清を第一抗体として使用し、次いでアルカリ性ホスファターゼを酵素として使用する免疫検出を行った（図９Ｃ）。図１０は、ｒＦ１０５ｓＦｖ抗体断片のアフィニティーカラムによる精製結果を示す。Ｆ１０５ｓＦｖカセットを含むｐＥＴｐｅｌＢベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）からのペリプラズム調製物をｇｐ１２０アフィニティーカラムに通した。結合したｒＦ１０５ｓＦｖをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離し、次いで、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。次いで、プールした画分を、ｇｐ１２０を被覆したプレート上でＥＬＩＳＡにより分析した。図１０に示すように、粗ペリプラズム画分をアフィニティーカラム精製するとｇｐ１２０結合活性が溶離されたが、溶出液（effluent）は結合活性に欠けていた。実施例４階層およびランダム結合一本鎖抗体のファージ抗体としての発現ｇｐ１２０に対して高い親和性を示すｓＦｖの同定は、患者の抗体反応の血清学的（ｇｐ１２０エピトープおよび抗体親和性）および分子的（使用する抗体遺伝子の選択、体細胞突然変異による多様性の発生）性質の理解を含む多くの理由、ｉｎｖｉｖｏでのそのような反応性の発生を研究するための重要な物質の提供および治療目的のために大いに望ましい。ｓＦｖ抗体断片を、遺伝子 IIIタンパク質との融合タンパク質として発現するのに適する繊維状ファージを作製するために、ファージ抗体を調製するために以前、McCaffertyら（上掲）により使用されたｆｄファージを使用する。ヒトｓＦｖ遺伝子は、McCaffertyらが使用して成功したｆｄ遺伝子 IIIの同じ位置に導入する。まず、一本鎖ファージＤＮＡの作製を、ｆｄ−ｔｅｔベクター（American Type Culture Collection）をＦ ’ｄｕｔ−ｕｎｇ大腸菌（例えば、ＣＪ２３６、ＲＺ１０３２）にトランスフェクションすることにより行う。ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異を使用して、１６１１および１６３１の位置にユニークなＫｐｎＩおよびＥａｇＩ部位を作る（図１３参照）。これらの変化は、遺伝子 IIIのコード配列に影響を及ぼさない。合成オリゴヌクレオチドをＫｐｎＩ／ＥａｇＩで消化したｆｅｄ−ｔｅｔＤＮＡでクローン化して、欠失したｐ IIIコード配列を再構成し、枠内のｓＦｖ遺伝子セグメントを挿入する。ｓＦｖ遺伝子のこれらのフランキングセグメントは、ｓＦｖ遺伝子内にＸｈｏＩおよびＰｖｕII部位を含み、完全なｓＦｖカセットのクローン化が可能である。その結果、（Ｎ末端からＣ末端へ）ｐ IIIタンパク質シグナル配列（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕシグナルペプチダーゼ切断部位を含む）、ｓＦｖおよび残りのｐ III配列を含むｐ III−ｓＦｖ融合タンパク質をコードするｆｄ−ｔｅｔｓＦｖベクターが得られる。ｇｐ１２０反応性ファージ抗体の特徴付けファージは、ｆｄ−ｔｅｔ−ｓＦｖベクターを大腸菌ＴＧ１へトランスフェクションすることにより作製し、次いで、テトラサイクリン選択を保持しながらこれらのバクテリア内で増殖する。コントロールファージはｆｄ−ｔｅｔプラスミドのトランスフェクションにより作製する。高力価ファージの上清をポリエチレングリコールで沈殿させ、最初の体積の約１／１００に再懸濁した後、残留バクテリアを除去し、遠心分離によりファージを集める。ｓＦｖファージおよびコントロールファージのｇｐ１２０結合力は、McCaffertyら（上掲）に記載されているように、濃縮ファージストックを使用してＥＬＩＳＡによりテストする。簡単に述べると、ｇｐ１２０を被覆したプレートを、２％のスキムミルク粉末を含むリン酸緩衝塩水中、約２×１０¹⁰ファージとともにインキュベートする。プレートを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、次いでＰＢＳで洗浄し、結合したファージをヤギ抗−Ｍ１３抗血清（Sigma）により検出する。牛血清アルブミンを被覆したプレートをコントロールとして使用し、認められる反応性がｇｐ１２０に特異的なものであるかどうか確かめる。Ｆ１０５ヒト抗−ｇｐ１２０ｓＦｖについて、このＦ１０５発現ファージの結合、溶離および濃縮のための条件を求める。典型的には、１回のアフィニティー精製で高親和性クローンが１０００倍に濃縮される。２回目（必要であれば３回目）のアフィニティー精製で得られる溶離液のファージをクローン化し、増殖して、そのＤＮＡをシークェンスする。同様の実験を、レパートリーライブラリーを使用して行う。実施例５を参照。一度に一人の患者を分析する。上述の方法を使用して、高親和性をもってｇｐ１２０と結合するクローンを選択する。各クローンは、ＤＮＡのシークェンシングを行って、余分なクローンでないことを確認する。選択される抗−ｇｐ１２０ｓＦｖをさらに機能分析するために、ｓＦｖカセットをｆｄ−ｔｅｔベクターから取り出し、ｐＥＴ発現ベクターでクローン化する。これらのベクターは、ＢＬ２１（ＤＥ３）バクテリアで個々に形質転換し、１０ｋＤカットオフを有するAmic on stir cellを使用して濃縮した後、これらの部分的に精製した抗体画分を、以下に記載する種々の活性について分析し、あるいは、ｇｐ１２０アフィニティーカラムによりさらに精製する。これらの抗ｇｐ１２０ｓＦｖ抗体によるウィルス中和を測定する。濃縮したペリプラズム画分または一夜培養した上清（適切な負のコントロールとともに）またはアフィニティーカラム精製したｓＦｖを０．４５＜ｍフィルターに通し、ウィルス中和に関して、特定目標（specific aim）１にあるように分析する。ｇｐ１２０に対するｓＦｖ抗体の親和性は、¹²⁵Ｉ−ｇｐ１２０によるラジオイムノアッセイを使用し、ｓＦｖ／ｇｐ１２０複合体を市販のウサギ抗−（ＩＣＬ）鎖間リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）抗血清により沈降させて測定する。さらに、エピトープマッピングを、回収されるｓＦｖ抗体に対して行う。上述したＰＮＤＥＬＩＳＡおよびＦ１０５競合試験を行って、ｇｐ１２０上の結合についてエピトープマッピングを行う。ｇｐ１２０上の立体配座決定因子を認識すると考えられる抗体については、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４結合の阻害能をさらに分析する。これらの研究において、組換え可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）は、American Biotechno logy，Inc．から入手し、ＥＬＩＳＡプレートの被覆に使用する。ＨＲＰで標識したｇｐ１２０は、これらのｓＦｖ抗体がＨＲＰ−ｇｐ１２０結合を阻害することができるかどうかを、プレート上のＨＲＰ反応性の低下を測定して求めるために使用する。実施例５末梢血白血球（ＰＢＬ）からの再配列ヒト免疫グロブリン遺伝子のレパートリークローニングＨＩＶ−１感染患者における抗ｇｐ１２０抗体の特徴付け抹消血白血球の再配列した免疫グロブリン遺伝子の階層（hierarchical）およびランダム結合ライブラリーを作製するために、健康なＨＩＶ感染患者が反映された。これらの患者の選択基準は、彼らの血清学的反応性（すなわち、中和活性、Ｆ１０５エピトープ阻害、Ｖ３ループ反応性）および全体的な臨床状態に基づく。健康なＨＩＶ感染患者の血清を、組換えｇｐ１２０ _MN（５〜１０μｇ／ｍｌ）または個々のＶ３ループペプチド（２〜５μｇ／ｍｌ）で被覆し、０．５％のＢＳＡでブロックしたＥＩＡプレート上でＥＬＩＳＡ法によりテストする。ＨＩＶの種々の株のＰＮＤＶ３ループ（３０７〜３１９の位置）に対応する１３個のアミノ酸のペプチドをAmerican Biotechnology，Inc.，Cambridge，Massach usettsから入手する。患者の血清を、IIIＢ、ＭＮ、ＳＦ２、ＲＦおよびＣＣなどのいくつかのＰＮＤに対してスクリーニングする。３７℃で２時間インキュベートして洗浄した後、プレートをＨＲＰ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧとともにインキュベートし、０．０３％のＨ₂Ｏ₂を含むアジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）を使用して発色させる。マルチスキャンプレート読み取り機（Dynatech）を使用して４１０ｎｍでの吸光度を読み取る。これらの研究により、Ｖ３ループ反応性およびｇｐ１２０に対する全抗体力価の両方が求められる。Ｆ１０５によって認識される、ｇｐ１２０上の広範囲に中和する立体配座決定因子と反応する抗体の存在を調べる［Posner，et al.，上掲；Thali，et al.，上掲］。これらの研究では、ＥＬＩＳＡプレートを、Ｆ１０５結合を可能にする最適濃度のｇｐ１２０_MNで被覆する。患者の血清の種々の希釈物について、そのビオチニル化したＦ１０５との競合をテストする。競合は、アビジン−ＨＲＰ反応性の低下によりその情報が得られる。競合がＦ１０５への直接の抗−ｉｄ反応性に劣らない（すなわち、Ｆ１０５結合を直接阻害する）ことを確かめるために、タンパク質Ａを被覆したＥＬＩＳＡプレートを患者の血清とともにインキュベートし、洗浄し、正常なヒト血清の添加によってブロックし、再び洗浄した後、正常なヒト血清と混合してあるビオチニル化したＦ１０５を添加する。検出されたどのアビジン−ＨＲＰ反応性もＦ１０５に対する抗−ｉｄ反応性に劣るものである。血清の種々の臨床検査用菌株に対する中和能力は、異なる二つの方法でテストすることができる。１．７日間アッセイでのＨＴ−Ｈ９細胞による逆転写酵素活性の生成を使用する方法；および２．ＭＴ−細胞中和アッセイによる方法［Posner，et al.，supra；Pawells，et al.，J．Viro．Methods，20：309（198 8）；Mosmann，et al.，J．Immunol．Methods，65：55（1983）］。簡単に述べると、逆転写酵素測定では、患者血清（またはコントロール血清）の種々の希釈物をＨＩＶ_IIIBまたはＭＮストックウィルスの５％ＴＣＩＤとともにインキュべートした後、ＨＴ−Ｈ９細胞を抗体とウィルスとの混合物とともにインキュベートする。次いで、感染細胞を単一栄養とともに７日間培養し、上清の逆転写酵素活性を評価する［Posner，et al.，上掲］。第二の中和アッセイは、ＭＴ−２細胞毒性アツセイ［Pawels，et al.，上掲；Mosmann，et al.，上掲］を少し変形したものである。患者血清の連続した希釈物をウェルの５０μｌの完全培地中に調製し、５０μｌの適切に希釈したウィルスストックを各ウェルに添加する。４ ℃で１時間後、４×１０⁴個のＭＴ−２細胞を有する培地１００μｌを添加する。プレートを５日間インキュベートした後、生存可能な細胞を、ホルマザン染料ＭＴＴの代謝変換を使用して比色定量的に測定する［Rossi，et al.，PANS，86:8055-8059（1990）］。２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）を各ウェルに添加する。４時間インキュベートした後、１００μｌの上清を取り出し、１３０μｌの１０％ＴＲＩＴＯＮＸ−１００／酸イソプロパノールを添加し、試料をピペットで取って析出物を溶解する。ウェルの吸光度を５４０ｎｍで測定し、バックグラウンドとしてのマイナス分は６９０ｎｍで測定する。阻害率（％）を、式：１−〔（ウィルスコントロール−実験値）／（ウィルスコントロール−培地コントロール）〕で計算する。ＭＴ−２法はＲＴ法よりも労力が少なく、より大がかりの実験に適切であり、これらのスクリーニング研究で使用される主要測定法である。レパートリークローニングに対しては、約１〜３×１０⁸個のリンパ球（約２５０ｍｌ）を得るために各患者の静脈切開を行う［Persson，et al.，PNAS，88: 2432-2436（1991）］。白血球画分を密度勾配分離（Ficoll-Hypaque；Pharmacia ）により、さらに精製する。この方法で処理した血液１ｍｌにおける１×１０⁶ 個のリンパ球は、その約１０％がＢ細胞であると予想される。ＲＮＡをグアニジニウムイソチオシアネート法［Chomczynski，et al．Analytical Biochemisty，162:156（1987）］により直ちに単離する。単離完了後、ＲＮＡを、２−メルカプトエタノールを含む５０％イソプロパノール／３Ｍグアニジニウムイソチオシアネートにより沈殿させ、逆転写に使用するまで−２０℃で保存する。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーの構築（図７）に関しては、全ＲＮＡ（２０〜５０＜ｇ）を６０ｐｍｏｌのＱ１、ＫまたはＧ遺伝子に添加する。反応混合物を２５〜３０回の増幅にかける。階層ライブラリーの生成に対しては、Ｊ_HおよびＪ_K（またはＣ_K）プライマーとともに、各々、Ｖ_H７１−４およびＨｕｍｖｋ３２５リーダー配列プライマーを使用する。プライマー配列に関しては実施例１を参照。最初の２０〜２５回の増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、縮退Ｖ_HおよびＶ_Kプライマーにより再増幅する。こうして、ファージ抗体ベクターでクローン化するための制限ｓＦｖライブラリーを作ることができる。ランダム結合ライブラリーに対しては、縮退Ｖ_HおよびＶ_Kプライマーを最初に使用する。実施例６再配列したＦ１０５Ｖ_H遺伝子の特徴付けＤＮＡ配列分析により、再配列したＦ１０５Ｖ_H遺伝子が、Lee，et al.，［Ie e，et al.，J．Mol．biol.，195:761-768（1987）］によって最近確認された生殖細胞系Ｖ_H遺伝子の全ての同定因子との類似性が８８％以上であることにより決定されたＶ^HＩＶ遺伝子ファミリーの一つから誘導されることが示された（データは示さない）。この新しく発見されたＶ_H遺伝子ファミリーは約１０個の構成要素を有する。Ｆ１０５Ｖ_Hは、生殖細胞系遺伝子Ｖ_H７１−４との配列類似性が最も大きい（９４．８％、２８５／２９７ヌクレオチド）（表２）。７１−４と比較すると、Ｆ１０５には全部で１２個のヌクレオチドの置換があり、これらの置換を表２にまとめる。９個の置換は枠組み構造残基にあり、これらは、３個の全枠組み領域に分布する３個の全枠組み残基に分布する。これらの置換は、４個のトランジションおよび５個のトランスバージョンを含む。残り３個の置換は全てトランジションであり、ＣＤＲＩ（１個）およびＣＤＲ２（２個）領域に生じる。表２は、Ｆ１０５Ｖ_Hのヌクレオチド配列と、再配列していない３個の別のＶ_HＩＶ生殖細胞系遺伝子（Ｖ_H４．１１、４．１５および４．１６）との比較も行う。後者は、健康なコーカサス成人のドナーから得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定した。これら３個の生殖細胞系遺伝子は、Ｖ_H７１−４と最も密接に関連している［Sanz，et al.，EMBO J.，8:3741-374 8（1989）］。明らかなように、これら３個の全生殖細胞系遺伝子およびＦ１０５は、Ｇ→Ａヌクレオチドを共有し、ポジション２９のＶａｌ→Ｉｌｅのアミノ酸置換は、この置換が対立遺伝子多型性を表す可能性があることを支持する。しかし、Ｆ１０５は、これらの遺伝子（１個：４．１１；または２個：４．１５および４．１６）と比較してヌクレオチドの置換が多く［Goudsmit，et al.，PNAS ，supra］、さらに別の体細胞突然変異が組換え技術後のＦ１０５に生じる可能性があることを示唆するものである。アミノ酸レベルでみると、Ｆ１０５Ｖ_Hの４個のヌクレオチド置換は、３個の枠組み領域の各々に等しく分布する（ポジション２６：ＦＲ１；４９：ＦＲ２；９４：ＦＲ３）無変化変異およびＣＤＲ２（ポジション５２）の１個の無変化変異になる。残りの８個のヌクレオチド置換はアミノ酸の変化となり、その変化はＣＤＲよりも３個の枠組み領域において頻繁に生じる（表３）。２個の非保存置換はＦＲ２領域に生じ（ポジション４０：Ｐｒｏ→Ｓｅｒ；４６：Ｇｌｕ→Ｇｌｎ）、３個の保存置換はＦＲ３領域に生じる（ポジション７２：Ａｓｐ→Ｇｌｕ；８２Ａ：Ｓｅｒ→Ｔｈｒ；８２Ｃ：Ｖａｌ→Ｍｅｔ）。保存置換Ｖａｌ→Ｉｌｅを与えるポジション２９の１個のＦＲＩ領域枠組み残基は、Kabat，et al.，［Kabat，et al.，上掲］により定義されたＣＤＲのすぐ隣に位置する。この領域は、抗体結合部位の位置関係にも寄与すると考えられる［Clothia，et al.，J ．Mol．Biol.，196:901-907（1987）］。７個の生殖細胞系Ｖ_HＩＶ遺伝子のうちの４個（全て、Ｇ→Ａヌクレオチド置換）にあるポジション２９のＩｌｅの存在は、ＩＩｅが対立遺伝子の相違を表し、体細胞突然変異ではないことを示唆する［Lee，et al.，上掲；Sanz，et al.，上掲］。ＣＤＲ領域では、ＣＤＲ１のポジション３２におけるＴｒｙ→Ｈｉｓの非保存置換およびＣＤ２のポジション６０におけるＡｓｎ→Ａｅｒの半保存変化とともに２個の置換が生じる。全体的に、置換と無変化変異との比は２：１である。置換変異はＦＲ／ＣＤＲにおいて３：１の比で生じる。Ｆ１０５Ｖ_Hと他のＶ_H７１−４由来の再配列したＶ_H遺伝子との比較分析表４のパネルＡは、Ｆ１０５Ｖ_Hのヌクレオチド配列を２個のモノクローナル抗体と比較したものである。後者は、ヌクレオチド配列分析により、再配列したＶ_H７１−４遺伝子を使用していることが明らかである。一方のＩｇＭモノクローナル抗体（Ａｂ２６）は健康なドナーのＣＤ５⁺Ｂ細胞由来のものであり、多くの抗原に結合する自然のポリ反応性抗体の代表である［Sanz，et al.，J．Imm unol.，142:4054-4061（1989）］。Ａｂ２６は、次に最も関連した生殖細胞遺伝子Ｖ_H７１−２（８９．５％）と比較してＶ_H７１−４（９２．３％）との類似性が最も大きい配列を有する。また、表３に示すように、抗体２６８−Ｄは、ＨＩＶ−１菌株ＭＮのｇｐ１２０の主要中和ドメインに対して特異的で、Ｖ_H７１− ４と８８．５％が同一であるＩｇＧ_IｍＡｂである［Andris，et al.，PNAS，88:7783-7787（1991）］。表４に見られるように、これらのＶ_H７１−４に関連するＨ鎖は３個とも全て、広範囲にわたる体細胞突然変異を受け、Ｆ１０５のヌクレオチド置換数が最も少ない。モノクローナル抗体Ａｂ２６および２６８−Ｄの場合は、各々１９個および４２個のヌクレオチドの置換がある。これらの例では全て、ヌクレオチドの置換がＣＤＲおよびＦＲ領域の両方に分散している。３個の抗体はどれも、Ｆ１０５と同様に２９番目のアミノ酸においてＧ→Ａのヌクレオチド置換がある。表４の後半のパネルでは、これら３個のモノクローナル抗体の対応するアミノ酸の変化を示す。抗体Ａｂ２６および２６８−Ｄの場合は、各々、１１および２３個のアミノ酸変化があり、一方、Ｆ１０５は８個の変化がある。３個の抗体に共通な唯一の変化は、２９番目のＶａｌ→Ｉｌｅである。ＣＤＲ IIIをコードするＦ１０５Ｄ_H遺伝子の分析Ｖ_H−Ｄ_H−Ｊ_H構造のＤ_H部分は、Ｈ鎖の相補性決定部位（ＣＤＲ）IIIに対応する［Schilling，et al.，Nature，283:35-40（1980）］。２０を超えるヒト生殖細胞系遺伝子が同定されており、Ｄ_H遺伝子の全数は約３０であると推定されている［Ichihara，et al.，EMBO J.，7:4141-4150（1988）］。表５（パネルＡ）に示すように、Ｆ１０５Ｄ_H部位は、Ｄ−Ｄ融合物質から成ると考えられる［M eek，et al.，J．Exp．Med.，170:39-57（1989）；Eilat，et al.，supra；Yama da，et al.，J．Exp．Med.，173:395-407（1991）；Sanz，et al.，J．Immunol. ，上掲］。Ｆ１０５Ｄ_H遺伝子の中心にある７個のヌクレオチド配列は、生殖細胞系Ｄ_H遺伝子ｄｌｒ４と同一である。この同一領域は、その５’端のすぐ隣にｄｌｒ４と同一のヌクレオチドがさらに２個ある。Ｆ１０５Ｄ_Hにあるさらに５ ’側のヌクレオチドはＧおよびＣが多いが、これらは、その酵素のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）に都合がよいヌクレオチドであるため、ランダムな「Ｎセグメント」ヌクレオチド付加を表していると考えられる［Kipps，et al.，J．Clin．Invest.，87：2087-2096（1991）］。Ｆ１０５Ｄ_H領域の３’端を調べると、１１／１３のヌクレオチドがｄａ４／ｄａｌ生殖細胞系遺伝子と同一であることがわかる。このヌクレオチド配列の３’ 端はＪ_H領域の５’端に伸びていると考えられるが、その明確な境界を正確に定義するのは、これがｄａ４／ｄａｌ生殖細胞系Ｄ_H遺伝子と同一であるため、困難である。これらのＤ_H遺伝子は両方とも転写方向が同じであるので、再配列は恐らく、逆位よりも欠失により生じると考えられる［Meek，et al.，上掲］。Ｆ１０５Ｄ_H遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を有する他の再配列したヒトＨ鎖遺伝子に関する遺伝子銀行調査では、２個の再配列遺伝子（Ｌ１７およびＬ３７）が示された。これらは、Ｆ１０５と比較して比較的短いＤ_Hセグメント（約２４ヌクレオチド）を有するが、それらの５’端付近には、Ｆ１０５Ｄ_H 遺伝子の３’端にある１２個のヌクレオチド（表４、パネルＢ）と同一の１２個のヌクレオチド「核」を含む［Alt，et al.，PNAS，79:4118-4122（1982）］。１個の読み取り枠の好ましい使用は、抗−ＤＮＡ抗体［Dersimonian，et al.，J ，Immunol.，142:4027-4033（1989）］およびある生殖細胞系Ｄ_H遺伝子［Yamada ，et al.，上掲］によって説明されているが、上記知見は、３個のコード枠が全てヒトにおいて等しく使用されると考えられるということを示す他の研究［Ichihara，et al.，上掲；Yamada，et al.，上掲］と一致する。Ｆ１０５Ｊ_H領域遺伝子の分析Ｆ１０５Ｊ_H領域と６個のヒトＪ_H生殖細胞系遺伝子とを比較すると、Ｊ_H5との配列類似性が最も大きいことがわかる（表６）。Ｆ１０５Ｊ_H領域は、Ｊ_H5 と６個のヌクレオチドが異なる。これらの相違のうち５個は、Ｊ_H遺伝子の５’ 端でかたまっている。これら５個の相違により４個のアミノ酸が変化する。非保存変化がポジション１００Ｅ：Ａｓｎ→Ｔｙｒ；１００Ｆ：Ｔｒｐ→Ａｒｇ；１０１：Ｐｈｅ→Ｌｅｕ；および１０３：Ｓｅｒ→Ｐｒｏで生じる。６番目のヌクレオチドの置換は、ＣＤＲ３の外側に位置するアミノ酸ポジション１０６にあり、無変化置換である。Ｊ_H5のポジション１００Ｅに対応するアミノ酸は、Ｆ１０５Ｊ_Hでは欠失させることができる。ＣＤＲ２イディオタイプＨＶ２ａにおけるＦ１０５Ｈ鎖の持ち分 Silverman，et al.，［Silverman，et al.，Eur．J．Immunol.，上掲］は、ヒトＶ_HIVＨ鎖の第一枠組み（ＦＲ１）および第二ＣＤＲ領域（ＣＤＲ２）の共通ペプチドに対するペプチド抗血清を使用して、寒冷凝集素およびリウマトイド因子抗体のＨ鎖のクラス指定を行った［Silverman，et al.，Eur．J．Immunol.，s upra；Silverman，et al.，Arthritis Rheum．上掲］。これらの抗体に対するＣＤＲ２共通ペプチドＨＶ２ａは、３個の異なるＶ_HIV生殖細胞系遺伝子（Ｖ７１ −２、Ｖ７１−４およびＶ７９）を区別できなかった［Silverman，et al.，Eur ．J．Immunol.，上掲］。その結果は、寒冷凝集素およびリウマトイド因子サブグループのＨ鎖はともにＦＲ１抗体と反応するが、寒冷凝集素抗体のみは抗−Ｖ_H ４−ＨＶ２ａ抗血清と反応することを示した。Ｆ１０５によるウェスタンブロット実験では、明らかなように、抗−Ｖ_H４−ＦＲ１抗血清はＦ１０５と反応するが、抗−Ｖ_H３−ＦＲ１抗血清はＦ１０５と反応しない。また、Ｆ１０５は抗 −Ｖ_H４−ＨＶ２ａと反応し、この結合は、抗−Ｖ_H４−ＨＶ２ａとＶ_H４−ＨＶ２ａペプチドとの予備インキュベーションによりかなり阻害されるが、密接に関連するＶ_H４−２ｃペプチドでは阻害されない。この結果は、Ｆ１０５Ｖ_Hの構造が、リウマトイド因子のＨ鎖よりも寒冷凝集素のＨ鎖により密接に関連することを示す。Ｆ１０５Ｌ鎖Ｖ_K遺伝子の生殖細胞系Ｈｕｍｖｋ３２５からの誘導ＤＮＡ配列分析により、再配列したＦ１０５Ｖ_K遺伝子はＶ_KIIIサブグループ遺伝子ファミリーの一つに由来することがわかった［Kabat，et al.，上掲］。Ｖ_KIIIサブグループはさらにサブ−サブグループに分けることができ、その一つがＶ_KIII ｂサブ−サブグループである。Ｆ１０５は、Ｖ_KIII ｂ生殖細胞系遺伝子Ｈｕｍｖｋ３２５との配列類似性が最も大きい（９７．７％；３４３／３５１ヌクレオチド）（表７、パネルＡ）。Ｈｕｍｖｋ３２５と比較して、Ｆ１０５Ｖ_Kには全部で８個のヌクレオチド置換があり、これらの置換を表３にまとめる。このうち、ともにトランスバージョン変異である２個の置換は、枠組み領域ＦＲ１およびＦＲ３に位置する。他の６個の置換は４個のトランジション変異および２個のトランスバージョン変異を含み、ＣＤＲ１［Gallo，et al．，上掲］およびＣＤＲ３［Patterson，et al.，J．Gen．Virol.，68:1177-1181（1987）］に位置する。アミノ酸レベルでは、１個のヌクレオチド置換のみが無変化変異である。残りの７個のヌクレオチド置換のうち、２個は枠組み領域に生じ、５個はＣＤＲ領域に生じる（表３および７、パネルＢ）。２個の枠組みでの置換は、ＦＲ１での非保存置換（ポジション１５：Ｐｒｏ→Ａｌａ）およびＦＲ３での保存置換（ポジション７８：Ｌｅｕ→Ｖａｌ）を含む。ＣＤＲ領域では、一つの変化として、ＣＤＲ１のポジション３１にＳｅｒ→Ａｒｇの非保存置換が生じる。ＣＤＲ３では３個の非保存アミノ酸置換があり、各々、ポジション９４、９５Ａおよび９５ＢのＧｌｙ→Ａｓｐ、Ｓｅｒ→ＡｓｎおよびＰｒｏ→Ｖａｌである。最後のアミノ酸置換は、１：２のＦＲ／ＣＤＲ比で生じる２個の点変異の結果である。これは、Ｆ１０５Ｖ_H配列に対して見られる置換パターンとはかなり対照的である（表３）。Ｆ１０５Ｊ_K領域遺伝子の分析Ｆ１０５Ｊ_K領域は、生殖細胞系Ｊ_K2遺伝子と最も類似している（表７、パネルＡ）。コドンポジション９６は、Ｖ_KおよびＪ_Kの組換えにより生成し、Ｔｙｒ→Ｃｙｓの非保存置換となる２個のヌクレオチド置換を有する。また、無変化Ｔ→Ａヌクレオチド置換はポジション１０８で生じ、そうでなければ、Ｆ１０５Ｊ_K遺伝子はＪ_K生殖細胞系配置となる。Ｆ１０５の再配列したＫ鎖と他の再配列したＨｕｍｖｋ３２５関連Ｋ鎖との比較分析リウマトイド因子抗体は、典型的にはＩｇＭｋ抗体であり、ＩｇＧ抗体に対して特異的である。多くのＩｇＭｋリウマトイド因子は、生殖細胞系の突然変異のない配置のＨｕｍｖｋ３２５遺伝子を使用し［Goni，et al.，J．Immunol.，135 :4073-4079（1985）；Silverman，et al.，J．Clin．Invest.，82:469-475（198 8）］、いくつかは、Ｆ１０５のような未突然変異形のＪ^K2遺伝子を使用する［G oni，et al.，上掲］。表７（パネルＢ）では、再配列したＦ１０５Ｋ鎖と、密接に関連するＩｇＭｋリウマトイド因子ｎｅｕのｋ鎖とのアミノ酸およびヌクレオチド配列を比較している。明らかなように、ｎｅｕはＦ１０５と類似しており、２個の同一の点変異（ポジション３１のＳｅｒ→Ａｒｇおよびポジション９６のＴｙｒ→Ｃｙｓ）を有する。後者の置換は異常なＶ／Ｊ結合の結果生じたものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１月１８日【補正内容】２６．ＨＩＶｇｐ１２０エピトープに対する親和性を有する抗体の存在を検出する方法であって、ヒト由来の生物学的流体を前記抗体をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡの存在に関して、（ａ）ｍＲＮＡまたはＤＮＡをＰＣＲ増幅にかけ、および（ｂ）増幅産物を反応物から単離することによりテストすることを含む前記方法。２７．生物学的流体が血液であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。２８．５’ＰＣＲプライマーが、配列表中に記載のＳＥＱＩＤＮＯ：１１〜１４および１７〜２４から成る群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。２９．３’プライマーがＦ１０５Ｈ鎖および／またはＬ鎖ＣＤＲ３に相補的であり、５’プライマーがＨ鎖および／またはＬ鎖ＣＤＲ１に相補的であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。３０．請求項２６に記載の増幅産物を発現し、得られた抗体を単離することを含む、高められたＨＩＶｇｐ１２０エピトープ結合活性またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２もしくはＳＩＶのｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおける高められた中和能を有する抗体の選択方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/10 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者マラスコ，ウエイン・エイアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02181、ウエルズリー、ライス・ストリート・43 (72)発明者ソドロウスキ，シヨーゼフ・ジーアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02155、メドフオード、アシユフオード・プレイス・10 (72)発明者ポスナー，マーシヤル・アールアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02026、デダム、コート・ストリート・19 (72)発明者ヘイゼルチン，ウイリアム・エイアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02138、ケンブリツジ、フオーレン・ストリート・８

Claims

【特許請求の範囲】１．配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：３によって定義されるヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡセグメント。２．ＳＥＱＩＤＮＯ：１もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：３のＤＮＡ配列あるいは、ＨＩＶｇｐ１２０エピトープに対する親和性またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２もしくはＳＩＶのｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおける中和能を有する抗体の発現が得られるのに十分な前記ＤＮＡ配列の断片に作動可能なように結合されたプロモータを含んで成るＤＮＡ配列。３．得られる抗体がＨ鎖可変領域断片であることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列。４．得られる抗体がＬ鎖可変領域断片であることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列。５．得られる抗体がＦａｂ断片であることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列。６．得られる抗体が一本鎖Ａｂであることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列。７．ＨＩＶｇｐ１２０エピトープに対する結合親和性またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２もしくはＳＩＶのｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおける中和能を有する組換えモノクローナル抗体。８．ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド配列によってコードされるＨ鎖可変領域を有することを特徴とする請求項７に記載の組換えモノクローナル抗体。９．ＳＥＱＩＤＮＯ：２のヌクレオチド配列によってコードされるＬ鎖可変領域を有することを特徴とする請求項７に記載の組換えモノクローナル抗体。１０．ＳＥＱＩＤＮＯ：２もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：４の少なくとも一方のアミノ酸配列あるいは、結合親和性または中和能を有するのに十分な前記アミノ酸配列の断片を有することを特徴とする請求項７に記載の組換えモノクローナル抗体。１１．抗体がｒＦ１０５であることを特徴とする請求項７に記載の組換えＡｂ。１２．ｒＦ１０５がｒＦ１０５Ｆａｂであることを特徴とする請求項１１に記載の組換えＡｂ。１３．ｒＦ１０５がｒＦ１０５一本鎖Ｆｖであることを特徴とする請求項１１に記載の組換えＡｂ。１４．ＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：３に結合するｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列のスクリーニング方法。１５．高められたＨＩＶｇｐ１２０エピトープ結合活性またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２もしくはＳＩＶのｉｎｉｔｒｏアッセイにおける高められた中和能を有する抗体の選択方法であって、請求項１４に記載の方法を使用して、発現ベクター内に前記選択配列をクローニングするｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列を選択し、その配列を発現させ、得られた抗体を単離し、得られた抗体を、ＨＩＶｇｐ１２０結合親和性または中和能を有する標準Ａｂと比較することを含む前記方法。１６．標準抗体がｒＦ１０５であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１７．ファージ抗体選択法を用いて、得られた抗体を単離することを特徴とする請求項１５に記載の方法。１８．さらに、抗体をコードするＤＮＡ配列を突然変異誘発することを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。１９．突然変異誘発を、Ｈ鎖可変部遺伝子のＣＤＲ１、２または３領域に対して特異的に行うことを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．突然変異誘発を、Ｌ鎖可変部遺伝子のＣＤＲ１、２または３領域に対して特異的に行うことを特徴とする請求項１８に記載の方法。２１．請求項１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載の方法により製造された抗体。２２．細胞毒性部分および請求項７に記載の組換え抗体を含むイムノトキシン。２３．細胞毒性部分がバクテリア、植物または真菌起源の酵素的に活性な毒素であることを特徴とする請求項１８に記載のイムノトキシン。２４．治療上有効な量の請求項７に記載の抗体を含む医薬組成物。２５．治療上有効な量の範囲が１ｍｇ〜１０ｍｇの抗体であることを特徴とする請求項２４に記載の医薬組成物。２６．その抗体をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡの存在を、（ａ）ｍＲＮＡまたはＤＮＡをＰＣＲ増幅にかけ；および（ｂ）増幅産物を反応物から単離することにより２７．生物学的流体が血液であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。２８．５’ＰＣＲプライマーが、配列表中に記載のＳＥＱＩＤＮＯ：１１〜１４および１７〜２４から成る群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。２９．３’プライマーがＦ１０５Ｈ鎖および／またはＬ鎖ＣＤＲ３に相補的であり、５’プライマーがＨ鎖および／またはＬ鎖ＣＤＲ１に相補的であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。３０．請求項２６に記載の増幅産物を発現し、得られた抗体を単離することを含む、高められたＨＩＶｇｐ１２０エピトープ結合活性またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２もしくはＳＩＶのｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおける高められた中和能を有する抗体の選択方法。