KR100266554B1 - 재조합항-hiv항체및그의제조방법 - Google Patents
재조합항-hiv항체및그의제조방법Info
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Abstract
본 발명은 인체 면역결핍 바이러스 (HIV)에 대하여 중화활성을 가지는 항체의 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편 및 그의 제조방법에 관한 것이다. HIV 에 대하여 중화활성을 가지는 쥐 - 인체 혼성 항체 및 쥐 - 인체 재성형 항체는, HIV 에 대하여 중화활성을 가지는 항체의 H 체인 및 L 체인 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편의 특이적 뉴클레오티드 배열을 수득한 후, 이 뉴클레오티드 배열에 기초하여 합성된 DNA를 인체 이뮤노글로뷸린을 암호화하고 있는 유전자와 인위적으로 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 신규 재조합 항 - HIV 항체는 AIDS의 치료및 예방에 유용하다.
Description
후천성 면역결핍증 (AIDS) 은 레트로바이러스 (retrovirus) 에 속하는 인체 면역결핍 바이러스 (HIV)에 기인하는 바이러스성 질병이다. 이 질병은 1981년에 미합중국에서 발견된 이래 빠른 속도로 전세계에 퍼져왔으나 상기 질병의 효과적인 백신 또는 치료법은 아직 정립되지 않았다.
이러한 상황에서, 수혈로 인하여 HIV 양성을 나타내는 탈라세미아 (thalassemic) 환자들의 군 및 AIDS 또는 ARC (AIDS 관련 증후군) 에 감염된 어린이들의 군의 중화 항체와 임상과의 관계에 대한 보고가 나왔다 [R. 구로프(Guroff) 일행, J. Imm Munol., 138, p3731, (1987) ; R. 구로프 일행, Pediatric Research, inpress]. 두 보고서 모두 중화 항체가 검출되는 경우에는 임상증상이 가볍고 양성인 반면에 중화항체가 검출되지 않는 경우에는 임상증상이 악성이 되는 것으로 언급하고 있다. 이러한 사실은 중화항체의 생체내 효과를 암시한다. 따라서, 항 - HIV 중화항체는 감염의 확대 방지 또는 감염된 세포의 축출에 사용될 수 있을 것으로 기대되며 현재 임상적으로 널리 사용되고 있는 항 - 바이러스제 등과 조합되어 사용될 경우 더욱 향상된 효과를 보일 것으로 기대된다.
상기 언급된 항 - HIV 중화 항체를 AIDS 환자로부터 직접 수득 또는 제조하는 것이 가능하다 할지라도, 이러한 방법은 윤리적인 문제, 원료의 입수 또는 생물재해 문제와 같은 많은 수의 어려움을 가지고 있을 것이다. 이러한 견지에서, 상기 고역가 혈청의 대안으로 HIV 바이러스에 대하여 중화 활성을 가지는 단일클론(monoclonal) 항체를 고려하게 되었다. 단일클론 항체의 제조를 위한 기초 기술이 쥐 - 유형 단일클론 항체에서 이미 정립되었다고 할지라도, 쥐의 항체는 부작용 (쥐의 단일클론 항체는 인체에 투여되었을때, 이종 단백질에 대한 과민성 쇼크 또는 혈청병등과 같은 부작용을 일으키는 것으로 생각된다) 이라는 견지에서 임상적 적용이 어렵기 때문에 궁극적으로는 인체 단일클론 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
그러나, 인체 단일클론 항체는 원하는 특이성을 가지는 항체의 제조를 위하여 극복해야할만은 문제점들을 야기시키며, 쥐 - 유형의 단일클론 항체의 제조에 비해 매우 어렵다.
이러한 문제들을 극복하기 위하여, 유전자 재조합 기술을 이용한 혼성 단일클론 항체의 제조방법이 최근에 보고되었는데, 여기에서는 항체의 특이성을 결정짓는 가변영역이 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열 (sequence) 을 가지며, 불변영역(constant region) 은 인체의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 가진다.
이러한 혼성 단일클론 항체는, V 영역의 재료로서 쥐의 단일클론 항체를 생산하는 쥐 히브리도마 (hybridoma)로 부터 클론된 (cloned) 가변 (V) 유전자를, 및 C 영역의 재료로서 인체 항체 - 생산 세포와 같은 인체세포로부터 클론된 불변 (C) 유전자를 함유하는 쥐 (V) - 인체 (C) 혼성 항체 유전자를 동물세포 또는 미생물세포 등에서 발현시킴으로써 수득되며, 원하는 혼성 단일클론 항체는 배지 상층액에 존재한다. 혼성 항체에 관해서는 수차례의 보고 [일본국 특허 공개 제 60 - 155132호, 일본국 특허 공개 제 61 - 47500 호] 가 있었으며, 본 발명자들은 이미 성공적으로 혼성 항체를 제조한 바 있다 [일본국 특허 공개 제 2 - 2352 호]. 더욱이, 이러한 혼성 항체의 개념에 더하여, 재성형 항체의 제조가 또한 보고되었다[일본국 특허 공개 제 62 - 296890 호].
이뮤노글로뷸린 유전자의 분석은 오늘날의 유전자 조작 기술의 빠른 발달과 더불어 빠른 진척을 이루었다. 이뮤노글로뷸린 유전자가 항원과의 결합에 관련된 가변영역 (V 영역) 유전자 및 보체(complement) 또는 특정 세포 등과의 상호작용에 관련된 생리학적 활성을 가지는 불변 영역 (C 영역) 유전자로 이루어 졌다는 것은 공지의 사실이다. V 영역 유전자는 많은 수의 V 유전자 단편들의 군, D 유전자 단편들 (L 체인에서는 발견되지 않는다)의 군 및 J 유전자 단편들의 군에서 선택되는 각각의 유전자로부터 형성되며, 각각의 선택된 유전자는 상기의 순서대로 결합한다. 더욱이, 결합된 유전자 단편(V 영역 유전자) 은 체세포 돌연변이에 의하여미소하게 변성됨으로써 더 변형되게 된다. 다시말하면, 항체의 특이성은 H 체인 및 L 체인의 V 영역 유전자 내의 각각의 유전자 단편의 조합 및 체세포 돌연변이에 의하여 결정된다 [참조, 수수무 토네가와[(Susumu Tonegawa), Nature, 307, p575 (1983) ; 타수꾸 혼조 (Tasuku Honjo), Annual Rev. Imm Munol. 1, p499 (1983)]. 따라서, 특정 항원에 대하여, H 체인의 특이 VDJ유전자 단편과 L 체인의 특이 VJ 유전자 단편 및 특이 체세포 돌연변이 모두가 있다고 생각된다. 더하여, 이러한 유전자 단편의 조합, 또는 그것의 뉴클레오티드 (nucleotide) 또는 아미노산 배열을 항원의 구조, 뉴클레오티드 또는 아미노산 배열 등으로부터 추론하기는 대단히 어려우며, 실제로 항체를 생산하는 세포로부터 항체유전자 또는 항체 단백질을 분리함으로써만 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, 항체 분자의 가변영역은 모든 항원 결정인자에 따라 변화하는 아미노산 배열을 가지게 되는데, 가변영역은 모든 항원에 따라 완전히 변화하는 아미노산 배열을 가진다.
본 발명이 목표로하는 재조합 항 - HIV 항체에 있어서, 본 발명자들은 이미 항 - HIV 중화항체로서의 0.5 β 재조합 항체 [일본국 특허 공개 제 2 - 2352 호]를 발표하였으나, 상기 재조합 항체는 HTLV - IIIB를 특이적으로 중화시킬수 있지만 널리 퍼져 있는 HTLV-IIIMN은 중화시킬 수 없다. 상기 언급된 것과 같이, 재조합 항체의 제조에 있어서, 원하는 항원에 결합특성을 가지는 항체분자 가변영역의 아미노산 배열을 암호화하고 있는 유전자릍 찾아내는 것이 매우 중요하다. 본 발명이 목표로하는 HIV, 특히 HTLV-IIIMN에 대하여 중화활성을 가지는 항체의 가변영역 아미노산 배열을 암호화하고 있는 유전자를 찾아내기가 어렵기 때문에, HTLV-III MN에 결합하여 실질적으로 중화시키는 재조합 항체를 수득하였다는 보고는 없다.
[발명의 목적]
이러한 상황하에서, 본발명자들은 HTV(HTLV-III MN) 에 대하여 중화활성을 가지는 단일클론 항체의 가변영역을 부호화하고 있는 유전자를, 상기 항체를 생산하는 세포 (히브로도마) 로부터 성공적으로 분리하였다. 본 발명자들은 더 나아가서, 상기 유전자를 사용한 쥐 - 인체 재조합 항체의 발현을 시도하였으며, 그 결과로서, HIV(HTLV - III MN) 에 대하여 중화활성을 가지는 재조합 항체를 성공적으르 제조함으로써 본 발명을 완성하였다. 다시말하면, 본 발명은 지금까지 전혀 보고되지 않은 항 - HIV중화항체의 가변영역을 암호화하고 있는 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 사용하여 형질전환된 세포에서 발현되는 재조합 항 - HIV 항체를 제공한다. 본 발명의 목적은 상기의 신규 항 - HIV 재조합 항체를 함유하며, 부작용이 감소된 AIDS 의 진단, 치료 및 예방제의 개발을 가눙하게 하는 것이다.
본 발명은 인체 면역결핍 바이러스(HIV)에 기인하는 AIDS 의 치료 및 예방에 사용될 수 있을 것으로 기대되는 신규 재조합 항 - HIV 항체에 관한 것이다. 상세하게 말하자면, 본 발명은 쥐 이뮤노글로뷸린 유전자 및 인체 이뮤노글로블린 유전자로부터의 유전자 재조합 기술을 사용하여 발현되며 HIV에 대하여 중화활성을 가지는 재조합 항 - HIV 항체 [재성형 (reshaped) 항체 및 혼성 (chimeric) 항체], 및 그의 제조를 위한 신규 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기의 유용한 재조합 항체의 발현에 효과적으로 사용될 수 있는 H 체인(chain) 및 L 체인의 가변영역 (variable region) 을 암호화 (coding) 하고 있는 DNA단편에 관한 것이다.
제 1 도는 실시예 (3) 에 나타낸 항 - HIV 중화항체 μ 39.l 의 H 체인 가변영역을 암호화하고 있는 본 발명 DNA단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론되는 아미노산 배열을 보여준다.
제 2 도는 실시예 (3) 에 나타낸 항 - HIV 중화항체 μ 39.1 의 L 체인 가변영역을 암호화하고 있는 본발명 DNA단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론되는 아미노산 배열을 보여준다.
제 3 도는 실시예(3)에 나타낸 항 - HIV중화항체 μ5.5의 H 체인 가변영역을 부보화하고 있는 본 발명 DNA 단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론되는 아미노산 배열을 보여준다.
제 4 도는 실시예(3)에 나타낸 항 - HIV중화항체 μ5.5의 L 체인 가변영역을 부보화하고 있는 본 발명 DNA 단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론되는 아미노산 배열을 보여준다.
제5도는 실시예(4)에서 제조된 항 - HIV 혼성 항체 H 체인 발현 플라스미드 (plasmid) CHμ 39.1 및 CHμ 5.5 의 구조를 보여준다.
제 6 도는 실시예(4)에서 제조된 항 - HIV 혼성 항체 L 체인의 발현 플라스미드 CLμ 39.1 및 CLμ 5.5 의 구조를 보여준다.
제 7 도는 실시예(5)에서 측정된 항 - HIV혼성 항체 μ39.1의 항 - HIV활성 및 실시예(7)에서 측정된 항 - HIV재성형 항체 μ39.1의 항 - HIV 활성을 보여준다.
제 8 도는 실시예(5)에서 측정된 항 - HIV혼성 항체 μ5.5의 항 HIV 활성 및 실시예(7)에서 측정된 항 - HIV 재성형 항체 μ 5.5의 항 - HIV 활성을 보여준다.
제 9 도는 실시예(6)에서 제조된 항 - HIV재성형 항체 μ39.1의 H 체인 가변영역을 암호화하고 있는 DNA단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론되는 아미노산 배열을 보여준다(밑줄친 배열은 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 나타낸다).
제 10 도는 실시예 (6) 에서 제조된 항 - HIV 재성형 항체 μ39.1의 L 체인 가변영역을 암호화하고 있는 DNA 단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론되는 아미노산배열을 보여준다(밑줄친 배열은 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 나타낸다).
제 11 도는 실시예(6)에서 제조된 항 - HIV 재성형 항체 μ5.5의 H 체인 가변영역을 암호화하고 있는 DNA단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론되는 아미노산 배열을 보여준다(밑줄친 배열은 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 나타낸다).
제 12 도는 실시예(6)에서 제조된 항 - HIV재성형 항체 μ5.5의 L 체인 가변영역을 암호화하고 있는 DNA단편의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추른되는 아미노산 배열을 보여준다(밑즐친 배열은 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 나타낸다).
[발명의 개시]
본 발명에 사용되는 항 - HIV(HTLV-III MN)쥐의 단일클론 항체 생산 세포는 쥐의 단일클론 항체 제조에 대하여 지금까지 정립된 기술에 의하여 제조된다. 예를들면, 적당한 면역원, 예컨대 HIV(HTLV-III MN)생산 세포로부터 수득되는 바이러스 입자, 또는 정제된 엔벨로프 (envelope) 글리코프로테인 gp 120, 또는 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조된 재조합 펩티드, 바람직하게는 gp 120 아미노산 배열 제 247-370 번에 해당하는 재조합 펩티드, 또는 상기 바이러스 단백질의 아미노산 배열에 기초하여 제조된 적당한 합성 펩티드, 바람직하게는 gp 120 아미노산 배열 제 303-325 번에 해당하는 합성 펩티드 등으로 쥐를 면역시키고, 비장세포를 수득하여 쥐의 골수종 세포와 융합시키고, 수득되는 히브리도마들로부터 정제 엔벨로프 글리코프로테인 gp 120 또는 상기 재조합 펩티드 또는 상기 합성 펩티드와 반응하는 세포를 선택한 후, 상기 세포를 배양합으로써 제조될 수 있다. 나아가서, 이렇게 수득된 항 - HIV쥐의 단일클론 항체 생산 세포로부터 HIV 에 대하여 중화활성을 가지는 단일클론 항체를 생산하는 세포를 선택한다. HIV의 경우에는, 그 자체의 특성으로 인하여 상기의 중화활성을 가지는 단일클론 항체를 수득하는 것이 쉽지 않으나, 그러한 세포주로서, 본 발명자들은 이미 HIV(HTLV - III MN)에 대하여 중화 활성을 가지는 항체를 생산하는 히브리도마 μ39.l 및 μ5.5 릍 성공적으로 정림하였으며 [일본국 특허출원 제 2 - 188300] 호, 이러한 세포주는 본 발명에 가장 바람직하게 사용된다.
본 발명의 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편이 상기 언급된 항 - HIV중화 단일클론 항체 생산 세포로부터 분리되었으며, 그것의 유전자 배열이 분석되었다. 그러나, 상기 언급된 것과 같이, 그러한 세포는 원하는 항 - HIV 항체에 특이적인 V 영역을 암호화하고 있는 유전자 이외에도 V 영역으로 이루어진 많은 수의 유전자들을 함유하며 (예를들면, 쥐 항체의 특이성을 결정하는 VH 체인의 V 유전자의 군하나는 100개 이상의 서로 다른 유전자들을 포함하며, D 유전자의 군 하나는 11 개 이상의 유전자들을, J 유전자의 군 하나는 4개의 유전자들을 포함하고, 유사하게, Vκ 체인의 V 유전자의 군 하나는 약 300개 이상의 유전자들을, J유전자의 군 하나는 4개의 유전자들을 포함한다), 따라서, 원하는 항 - HIV 항체에 특이적인 V 영역을 암호화하고 있는 유전자를 분리할 필요성이 있다. V 영역의 유전자는 예를 들면, 통상적인 방법 [참조. 예릍 들면, T. 마니아티스(Maniatis) "Molecular C1oning" Cold Spring Harbor Lab.(1982)] 을 사용하여 세포의 염색체 DNA 로 부터 V 영역 유전자를 클로닝하는 방법 또는 통상적인 방법[예, D. M. 글로버 (Glover) 판 "DNA cloning Vol. I" IRL 출판 (1985)] 을 사용하여 세포의 mRNA 로 부터 cDNA 를 합성하고 V 영역 유전자를 클로닝하는 방법을 포함하는 통상적인 유전자 조작기술에 의하여 분리될 수 있다. 둘중 한가지 방법에서, 이미 보고된 [예. 사카노 (Sakano) 일행, Nature. 286, p676, (1980); E. E. 막스(Max) 일행, J. Biol. Chem.,256, p 5116, (1981)] 쥐 이뮤노글로뷸린 유전자의 뉴클레오티드 배열을 참조하여 합성된 DNA프로브(probe)등을 V 영역 유전자의 클로닝을 위한 프로브로서 이용할 수 있다. PCR(중합효소 연쇄 반응) 로 클로닝 하는 것 또한 수행될 수 있다 [R. 올란디(Orlandi) 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 (1989);W. D. 휴스(Huse) 일행, Science, 246,1275 (1989)].
이렇게 클론된 V 영역 유전자는 혼성 항체의 제조방법 [일본국 특허 공개 제 2 - 2352호 또는 재성형 항체의 제조방법 [일본국 특허 공개 제 62 - 296890 호]와 같은 다양한 방법에 의하여 유전적으로 분석될 수 있다. 결과로서, 항 - HIV 항체 V 영역을 암호화하고 있는 본 발명의 유전자 단편은, 이것이 특이적 유전자 배열로서 하기의 아미노산을 암호화하고 있는 유전자를 함유하는 것으로 특징지워질 수 있다는 것이 발견되었다:
H 체인의 일부분을 암호화하고 있는 유전자 내에(H-a),
(a) Lys - Tyr - Gly - Met - Asn
(b) Trp - Lys - Asn - Thr - Asn - Thr - Gly - Glu - Ser - Thr - His - Val - Glu - Glu - Phe - Lys - Gly
(c) Glu - Tyr - Asp - Tyr - Asp - Gly - Gly - Phe - Ser - Tyr 또는 (H - b),
(a) Glu - Tyr - Thr - Met - His
(b) Gly - Ile - Asn - Pro - Asn - Asn - Gly - Asp - Thr - Ser - Tyr - Thr - Gln - Lys - Phe - Lys - Gly
(c) Pro - Tyr - Tyr - Ala - Tyr - Ala - Ile - Asp - Ser
및 L 체인의 일부분을 암호화하고 있는 유전자 내에 (L - a),
(a) Lys - Ala - Ser - Gln - Asp - Val - Gly - Ala - Asp - Val - Ala
(b) Trp - Ala - Ser - Thr - Arg - His - Thr
(c) Gln - Gln - Tyr - Ser - Ser - Phe - Pro - Leu - Thr 또는 (L - b),
(a) Lys - Ala - Ser - Gln - Ser - Val - Asp - Tyr - Asp - Gly - Asp - Ser - Tyr - Met - Asn
(b) Ala - Ala - Ser - Asn - Leu - Glu - Ser
(c) Gln - Gln - Ser - Asn - Glu - Asp - Pro - Trp - Thr
H 체인 및 L 체인에 함유된 상기 3개의 아미노산 배열의 조 각각은 항체 분자의 결합 능력을 결정하는 중요한 아미노산 배열로 생각되며, 그러한 아미노산 배열은 HIV에 대하여 중화활성을 가지는 항체 분자의 기능과 밀접하게 관계된 것으로 생각된다. 다시말해서, 카바트(kabat) 일행에 의하여 보고된 항체 유전자의 일반적 분석 [Sequence of proteins of Imm Muno1ogical Interest, 4 판, U. S. Department of Health and Human Services (1987)] 의 결과에 따르면, 상기 아미노산 배열은 본 발명 항 - HIV 항체의 항체 활성을 결정하는 가변영역 내의 상보성 (complementarity) 결정 영역의 배열임을 알 수 있다. 항 - HIV 중화활성을 가지는 항체 분자의 상기 가변영역을 암호화하고 있는 유전자는 H 체인에 있어서는 제 1 도 또는 제 3 도에 나타낸 아미노산 배열을 암호화하고있는 유전자 단편을, L 체인에 있어서는 제 2 도 또는 제 4 도에 나타낸 아미노산 배열을 암호화하고 있는 유전자 단편을 바람직한 예로서 각각 포함한다. 예를 들면, 상기 유전자들의 특이적 뉴클레오티드 배열은 제 1 도 또는 제 3 도, 또는 제 2 도 또는 제 4 도에 나타낸 뉴클레오티드 배열을 H 체인 또는 L 체인에 대하여 각각 포함한다.
본 발명에 의하여 제공된 상기 뉴클레오티드 배열에 기초하여, HIV 에 대하여 중화활성을 가지는 재조합 항체가 제조될 수 있다. 다시말하면, 이러한 재조합 항체의 가변영역을 암호화하고 있는 유전자로서, 상기 아미노산 배열을 상보성 결정 영역으로서 암호화하고 있는 DNA 단편인 합성 DNA 를 제조하고, 상기 DNA 를 인체 이뮤노글로뷸린을 암호화하고 있는 유전자와 융합시킴으로써 원하는 재조합 항 - HIV 항체, 즉, 항 - HIV혼성항체 또는 항 - HIV재성형 항체를 제조 할 수있다. 이렇게 제조된 본 발명의 재조합 항 - HIV 항체는, 그것이 H 체인 가변영역의 상보성결정 영역으로서 하기의 배열(CDR1 - CDR3) 을 함유하는 것으로 특징지워질 수 있다:
(H - A)
CDR 1 : Lys - Tyr - Gly - Met - Asn
CDR 2 : Trp - Lys - Asn - Thr - Asn - Thr - Gly - Glu - Ser - Thr - His - Val - Glu - Glu - Phe - Lys - Gly
CDR 3 : Glu - Tyr - Asp - Tyr - Asp - Gly - Gly - Phe - Ser - Tyr
또는
(H - B)
CDR 1 : Glu - Tyr - Thr - Het - His
CDR 2 : Gly - Ile - Asn - Pro - Asn - Asn - Gly - Asp - Thr - Ser - Tyr - Thr - Gln - Lys - Phe - Lys - Gly
CDR 3 : Pro - Tyr - Tyr - Ala - Tyr - Ala - ne - Asp - Ser.
본 발명의 재조합 항 - HIV 항체는 또한, L 체인 가변영역의 상보성 결정 영역으로서 하기의 배열(CDR1-CDR3)을 함유하는 것으로 특징지워질 수있다:
(L - A)
CDR 1 : Lys - Ala - Ser - Gln - Asp - Val - Gly - Ala - Asp - Val - Ala
CDR 2 : Trp - Ala - Ser - Thr - Arg - His - Thr
CDR 3 : Gln - Gln - Tyr - Ser - Ser - Phe - Pro - Leu - Thr
또는
(L - B)
CDR 1 : Lys - Ala - Ser - Gln - Ser - Val - Asp - Tyr - Asp - Gly - Asp - Ser - Tyr - Met - Asn
CDR 2 : Ala - Ala - Ser - Asn - Leu - Glu - Ser
CDR 3 : Gln - Gln - Ser - Asn - Glu - Asp - Pro - Trp - Thr.
더욱이, 본 발명자들은 또한 재성형 항체를 제조함에 있어서, 상보성 결정 영역만을 지금까지 보고된 쥐 - 유도 배열로 치환되는 대신에, 상보성 결정 영역에 더하여 상기 상보성 결정 영역에 인접한 프레임(Frmne ; FR)영역 부분을 쥐 - 유도 배열로 치환 함으로써 본래의 항체 활성을 더욱 충분히 보유하는 재조합 항체가 수득될 수 있다는 것을 발견하였다.
다시 말해서, 상기의 상보성 결정 영역 배열(H-A)가 H 체인 가변영역 유전자로서 사용될 때, 가변영역 내의 상보성 결정 영역 CDR 1 에 인접한 FR1 C 말단의 하나의 아미노산이 스레오닌 (Thr) 이고, CDR 2에 인접한 FR2 C말단의 4개의 아미노산 배열이 Lys-Trp - Met - Gly이고, CDR 2에 인접한 FR3 N말단의 5개의 아미노산 배열이 Arg - Val - Thr - Met - Ser 이며, CDR 3에 인접한 FR3 C 말단의 하나의 아미노산이 아르기닌(Arg)인 H 체인 가변영역을 제조함으로써, 더욱 뛰어난 활성을 가지는 항 - HIV재성형 항체가 제조될 수 있다. 유사하게, 상기의 상보성결정 영역 배열(H-B)가 H 체인 가변영역 유전자로서 사용될때, 가변영역 내의 상보성 결정영역 CDR 1 에 인접한 FRl C말단의 하나의 아미노산이 스레오닌(THr)이고, CDR 2에 인접한 FR2 C말단의 2개의 아미노산 배열이 Ile - Gly이고, CDR 2에 인접한 FR3 N말단의 6개의 아미노산 배열이 Lys - Ala - Thr - Met - Thr - Val이며 CDR 3 에 인접한 FR3 C 말단의 하나의 아미노산이 스레오닌(THr)인 H 체인 가변영역 유전자를 제조함으로써, 더욱 뛰어난 활성을 가지는 항 - HIV재성형 항체가 제조될 수있다. 상기의 상보성 결정영역 배열(L-A)가 L 체인 가변영역 유전자로서 사용될때, 가변영역 내의 상보성 결정영역 CDR 2 에 인접한 FR2 C 말단의 하나의 아미노산이 세린 (Ser) 인 L 체인 가변영역 유전자를 제조하는 것이 바람직하다.
이렇게 제조된 본 발명 항 - HIV재성형 항체의 H 체인 가변영역을 암호화하고 있는 유전자의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론된 아미노산 배열은, 바람직한 예로서, 제 9 도 또는 11도(여기서 밑줄친 부분은 쥐로부터 유도된 아미노산 배열을 나타낸다) 에 나타낸 배열을 포함한다. 한편, 본 발명 항 - HIV 재성형 항체의 L-체인 가변영역을 암호화하고 있는 유전자의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론된 아미노산 배열은, 바람직한 예로서, 제 10 도 또는 12도(여기서 밑줄친 부분은 쥐로부터 유도된 아미노산 배열을 나타낸다) 에 나타낸 배열을 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 항 - HIV 혼성항체를 제조함에 있어서, H 체인 가변 영역을 암호화하고 있는 유전자의 뉴클레오티드 배열 및 그로부터 추론된 아미노산 배열은, 바람직한 예로서, 제 1 도 또는 3 도에 나타낸 배열을 포함한다. L 체인 가변 영역을 암호화하고 있는 유전자의 뉴클레오티드배열 및 그로부터 추론되는 아미노산 배열은, 바람직한 예로서, 제 2 도 또는 4도에 나타낸 배열을 포함한다.
한편, 항 - HIV재조합 항체의 제조에 사용되는 인체 이뮤노글로뷸린 H 체인 유전자 및 L체인 유전자의 불변(c)영역 유전자는 동일한 방식, 예컨대 인체 항체생산 세포로부터 분리될 수 있다. C 영역 유전자에서 재배열이 일어나지는 않으므로, 인체 항체생산 세포를 인체 C영역 유전자 분리에 사용할필요는 없다. 분리는 상기 언급한 바와 같이 쥐의 V 영역 유전자를 분리하는 것과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. C영역 유전자는 γ1체인 또는 κ체인에 한정되지 않으며, μ 체인, α 체인, γ2 체인, γ3 체인, γ4 체인, ε 체인, 또는 λ 체인과 같이 어떤 종류의 C 영역 유전자라도 사용될 수 있다. 그러나, 보체(complement) 활성화 능력 또는 항체 - 의존 세포독성을 원한다면, Γ1체인이 바람직하다.
항 - HIV재조합 항체 유전자에 있어서, H 체인 유전자 및 L 체인 유전자 모두는 기본적으로 상기 언급된 두 유전자 단편 (V 영역 유전자 및 C영역 유전자)들을 결합시킴으로써 작제될수있다. 예를들면, 와다나베 (Watanabe) 일행에 의하여 공지된 방법 [와다나베 일행, Cancer Research, 47, p 999 - l005, (1987)], 또는 M 브루그만 (Bruggemann) 에 의하여 윤곽이 잡힌 방법 [Waldmann H (ed) Monoclonal Antibody Therapy. Prog Allergy. Basal, karger, 1988, vol 45, pp 91] 또는 S. L. 모리슨 (Morrison) 에 의하여 윤곽이 잡힌 방법[Advances in imm uno1ogy, 44, 65, (1989)] 에 따라 작제가 수행될 수 있다. 벡터계 (vector system) 는 동물 세포 발현계, E. 콜리 (coh) 발현계, 또는 효모 발현계와 같이 발현에 사용되는 숙주에 따라 변화하지만, 본 발명의 유전자는 이러한 발현계의 어느것에서도 발현될 수 있다. 더하여, DHFR 와 같은 유전자 증폭계 (amplification system) 또한 사용될 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 제조합 항체가 HIV에 대하여 중화활성을 가지는 것으로 확인됨으로써, 본 발명은 지금까지 전혀 제조된 바 없는 항 - HIV 재조합 항체의 제조를 가능케 하였다. 이러한 항 - HIV재조합 항체는 AIDS의 임상에서 실질적으로 효과적인 AIDS 치료제가 될수있다. 더욱이, 본 발명에 의하여 제공되며 항 - HIV 항체 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편은 HIV에 대하여 중화활성을 가지는 항체 가변영역의 특이적 아미노산 배열 또는 뉴클레오티드 배열을 밝혀주고, 더욱 발전된 유전자 재조합 기술을 이용하여 원하는 항체 분자를 변성 또는 부분적으로 치환시킴으로써, 더욱 뛰어난 항 - HIV 재조합 항체 분자의 개발을 가능케 하였다.
[발명수행의 최적 형태]
실시예로 본 발명을 더욱 상세히 설명하는 바, 거기에 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
(1) 항 - HIV쥐 단일클론 항체 생산세포의 제조
항 - HIV쥐 단일클른 항체를 생산하는 히브리도마의 제조방법을 하기에 나타낸다. 면역을 위한 항원에는 HTLV-III MN 주 (strain) 엔벨로프 글리코프로테인 gp 120 의 아미노산 배열 제 303 - 325 번 (SP - 1 : YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIG) 에 해당하는 합성 펩티드 및 KLH에 결합된 상기 합성 펩티드를 합유하는 펩티드-KLH[키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole hmpet hemocyanin)] 접합체 (congugate), 또는 슈크로스 밀도-구배 원심분리에 의하여 HTLV-III MN 생산 세포의 배양 상층액으로부터 수득되는 바이러스 입자, 또는 1 % 트리톤 (Triton) X - 100 으로 H 9 / HTLV - III MN 배지의 세포릍 용해 (lysing) 시킨후, 콘 A - 세파로스 4 B (ConA - Sephaose 4 B) 컬럼 및 HIV 항체(IgG) - 세파로스 4 B 컬럼을 통한 친화성 크로마토그래피로 정제함으로써 수득되는 gp120, 또는 H9/HTLV-III MN세포의 고분자량 DNA (게놈상 DNA) 로 부터 HTLV - III MN gp 120 V 3 도메인(domain) [아미노산 제 247 - 370 번] 을 암호화하고 있는 DNA 단편을 분리하여 PCR 법 [G.I. 라로사 (Larosa) 일행, Science Vol.249 p932 (1990)] 으로 증폭한 후 상기 DNA 단편을 p UEX 2 [아머샴 (Amersham)에 의해 제조] 발현 벡터를 사용하여 E.콜리에서 발현시킴으로써 제조된 HTLV - III MN gp 120 V3 도메인 (아미노산 제 247 - 370) β - 갈락토시다제 융합 단백질, 또는 이러한 항원들의 조합이 포함된다. 이러한 항원으로 BALB / C 쥐를 4회 면역시킨후, 비장세포를 채취하고 폴리에틸렌 글리콜 (시그마 ; sigma) 을 사용하여 P3X63Ag8 - U1X63 쥐의 골수종세포[ATCCCRL1597]와 세포융합 시킨 다음 클로닝을 수행한다. 수득된 클른의 배지 상층액 내 항체의 상기 항원에 대한 결합활성은 효소 면역검정법 (enzyme imnnmoassay) 으로 측정한다. 웨스턴 블롯팅 법 (Westem blotting method) 및 간접 형광법 (indirect fluorescence mdhod) 을 사용하여, 양성으로 나타난 클론들의 결과릍 더욱 확인하여 항 - HIV 단일클론 항체 μ39.1 또는 μ5.5 [일본국 특허 출원 제 2 - 188300, 기탁 번호 ; μ39.1 (P - 11472), μ5.5 (BP - 3402)] 릍 생산하는 히브리도마를 정립한다. 이러한 항체들은 SP-1 펩티드에 결합하여 HIV - 감염 세포와 비감염된 CD 4 양성세포 사이의 결합체(syncytium)의 형성을 억제한다. 더욱이, 이러한 항체들의 중화활성은 또한 이러한 항체들을 HIV바이러스와 혼합하고 이 혼합물로 세포(H 9)를 감염시키는 바이러스 증화시험에 의하여서도 확인된다.
하기에 언급된 븐 발명 항 - HIV재조합 항체의 V 영역 유전자의 제조를 위하여, 상기 중화활성을 가지는 항 - HIV쥐의 단일클론항체 생산 세포 (μ 39.1, μ 5.5 세포) 가 사용된다.
(2) 항 - HIV 항체 쥐V 영역 유전자의 분리
쥐 이뮤노글로불린 가변 (V) 영역 유전자의 분리가 하기 방식에 따라 수행된다.
통상적인 방법 [D. M 글로버 일행 "DNA cloning Vol. I" IRL 출판(1985)] 에 따라 μ 39.1 및 μ5.5 세포로부터 전체 RNA 릍 추출하고, cDNA 합성기 시스템 플러스 (System Plus ; 아머샴) 를 사용하여 외줄 cDNA 릍 합성한다. 이 외줄 cDNA 릍 주형으로 사용하고, 카바트일행이 분류한 V 영역 및 J영역의 뉴클레오티드 배열 [Sequences of Proteins of Imm Munological Interest 4 판, Public Health Service, NIH, 워싱톤 DC, 1987]에 기초해서 합성된 DNA 프라이머 (phmer) 를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한다. Hind III좌 및 Bam HI 좌가 V 영역 프라이머 및 J 영역 프라이머에 각각 도입된다. PCR 은 CETUS 의 실험서에 따라 수행된다. 즉, 상기 프라이머는 각각 100pmol씩 사용하며, PCR 시약은 CETUS 에서 제조된 키트(kit)의 것을 사용한다. PCR 은 25 주기로 수행되며 각 주기는 94℃에서 1분, 55℃C 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 1 분 동안으로 구성된다. PCR 후에, 수득된 DNA 단편을 pUC18 [타까라 슈우죠 (Takara Shuzo) 에 의해 제조 ; 실시예에서 사용되는 시약들은 다른 언급이 없는한 타까라 슈우조 또는 토요보(Toyobo)에 의하여 제조된 것임의 Hinc II 좌내로 도입한다.
(3) 항 - HIV 항체 쥐 V 영역 유전자의 뉴클레오티드 배열
토요보에 의하여 제조된 시쿼나제 (Sequenase) Ver.2 키트를 사용하여, pUC 18에 도입된 V 영역 유전자의 배열을 구명한다. 이렇게 수득된 μ39.1 및 μ5.5의 뉴클레오티드 배열을 제 1 도 - 4도에 나타내었다. 뉴클레오티드 배열로부터 추론된 아미노산 배열 또한 제 1 도 - 4도에 나타내었다. μ39.1 및 μ5.5의 뉴클레오티드 배열 양자는 V 영역 유전자에 특이적인 재배열을 나타내었으며 발현을 가눙케하는 열린 해독축 (open reading frame Me ; ORF) 을 나타내었다.
(4) 항 - HIV 혼성 항체의 제조
상기 (2) 에서 분리된 V 영역 유전자 μ39.1 및 μ5.5가 실제적으로 항 - HIV 활성에 상응하는 V 영역을 암호화하고 있는 유전자라는 것을 확인하기 위하여 쥐-인체 혼성항체를 제조하였다. 혼성 항체의 발현을 위하여 인체 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus ; HCMV)의 인핸서 (enhancer) 및 프로모터 (promoter) 를 담지하는 발현 벡터 HCMV - κ 및 HCMV - γ1[N. 휘틀 (Whittle) 일행, Protein Engineering, 1, 409 (1987)]을 각각 사용하였다. HCMV - κ는 인체 κ 체인 불변영역 유전자를 함유하며 HCMV - γ1은 인체 γ1 체인 불변영역 유전자를 함유한다. 상기 과정 (2) 에서 제조된 μ39.1 V 영역 유전자를 제한효소 Hind III 및 Bam HI 으로 소화시키고, VH 및 VL 단편을 HCMV - γ1 및 HCMV - κ의 Hind III - Ban HI좌내로 각각 도입한다. 제 5 도 및 6도는 μ39.1 혼성 항체 유전자 발현 벡터(각각 CHμ39.l 및 CLμ39.1) 의 구조를 나탄낸다.
유사하게, μ5.5 VH 및 VL 영역 유전자를 HCMV - γ1 및 HCMV - κ내에 도입한다(각각 CHμ5.5및 CLμ5.5 ; 제 5 도 및 6도 참조).
(5) 항 - HIV 혼성 항체의 발현
상기 언급된 것과 같이 작제된 μ39.1 또는 μ5.5 혼성 항체 유전자가 보이는 항체활성은 COS 7세포[ATCC CRL 1651]을 사용한 일시적 발현계에서 조사된다. 바이오 - 라드 (Bio - Rad) 에서 제조된 전기영동장치를 사용하여, CH μ39.1 와 CL μ39.1 플라스미드 DNA 의 혼합물 또는 CH μ5.5 와 CL μ5.5 플라스미드 DNA 의 혼합물을, 바이오 - 라드의 실험서에 따라 COS 7세포 내로 도입하고 10%페탈카프(fetalcalf) 혈청(GIBCO) 이 첨가된 DMEM 배지 내에서 배양한다. 3 일후, 배양 상층액을 수거하여 배양 상층액 내에 존재하는 항체의 활성을 항 - 인체 IgG 또는 SP-1 항원 펩티드를 이용한 ELISA 로 측정한다. 결과로서, 제 7 도에 나타낸 것과 같이, CHμ39.1 과 CLμ39.1 플라스미드 DNA의 혼합물 및 CH μ5.5와 CL μ5.5 플라스미드 DNA 의 혼합물로부터의 발현 생산물 양자는 SP - 1 펩티드에 결합하였다. 따라서, 과정 (2)에서 분리된 μ39.1 및 μ5.5V 영역 유전자는 실제적으로 항 - HIV 활성을 가지는 항체의 V 영역을 암호화하고 있는 유전자라는 것이 확인되었다.
(6) 항- HIV재성형항체의 제조
클론된 μ39.1 또는 μ5.5의 VH 또는 VL영역의 어느 부분이 항원에 결합하는 데에 중요한가를 조사하기 위하여, μ39.1 및 μ5.5 의 CDR(상보성 결정)영역이 인체 V 영역으로 이식되었다. 이것은 재성형 항체의 제조 방법 [일본국 특허 공개 제 62 - 296890 호]에 따라 수행되었다. μ39.1 및 μ5.5 VH 영역의 CDR 영역은 인체소군 I의 구조(framework ; FR) 영역을 가지는 VH 영역 [SGI : 영국 MRC Collabrative Cennter 의 Dr. 벤디그 (Bendig) 제공] (제 8 도 및 10 도) 으로 이식된 반면, μ39.1 및 μ5.5 VL 영역의 CDR 영역은 인체 κ체인의 FR영역을 가지는 VL 영역 [REI : W. 필름 (Palm) 및 N. 힐스크만 (Hilscmann) Z. Physiol, Chem., 356, 167 (1975)] (제 9 도 및 11 도) 으로 이식되었다. 특별히, 재성형 항체는 아머샴의 키트 (Oigonucleotide - directed in vitro mutagenesis system version 2 code RPN. 1523) 와 PCR [사이끼 (Saki), R. G. 일행, Science, 239, 487 (1988)] 를 조합한 아머샴 - PCR 법에 의하여 제조된다. μ39.1 또는 μ5.5의 VH 또는 VL영역의 이식부위를 암호화하고 있는 긴 체인 뉴클레오티드를 SGI 또는 REI의 V 영역 유전자가 도입된 M 13 DNA 에 아닐시킨 후 (annealed), dCTRαS가 함유된 용액 내에서 DNA의 연장 및 결합을 수행한다. 주형 M13 DNA를 Ncil으로 절단하고 주형 DNA를 엑소뉴클레아제 III로 소화시켜 돌연변이된 M 13 DNA만을 수득한다(지금까지의 과정은 아머샴의 실험서에 따라 수행된다). 다음에, 엑소뉴클레아제 III 소화 생산물을 주형으로 사용하고, 범용 (universal) 프라이머 (UP : 이 프라이머는 Ml3mp18의 5' 위치에 상보적인 배열을 함유한다) 및 역 프라이머(reverse primer, RSP : 이 프라이머는 M13mp18 의 3' 위치와 동일한 배열을 함유한다) 를 사용하여 PCR 을 수행한다. 이러한 프라이머들은 20pmol씩 사용되며, PCR용 시약은 CETUS사의 것들이다. PCR 은 25 주기 수행되는데, 각 주기는 94℃에서 1 분, 55℃에서 1 분 및 74℃에서 l 분 동안으로 구성된다. PCR 을 완성한 후, 생산물을 Bam HI/Hind III로 소화시키고 소화 생성물을 DH5α(BRL) 의 형질전환에 사용되는 pUC18 의 Bam HI - Hind III 좌로 도입시킨다. 1 차 스크리닝 (screening) 으로서, 아머샴 키트의 실험서에 따라 CDR내에서 성공적으로 돌연변이된 클론을 선택하기 위하여 돌연변이 제조에 이용되는 CDR프라야머를 사용하어 콜로니 히브리디제이션 (colony hybridization) 을 수행한다. 다음에, 2 차 스크리닝으로서, 1 차 스크리닝에서 수득된 클론으로부터 플라스미드릍 제조하고 시쿼나제 키트 (토요보)로 배열구명(sequencing)을 수행하여 CDR 이식의 정확성 여부를 확인한다. 이러한 방식으로, μ39.1 또는 μ5.5 의 재성형 V 영역 (각각, RH μ39.1, RL μ39.1, RHμ5.5, RLμ5.5 : 제 8 도 - 11 도 참조)을 수득한다. 과정(4)의 혼성 항체 제조에서와 같이, 이 재성형 V 영역 단편을 Hind III 및 Bam HI 제한효소로 소화시키고, VH 및 VL 단편을 HCMV - ν1 또는 HCMV - κ의 Hind III - Bam HI 좌로 각각 도입시킨다. 이렇게 하여 μ39.1 재성형 항체 유전자 발현벡터 (각각 RH μ39.1 및 RL μ39.1) 및 μ5.5 재성형 항체 유전자 발현 벡터 (각각, RH μ5.5 및 RL μ5.5) 가 제조되었다.
(7) 항 - HIV재성형항체의 발현
상기 재성형 μ39.1 및 μ5.5 항체 유전자에 의하여 수득되는 항체의 활성을, COS 7세포를 사용하여 상기 언급된 일시적 발현제에서 조사한다. 과정 (5) 에서와 같이, 유전자가 도입된 세포의 배지 상층액을 수거하고, 배지 상층액 내에 존재하는 항체의 활성을 항 - 인체 IgG 또는 SP - I 펩티드를 이용한 ELISA 로 측정한다. 결과로서, 제 7 도에 나타낸 것과 같이, RH μ39.1과 RL μ39.1플라스미드 DNA의 혼합물 및 RH μ5.5와 RL μ5.5 플라스미드 DNA의 혼합물의 발현 생산물 양자는 SP - 1 펩티드에 결합하였다. 따라서, 제 9 도 - 12 도에 나타낸 μ39.1 및 μ5.5의 아미노산 배열에서, 이식된 CDR영역이 항 - HIV활성을 부여하는 데에 가장 중요한 영역이라는 것이 확인되었다. 이 결과로부터, 이러한 영역을 암호화하고 있는 유전자는 재조합 항 - HIV 항체를 제조하는 데에 상당히 유용한 유전자라는 것이 확인되었다.
배열표
배열 번호 : 1
배열 길이 : 357
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 : 게놈상 RNA 의 cDNA
특징
기원
생물 : 쥐
배열
배열 번호 : 2
배열 길이 : 321
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 :게놈상 RNA 의 cDNA
특징
기원
생물 : 쥐
배열
배열 번호 : 3
배열 길이 : 354
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 : 게놈상 RNA 의 cDNA
특징
기원
생물 : 쥐
배열
배열 번호 : 4
배열 길이 : 333
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 : 게놈상 RNA 의 cDNA
특징
기원
생물 : 쥐
배열
배열 번호 : 5
배열 길이 : 357
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 : 다른 핵산 (합성 핵산)
특징
기원
생물 : 쥐 및 인체
배열
배열 번호 : 6
배열 길이 : 321
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 : 다른 핵산 (합성 핵산)
특징
기원
생물 : 쥐 및 인체
배열
배열 번호 : 7
배열 길이 : 354
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 : 다른 핵산 (합성 핵산)
특징
기원
생물 : 쥐 및 인체
배열
배열 번호 : 8
배열 길이 : 333
배열형 : 핵산
가닥형 : 이중
형태 : 직선
분자형 : 다른 핵산 (합성 핵산)
특징
기원
생물 : 쥐 및 인체
배열
Claims (12)
- 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열 및 인체의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 함유하며, 인체 면역결핍 바이러스(HIV)에 대하여 중화활성을 가지고, 상보성 결정영역(CDR1 - CDR3)은 하기의 아미노산 배열을 가지는 것을 특징으로 하는, 재성형 항체인 유전자 재조합 항 - HIV 항체 H 체인 :CDR 1 : Lys - Tyr - Gly - Met - AsnCDR 2 : Trp - Lys - Asn - Thr - Asn - Thr - Gly - Glu - Ser - Thr - His - Val - Glu - Glu - Phe - Lys - GlyCDR 3 : Glu - Tyr - Asp - Tyr - Asp - Gly - Gly - Phe - Ser - Tyr.
- 제 1 항에 있어서, 가변영역내 상보성 결정영역 CDR 1 에 인접한 FR1 C말단의 하나의 아미노산은 스레오닌 (Thr) 이며, CDR 2 에 인접한 FR2 C 말단의 4개의 아미노산 배열은 Lys-Trp-Met-Gly이고, CDR 2에 인겁한 FR3 N말단의 5개의 아미노산 배열은 Arg-Va1-Thr - Met - Ser이며, CDR 3에 인접한 FR3 C 말단의 하나의 아미노산은 아르기닌 (Arg) 인 재조합 항 - HIV 항체 H 체인.
- 제 1 항에 있어서, 가변영역의 전체 아미노산 배열은 배열표 : 배열번호 5 에 기재된 아미노산 제 1 - 119 번의 아미노산 배열인 재조합 항 - HIV 항체 H 체인.
- 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열 및 인체의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 함유하며, 인체 면역결핍바이러스(HIV)에 대하여 중화활성을 가지고, 상보성 결정 영역(CDR1 - CDR3)은 하기의 아미노산 배열을 가지는 것을 특징으로 하는, 재성형 항체인 유전자 재조합 항 - HIV 항체 L 체인 :CDR 1 : Lys - Ala - Ser - Gln - Asp - Val - Gly - Ala - Asp - Val - AlaCDR 2 : Trp - Ala - Ser - Thr - Arg - His - ThrCDR 3 : Gln - Gln - Tyr - Ser - Ser - Phe - Pro - Leu - Thr
- 제4항에 있어서, 가변영역의 전체 아미노산 배열은 배열표 : 배열번호 6에 기재된 아미노산 제 1 - 107 번의 아미노산 배열인 재조합 항 - HIV 항체 L 체인.
- 제1항의 재조합 항 - HIV 항체 H 체인 및 제 5 항의 항 - HIV 항체 L 체인을 함유하는 재조합 항 - HIV 항체
- 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열 및 인체의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 함유하머, 인체 면역결핍 바이러스 (HIV)에 대하여 중화활성을 가지고, 상보성 결정영역(CDR1 - CDR3)은 하기의 아미노산 배열을 가지는 것을 특징으로 하는, 재성형항체인 유전자 재조합항-HIV 항체 H 체인:CDR 1 : Glu - Tyr - Thr - Met - HisCDR 2 : Gly - Ile - Asn - Pro - Asn - Asn - Gly - Asp - Thr - Ser - Tyr - Thr - Gln - Lys - Phe - Lys - GlyCDR 3 : Pro - Tyr - Tyr - A1a - Tyr - Ala - Ile - Asp - Ser.
- 제7항에 있어서, 가변영역내 상보성 결정영역 CDR 1 에 인접한 FR 1 C 말단의 하나의 아미노산은 스레오닌 (Thr) 이며, CDR 2에 인접한 FR 2 C말단의 2개의 아미노산 배열은 Ile-Gly이고, CDR 2 에 인접한 FR3 N 말단의 6개의 아미노산 배열은 Lys - Ala - Thr - Met - Thr - Val 이며, CDR 3 에 인접한 FR3 C 말단의 하나의 아미노산은 스레오닌(Thr)인 재조합 항 - HIV 항체 H 체인.
- 제 7 항에 있어서, 가변영역의 전체 아미노산 배열은 배열표 : 배열번호 7에 기재된 아미노산 제 1-118 번의 아미노산 배열인 재조합 항 - HIV 항체 H 체인.
- 쥐의 항체로부터 유도된 아미노산 배열 및 인체의 항체로부터 유도된 아미노산 배열을 함유하며, 인체 면역결핍 바이러스 (HIV) 에 대하여 중화활성을 가지고, 상보성 결정 영역 (CDR 1 - CDR 3)은 하기의 아미노산 배열을 가지는 것을 특징으로 하는, 재성형항체인 유전자 재조합 항 - HIV 항체 L 체인:CDR 1 : Lys - Ala - Ser - Gln - Ser - Val - Asp - Tyr - Asp - Gly - Asp - Ser - Tyr - Met - AsnCDR 2 : Ala - Ala - Ser - Asn - Leu - Glu - SerCDR 3 : Gln - Gln - Ser - Asn - Glu - Asp - Pro - Trp - Thr.
- 제10항에 있어서, 가변영역의 전체 아미노산 배열은 배열표 : 배열번호 8에 기재된 아미노산 제 1-111 번의 아미노산 배열인 재조합 항 - HIV 항체 L 체인.
- 제7항의 재조합 항 - HIV 항체 H 체인 및 제 13 항의 항 - HIV 항체 L 체인을 함유하는 재조합 항 - HIV 항체.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1993/000039 WO1994015969A1 (en) | 1993-01-14 | 1993-01-14 | Recombinant anti-hiv antibody and preparation thereof |
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| KR960700274A KR960700274A (ko) | 1996-01-19 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| JPH04152893A (ja) * | 1990-07-02 | 1992-05-26 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | モノクローナル抗体 |
-
1993
- 1993-01-14 KR KR1019950702908A patent/KR100266554B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| JPH04152893A (ja) * | 1990-07-02 | 1992-05-26 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | モノクローナル抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR960700274A (ko) | 1996-01-19 |
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