JPH05506157A - ヒト化及びキメラモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト化及びキメラモノクローナル抗体 産業上の利用分野 本発明は、新規のヒト化（ｈｕａ＋ａｎｉｚｅｄ）モノクローナル抗体に関し、 これは、ヒト免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域中のＦＲに少なくとも人工的に修 飾した共通配列を含む。

さらに、本発明は、表皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒａ＋ａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　 ｆａｃｔｏｒ）のエピトープに結合しているヒト化およびキメラモノクローナル 抗体に関する。本発明は、このレセプターの応答のための抗原結合部位のアミノ 酸配列を開示する。

本発明は、黒色腫、神経膠層または癌腫のような腫瘍の処置の目的のための上記 抗体を含む薬剤組成物に関する。これらの抗体はまた、インビトロまたはインビ ボにおける前記腫瘍の探索および判断のための診断的な適用にも用いることがで きる。

本明細書には、次に定義するようないくつかの技術用語が用いられる。

「ヒト化（ｈｕａ＋ａｎｉｚｅｄ）　Ｊ抗体は、ヒト由来のしおよびＨ鎖に位置 するアミノ酸の可変領域のＦＲおよびアミノ酸の定常領域を有し、超可変領域が ヒト以外に由来する抗体を意味する。

「キメラ」抗体は、ヒト以外に由来する可変および超可変領域を有し、定常領域 がヒト由来である抗体を意味する。

「ＦＲＪは抗体の骨格領域を意味し、可変領域内に見出だされる。この領域にお いて、各抗体間でアミノ酸の変化が生じる。

「ＣＤＲ」は抗体の相補性決定領域あるいは「超可変」領域を意味し、可変領域 内に見出だされる。この領域は特異的抗原結合部位を代表し、この部分が各抗体 間でのアミノ酸の無限の変化を示す。ＣＤＲは抗原の結合親和性において重要な 役割をしている。

「共通配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　Ｊは、ＬおよびＨ鎖の 可変領域としての自然には生じないアミノ酸配列を意味し、自然に存在している ヒト由来ではないＨまたはＬ鎖可変領域の代わりとして用いられる。共通配列は 合成物であって、したがって、明確とされているクラスもしくはサブクラス、ま たはサブグループのヒト免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ鎖のそれぞれに最も共通 したアミノ酸の人工配列である。

［ＥＧＦＪはおよび「ＥＧＦＲ」は、それぞれ表皮細胞増殖因子およびそのレセ プターを意味する。

ｒＶＬＪｌｊ（域は、Ｌ鎖可変領域を意味する。

ｒＶ＋ＪＩｉ域は、Ｈ鎖可変領域を意味する。

発明の背景 ネズミのモノクローナル抗体４２５　（ＭＡｂ４２５）をヒ）Ａ４３１癌腫細胞 株に対して生起させ、それがヒト表皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の外 側ドメイン上のポリペプチドエビトープに結合することが見出だされた。またそ れがＥＧＦＨの低および高親和性部位の画方における表皮細胞増殖因子（ＥＧＦ ）の結合を阻害することが見出だされた（　Ｍｕｒｔｈｙら、１９８７）。ＥＧ ＦＲの増強された発現が種々の由来の悪性腫瘍の組織上で起きることが見出ださ れたことから、ＭＡｂ４２５のヒ）Ｊｌ瘍の診断および治療の試薬としての可能 性が考えられるようになった。実際、ＭＡｂ４２５が腫瘍細胞毒性をインビトロ で媒介することおよび類表皮腫および結腸直腸癌腫由来の細胞株の腫瘍細胞増殖 をインビトロで抑制することが見出だされた（　Ｒｏｄｅｃｋら、１９８７）。

また、放射性標識されたＭＡｂ４２５がヒト悪性神経膠層の異種移植片に結合す ることもマウスにおいて示された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８７）。

ＥＧＦは、表皮および上皮細胞の分裂促進を行うポリペプチドホルモンである。

ＥＧＦが感受性細胞と相互反応するときは、これは膜にあるレセプターと結合す る。

レセプターＥＧＦ複合体はクラスターを形成し、次いで、エンドサイト−シスに より小胞内に取り込まれる。これは［ダウンレギュレーシコン（ｄｏｗｎ−ｒｅ ｇｕｌａｔｉｏｎ）　Ｊ現象の原因となる。ＥＧＦの結合はレセプター分子のチ ロシンキナーゼ活性を誘導して、ＤＮＡ合成を誘導する。

ＥＧＦレセプターは、約１７０．０００ダルトンの膜内糖タンパク質である（Ｃ ｏｈｅｎ、１９８２　）。これはニーｅｒｂ−Ｂプロトオンコジーン（癌原遺伝 子）の遺伝子産物である（　Ｄｏｗｎｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、　３ ０７．５２１−５２７、１９８４）。このレセプターは、いわゆる低親和性およ び高親和性レセプターの二つの運動型で存在する。

Ａ４３１癌腫細胞株は、多数のＥＧＦレセプターをその細胞表面に発現し、した がって、多くの研究で抗−ＥＧＦレセプター抗体を産生させるために用いられて きた。

しかし、Ａ４３１上のレセプターは、ポリペプチドに付いている炭水化物部分が 他の細胞型のものと異なっている。このように、Ａ４３１の膜に対して生じる各 種抗体は、全てのをのレセプター分子に共通ではない炭水化物に対応したものに なる（例えば、５ｃｈｒｅｉｂｅｒ、１９８３　）別のモノクローナル抗体はＥ ＧＦレセプターのタンパク質部分と反応する。これら抗体はＥＧＦレセプターへ の結合において多様な性質を示し、それは、おそらく、結合したレセプター分子 の個々の部分、および抗体のアイソタイプに依存していると思われる。いくつか の抗体はＥＧＦに似た効果を示しく　ａｎｇｏｎｉｓｔ、作動物質）、いくつか の抗体はこの効果を阻害する（　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、拮抗物質）。

ＥＧＦレセプターの発現は腫瘍増殖の進行と関係づけられてきた。レセプターの 遺伝子はトリウィルスオンコジーンｖ−ｅｒｂ−Ｂの細胞アナログであることが 見出だされた（Ｕｌｒｉｃｈ、１９８４　）。加えて、黒色腫形成の後期とレセ プター遺伝子を有するクロモシームの余分のコピーとの間の関連が検出された（ 　Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、ＳｏｍａｔＬｃ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｖｏｌ、１１、２９７−３０２．１９８５）。

ＥＧＦレセプターは、それが広範な種類の固形腫瘍上で発現されることから、抗 腫瘍療法のための適切な標的を提供する。しかし、この分野においては、適切な 抗−レセプター抗体が必要となる。既知の抗体の多くは、抗腫瘍剤として用いた 場合に有害となり得る性質を有する。

例えば、ＥＧＦの効果を模倣する抗体は、腫瘍の進行を阻止せずにむしろ促進す ることが考えられる。ＥＧＦはその効果を非結合レセプターを介しても発揮する ことから、高または低親和性レセプターとのみ結合する他の抗体は、決して最適 な効果を与えるものとはいえない。さらに他の抗体は低親和性レセプターを高親 和性レセプターに変換し、これによって腫瘍の増殖を阻止しないでむしろ悪化さ せることが考えられる。このように、この分野において、抗腫瘍療法に好適な抗 −ＥＧＦレセプター抗体が必要とされている。

ネズミＭＡｂｓはヒトにおける治療のために使用されてきたが、免疫応答を引き 起こす（Ｇｉｏｒｇｉら、１９８３Ｊａｆｆｅｒｓら、１９８６）。この問題を 解決するために、いくつかのグループがネズミ抗体を「ヒト化」することを試み た。これらには二つのアプローチの一つを用いることができる。一つの方法では 、ＬおよびＨ鎖両方のネズミ定常領域ドメインをヒト定常領域と置き換えること ができる。そのような「キメラ」ネズミーヒト抗体が、ヒト腫瘍関連抗原に対す るいくつかのネズミ抗体から首尾よく構築された（　Ｓｕｎら、１９８７　：　 Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８７　：　Ｌｉｕら、　Ｉ　９８７　：　Ｇ１１ｌｉｅ ｓお−よびＷｅｓｏｌｏｗｓｋｉ１１９９０）。このアプローチではネズミ抗体 の抗原結合部位が完全に保たれ、したがって、抗原親和性も保持され、その一方 で、ヒトアイソタイプおよびヒトエフェクター機能が付与される。第二のアプロ ーチは、マウス可変領域からの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをＬおよびＨ鎖可 変ドメイン（ＶＬおよびＶｓ）両方のヒト骨格領域（ＦＲ）とともに融合させる 。これは、この手法によってヒト抗体への抗原結合部位の決定的な主要部分が移 されるであろうという理由に基づいている（　Ｊｏｎｅｓら、１９８６）。

ＣＤＨの融合はいくつかのｉＦ薗類モノクローナルに関して行われた（　Ｊｏｎ ｅｓら、１９８６　：　ＲｅＬｃｈｍａｎｎら、１９８８　：　Ｖｅｒｈｏｅｙ ｅｎら、１９８８　：　Ｑｕｅｅｎら、１９８９：Ｃ。

ら、１９９１　：　Ｇｏｒｍａｎら、１９９１　：　Ｍａｅｄａら、１９９１　 ：　Ｔｅｍｐｔｅｓｔら、１９９１）、親和性は通常低減したが、全ての場合に 抗原との結合能は保持された。はとんどの場合、ヒト骨格残基（ＦＲ）のあるい くつかのアミノ酸を変えることが必要であるとみなされた。キメラ抗体およびＣ ＤＲ融合抗体の両方とも、マウス抗体よりも優れていることが臨床的に証明され た（Ｈａｌｅら、１９８８：ＬｏＢｕｇｌｉｏら、１９８９　：　Ｍａｔｈｉｅ ｓｏｎら、１９９０）。しかし、どのアミノ酸を改変すべきかという一般的な知 見は得られておらず、いずれの場合にも完璧な予測は不可能である。

ＥＰ　Ｏ８８９９４は、予め決定されたリガンドに特異的な免疫グロブリンのし またはＨ鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡベクタ ーの構築を提言している。この適用は可変ドメインの改変を意図するものではな い。

ＥＰ　１０２６３４には、ヒトＩｇＧのＨ鎖ポリペプチドの全部または一部分を コードする遺伝子の細菌宿主におけるクローニングおよび発現が記載されている が、これはポリペプチドの配列の改変を意図するものではなし）。

ＥＰ　２３９４００は、ヒト抗体の抗原結合部位（Ｍ可変領域）を、遺伝子工学 的方法によって、ヒト以外の、例えばマウスまたはラットの抗体の抗原結合部位 で置き換えることによって、ヒト化抗体を得ることができると提言している。

したがって、この知見から、今までのヒト由来の抗体中からは得ることのできな かった特異的抗原結合部位を有するヒトのあるいはヒト化抗体を製造することが できる。

キメラ抗体は、ＣＤＲのみをらず、ＬおよびＨ鎖の全可変領域を置き換えること によって得られる。ところが、キメラ抗体はなお免疫原性を保持したままである 。しかしながら、キメラ抗体は診断への利用や、ヒト化抗体の最適化の操作にき わめて有用である。

抗原結合部位の親和性は、直接にはＣＤＨの部分ではない可変領域中のいくつか の単一アミノ酸の選択的交換によって影響され得ることが示された（Ｒｅｉｃｈ ｍａｎｎら、１９８８）。

ＥＰ　２３９４００の方法での最悪の結果においては、抗原結合での親和性は完 全に消失することもある。本発明者らは、この事実を、ＥＧＦレセプターのエピ トープに向けられたヒト化抗体を構築できなかったことにより示すことができた 。

したがって、上述のようなヒト化が成功するかどうかは、使用する可変領域の組 成及び構造や、その可変領域と抗原結合部位との相互反応に依存することを考慮 しなければならない。すなわち、抗体に抗原との結合能を得るために、あるいは 抗原結合能を改善するために、抗体の可変ドメイン中に修飾が必要であるかどう か、あるいはどのような修飾が必要であるかについて完全に予知することは不可 能である。

発明の概要 したがって、本発明の目的はヒト化モノクローナル抗体を提供することであり、 この抗体は、とくに、ＥＧＦレセプターに対するもので、ヒト由来ではない抗原 結合部位およびヒト由来の可変領域のＦＲおよび定常領域を含み、これらは、必 要であれば、結合部位の特異性が保存あるいは修復されるように修飾される。

とくに、本発明の目的は、ＥＧＦレセプターに対する抗体の抗原結合部位の超可 変領域の特徴づけを行うこと、および上記定義のヒト化モノクローナル抗体内に ＣＤＲを提供することである。

この抗体およびそのキメラ壓誘導体は、黒色腫、神経膠層または癌腫などの腫瘍 の撲滅のための治療または診断剤として重要な役割を果たすことができる。

効果的で特異的なヒト化モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンの少なくと もＨ鎖可変領域の共通配列を用いることによって容易に得られることが見出ださ れた。

とくに、これら共通配列の全てが適切であり、その元となったヒト由来でない抗 体の可変領域と比較して良好な（少なくとも６０〜７０％、とくに６５〜７０％ の）同一性を有する。

さらに、天然に生じるヒト抗体の可変領域を用いてより大幅な修飾を行わねばな らないこともあるが、これら共通配列に対する修飾は小範囲に限らなければなら ないことが見出だされた。良好な特異的な抗原の結合を得るために、本発明によ れば、多くの場合、アミノ酸配列の修飾は全くしなくてもよいか、あるいはｚＪ ｓ数個の修飾ですむ。すなわち、本発明によれば、ＥＧＦレセプターの好ましい ヒト化抗体への完全な結合を達成するためには、小数個のアミノ酸のみを置換す ればよい。これに対して、ＥＰ　２３９４００の教示に従ってもいかなる結合も 得ることはできない。本発明によって必要とされる修飾は、０〜１０％、好まし くは１〜５％の範囲のアミノ酸の交換で示すことができる。

本発明によるヒト化モノクローナル抗体は、次のような特長を有する。

明かとされているクラス、サブクラスまたはサブグループのヒト免疫グロブリン 銀量で違いのある位置に、その位置にもっとも共通に出現するアミノ酸を用いた 配列である共通配列の合成は、全体として、あるいは部分的に問題なく行うこと ができ、個々の抗体あるいは抗体断片に関する詳細な知識あるいはその入手の可 能性がどうであるかに左右されることがない。これは、極めて限定された数の共 通配列（これは発現ベクターにクローニングされる）を提供することで、広範囲 の側々におよび天然に生じている抗体断片がカバーされ得ることを意味する。時 に他の抗体（例えば抗−イディオタイプ抗体）のエピトープとなることが知られ ている個々の天然配列と比較して、共通配列は免疫速性に関してより好ましいも のであり得る。

好ましい具体例を一つだけあげたが、本発明によって一般的な原理が教示されて いる。共通配列に関してここに記述された教示によるＥＧＦレセプターに対する ヒト化抗体の構築の成功は、可変および超可変ドメインにおける多数の可能な配 列および配列の組み合わせに関しての単なる偶然によるものではない。

さらに、可変ドメインのＨ鎖はそれに対応するし鎖よりも、抗原結合部位により 大きく貢献することが見出だされた。したがって、共通配列を有するヒト化抗体 のＬ鎖を同様にして修飾する必要は必ずしもない。いくつかの既知の天然抗体中 のＬ鎖はそれに対応するＨ鎖よりもより重要な役割を果たしていることが知られ ていることから、これは興味深いことである（Ｉｌｉｌｌｉａｍｓら、１９９０ を参照されたい）。

最後に、何にもまして、本発明は、ＥＧＦレセプター（ＭＡｂ４２５）に対する ネズミ抗体の抗原結合部位の遺伝子工学による特徴づけ、クローニングおよび増 幅を最初に提供するものである。この抗原結合部位をコードするオリゴヌクレオ チドや、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体の全可変ドメインをコードする オリゴヌクレオチドを合成することが可能である。さらに、本発明は、適当な真 核細胞の形質転換のために使用できる効果的な発現ベクターを提供する。

このように、本発明は、ヒト由来ではない抗原結合部位（ＣＤＲ）と、ヒト由来 のしおよびＨ鎖の可変領域のＦＲおよび定常領域を有するヒト化モノクローナル 抗体に関し、少なくともＨ鎖の可変領域のＦＲがヒト免疫グロブリンの明確にさ れているクラスまたはサブグループの可変領域からの共通配列を更に修飾して得 た誘導（変異）配列を有することを特徴とする。

とくに、本発明は、共通配列からなるＦＲが抗原結合部位の起源となったヒト由 来でない抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸配列と比較して少なくとも７０％の相 同性を有することを特徴とする、ヒト化モノクローナル抗体に関する。

とくに、本発明は、次のような性質を有する、ヒト化モノクローナル抗体に関す る。

（ａ、）ヒトＥＧＦレセプターに結合する。

（ｂ）ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する。

（Ｃ）ＥＧＦレセプターのＥＧＦ依存性チロシンキナーゼ活性を阻害する。

（ｄ）ＥＧＦ感受性細胞の増殖を阻害する。

とくに、本発明は、抗原結合部位の超可変額域が次のアミノ酸配列を有する、ヒ ト化モノクローナル抗体に関する。

Ｌ鎖 ＤＲ−１ −Ｓｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅ　 ｔ−Ｔｙｒ− ＤＲ−２ −Ａｓｐ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ　−Ｓｅｒ− ＤＲ−３ −Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｈｉｓ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ− Ｔｂ　ｒ　− Ｈ鎖 一５ｅｒ−Ｈｉ　ｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｈｔｓ−ＤＲ−２ −Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇ　１　ｙ−Ａｒ　ｇ− Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｔｙｒ−Ａｓ　ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−５ ｅｒ−ＤＲ−３ −Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ −Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−とくに、本発明は、抗原結合部位に関連していない 可変領域のＦＲが次のアミノ酸配列を有するヒト化モノクローナル抗体に関する 。ただし、括弧で示された部分は括弧内のアミノ酸により置換されてもよいもの である。

Ｌ鎖 ５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ　−Ａｌ　ａ−５ｅ　ｒ−Ｖ ａ　１−Ｇ　１　ｙ−Ａｓ　ｐ−Ａｒ　ｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉ　１　ｅ−Ｔｈ ｒ−Ｃｙｓ　−ｅｕ−Ｉ　１　ｅ−Ｔｙｒ　− ＦＲ−３ −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ　−５ｅｒ−Ｇｌｙ−５ｅ ｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ　（Ｐｈｅ、Ｔｒｐまた はＨｉｓ）−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉ　１　ｅ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ− Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａ−Ｐｈ　ｅ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ 　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｙ　ｓ　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ− Ｈ鎖 ＦＲ−１ −Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｌ −Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌ　ａ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔ ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ　（Ｓｅｒ）−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｒｇ　（Ｈｉ ｓ）−Ｇｉｎ−Ａｌａ（ＬｙｓまたはＨｉｓ）−Ｐｒｏ　（Ｖａｌ）−Ｇｌｙ− Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−１１ｅ　（ＶａｌまたはＬｅｕ）− Ｇｌｙ− ＦＲ−３ −Ｌｙｓ　（ＡｒｇまたはＨｉｓ）−Ａｌａ　（Ｖａｔ、ＰｒｏまたはＧ　１　 ｙ）　−Ｔｈ　ｒ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　１（ＡｌａｌＰｒｏまたはＧ　 １　ｙ）　−Ａｓ　ｐ−Ｔｈ　ｒ−５ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｔｈｒ−Ａ Ｌ　ａ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ　（Ａｓｎ）　−Ｌａｕ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌ ｅｕ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ− Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌ　ａ−５ｅｒ−ＦＲ−４ −Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ　−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｖ ａ　１−５ｅｒ−５ｅｒ　−とくに、本発明は、Ｈ鎖の定常領域がヒト免疫グロ ブリンのγ−１１Ｉのアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリ ンのに鎖のアミノ酸配列を含む、ヒト化モノクローナル抗体に関する。

とくに、本発明は、可変および定常領域内におけるアミノ酸の欠失、置換、追加 または転位による修飾により得られた誘導（変異）アミノ酸配列を含み、かつ抗 原への特異的結合の生物学的機能が保持された、ヒト化モノクローナル抗体に関 する。

さらに、本発明は、ヒト化抗体のＬおよび／またはＨ鎖の可変および／または定 常領域をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、宿主細胞の形質転換 に適する発現ベクターに関する。

さらに、本発明は、ネズミ由来の抗原結合部位の超可変領域（ＣＤＲ）およびヒ トまたはネズミ由来の可変領域のＦＲおよびヒト由来のしおよびＨ鎖の定常領域 を有し、超可変領域が以下に示すアミノ酸配列有することを特徴とし、かつＨ鎖 の定常領域がヒト免疫グロブリンのγ−１鎖のアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の定 常領域がヒト免疫グロブリンのに鎖のアミノ酸配列有する、ヒト化またはキメラ モノクローナル抗体に関する。

Ｌ鎖 ＣＤＲ−１ 一５ｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅ　 ｔ−Ｔｙｒ− ＣＤＲ−２ −Ａｓｐ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ　−Ｓｅｒ− ＣＤＲ−３ −Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ−Ｔ ｈｒ　− Ｈ鎖 一５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＣＤＲ−２ −Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒ　ｇ−Ｔｈ ｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−ＣＤ Ｒ−３ ＝Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ　−Ｇｌｙ−Ａｒ　ｇ−Ｔ ｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ　−とくに、本発明は、抗原結合部位に関係しな い可変領域中のＦＲがヒト由来であって、次のアミノ酸配列を有する、請求項１ ２に記載のヒト化モノクローナル抗体に関する。

Ｌ鎖 ＦＲ−１ −Ａｓ　ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌ　ｎ　−５ｅ ｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌ ｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　−ＦＲ− ２ −Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌ　 ａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉ　１　ｅ−Ｔｙｒ　− ＦＲ−３ −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ　（Ｐｈｅ、Ｔｒｐまたは Ｈｉｓ）−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉ　１　ｅ−３ｅｒ−５ｅｒ　−Ｌｅｕ− Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａｌ　ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ −Ｃｙｓ　−ＦＲ−４ −Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−Ｖａ　１−Ｇｌｕ−Ｉ 　１　ｅ−Ｌｙｓ　−Ｈ鎖 ＦＲ−１ −ＧＩｎ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｇｉｎ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｌ −Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ −Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ　（Ｓｅｒ）−Ｔｒ　ｐ−Ｖａ　１−Ａｒ　ｇ　（Ｈ ｉ　ｓ）　−Ｇｌ　ｎ−Ａｌ　ａ（ＬｙｓまたはＨｉｓ）−Ｐｒｏ　（Ｖａｌ） −Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−１１ｅ　（Ｖａｌまたは Ｌｅｕ）−Ｇｌｙ− ＦＲ−３ −Ｌｙｓ　（ＡｒｇまたはＨｉ　５）−Ａｌａ　（Ｖａ　ｌ、ＰｒｏまたはＧｌ ｙ）−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＧ　ｌ　ｙ）　 −Ａｓ　ｐ−Ｔｈ　ｒ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｔｈｒ−Ａｌ　ａ−Ｔ ｙｒ　−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ　（Ａｓｎ）−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒ ｇ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃ ｙｓ−Ａｌａ−５ｅｒ　−ＦＲ−４ −Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａ 　１−５ｅｒ−３ｅｒ　−とくに、本発明は、抗原結合部位に関係していない可 変領域のＦＲがネズミ由来であって、次のアミノ酸配列を有する、請求項１２に 記載のキメラモノクローナル抗体に関する。

Ｌ鎖 ＦＲ−１ −Ｇｉｎ−Ｉ　１　ｅ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ　−５ｅｒ−Ｐｒ　 ｏ−Ａｌ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙａ−ＦＲ−２ −Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅ ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉ　１　ｅ−Ｔｙｒ　− ＦＲ−３ −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ　−５ｅｒ−ＧＬｙ−Ｓｅ ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈ ｒ−Ｉ　１ｅ−Ｓ　ｅ　ｔ−Ａｒ　ｇ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　１　ｕ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ 　ｕ−Ａｓ　ｐ−Ａｌ　ａ−Ａｌ　ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ　−Ｃｙａ− ＦＲ−４ −Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｙ−３ｅｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− ４１ｅ−Ｌｙｓ　− Ｈ鎖 ＦＲ−１ −Ｇｌｎ−Ｖａｔ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌ　ａ−Ｓｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙ ｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ　−Ｌｅ−Ｇｌｙ− １ａ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−５ ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒｅｒ− さらに、本発明は、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体のＬおよび／または Ｈ鎖の可変および／または定常領域をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴 とする、宿主細胞の形質転換に適する発現ベクターに関する。

さらに、本発明は、培地中で形質転換した宿主細胞を培養し、発現された抗体タ ンパク質を精製分離することによる、ヒト由来ではない抗原結合部位の超可変額 域（ＣＤＲ）およびヒト由来のしおよびＨ鎖の可変領域のＦＲおよび定常領域を 有するヒト化モノクローナル抗体の調製法であって、次のように特徴づけられる 調製法に関する。

（ａ）ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグループのＨ鎖の異なる可変領域 （ＦＲ−１−ＦＲ−４）に用いるアミノ酸共通配列をコードするオリゴヌクレオ チド配列を合成、部分的に合成、または分離する。ここで、用いる共通配列は、 抗原結合部位の起源であるヒト由来でない抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸配列 と比較して少なくとも７０％の相同性を有し、抗原の超可変額域への結合能を保 持するために最高１０％のアミノ酸の改変（変異）によって修飾される。

（ｂ）（ａ）に記載の条件下で、ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグルー プのＬ鎖の異なる可変領域（ＦＲ−１−ＦＲ−４）に用いるアミノ駿共通配列） をコードするオリゴヌクレオチド配列、または天然に生じる対応するアミノ酸配 列をコードするオリゴヌクレオチ配列を合成、一部合成または分離する。

（Ｃ）それぞれの場合、元となるヒト由来でない抗体の超可変額域に相当するし およびＨ鎖の超可変額域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオ チド配列を合成、一部合成または分離する。

（ｄ）それぞれの場合、ヒト免疫グロブリンのしおよびＨ鎖の定常領域のアミノ 酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を合成、一部合成または分離する。

（ｅ）それぞれの場合、少なくともプロモーター、複製開始点および（ａ）〜（ ｄ）のコードＤＮＡ配列を有する発現ベクターの１以上を構築する。なお、Ｌお よびＨ鎖をコードするＤＮＡ配列は、一つのベクターに一緒に、あるいはその代 わりに、二つ以上の異なるベクターに別々に存在させることができる。

そして、最後に、 （ｆ）（ｅ）の一つまたはそれ以上の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。

とくに、本発明は、超可変領域（ＣＤＲ）を代表する次のアミノ酸配列をコード するＤＮＡ配列を用いる、方法に関する。

Ｌ鎖 ＣＤＲ−１ −Ｓｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅ　 ｔ−Ｔｙｒ− ＣＤＲ−２ −Ａｓｐ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ− ＣＤＲ−３ −Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｈｉｓ　−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔ ｈｒ　− Ｈ鎖 −Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−ＣＤＲ−２ −Ｇｌ　ｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒ　ｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔ ｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｃ ＤＲ−３ −Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ −Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−とくに、本発明は、可変領域のＦＲを代表する次の アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いる、方法に関する。

Ｌ鎖 ＦＲ−１ −Ａｓ　ｐ−Ｉ　１　ｅ−Ｇｌ　ｎ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ　−５ｅｒ−Ｐ ｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ　−Ａｌ　ａ−５ｅ　ｒ−Ｖａ　１−Ｇ 　１　ｙ−Ａｓ　ｐ−Ａｒ　ｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　 −ＦＲ−２ −Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌ 　ａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉ　１　ｅ−Ｔｙｒ　− ＦＲ−３ −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ　−５ｅｒ−Ｇｌｙ−３ｅ ｒ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ　（Ｐｈｅ、Ｔｒｐまた はＨｉｓ）−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉ　１　ｅ−５ｅｒ−５ｅｒ　−Ｌｅｕ −Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ −Ｃｙｓ　−ＦＲ−４ −Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉ　 ｌ　ｅ−Ｌｙｓ　−Ｈ鎖 ＦＲ−１ −Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ　−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ ａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｖａ ｌ−Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌ　ａ−３ｅｒ−Ｇｌｙ− Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ　（Ｓｅｒ）−Ｔｒ　ｐ−Ｖａ　１−Ａｒ　ｇ 　（Ｈｉ　ｓ）　−Ｇｌ　ｎ−Ａｌ　ａ（Ｌｙ　ｓまたはＨｉｓ）−Ｐｒｏ　（ Ｖａｌ）−Ｇｌｙ　−ＧＩｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−１１ｅ　（Ｖ ａｌまたはＬｅｕ）−Ｇｌｙ− ＦＲ−３ −Ｌｙ　ｓ　（Ａｒ　ｇまたはＨｉｓ）　−Ａｌａ　（ＶａｌＳＰｒＯまたはＧ ｌ　ｙ）−Ｔｈｒ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１（ＡｌａｌＰｒｏまたはＧｌｙ ）−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｔｈｒ−Ａ　１　ａ−Ｔ ｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ　（Ａｓｎ）−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙ ｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ　−ＦＲ−４ −Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ　−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｖ ａ　ｌ−５ｅｒ−Ｓｅｒ　−さらに、本発明は、形質転換された宿主細胞を培養 して発現した抗体蛋白質を精製、分離することにより、ネズミ由来の抗原結合部 位の超可変額域（ＣＤＲ）と、ネズミ由来の可変領域のＦＲと、ヒト由来のしお よびＨ鎖の定常領域を含み、ＥＧＦレセプターのエピトープに結合する生物学的 な機能を有するキメラモノクローナル抗体を調製する方法に関し、この方法は、 先に挙げた発現ベクターで形質転換を行うことを特徴とする。

さらに、本発明は、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体を含む薬剤組成物に 関する。

さらに、本発明は、腫瘍に対する医薬物の製造のためのヒト化またはキメラ抗体 の使用に関する。

最後に、本発明は、腫瘍増殖の診断的探索および評価のためのヒト化またはキメ ラ抗体の使用に関する。

要約すれば、本発明は、ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグループのＨ鎖 の可変領域での共通配列を有するモノクローナル抗体に関する。

上記および下記に引用された全ての出願、特許および、出版物、並びに１９９１ 年３月６日に申請された対応する欧州特許出願９１１０３３８９．２中の全の記 述が参考文献としてここに組み入れられている。

日に　いられた　およびプリスミ　゛ （ａ）ｐＲＶＬ４２５　（＝ＨＣＭＶ−ＲＶＬｂ４２５−に）、ブダペスト条約 に従って、１９９１年２月１日にＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａａ＋ｍｌｕｎｇ　ｖａ ｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｔｓａｍｅｎ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に受け入れ番号ＤＭ Ｓ６３４０の下に寄託された。この発現ベクターは、ネズミ抗体４２５の超可変 額域（ＣＤＲ）およびヒト化抗体のＬ鎖可変領域のＦＲおよび定常（に）領域の 配列を含む。Ｒは［リシエイブ型（改変された（ｒｅｓｈａｐｅｄ）型）」を意 味する。

（ｂ）ｐＲＶＨ４２５（＝ＨＣＭＶ−ＲＶＨｇ４　Ｚ　５−７）：ブダペスト条 約に従って、１９９１年２月１日にＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏ ｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓａ＋ｅｎ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に受け入れ番号ＤＭ Ｓ６３３９の下に寄託。この発現ベクターは、ネズミ抗体４２５の超可変額域（ ＣＤＲ）およびヒト化抗体のＨ鎖可変領域のＦＲおよび定常（γ−１）領域の配 列を含む。Ｒは「リシエイプ型Ｊを意味す（ｃ）ｐＣＶＬ４２５　（＝ＨＣＭＶ −ＣＶＬ４２５−に）：ブダペスト条約に従って、１９９１年２月１日にＤｅｕ ｔｓｃｈｅ　Ｓａ＋ａａ＋ｌｕｎｇ　ｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ 　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に受け入れ番号ＤＭ３６３３８の下に寄託された。この発現 ベクターは、ネズミ抗体４２５のＬ＠可変領域のＦＲおよび超可変額域（ＣＤＲ ）およびヒト免疫グロブリンのし鎖の定常（に）９Ｘ域の配列を含む。Ｃは「キ メラ」を意味する。

（ｄ）ｐ　ＣＶＨ４２５（＝ＨＣＭＶ　ＣＶｓ４２５−γ）：ブダペスト条約に 従って、１９９１年Ｚ月１日にＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　 Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に受け入れ番号ＤＭＳ　６ ３３７の下に寄託された。この発現ベクターは、ネズミ抗体４２５のＬ鎖可変領 域のＦＲおよび超可変額域（ＣＤＲ）およびヒトγ−１免疫グロブリンのＬ鎖の 定常領域の配列を含む。Ｃは「キメラ」を意味する。

（ｅ）ハイプリドーマ細胞株４２５：ブダペスト条約に従って、１９８８年１月 ２６日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ七ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ 　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）に受け入れ番号ＨＢ　９６２９の下に寄託された。この細胞 株は、ＥＧＦレセプターに対するネズミ抗体４２５を産生する。

の 本出願中に記述されている他の微生物、細胞株、プラスミド、プロモータ、耐性 マーカー、複製開始点または他のベクターの断片は、市販されているか一般に入 手できるものである。本出願中においてとくに記載がなければ、それらは例とし て用いられただけで、本発明に不可欠なものではなく、それぞれ他の適当な手段 および生物学的材料によって置き換えることができる。

好ましくは、微生物宿主をＤＮＡ配列の増幅に用いる。

これら宿主の例としては、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）またはバチルス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ）がある。

例えば、ＣＯ５（ＣＶＩ由来の５Ｖ４０）　細胞マタハＣＨＯ（チャイニーズハ ムスター卵巣）細胞のような真核細胞、あるいは酵母が、本発明によるヒト化お よびキメラ抗体を産生ずるために好ましい。ＣＯ８およびＣＨＯ細胞がなかでも 好ましい。

のための−゛ 本発明に不可欠な技術に関しては、本明細書に詳細に記述されている。

詳細に述されていない他の技術は、当業者によく知られているか、あるいは引用 文献および特許出願および標準的な文献により詳細に記述されている既知の標準 法である。

図面の簡単な説明 図１は、キメラおよびリシェイプ歴のヒト抗体の発現のために用いられるベクタ ーの構造を表す構成図である。

発現プラスミドの構築に用いられる制限酵素切断部位がマークされている。可変 領域をコードする配列は黒塗り枠で、定常領域は白抜き粋で、ＨＣＭＶプロモー タおよびエンハンサ−は斜線枠で、プラスミドｐｓＶｎｅｏからのヌクレオチド 断片は斑点枠で示されている。転写の方向は矢印で示されている。

図２は、ｐＵＣ１８にクローニングされたｖＨ４２５ｃＤＮＡ　（Ａ）およびＶ Ｌ４２５　ｃＤＮＡ　（Ｂ）（ｆ）ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配 列である。リーダー配列となり得るアミノ酸は下線で、ＣＤＲは括弧で示されて いる。可変領域と定常領域間のスプライシング部位もまた、示されている。キメ ラ抗体をコードする遺伝子の構築に使用される前方および後方ＰＣＲプライマー およびそれらがアニール（結合）する部位が示されている。

図３は、リシェイプ型ヒトＶ＋ａ４２５をコードする合成遺伝子断片のヌクレオ チド配列および対応するアミノ酸配列である。リーダー配列を下線で、ＣＤＲと なり得る残基を括弧で示す。

図４は、マウスとリシェイプ型ヒトにおける４２５可変領域のアミノ酸配列の比 較を示す。パネルＡは、マウスＶＬ（ＶＬ４２５）およびリシェイプ型ヒトｖＬ Ｓ（ＲｖＬａ４２５およびＲｖＬｂ４２５）の配列を示す。パネルＢは、マウス ｖＨ（Ｖ、４２５　）およびリシェイプ型ヒ）　Ｖ＋Ｓ　（ＲＶＨａ　４　２　 ５　、　ＲＶ、ｂ４２５　、　ＲＶ、−１ｃ４２５、ＲＶ、ｄ４２５、ＲＶＨｅ ４２５、ＲＶＨｆ４２５、ＲＶ＋ｇ４２５、ＲＶＨｈ４２５およびＲＶＨｉ４２ ５）の配列を示す。ＦＲおよびＣＤＲが示されている。アミノ酸はＫａｂａｔら （１９８７）の方法によって番号が付与されている。

図５は、マウスＭＡ　ｂ　４２５可変領域の分子モデルである。

図６は、ＥＧＦＲへの結合のＥＬＩＳＡによる検出を示す。抗原結合活性を、ト ランスフェクトしたＣｏＳ細胞上清の希釈液中で分析し、４５０ｎｍの吸光度を ＩｇＧ濃度に対してプロットした（ＥＬＩＳＡによって定量された。材料および 方法の項を参照されたい）。リシエイプ型ヒトｖＨ領域の全ての型は、ＲＶＬａ ４２５とコートランスフエクトされ、それぞれ次のように表される。

ＲＶＨａ４２５　（Ａ）　、ＲＶＨｂ４２５　（０）　、ＲＶ＋ｃ４２５　（△ ）、ＲＶ＋ｄ４２５　（■）、ＲＶＨｅ４２５　（ロ）、ＲＶｌ−１ｆ４２５　 （Ｉｇ）、ＲＶ＋ｇ４２５　（ロ）、ＲＶＨｈ４２５　（０）　、ＲＶ＋１４２ ５　（０）　。ＲＶＬｂ４２５とコートランスフエクトされたＲＶ、ｂ４２５は 、◆で表される。キメラＶＬ４２５およびＶＨ４２５のコートランスフエフシコ ンは、・で表される。

図７は、抗原への結合の競合を示す説明図である。

（Ａ）は、標識されたマウス４２５抗体と、（１）非標識マウス４２５抗体（＋ ）との、または（２）ＨＣＭＶ−ＣＶＬ４２５−＆お！びＨｃＭＶ−ＣＶ、４２ ５−γ−１でのコートランスフエフシコンの後にＣＯ８細胞によって産生された キメラ４２５抗体（・）との間の競合を示す。

（Ｂ）は、標識されたマウス４２５抗体と、（１）非標識マウス４２５抗体（＋ ）との、または（２）ＨＣＭＶ−ＲＶＬａ　４２５−にお！びＨｃＭＶ−ＲＶ＋ １４２５−γ−１のコートランスフエフシコンの後にＣｏＳ細胞によって産生さ れたりシエイブ型ヒト４２５抗体（０）との、あるいはＨＣＭＶ−ＲＶＬａ　４ ２５−　ｇ　オ！　ヒＨＣＭ　Ｖ　−ＲＶ　Ｈｇ　４２５−７−１　ノコ−トラ ンスフェクションの後にＣＯ８細胞によって産生されたリシェイプ型ヒト４２５ 抗体（ロ）との間の競合を示す。それぞれの場合、横軸はインヒビターの濃度（ ｎｇ／ｍｌ）を表す。縦軸は結合阻害のパーセントを表す。

図８は、種々のりシエイプ型ヒトｖＬｆｉＩ域の抗原結合に及ぼす影響を調べた 結果を示す。（Ａ）は、ＨＣＭＶＣＶＬ４２５　ｇ　トＨＣＭＶ　ＣＶＨ４２５ ｙ　１　ｆ）組合せ（・）　、ＨＣＭＶ　ＲＶＬａ４２５−ｇ　とＨＣＭＶ　Ｒ ＶＨｇ　４２５　７　１　ノ組合セ（ロ）、ＨＣＭＶＲＶＬｂ　４２５−ｇ　ト ＨｃＭＶ−ＲｖＨｇ　４２５　Ｗ：／マー１の組合せ（■）　、ＨＣＭＶ−ＲＶ Ｌａ　４２５−ｇとＨＣＭＶ−ＲＶＨｃ　４２５−７−１の組合セ（△）まタハ ＨＣＭＶ−ＲＶＬ　ｂ　４２５−力ｙｉ＜トＨｃＭＶ−ＲＶ）４Ｃ４２５−γ− １の組合せ（ム）でコートランスフェクトされたＣＯ５細胞によって産生された りシエイプ型ヒト４２５抗体による抗原結合を示す。（Ｂ）は、標識されたマウ ス４２５抗体と、 （１）非標識マウス４２５抗体（＋）との、および（２）ＨＣＭＶ−ＶＬａ　４ ２５−ｘとＨＣＭＶ　ＶＨｇ　４２５−γ−１の組合せでコートランスフエクト されたＣＯ８細胞において産生されたりシエイブ型ヒト４２５抗体（ロ）との、 アルイハＨｃＭＶ　ＶＬｂ　４２５　ｘ　トＨＣＭＶ−ｖ、ｇ　４２５−７−１ との組合せでコートランスフェクトされたＣＯ５細胞において産生されたりシエ イプ型ヒト４２５抗体（■）との間での競合を示す。

（Ａ）において、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤＡ５０）を表し、横軸はＩ ｇＧの濃度（ｎ　ｇ　／　ｍ　１　）を表す。

（Ｂ）において、横軸はインヒビターの濃度（ｎ　ｇ／ｍｌ）を表し、縦軸は結 合阻害のパーセントを表す。

図９（Ａ）は、リシエイプ型（レーン１および２）、キメラ（レーン３）および ネズミ（レーン４）のＭＡｂ４２５の非還元条件下（ａ）および還元条件下（ｂ ）での５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す。リシエイプ製（レーン７およ び８）、キメラ（レーン９）およびネズミ（レーン１０）。レーン５．６．１１ および１２は、ＭＷママ−−である。

図９（Ｂ）は、リシエイプ塁ＭＡｂ４２５のスベロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　 １２でのゲル濾過による精製の説明図である。ビーク２はＩｇＧを表す。

第１０図は、ネズミ、キメラおよびリシエイブ型のＭＡｂ４２５のＥＧＦレセプ ター（ＥＧＦＲ）への競合的結合を示す。縦軸は全ＭＡｂに対する結合ＭＡｂの 比をパーセント（％結合／全体）で示す。横軸は抗体の濃度（モル／リットル［ ｌｏｇ］）を示す。

はネズミＭＡｂ４２５を表す ＯはキメラＭＡｂ４２５を表す ・、マはリシエイプ型ＭＡｂ４２５を表す。

図１１は、ＥＧＦおよび抗体のＥＧＦレセプターへの競合を示す。縦軸は、％結 合／全体（ＭＡ　ｂ　）を表す。

横軸は、抗体の濃度（モル／リットル［ｌｏｇ］）を１す。

○はネズミＭＡｂ４２５を表す。

△、、口はリシエイブ型ＭＡｂ４２５を表す。

発明の詳細な説明 ＭＡｂ４２５の口　・　−の　ローニン　および五人１ に鎖プライマーを用いるｃＤＮＡ合成およびクローニングから、好ましくは３０ ０〜４００コロニーをスフ■。

−ニングのために取り出す。γ−２ａプライマーを用νるｃＤＮＡ合成およびク ローニングから、好ましくは２００〜３００コロニーをスクリーニングのために 取りｄす。二つのそれぞれのクローニングプライマーを用い之ハイブリダイゼー ションによるスクリーニングの後に、２０〜３０のＬ鎖コロニーおよび１０〜２ ０のＨ［コロニーが強いシグナルを示す。プラスミドＤＮＡをこれらコロニーか ら分離して、通常の市販の制限酵素消化物によって分析して、ｃＤＮＡ挿入物の サイズを決定する。

ｖＬおよびｖＨクローニングのために４００〜５００ｂｐまたは５００〜６００ ｂｐの挿入物を有すると思われるクローンをそれぞれ配列決定のための候補クロ ーンとして選択する。Ｍ１３ユニバーサルおよび逆配列決定プライマーを用いて 、三つのｖＬクローンおよび三つのｖＨＨａ−ンの両鎖の配列決定を杼う。配列 決定した三つの７表　しクローンのうち、一つは完全な可変領域をコードし、残 りは無関係のペプチドをコードすると考えられる。ＶＨＨａ−ンのうちの二つは 同一のｖＨ領領域コードし、残りはリーダー配列となお存在するＦＲ−１の間の イントロンを有するＶ、領域をコードすると思われる。三番目のｖＨＨａ−ンは イントロンの他に、最初の二つのクロ配　−ンのコード配列と同一の配列を含む 。ｖＬ領領域配列を確託するために、適当なサイズの挿入を含むさらに三二　つ のｃ　ＤＮＡクローンを配列決定する。これらのうちのり　二つは、最初のＶＬ クローンと同一の配列を示しな。三い　番目のクローンは無関係のＤＮＡ配列で あった。配列状２　足されたクローンにおいて、用いたプライマーにオリジ出　 ナルな配列の全部は存在しない。欠失の程度は各クローる　ンによって異なる。

おそら＜ｃＤＮＡ合成およびクローニング中に起きると思われるこれら欠失は、 コロニースロ　クリーニングの効率を下げるとも考えられる。

ら　ＭＡｂ４２５のｖＬおよびｖＨ遺伝子を図２に示す。４２二　２５ＶＬおよ びＶＨｌ域のアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら、１９８ ７）の他のマウス可変領域とｐ　比較する。ｖＬ領領域、マウスに鎖可変領域の サブグル５　−プｒＶまたはＶＩに分類することができる。ＦＲ内で、Ｌ、　４ ２５　ＶＬ領領域、マウスにサブグループエｖの共通配２　列と約８６％の同一 性、およびサブグループＶＩと約８才　９％の同一性を有する。４２５　Ｖ、ｆ ｉ域は、ＩＫ４断片Ｊ　を用いていると考えられる。ＶＨ領領域調べることによ って、マウスＨ鎖サブグループＩＩ（Ｂ）の共通配列のＦＲと約９８％の同一性 が示される。

ヒト免疫グロブリンの適切なりラスまたはサブグループの正しい選択は、ヒト由 来でない抗体中のもともと存在する鎖との同一性の程度によって行う。本発明で 導き出された共通配列は、元になるヒト由来ではない鎖の配列と比較して６５〜 ７０％以上の同一性を有するものでなければならない。

Ｈａの共通配列が好ましく、特に、ヒトＨ鎖サブグループＩの共通配列であるこ とが好ましい。しかし、それ以外の抗体の場合には、他のヒトＨ鎖の共通配列が 適当である。好ましい共通配列は修飾される。アミノ酸の可能な交換は、本発明 によれば、０〜１０％、好ましくは、５〜１０％である。

キメラ４２５　の　および ＶＬおよびＶＨ９！域をコードするｃＤＮＡをキメラ４２５抗体の構築に用いる 前に、５′末端および３′末端におけるいくつかの修飾を導入する必要がある。

これには、可変領域コード配列を適宜にＨＣＭＶ発現ベクターにサブクローニン グできるような適切な制限酵素部位を導入することが含まれる。可変領域から定 常領域に正しく効果的にスプライシングされるようにドナーのスプライシング部 位を３′側の隣接領域に再作出することが必要である。５゛側の隣接領域もまた 、真核細胞リポソームによる翻訳のための効果的な翻訳開始部位を作出するよう な配列を含むように修飾される（　Ｋｏｚａｋ、１９８７）。これらの修飾は、 ＰＣＲプライマーを用−て導入される。用いられるプライマーを表１に示す。

表１　ｃＤＮＡクローニング、キメラ構築および突然変異誘発に用いられるオリ ゴヌクレオチド。下線を施した部分はヒト骨格構造にアニーリングする塩基を示 す。

七　１刀 皿３ １５°−ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧ−３’ｃＤＮ Ａ合成のためのＬ鎖プライマー ２　５’−ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧ−３’ｃＤＮ Ａ合成のためのＨ鎖プライマー ３５°−ＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧ−３’キメラｖ日前 方プライマー ４５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡ−３’ キメラＶ、後方プライマー ５５°−ＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧ−３’ キメラｖＬ前方プライマー ６　５’−ＧＴＡＧＡＴＣＴＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣ−３’ キメラｖＬ後方プライマー ７５°−ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧ−ＴＡＡ ＣＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧ−３゜リシエイプ型ＶＬＣＤ Ｒ−１プライマー８　５’−ＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡ ＣＣＴＧＧＣ−ＴＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣ−３’リシエイプ壓Ｖ、ＣＤ Ｒ−２プライマー９　５’−ＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧ ＴＡＧＴＣＡ−ＣＡＴＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡ−３’リシェイプ型Ｖ ＬＣＤＲ−３プライマー１０　５°−ＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＣＴ ＴＣＡＣＣＡＴＣ−３’１１　５’−ＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＴＧ −３゜５３０ＴをＲＶＨに導入するためのプライマー１２　５’−ＣＧＡＧＴＧ ＧＡＴＴＧＧＣＧＡＧＴ−３゜Ｖ４８ＩをＲｖＨに導入するためのプライマー１ ３　５’−ＴＴＴＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡ−Ｃ ＡＣＣＴＣＴ−３’ Ｒ６６ＫＳＶ６７ＡＳＬ７１　ＶヲＲＶ１．ｌニ導入スるためのプライマー １４　５’−ＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＴ−３’Ｌ７１ＶをＲＶＨ に導入するためのプライマーそれぞれの可変領域ｃＤＮＡに関して、二つのプラ イマーが好ましくはデザインされる。前方プライマーにおいては、プライマーの ３′末端の１５塩基はプライマーを鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせるために用 いられ、プライマーの５′末端はＨｉｎｄｌＩＩ部位および「ＫＯｚａｋＪ配列 を含む。後方プライマーは、同様のデザインを有し、３′末端の１５塩基はプラ イマーを鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせるために用いられ、プライマーの５′ 末端はＢａｍＨＩ部位およびドナースプライシング部位を含む。Ｌ鎖後方プライ マーの場合においては、ＶＬをコードするｃＤＮＡが内部ＢａｍＨＩ部位を含む ことから、ＢａｍＨＩ部位の代わりにＢｇｌＩＩ部位が用いられる（図２）。Ｐ ＣＲ反応は好ましくは実施例に記述のようにして行われる。

ＰＣＲ修飾ｖＬ領域ＤＮＡは、Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＢｇＩＩＩ断片として ＨＣＭＶのＬｆｆ１発現ベクターのＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ部位にク ローニングされる。このベクターは、必要なスプライシングアクセプタ一部位お よびポリ（Ａ十）部位とともにヒトゲノムに定常領域を既に含んでいる。ＰＣＲ 修飾全ｖＬ断片を、発現ベクター中のクローニング部位の両隣接部位にアニーリ ングする二つのプライマーを用いて配列決定する。配列決定によって、ＰＣＲＣ デステップ中かなるエラーも入り込まなかったことが確認される。ＰＣＲ修飾Ｖ ＨＤＮＡは、ＨＣＭＶ（７）Ｈ鎖発現ベクターにＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　−Ｂａｎ ＨＩ断片としてクローニングされ、また、ＰＣＲエラーがないことを確認するた めに配列決定される。ヒトゲノムγ−１定常領域を含むＢａｍＨＩ断片は、ｖＨ 領領域３′側でＨＣＭＶ−ＣＶＨベクターに挿入される。この断片は、インビボ でＶ−Ｃスプライシングを起こすために必要なスプライシングアクセプタ一部位 および天然に生じるポリ　（Ａ＋）部位を含む。

キメラ４２５ＶＬおよびＶｓｔａ域を含む発現ベクターは、適当な真核細胞、好 ましくはＣＯ８細胞にコートランスフェクトされる。約７２時間の暫時発現の後 に、細胞培養培地の分析をと）ＩｇＧ産生およびＥＧＦＲタンパク質への結合に 関してＥＬＩＳＡによって行う。培地に検出されるヒトＩｇＧの量は、ｌ　ＯＯ 〜４００　ｎ　ｇ　／　ｍ　１とばらつく。産生されるキメラ抗体は、標準抗原 −結合ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいてＥＧＦＲタンパク質によく結合しており、これに よって正しいマウス可変領域がクローニングされて配列されたことが確認される 。

リシエイプ　ヒト４２５ＬおよびＨの　の　サイシミ１亙圭１１１ リシェイプ型ヒト４２５抗体のデザインにおいて、ＶＨ領域ドメインが抗原の結 合においてしばしばもつとも重要であるからこと（Ａｍｉｔら、１９８６　：　 Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８）から、この領域に主な重点がおかれる。マウ スＣＤＲをその上に融合させるヒトＦＲを選択するために、マ’７　スＭ　Ａ　 ｂ　４２５　Ｖ　Ｈ領域ノＦＲヲヒトｖＨ１ｉＪ［域）全サブグループに対する 共通配列からのＦＲと比較する（Ｋａｂａｔら、１９８７）。この比較によって 、マウスＭＡｂ４２５ｖＨのＦＲはヒトｖＨサブグループＩ　ノＦ　Ｒ）二もっ とも類似していることが示され、これ番よＦＲ内で約７３％の同一性をおよび全 ｖＨ領域にわたって約６５％の同一性を示す。

マウス４２５Ｖ＋領域と同じＫａｂａｔサプグループカ１らの他のマウス可変領 域とのさらなる比較を、ＭＡｂ４２５に特徴的で、そのために抗原結合に関与す る可能性を有するＦＲの残基を見出だすために行う。マウスＭＡｂ４２５ＶＨ領 域の位置９４の残基はセリンで、マウスサブグループＩＩ（Ｂ）おいて、またヒ トサブグル−ブエカλらの他のｖＨ領領域おいても残基９４（よアルギニンであ る（Ｋａｂａｔら、１９８７）、位置９４はＣＤＲ−３＆二隣接していることか ら、このアミノ酸置換番よ通常のものではなく、これはきわめて重要な位置を占 める。これらの理由から、リシエイプ型ヒト４２５ＶＨ領域は、好ましくは、マ ウスＭＡｂ４２５のＣＤＲおよびヒトサブグループＩＦＨにおける共通配列から 誘導されるＦＲ）二基づいてデザインされる（　Ｋｏｂａｔら（１９８７）の定 義番二よる）。ＦＲ−３中の位置９４は、マウスＭＡｂ４２５＆二見出だされる ようにセリンとする。ヒトサブグループエＦＲの共通配列のなかで単一のアミノ 酸を載せること力ｆできない位置については、その位置に最もよく見出だされる アミノ酸を選択する。ヒト共通配列におし１て特定の位置に好ましいアミノ酸が ない場合には、マウスＭＡｂ４２５Ｖ＋の配列のその位置に見出だされるアミノ 酸を選択する。結果として得られるアミノ酸配列は、リシェイプ型ヒト４２５　 ＶＨの最初の型（ａ型）を構成する（図３）。これに続くリシェイプ型ヒト４２ ５　ｖＨの型の全ては、この最初の塩の修飾（変異）塁である。

上記のように、リシェイプ型ヒト４２５　ＶＨ領領域コードする４５４ｂｐのＤ ＮＡ断片をデザインして、合成する（実施例および図３を参照されたい）。この ＤＮＡ断片は、リシエイプ型ヒト４２５ＶＨ領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ 配列に加えてヒトリーダー配列をコードする配列も含む。ヒトリーダー配列は、 例えば、ヒトＶＨサブグループＩ　（Ｋａｂａｔ、１９８７）　ｆ）構成要素で ある抗体ＨＧ　３　ＣＬ　（Ｒｅｃｈａｖｉら、１９８３）から得ることができ る。合成りＮＡ断片もまた、５゛末端に真核細胞翻訳シグナル（Ｋｏｚａｋ、１ ９８７）　、３′末端ニトナ一スプライシング部位（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈら、 １９７Ｂ）およＵＨＣＭＶ発現ベクターへのサブクローニングのたメツ５′およ び３′末端のそれぞれのＨｉ　ｎｄＩ　Ｉ　ＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む。

リシエイブ型ヒト４２５　ＶＬＱ域のデザインのために同様の操作を行う。マウ スＭＡｂ４２５ＶＬ領域のＦＲをヒトｖし領域の全サブグループに対する共通配 列と比較する（　Ｋａｂａｔら、１９８７）。ＦＲ内で、マウス４２５ｖＬとヒ トにＶＬサブグループＩＩＩとの間に約７１％の同一性が、ヒトにＶＬサブグル ープＩとの間に約７０％の同一性が見出だされる。ヒトにｖＬサブグループエの ヒトＦＲをコードするＤＮＡはリシェイプ型ヒトＤＩ３ｖＬ領域（ＥＰ　２３９ ４００．　Ｗｉｎｔｅｒ）およびリシェイブ型ヒトＣＡ　Ｍ　Ｐ　Ａ　Ｔ　Ｈ− １（Ｒｅｉｃｈａ＋ａｎｎら、１９．８８）　から既に入手できる。これら二つ のヒト抗体におけるリシエイプ型ヒトｖＬ領域のデザインは、構造的に解明され ているヒト免疫グロブリンＲＥＩタンパク質（Ｅｐｐら、１９７５）に基づいて 行われる。これらの理由から、リシエイプ型ヒトＤ１．３およびＣＡＭＰＡＴＨ −Ｉ　ＨからのヒトＶ、ＦＲもまた、リシェイブ型ヒト４２５ＶＬにおいて用い る。マウス４２５ＶＬ領域のＦＲと、同様のサブグループからの他のマウス抗体 のＦＲとの比較によって、機能的に重要な位置におけるアミノ酸残基に有意の差 がないことが明らかになる。したがって、ヒトＦＲにおける改変が不要である。

リシェイプ型ヒト４２５ｖＬ’ｌｌ域ａ型のアミノ酸配列は図４の通りである。

リシェイプ型ヒト４２５　ｖＬ領領域構築するために、三つのオリゴヌクレオチ ドがデザインされる。これらはマウス４２５　ＶＬ領領域三つのＣＤＲをコード する内部ＤＮＡを含み、また、リシェイプ型ヒトＤ１．３ＶＬ領域中のヒトＦＲ をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズするようにデザインされた１２塩基を ５′および３′末端に含む（表１のオリゴヌクレオチド７〜９を参照されたい） 。ＣＤＲ−融合は、実施例に記述の方法で行う。

スクリーニングから陽性と推定されたクローンのＤＮＡ配列決定の後に、三点変 異体（ｔｒｆｐｌｅ　ｒａυｔａｎｔ）の全体収量として５〜１５％、好ましく は、９〜１０％が得られる。ＰＣＲエラーを含まないリシエイブ型ヒト４２５Ｖ ＬＭ域をＨ４ｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片としてＬ鎖発現ベクターにクロー ニングして、プラスミドＨＣＭＶＲＶＬａ４２５　ｐｇを得る（図１）。

リシェイプ型ヒト４２５　ＶＬおよびｖｌ、ｌｆａ域を含む二つの発現ベクター を、ここで適切な細胞にコートランスフエクトさせて（上記を参照されたい）、 機能的リシェイプ型ヒト４２５抗体の暫時発現を図る。約７２時間の後に、細胞 上清を集めて、ヒトＩｇＧの分析をＥＬＩＳＡにより行う。ヒトＩｇＧは１００ 〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲のレベルで検出することができるが、驚くことに、抗 厚結合に関するＥＬＩＳＡ分析ではＥＧＦＲへの結合は検出できない。細胞がＨ ＣＭＶ−ＲＶＬａ４２５−に／ＨＣＭＶ−ＣＶＨ４２５−ｙ−１でコ−）ランＸ ７エクトされる場合、ヒトＩｇＧが産生されて、これがＥＧＦＲに結合スル。シ カシ、細胞がＨｃＭＶ−ＣＶＬ４２５−に／ＨＣＭＶ−ＲＶ、ａ４２５−７−１ で＝ｒ−）？ンスフェクトされる場合、ヒトＩｇＧが産生されるが、これは検出 可能なレベルではＥＧＦＨに結合しない。これらの予期しない結果から、Ｉ！能 的抗厘結合部位を得るためには、リシェイプ型ヒト４２５　Ｖ＋のＦＲにおける さらに工夫された修飾が必要であることが明かである。

１シエイプ　ヒ　４２５ｖ　のＦＲにお番るリシェイブ型ヒト４２５Ｖ＋領域の ＦＲにおけるさらなる改変はマウス４２５町変領域ドメインの分子モデルに基づ いて行われる。リシェイプ塁ヒトｖＨ領域のＣＤＲループを調べて、Ｃｈｏｔｈ ｉ　ａら（１９８９）によッテ記述された標準的構造にどれほど一致するかを明 らかにする。この分析の結果、ＦＲにおける特定の改変（変異）が行なわれる。

ＦＲにおける他の改変は、これもまたサブグループＩからのヒトＦＲに基づいて デザインされた機能的リシェイプ型ヒト抗−Ｔａｃ抗体（Ｑｕｅｅｎら、１９８ ９）に基づいて行われる。驚いたことに、マウス抗−Ｔａｃ抗体のｖＨ領領域、 約７９％のマウス４２５抗体のｖＨ領領域の一致性を有する。ここで、本発明に よって、マウス４２５可変領域の分子モデルが作られる（図５）。このモデルは 構造的に解明されている抗体であるＨＹＨＥＬ−５の構造に基づき、この抗体の 可変領域はマウス４２５抗体と高度の相同性を示す。上記の・分析の結果、リシ ェイプ型ヒト４２５　ｖ、領域の位置３０．４８．６７．６８および７１のアミ ノ酸残基は、マウス４２５　ＶＨＩＪ［域におけるこれらの位置にあるアミノ酸 と一致するように改変される。これらの改変のそれぞれの影響゛を詳細に調べる ために、これらの変化の種々の組み合わせを構築して、本発明にしたがって試験 する。

全部で八つのりシェイブ型ヒト４２５Ｖｓ領域の新型を構築する（図４を参照さ れたい）。実施例に詳細に記載の方法によって作出された型から、ＤＮＡ小断片 を組換えることによって前の型から他の型を作る。一旦全部の所望の型が好まし くはｐＵｃ１８に組み込まれると、リシェイプ製ヒト４２５ＶＨ領域はＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＨＣＭＶ−ＶＨ発現ベクターに移されて、プラス ミ）’ＨＣＭＶ−ＲＶ）４４２５−７−１　ノｂ型からｉｉｌまでが作出される （図４）。

！シェ　プ　ヒト４２５ｖ　のＦＲにおシるリシェイブ型ヒト４２５ＩＪＪＩ（ ｅ型）およびキメラ４２５Ｈ鎖を発現するベクターでコートランスフェク、トさ れた細胞がＧＲＦＲに結合する抗体を確かに産生ずるが、リシェイプ型ヒト４２ ５Ｌ鎖を有する抗体はキメラ４２５抗体のようにはよく結合しない。マウス４２ ５のＶＬ領領域よびリシエイプ型ヒト４２５ａ型を調べると、ＣＤＲ−１（ＬＬ ）の標準構造（Ｃｈｏｔｈｆ　ａら、１９８９）の部分である残基７１がａｆｉ には保持されていないことが明らかにされる。ＰＣＲ−突然変異誘発法（Ｋａｍ ｍａｎら、１９８９）は、この位置でＰｈｅのＴｙｒへの変化を導入するために 好ましく用いられる。この突然変異誘発によって作出されるＨｉｎｄｌＩｌ−Ｂ ａｍＨＩ断片をＨＣＭＶ−ＶＬ発現ベクターに導入することによって、ＨＣＭＶ −ＲＶ、ｂ−４２５−にが得られる〔図４〕。

１シエイプ声ヒト４２５ｖ　の軍シェイブ　のリシエイプ型ヒトＶＨａ型〜ｉ型 を含む発現ベクターを、リシエイプ製ヒトｖＬ領域ａ型を含む発現ベクターを有 する上記の特性を有する細胞にコートランスフェクトさせる。約３日間後、細胞 上清をヒ）ＩｇＧ産主に関してＥＬＩＳＡで分析する。産生のレベルは５０〜５ ００ｎｇ／ｍｌの範囲で変動する。次いで、サンプルをＥＧＦＲへの結合能を有 するヒトＩｇＧに関してＥＬＩＳＡで分析する。リシエイプ型ヒトＶ、領域の異 なる型に応じて広範に異なる抗原結合レベルが示される（図６）。

抗原結合に関するこのＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析において、穫々のリシェイプ型ヒト４ ２５抗体を直接キメラ４２５抗体と比較することができるが、マウス４２５抗体 との比較はできない。これは抗原への結合を検出するために用いる抗体が抗ヒト ＩｇＧ抗体であるからである。リシエイプ覆ヒトｖＨ領域の九つの塁をＥＧＦＲ への結合能によってグループ分けすることができる。リシエイブ型ヒトＶＨ領域 ｇ型およびｉ型はもっとも高レベルの結合能を示し、これにｅ型、ｆｆＪｌおよ びｈ型が続き、さらにｂ型が続く。いくつかの実験において、ｅ型は低いが検出 可能なレベルの結合を示す。ｅ型およびｄ型は検出可能なレベルの結合を全く示 さない。

競合結合アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｊｔｉｏｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）を 用いて、キメラ４２５抗体と、あるいは、ｖＨのｇＷおよびｉ５を含むリシェイ プ型ヒト４２５と、マウス４２５抗体とを直接比較する（図７）。細胞上溝中の 抗体は精製されていないが、ＥＬＩＳＡによって定量されているので、競合結合 アッセイの結果は親和性の正確な定量測定ではなくむしろ結合の相対的レベルを 示すものとみなされる。例えば、ＣＯ５細胞における四つの実験からのサンプル を用いた競合結合アッセイの結果は、抗原への結合の相対的レベルに関して一致 している。キメラ４２５抗体は標識されたマウス４２５抗体とよく競合し、結合 阻害の割合（％）は非標識マウス４２５抗体を標識マウス４２５抗体と競合させ て得られるものよりもわずかに低いだけである（図７、（Ａ））。ＶＬａおよび ｖＨｇを有するリシェイプ型ヒト抗体はｖＬａおよびＶＨｉ領域を有するものよ りもよい（図７、（Ｂ））。結合曲線の平坦点の比較において、ｖＨｇを有する リシェイプ型ヒト抗体は標識されたマウス４２５抗体とは、同じアッセイでの非 標識マウス４２５抗体との場合の６０〜８０％の割合で競合することが示される 。例えば、ＣＯ８またはＣＨＯ細胞における四つの別々の実験からのサンプルを 用いた場合の結果を平均すると、ｖＬａおよびＶＨｇを含むリシェイプ型ヒト抗 体はマウス４２５抗体の６０〜８０％の結合を示す。

これらの結果に基づいて、ＦＲ中のそれぞれの残基の抗原結合への相対的寄与に 関して考察することが可能である。本研究においてもっとも重要な改変をひとつ あげるとすれば、それはＬ７１Ｖの改変である。この改変なしでは、驚くべきこ とに、抗原への結合は全く検出されない（ＶＨのｅ型とｂ型を比較せよ）。Ｒ６ ７におよびＶ６８Ａの改変もまた、驚くべきことに結合に重要である（ＶＨのｂ 型とｅ型を、またｉ型とｈ型を比較せよ）。

Ｖ　４８　Ｋ　Ｉ　ノ改変ノミ、オヨヒＶ　４８　Ｉ　Ｊ：、、　Ｓ　３０　Ｔ 　ｆ）　同時改変は有意の抗原結合をもたらさないが、これらの位置での改変は 抗原結合を促進する。驚いたことに、８３０Ｔの改変はＶ４８Ｉの改変よりも大 きな影響を及ぼす（ＶＨのｇ型とｉ型を、およびｆ型とｉ型を比較せよ）。

リシエイプ声ヒト４２５ｖ　のリシエイプμのＲＶＬｂ４２５含む発現ベクター を、リシエイプ型ヒトＶＨ領域す型、ｅ型またはｇ型を含む発現ベクターを有す る適切な、好ましくは真核細胞にコートランスフエクトさせた。細胞上清を集め て、ヒトＩｇＧ産主に関して、次いでＥＧＦＲへの結合能を有するヒトＩｇＧに 関して分析する（図８、（Ａ））。これらの結果は、リシエイプ型ヒ）　４２５ 　Ｖ、領域のｂ型が抗原への結合を増加することを示す。次いで、競合結合アッ セイを行い、ＶＬａ　＋　Ｖ、４ｇ　、　ｔ　ｆ：＋ｔ　ＶＬｂ　＋　ＶＨｇ　 ’Ｉｔ含ムリシエイプ型ヒト４２５抗体を、マウス４２５抗体と比較する。ｖＬ 領領域ｂ型を有するヒトＭＡｂ４２５はより強い抗原親和性を有する。このよう に、ｖＬ中のＦ７１Ｙ改変は抗原結合を増強する。ｖＬｂおよびＶＨｇを有する リシエイブ型ヒトＭＡｂ４２５はネズミＭＡｂ４２５の抗原に対する親和性の６ ０〜８０％を有する。

■Ｌｂ＋ｖＨｇを含むリシエイプ型ヒト抗体を用いる別の実験（実施例１０．１ １）から、ＥＧＦＲへの結合能はキメラ、リシェイプ型およびネズミ抗体で同様 であることが明らかにされる。

本発明は、ＦＲ中の残基の比較的中庸の改変が抗原結合に大きく影響することが 可能であることを示す。

マウス４２５可変領域の分子モデルによって、ＶＨ中の位置３０の残基がＣＤＲ −１に近接して分子の表面にあることが明確にされている。事実、Ｃｈｏｔｈｉ ａおよびＬｅｓｋ（１９８７）によって定義されるＨｌは、残基２６から３２に 伸びて、位置３０の残基を包含している。ＣＡＭＰＡＴＨ−Ｉ　Ｈ抗体において 位置３０の残基をＳｅｒからＴ　ｈ　ｒに改変すると、これは抗原結合に影響を 与えない。リシエイプ型ヒトＶ、４２５において位置３０をＳｅｒからＴｈｒに 改変すると、抗原への結合は改善される。位置３０のアミノ酸はこの特定の抗体 −桃源相互反応における抗原結合で確かに何らかの役割を果たしていると考えら れる。５３０Ｔ改変は抗原結合をほんのわずかしか改善しないこと、また、改変 が抗原結合に必須ではないことから、位置３ｏのＴｈｒは抗原と弱い相互反応を 有するだけである。

ＶＨ中の位置７１の残基の変化は、抗原結合に強く影響する。これは、この位置 の試験された二つの残基であるＶａｌとＬｅｕの違いがメチル基一つだけである ことから、驚くべきことである。マウス４２５抗体のＨ２は、Ｃｈｏｔｈｉａら （１９８９）によって定義されたグループ２標準構造であるＨ２の一つである。

ＨＹＨＥＬ−５はＨ２を有し、このＨ２はマウス４２５抗体のＨ２と同様のアミ ノ酸配列を有する。Ｈ）ｒＨＥＬ−５において、ＤＣＲ−２における位置５２Ａ のＰｒｏは、ＦＲ中の位置７１の小アミノ酸（Ａｌａ）によってつくられたくぼ みに詰め込まれる。マウス４２５可変領域のモデルでは、Ｐｒｏ−５２ＡとＶａ 　１−７１の間で同様の相互反応がある。マウス４２５Ｖ、では位置５２ＡのＰ ｒｏは位置７１のＶａｌによってつくられるくぼみに詰め込まれ得るが、位置７ １のＶａｔのＬｅｕによる置き換えは分子の不調和を起こし、ＣＤＲ−２ループ の構造を変化させ得る。この理由のために、リシエイプ壓ヒトＶ、４２５中のＶ ７１Ｌの変化は、マウス４２５　ｖ、において起きるようなＣＤＲ−２−ＦＲ相 互反応を再び起こす。驚いたことに、これによって、リシェイプ型ヒト４２５抗 体の抗原結合の性質が大きく改善される（図６のＶＨの８塁とｂ型を有するリシ エイプ型ヒト抗体を比較せよ）。

残基７１は、提案されているＬｌの標準構造（ＣＤＲ−１）　（Ｃｈｏｔｈｉａ ら、１９８９）の構成員であることから、ＶＬ中の位置７１の改変はおそら＜Ｃ ＤＲ構造に影響する。ＣＤＲ−１中の残基２９は埋もれた残基で、ＦＲ中の残基 ７１との接触を持つ。マウス４２５抗体において、ＶＬの残基７１はＴｙｒであ る。リシエイプ型と）ＶＬを構築するために用いたヒトＦＲにおいては、これは Ｐｈｅである。Ｐｈｅ中には見出だされずＴｙｒに見出だされる水酸基はＣＤＲ −１の正しい構造を維持するための役割を有すると考えられる。

マウス４２５可変領域の分子モデルから、Ｌｙｓ−６６がＡｓｐ−８６と塩架橋 を形成すると考えられる。位置６６へのより大きなＡｒｇ残基の導入は、その構 造を壊す。位置６７のＡｌａはＣＤＲ−２と相互反応し、ＶＨａ　４２５におけ るように、残基６６および６７のＡｒｇおよびＶａｌへの同時の改変はＣＤＲ− ２に有害な立体的影響を及ぼす可能性がある。位置４８の残基は、埋もれている ことが知られており（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ。

１９８７）、これはモデルで確認されている。マウス４２５抗体に見出だされる ように残基４８を、Ｉｌｅから、サブグループ■のヒトＶＨ領域において見出だ されるようにＶａｌへ変えることで、構造が広く破壊されて抗原結合に影響が出 る可能性がある。位置４８のアミノ酸もまたＣＤＲ−２に近く、ＣＤＲ−２ルー プに微妙な立体的影響を及ぼし得る。

競合結合アッセイによると、最良のリシエイプ型ヒトｖＬおよびｖＨ領域ハ、ｖ ＬｂおよびＶＨａであるｏＶＨｇは、上記のＦＲの変化の五つの全てと、リシエ イプ型と）　４２５　ＶＨｑ域の最初の型に含まれる位置９４における変化を有 する。リシェイプ型ヒト４２５　Ｖ、領域のｂ覆のＦＲは、マウス４２５　Ｖ、 領域におけるものと７０％の同一性を示す。リシエイプ型ヒト４２５　ｖＨ領領 域ｇ型のＦＲは、マウスにおけるものと８０％の同一性を示す。

の゛　およ 本発明による抗体の、ヒト患者への治療または診断のための投与は、既知の方法 によって行うことができる。

典型的には、抗体または抗体断片を、非経口的に、好ましくは、腹腔内に注射す る。しかし、本発明のモノクローナル抗体はまた、静脈注射でも投与できる。

投与する抗体の適当な力価の決定は、当業者に公知の技術範囲である。一般に、 本発明のモノクローナル抗体の投与量の範囲は、所望の腫瘍抑制効果を発揮する に充分の量である。望ましくない交差反応、アナフィラキシ−反応のような有害 な副作用を起こすような多量の投与は行うべきではない。一般に、投与量は、年 齢、条件、性別および患者の疾患の程度によって異なり、当業者によって決定で きる。投与量は、ｌ投与あたり、個々の医師によって反対適応、免疫寛容、その 他の条件の場合には調整することができる。投与量は、１投与あたり、０゜１　 ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　〜７０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　、好ましくは０．１ｍｇ／ ｋｇ　〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲で変動し、投与は１日−回またはそれ以上で、 １日または数日間行う。

非経口投与のための調製物には、滅菌水性あるいは非水性溶液、懸濁液およびエ マルジョンが含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリ エチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのよ うな注射用有機エステルがあげられる。水性担体には、水、アルコール／水性溶 液、生理的食塩水や緩衝液を含むエマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口 基剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドー糖、ブドー糖および塩化ナトリ ウム、乳酸化リンゲルまたは不揮発性油が含まれる。静脈注射用担体には、液状 補給剤、栄養補給剤、リンゲルブドー着を基にした電解質補給剤などが含まれる 。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存料やその 他の添加物を含めてもよい。

抗体は、リジンサブユニットＡ１ジフテリアトキシンまたは毒性酵素などのトキ シンに接合させることもできる。代わりに、当業者に既知の方法で放射性標識す ることもできる。しかし、本発明の抗体は、トキシンの存在なしで、ヒト単核細 胞などのエフェクター細胞の存在下で、優れた細胞毒性を発揮する。

本方法で検出および治療が可能な固形腫瘍には、黒色腫、神経膠層および癌腫が 含まれる。ＥＧＦレセプターを高度に発現しない癌細胞を、リンフ才力イン調製 物を用いて発現するように誘導することができる。また、リンフ才力イン剤は各 腫瘍細胞の間でより均質なＥＧＦレセプターの発現を起こし、その結果、より効 果的な治療が期待される。

投与に適するリンフ才力イン調製物には、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子 およびこれらの組み合わせが含まれる。これらは静脈注射で投与することができ る。

適切なリンフ才力イン投与量は、１０．０００〜１．０００．０００単位／患者 である。

診断的目的のために、抗体を放射性不透明染料に接合させるかまたは放射性標識 することができる。好ましい標識法は、ヨートゲ：／　（Ｉｏｄｏｇｅｎ）法（ Ｆｒａｋｅｒら、１９７８）である。好ましくは、抗体は診断の目的のためにＦ （ａｂ゛　）２断片として投与される。これによって優れた結果が得られ、バッ クグランドの基礎構造部分が不要になる。断片は既知の方法で調製することがで きる（例えば、Ｈｅｒｌｙｎら、１９８３）、一般に、ペプシン消化は酸性ｐＨ で行われ、断片は未消化ＩｇＧおよびＨ鎖断片とプロティンＡ−セファロース（ 登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。

本発明によるリシエイプ型ヒト４２５抗体のヒトにおける免疫応答は、マウスま たはキメラ４２５抗体のいずれよりも低い傾向にある。発明の実施のための最良 の形態において、リシエイプ壓ヒト４２５抗体の最良の型の親和性は、マウスま たはキメラ４２抗体のそれと等しい。

最適条件下でのＥＧＦＲへの結合のためのＥＧＦとの競合能は、キメラ、リシエ イプ型およびネズミ抗体で同じであることが、競合結合アッセイによって示され る。さらに、ヒトにおける治療に用いられた場合、リシエイプ型ヒト４２５抗体 はマウスまたはキメラ４２５抗体のいずれよりも効果的である。免疫原性が著し く低減されているために、リシエイプ型ヒト抗体は、より長い半減期をヒトにお いて有し、ヒト患者においていかなる有害な免疫応答をもっとも起こしにくい。

明かにされたＭＡｂ４２５の結果によって、人工的共通配列を有するヒト化モノ クローナル抗体は、認識できる最小応答をも行わないことが示される。さらなる 利点は上記の発明の概要に記述されている。

このように、本発明による新規抗体の治療および診断目的のための価値はきわめ て高い。

Ｉ　にお番る Ａｍ１ｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３，７４７Ａ ｖｉｖ　ｅｔ　ａｌ、（１９７２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　６９、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７７）、Ｊ、Ｍｏ１． 　Ｂｉｏ、１１２．５２５Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９７ｇ）、 Ｐｒｏｃ、ＮａｔＬ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５．４８５３ Ｂｒｏｏｋｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）、Ｊ、Ｃｏｍｐ、Ｃｈｅｗ、４．１８ ７Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ　ａｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｊ、Ｅｘｐ、ｌｅｄ、 １６６．１３５１Ｃａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、　０１　ｉｇｏｎ ｕｃｌｅｏ七ｉｄｅ　ＳｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ 　Ｍ　１３、　ａｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｍａｎｕ ａｌ、Ａｎｇｌｉａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ、Ｃｏｌｃｈｅｓ ｔｅｒＣｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　１８，５２９４Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、１９６．９０１Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）、Ｎａｔ ｕｒｅ　３４２．　Ｆ３７７Ｃｏ　ａｔ　ａｌ、　（１９９１）、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．２Ｃｏｈｅｎ　（１９８ ２）、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、　２５８．１５２３Ｄｏｗｎｗａｒｄ 　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ　３０７．５２１Ｅｐｐ　ｅｔ　 ａｌ、（１９７５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４、４９４３Ｅｐｐ　ｅｔ 　ａｌ、（１９８３）、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３３．　５１Ｆｒａｋ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）、ＢｉｏｃｈｅＬＩｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ ｓ、Ｃｏｒｎｒｎｕｎ、８０．８４９ Ｇｉｌｌｉｓ　ａｔ　ａｌ、（１９９０）、Ｈｕｍ、Ａｎｔｉｂｏｄ、Ｈｙｂｒ ｉｄｏｍａｓ　１、Ｇｉｏｒｇｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）、　Ｔｒａｎｓｐ ｌａｎｔ、Ｐｒｏｃ、１５、６３９Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８、４１８１ Ｇｕｂｌｅｒ　ａｔ　ａｌ、（１９８３）、Ｇｅｎｅ　２５、２６３Ｈａｌｅ　 ｅｔ　ａｌ、（１９８８）、Ｌａｎｃｅｔ、　ｉｉ、　１３９４Ｈｅｒｌｙｎ　 ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４３．　２７３１Ｈｏｇｇ ｅｎｂｏｏｍ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）、Ｊ、Ｉ＋ｉｍｕｎｏ１．　１４４． ３２１１Ｊａｆｆｅｒｓ　ａｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ ｔｆｏｎ　４１．５７２Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａＬ、（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ 　３２１、１４Ｋａａｒｉ七ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）、Ｊ、Ｉｎ＋ｍ ｕｎｏ１．　１３０、９３７Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、５ｅｑｕ ｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉａ＋＋ａｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ、）Ｉｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　 ５ｅｒｖＬｃｅｓ＋　ＵＳ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｏｆｆ ｉｃｅｓＫａｍｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、１７．５４０４Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５） 、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１、２ ９７ Ｋｏｚａｋ　（１９８７）、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏ、１９６．　９４７Ｌｅｖ ｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｇｏｎｅ　５４．　１６７Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ 、　（１９８７）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４゜ ＬｏＢｕｇｌｉｏ　ａｔ　ａｌ、（１９８９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８６、４２２０ Ｍａｅｄａ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、Ｈｕｍ、Ａｎｔｉｂｏｄ、Ｈｙｂｒｉ ｄｏｍａｓ　２．　１Ｍａｒｔｉｎ　（１９９０）、Ｄ、Ｐｈ１１．　ｔｈｅｓ ｉｓ、０ｘｆｏｒ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ ９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６、　９２６８ Ｎａｔｈｉｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３ ２３．２５０Ｍｕｒｔｈｙ　ｅｔ　ａｔ、（１９８７）、Ａｒｃｈ、旧ｏｃｈｅ ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２５２゜Ｎａｋａｍａｙｅ　ａｔ　ａｌ、（１９８６ ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ｒｅｓ、１４，９６７９Ｐａｄｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１ ９８９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６、５９３ｇ Ｐａｎｋａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ｇ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　８５、３０８０ Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　８６、　１００２９ Ｒａｂｂｊｔｔｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１３．１６６ Ｒｅｃｈａｖｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０、　８５５ Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ　３２２，２１ Ｒｏｄｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４７．３６ ９２Ｓａｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｆｄ　Ｒ ｅｓ、１６，７９１Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ　（１９８３）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｗ、２５８．８４６Ｓｈｅｒｉｆｆ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４、８０７５ Ｓｈｅｒｉｆｆ　ｅｔ　ａｔ、（１９ｇ？）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４、　８０７５ Ｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｔ、（１９８６）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１．　２６７Ｓｕｈ 　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１，７４Ｓｕｈ　ｅｔ　ａｌ 、（１９８７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４゜Ｓｕ ｔｃｌｉｆｆｅ　（１９８８）、Ｐｈ、Ｄ、ｔｈｅｓｆｓ、Ｌｏｎｄｏｎ　Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉ七ｙＴａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、４７．　３８４７Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２） 、Ｃｅ１ｌ　２９．６７１Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、＜１９８５ａ）、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．　８７４９Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、 （１９８５ｂ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．８７６４Ｔｅｍ ｐｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）、　Ｂｉｏｌ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 ９、２６６Ｕｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ　３０９． 　４１８Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ａｔ　ａｌ、（１９８８）、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３９，１８Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、Ｉｎ　Ｅｐｅｎｅ ｔｏｓ、Ａ、Ａ＋（ｅｄ、）。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　 ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐａ＋ａｎ　ａｎｄ　Ｈａ ｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐｐ、３７Ｗａｒｄ　ａｔ　ａｌ、（１９８９）、Ｎａｔ ｕｒｅ　３４１．５４４Ｗｈｉｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｐｒｏｔ ｅｉｎ　Ｅｎｇ、１．　４９９Ｗｉｌｌｉａ＠ｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）、 Ｔｉｂｔｅｃｈ　８，２５６実施例１ のクローニングおよび己１゛ 全ＲＮＡを、ＭＡｂ４２５を産生する細胞株Ｗ４２５−１５　（ＡＣＣＴ　ＨＢ 　９６２９）から分離した。約９．６ＸＩＯ７個細胞を用いて、グアニジン−Ｃ ｓＣ１法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）を用いて全ＲＮＡを産生じた。全Ｒ ＮＡ分離に用いた細胞からの上清をＥＬＩＳＡで分析して、細胞が正しいＭＡｂ を多量に産生じていることを確認した。ポリ　（Ａ−）ＲＮＡを調製した（Ａｖ ｉｖおよびＬｅｄｅｒ。

１９７２）。二本鎖ｃＤＮＡを、マウスにおよびγ−２ａ免疫グロブリン定常領 域の５′領域と相同であるプライマ（Ｌｅｖｙら、１９８７）を第−鎖合成のプ ライマーとして用いる以外は本質的にＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｏ＋ａｎ　（ １９８３）の方法に従って、合成した。Ｌ鎖プライマーのデザインは、発表され たデータ（Ｌｅｖｙら、１９８７：Ｋａａｒｉｔｅｎら、１９８３）に基づいて デザインされた２６−ｍａｒ（オリゴヌクレオチド１、表１）であった。Ｈ鎖プ ライマーのデザインは、発表されたデータ（Ｋａａｒｉ　ｔｅｎら、１９８３　 ：　Ｋａｂａｔら、１９８７）に基づイテテザインされた２５−ｍａｒ（オリゴ ヌクレオチド２、表１）であった。プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅ＋＋＋ｓ　３８０Ｂ　ＤＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上でデザインおよび合 成されて、尿素−アクリルアミドゲル上で精製された。第二鎖合成の後、平滑末 増にしたｃＤＮＡをＳｍａＩ−消化したｐＵｃ１８（市販されている）にクロー ニングして、例えばＤＨ５−α（市販されている）などのコンピテントの大腸ｙ ｉｔｍ胞を形質転換した。コロニーを寒天プレート上に付け３２Ｐ−標識した第 −鎖合成プライマーを用いるハイブリダイゼーションによってスクリーニングし た（　Ｃａｒｔｅｒら、１９８５）。二本鎖プラスミドＤＮＡの配列決定をシー ケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。

実施例２ キメラ゛　−の それぞれの可変領域のために、前方５′および後方３・　ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）プライマーを合成した（オリゴヌクレオチド３〜６、表１）。ＰＣＲ 反応を、クローニングしたｃＤＮＡを含むｐＵｃ１８プラスミドＤＮＡ　１　ｎ 　ｇ、最終濃度各１μＭの前方および後方ＰＣＲプライマー、各２００　ｐＭｃ ｌ）　ｄ　ＮＴ　Ｐ、１０ｍＭ　）　’ＪスーＨＣＩ　（ｐＨ８，３）、５０ｍ ＭのＫＣＩ、１．５ｍＭのＭｇＣ１および０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ）を用い て行った。アンブリタフ（Ａｍｐｌｔｔａｑ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（Ｐｅ ｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を１回の分析塵たり２゜５単位加えた。９ ４℃で１．５分間の最初の溶解の後、２５′サイクルの増幅を９４℃で１分間、 ４５℃で１分間および７２℃で３分間行った。７２℃における最終の伸長ステッ プを１０分間行った。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化する前に、ＰＣＲ 反応物をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱させた。次い でＶＬまたはＶｓｉｊ域をコードするＰＣＲ断片を、発現ベクターにクローニン グした。このベクターは、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメロウィルス）エンハンサ−お よびプロモーター、細菌性ｎｅｏ遺伝子およびＳＶ４０複製開始点を含む。ヒト γ−１定常領域をコードするゲノムＤＮＡ　（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８２ ）の２、ＯＫｂのＢ　ａ　ｍ　Ｈ工断片を正しい位置方向でＶ、領域断片の下流 に挿入した（第１図のＨＣＭＶ−ＣＶＨ４２５−γ−１を参照されたい）。定常 領域断片の３′末端におけるＢａｍＨＩを除去することによってこのベクターに 更に適合化の処理を行い、可変領域を直接にＨ鎖発現ベクターにＨｉｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片として挿入することを可能にした（　Ｍａｅｄａら、１ ９９１）。ＶＬ領領域コードする断片を、同様のＨＣＭＶ発現ベクターに挿入し た。この場合のベクターは、約２．６Ｋｂの大きさで、ヒトに定常領域をコード するゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ断片、およびスプライシングアクセプタ一部位お よびポリ（Ａ÷）を含む（Ｒａｂｂｉｔｔｓら、１９８４）Ｃ図１のＨＣＭＶ− ＣＶＬ−４２５−にを参照されたい）。

実施例３ ＭＡｂ４２５Ｖおよびｖ　の　モデル ネズミＭＡｂ４２５の可変領域の分子モデルを高相同性の抗−リゾチーム抗体、 Ｈｙ　ＨＥ　Ｌ　−５（Ｓｈｅｒｉｆｆら、１９８７）の解明された構造に模し て構築した。ＭＡｂ４２５の可変領域およびＨＹＨＥＬ−５は、約９０％の相同 性を有する。

モデルは、ＵＮＩＸ作動のシリコングラフィックスアイリス（Ｓｉｌｉｃｏｎ　 Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｉｒｆｓ）　４　Ｄワークステーション上で、分子モデル化 既製プログラムの「クインタ（ＱＵＡＮＴＡ）　Ｊ　（Ｐｏｌｙｇｅｎ　Ｃａｒ ｐ、）を用いて作出した。

骨格構造の同一の残基は保持された。同一でない残基はクインタのタンパク質モ デル化設備に組み入れられた最大オーバーラツプ（ＳｎｏｗおよびＡｍｚｅｌ、 １９８６　）を用いて置換した。Ｈ鎖の三つのＮ末端残基の主要鎖構造には、そ れらの温度因子が異常に高く（バックボーン温度因子から平均＋３×標準偏差よ りも大きい）、それらがＶＨＣＤＲ−３（Ｈ３）　（Ｍａｒｔｉｎら、１９９０ ）のパブキングに影響を及ぼすことから、相同する抗体構造（ＨｙＨＥＬ−１０ （Ｐａｄｌａｎら、１９８９））が用いられた。

ＭＡｂ４２５からのｖＬ領領域ＣＤＲ−１（Ｌｌ）およびｃＤＲ−２（Ｌ２）　 配列お！（ＦＶ＋ｔａｍのＣＤＲ−１（Ｈｌ）　おＪ：びＣＤＲ−２（Ｈ２）配 列＋ｔ、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）によって仮定された標準型に一致してい た。これらループの主要銀ねじれ角度については、ＨｙＨＥＬ−５におけるもの が保たれた。ＭＡｂ４２５から１７）ＶＬ領領域ＣＤＲ−３（Ｌ３）配列および ｖＨ領域ノＣＤＲ−３（Ｈ３）は、標準構造に一致しなかった。したがって、こ のモデルは異なる方法で設計された。Ｍａｒｔｉｎら（１９８９）のコンピュー タプログラムを、ブルツクヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）データパンク（Ｂｅ ｒｎｓｔｅｉｎら、１９７７）からループ構造を抽出するために用いた。次いで 、ループ構造を配列の類似性、エネルギーおよび構造決定残基に基づイテ分類し た（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９８８　）。

トップにランクされたループ構造をグラフィック上で調べて、最良のものを肉眼 で選択した。Ｈ３は、ウシグルタチオンペルオキシダーゼ（Ｅｐｐら、１９８３ ）の残基９２〜９３の領域をモデルにして作られた。Ｌ３は、ネズミＩ　ｇＡ　 （Ｊ　５３９）　Ｆ　ａ　ｂ断片（Ｓｕｈら、１９８６）のＬ鎖の残基８８〜９ ６の領域をモデルにした作られた。

好ましくない原子接触を取り除き、ファンデルワールスおよび静電気的相互反応 を最適なものとするために、モデルに最大勾配降下および抱合勾配エネルギー最 小化（ｓｔｅｅｐｅｓｔ　ｄｅｓｃｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｇ ｒａｄｉｅｎｔｓ　ｅｎｅｒｇｙｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ）の処理を、ＣＨＡ Ｒｍポテンシャル（Ｂｒｏｏｋｓら、１９８３）を用いてＱＵＡＮＴＡで実施し たようにして行った。

実施例４ ヒト　−の リシエイプ型ヒト４２５Ｌ鎖の最初の型の構築を、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９ ８８）およびＶｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）による記載のものと同様のＣＤ Ｒ融合アプローチを用いて行った。−重鎖鋳型ＤＮＡを、ヒト抗−リゾチームＶ Ｌ領域をコードするＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を含むＭ１３ｍｐ１８ ベクター（市販されている）から調製した（ＥＰ　２３９４００、Ｇ、　Ｗｉｎ ｔｅｒ）　ｏこのＬ鎖の各ＦＲは、結晶学的に解明されたＲＥＩタンパク質に由 来する。

三つのオリゴヌクレオチドがデザインされ、これらはヒトＲＥＩに隣接するＦＲ をコードするＤＮＡ配列に相補的なりＮＡの１２塩基によってそれぞれの末端が 占められているマ’７ＸＭＡｂ　４２５ＬｉｉｉＣＤＲｅ：＋−）’するＤＮＡ 配列を有する（オリゴヌクレチド７〜９、表１）。

オリゴヌクレオチドは、前記のようにして合成され、精製された。三つのヌクレ オチドは全て燐酸化されて、Ｅｃｋｓｔｅｔｎおよび共同研究者（Ｔａｙｌｏｒ ら、１９８５　：　ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９８６　：お よび５ａｙｅｒｓら、１９８８）に従ったオリゴヌクレオチド指定のインビトロ 突然変異誘発システムにおいて同時に用いられた。このシステムの製造者のイン ストラクションに従って、エクソヌクレアーゼＩＩＩ消化ステップを行った。次 いで、反応物をフェノール／クロロホルム抽出して、エタノール沈澱させて、１ ００μｌのＴＨに再懸濁させた。１０ｐｌの量を、最終濃度でそれぞれ０．２μ ＭのＭ１３ユニバーサルブライマーおよび逆配列プライマーを含む１００μｌの ＰＣＲ増幅反応液中で鋳ＷＤＮＡとして用いた。

ｌＩｉ衝液および温度サイクル条件は、５５℃のアニーリング温度を用いる以外 は実施例２に記述と同様であった。

ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによる消化およびｐＵＣ１８へのサブクローニ ングの前に、ＰＣＲ反応物をフェノール／クロロホルムで２回抽出してエタノー ル沈澱させた。陽性と推定されたクローンを、３２ｐ−標識突然変異誘発プライ マーとのハイブリダイゼーシヨンによって同定した（　Ｃａｒｔｅｒら、１９８ ７）。クローンは配列決定によって陽性であると確認された。三つの融合ＣＤＨ の全てを含むｖＬ領領域Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片としてＶＬ発現ベ クターにクローニングして、プラスミドＨＣＭ　Ｖ　ＲＶ　Ｌ　ａ　４２５　ｇ を得た。

リシエイプ型ｖＬのｂｍを、／ｈ修飾を伴うＫａｍｍａｎｎら（１９８９）のＰ ＣＲ突然突然変異誘発剤いて構築した。

鋳ｆｉＤＮＡは、ｐＵｃ１８にサブクローニングしたＲＶＬａであった。最初の ＰＣＲ反応を、全量５０μｌで、ｌｏｇの鋳型、最終濃度ｌμＭのＭ１３逆配列 プライマー　オ！　Ｕ　フライ７−１０　（表１　）　、２００　ｐ　Ｍ　（７ ）　ｄ　Ｎ　ＴＰｓ、１０ｍＭ）リス−ＭＣＩ　（ｐＨ８，３）、５０ｍＭのＫ ＣＩ、１．５ｍＭのＭｇＣ１および０．０１％ゼラチン（Ｗ／Ｖ）を用いて行っ た。アンプリタフＤＮＡポリメラーゼを１分析当たり１単位の濃度で加えた。反 応を３回繰り返した。９４℃で１．５分間溶解した後、反応を１サイクルを９４ ℃で１分間、３７℃で１分間および７２℃で２分間で、４０サイクル行って、７ ２℃における伸長ステップを１０分間行った。反応物を集めて、ＴＡＥアガロー スゲルからＰＣＲ産生物を分離する前にフェノール／クロロホルムで抽出してエ タノール沈澱させた。次いで、最初のＰＣＲ反応物の１０分の１を第二のＰＣＲ 反応におけるプライマーの一つとして用いた。

第二の反応を、第一反応産生物および２０ｐｍｏｌのＭ１３ユニバーサルプライ マーを用いる以外は第一の反応と同様に行った。サイクルはＫａｍｍａｎｎら（ １９８９）による記載に従って行った。ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を ｐＵｃ１８にクローニングして、配列決定した。所望の変化を有するＤＮＡ断片 をｖＬ発現プラスミドにサブクロー　＝　ンクｌ、　で、プラスミ）’ＨＣＭＶ −ＲＶＬｂ　４２５−にを得た。

４２５のリシェイプ型ヒトｖＨ領域の最初のｆｆ１（ａｆｆｉ）を、化学的に合 成した。ＤＮＡ配列を所望のアミノ酸配列をコードするように、また必要な隣接 領域のＤＮＡ配列を含むようにデザインした（上記を参照されたい）。

コドンの使用は、各ＦＲをコードするＤＮＡ配列に遺伝子工学的に組み入れられ た有用な制限酵素切断部位によって哺乳動物細胞のために最適化された。４５４ ｂｐを合成して、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としテｐＵＣ１８にサブクロ ーニングした。次いで、リシェイプ型ヒト化４２５Ｈ鎖をコードするＨｉｎｄＩ ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｖＨ発現ベクターに移入して、プラスミドＨＣＭＶ−Ｒ Ｖ＋ａ−４２５ｙ−Ｌｔ得ｆ：。

八つの他の型のりシェイプ覆ヒト化Ｈ鎖を、変法で構築しな。Ｈ鎖ｆ）ａｌＪを コードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＭ　１３　ｍ　ｐ　１８に移して 、−重鎖ＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチド１１〜１３（表１）を用いて、 上記のようなＰＣＲ−適合Ｍ］３突然変異誘発を用いて、ｐＵｃ１８中にリシエ イプ型ヒト４２５　ｖＨ領領域型、ｅ型、ｉ型またはｇ型をコードするＤＮＡを 作出した。これらの型をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＨ鎖発現ベクタ ーにサブクローニングして、プラＸ　ミ）’ＨＣＭＶ　ＲＶ＋ｄ　４２５　ｙ　 １、ＨＣＭＶ−ＲＶＨｅ４２５−７　１、ＨＣＭＶ−ＲＶ、ｆ　４２５−ｙ−１ およびＨＣＭＶ−ＲＶｌ、１ｇ４２５−γ−１を作出した。

リシエイブ壓ヒト４２５　ｖＨ領領域ｍおよびｅ型をＫａｍｍａｎｎら（１９８ ９）のＰＣＲ突然突然変異誘発剤いて上記のようにして作出した。鋳型ＤＮＡは ｐＵｃ１８にサブクローニングしたりシエイプ型ヒト４２５　Ｖ、領域ａ型であ り、最初のＰＣＲ反応に用いた突然変異誘発プライマーはプライマー１３または １４（表１）のいずれかであった。突然変異誘発および配列決定の後に、所望の 変化を有する配列をＨ鎖発現プラスミドにサブクローニンクシテ、ＨＣＭ　Ｖ　 −ＲＶ　ｓ　ｂ　４２５−　ｙ　１　オヨヒＨＣＭＶ　ＲＶＨＣ４２５ｙ　１　 を得た。

リシェイプ型Ｈ鎖り型およびｉ型をすでに構築した他の型のｐＵＣをベースとし たクローンから構築した。ｅ型からの０，２ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断 片をｂ型またはｅ型のいずれかからの２．８ＫｂのＸｈｏ　１−ＨｉｎｄＩＩＩ 断片に連結させて、リシエイプ型のａ型およびｉ型をそれぞれ作出した。これら の型をコードするＨ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片をＨ鎖発現ヘク ターニサフクローニンクシテ、ＨＣＭＶ−ＲＶ、ｈ　４２５−７−１およびＨＣ ＭＶ−ＲＶＨｉ　４２５−γ−１を得た。

実施例５ ＣＯ５へのＤＮＡのトランスフェクションＣｏＳ細胞を、Ｈ鎖およびＬ鎖をコー ドする遺伝子を含む発現ベクターのそれぞれ１０ｐｇとともにエレクトロポレー ション処理した。簡単に説明すれば、プラスミド１０μｇを、ｌＸ１０７（Ｉ細 胞／　ｍ　ｌのＣＯＳ細胞のＰＢＳ懸濁液の０．８ｍｌに加えた。Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ　（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒを用いて、静電容量２４ｐＦで１９ ００ｖのパルスをかけた。１０％牛脂児血清を含む８　ｍ　ｌのＤＭＥＭにプレ ートする前に、細胞を回収するために室温で１０分間静置した。７２時間のイン キュベーションの後に、培地を集めて、細胞残滓を除去するために遠心分離して 、ＥＬＩＳＡによる分析の前に、滅菌条件下で短期間では４℃、長期間では一２ ０℃で保存した。

実施例６ ＣＨＯｆｌａへのＤＮＡのトランスフェクションを実施例５と同様にして行った 。

実施例７ エ　Ｇ　の　お　び　の ＣＯ８細胞上清に存在すると）ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって検出した。ヒトＩｇ ＧのＥＬＩＳＡ分析において、９６−ウェルのプレートをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ 全分子）でコートして、アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗−ヒ）ＩｇＧ（γ鎖 特異性）を用いて、プレートに結合したサンプル中のＩｇＧを検出した。市販さ れている精製ヒ）ＩｇＧを標準として用いた。ＭＡｂ４２５によって認識される 抗原に対する結合は、二番目のＥＬＩＳＡで決定された。プレートをＥＧＦＲタ ンパク質調製物（例えば、Ｒｏｄｅｃｋら（１９８０）の方法で得られる）でコ ートして、ＥＧＦＲへの抗体の結合を、抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異性）ペルオキ シダーゼ接合物（キメラおよびリシエイプ型ヒト抗体のため）または抗−マウス ＩｇＧ（全分子）ペルオキシダーゼ接合物（マウスＭＡｂ４２５抗体のため）（ 接合物はシグマ製）のいずれかを用いて検出した。精製したネズミＭＡｂ４２５ を標準として用いた。

実施例８ ′　ムアツセイ ネズミＭＡｂ４２５を、適合する購入可能なキットを用いてビオチン化（ｂｉｏ ｔｉｎｙｌａｔｅ）させた。ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートを最適希釈のＥＧＦＲタン パク質でコートした。

５０μｍのＣＯ８細胞上清希釈物を５０μｌのビオチン結合ネズミＭＡｂ４２５ 　（ＥＬＩＳＡによる推定で１゜７５μｇ／ｍ　１　）と混合した。各ＣＯ５細 胞上清の試験は二重に行った。プレートを室温で一晩インキユベートした。結合 したビオチン結合ネズミＭＡｂ４２５を、市販のストレプトアビジン・ホースラ ディツシュペルオキシダーゼ複合体の添加によって検出した。競合物の存在しな い対照によって、それぞれのＣＯ５細胞上清についての阻害すなわちブロックの パーセント値を、次のよう算出した。

１００−［（サンプルの○Ｄ４５０／対照のＯＤ４５０）　ｘ　１００］ 実施例９ ネズミ、リシエイプ型およびキメラＭＡｂ４２５の異なるプローブを、Ｌａｅｍ ｍｌｉらの方法による５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ）によって分析した。それぞれのサンプルの２．５μｇを各ウェルに非還元 および還元条件で入れた。タンパク質をクマシー染色で可視化した。図９（Ａ） は、サンプルが同様の純度を有することを示す。

抗体の分子量の範囲は、１８０１０００〜２００．０００でありた。

実施例１０ リシェイプ型ＭＡｂ４２５を、スパーロース（５ｕｐｅｒ。

ｓｅ）　１２　（登録商標、Ｐｈａｒ＋＋ａｃｉａ　Ｃａｒｐ、、スウェーデン ）上でのゲル濾過によって標準法に従って精製した。抗体は、ＰＢＳ　（ｐ）（ ７，４，０，８Ｍ　ＮａＣ１）（０゜１Ｍ）で溶出した。単一のピーク（５分） を得ることができた（図９、（Ｂ））。

実施例１１ ビオチン標識したＭＡｂ４２５を用いて、ＥＧＦＲへの結合を非標識ＭＡ　ｂ　 ４２５または誘導体と競合させた。

ビオチン標識は標準法によった。ＥＧＦＲを、Ａ４３１膜から標準法によって溶 解した。Ａ４３１細胞は市販のものを使用した。検出は、ＰＯＤ接合ストレプト アビジンおよび基質とともにインキュベーションした後に行った。このデータか ら阻害曲線が作成された（図１０）。

曲線によって、種々の抗体の結合が同等であることが示される。

実施例１２ 精製したネズミ、キメラおよびリシェイプ型ＭＡｂ４２５の異なるプローブを、 ＥＧＦＲへの結合に関してＥＧＦとのそれらの競合能を試験した。試験は、１２ ５ｆ　−標識Ｅ　Ｇ　Ｆ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、英国）と種々の抗 体とをＥＧＦ−レセプター陽性Ｍ（Ａ４３１）への結合に関して競合させること によって行った。試験システムは、ＳＰＡ手法（ＡｍｅｒｓｈａＩｌｌ）に基づ いた。ネズミおよびリシェイプ型抗体（３プローブ）の競合曲線はほぼ一致して いる（図１１）。

第１図 第２図 ＦＩＧ、コ 第４−１図 第４−２図 Ａ　Ｆ＋５．ｒ Ｂ ０Ｌ５０ ・ｌ。　Ｉｇ　Ｇ　（ｎｇ／ｍａｌ　Ｆ　Ｉ　［、８Ａ１　１　ｊ　、１　番　 １−１ ０　１０　２０　３０　ム０　５０　６０　７０　ＢＯ９０１００ＦＩＧ、８Ｂ 　ｆｎｇ／ｍｌｌ ＦＩＧ、９Ａ 第１０図 第１１図 二 ； ヨ ＝ 〒 要約 ヒト化およびキメラモノクローナル抗体本発明は、新規のヒト化（ｈｕｍａｎｉ ｚｅｄ）モノクローナル抗体に関し、これは少なくとも、ヒト免疫グロブリンの Ｈ鎖可変領域のＦＲの人工的な修飾された共通配列有する。さらに、本発明は、 上皮細胞増殖因子のエピトープに結合している対応するヒト化およびキメラモノ クローナル抗体に関し、関与する超可変額域は次のようなアミノ酸配列を有する 。

Ｌ鎖 ＣＤＲ−１−５ｅｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−５ｅｒ−５ｓｒ−Ｖａ　ｌ−Ｔｈｒ−Ｔ ｙｒ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｙｒ　−ＣＤＲ−２−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌ ｅｕ−Ａｌａ−３ｅｒ− ＣＤＲ−３−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−５ｅｒ　−Ｈｉ　ｓ−１１ｅ− Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ　−Ｈ鎮 ＣＤＲ−１−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−ＨｉＣＤＲ−２−Ｇｌｕ−Ｐｈ ｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌ ｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ− ＣＤＲ−３−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒ ｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ− 抗体は、治療および診断の目的で使用すること力（できる。

国際調査報告 ＦｙｍＰｃＴＺｌｓ＆？ＩＱ（ｓｔ叩９噛Ｍ−嘴−ｍ（ｘ１ト阿ドＩ！ＩＯ＆Ｉ Ｉ

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト由来ではない抗原結合部位（ＣＤＲ）と、ヒト由来のＬおよびＨ鎖の可 変領域のＦＲおよび定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体であって、少な くともＨ鎖の可変領域のＦＲがヒト免疫グロブリンの明確とされているクラスま たはサブグループ内において異なる可変領域に対する修飾された共通配列を有す ることを特徴とする。
2. ２．共通配列のＦＲが、抗原結合部位の起源であるヒト由来でない抗体の可変領 域のＦＲのアミノ酸配列と比較して少なくとも７０％の相同性を有することを特 徴とする請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
3. ３．次のような性質を有する、請求項１または２に記載のヒト化モノクローナル 抗体。 （ａ）ヒトＥＧＦレセプターに結合する。 （ｂ）ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する。 （ｃ）ＥＧＦレセプターのＥＧＦ依存性チロシンキナーゼ活性を阻害する。 （ｄ）ＥＧＦ感受性細胞の増殖を阻害する。
4. ４．抗原結合部位の超可変領域が次のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の ヒト化モノクローナル抗体。 Ｌ鎖 【配列があります】 Ｈ鎖 【配列があります】
5. ５．抗原結合部位に関連していない可変領域のＦＲが次のアミノ酸配列を有する 、請求項４に記載のヒト化モノクローナル抗体。ただし、括弧内のアミノ酸は代 わりになり得るアミノ酸である。 Ｌ鎖 【配列があります】 Ｈ鎖 【配列があります】
6. ６．Ｈ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリンのγ−１鎖のアミノ酸配列を有し、Ｌ 鎖の定常領域がヒト免疫グロブリンのк鎖のアミノ酸配列を有する、請求項４ま たは５に記載のヒト化モノクローナル抗体。
7. ７．可変および定常領域内におけるアミノ酸欠失、置換、追加または転位によっ て修飾されたアミノ酸配列の誘導配列からなり、抗原への特異的結合の生物学的 機能が保持された、請求項３〜６のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル 抗体。
8. ８．請求項１〜７のヒト化抗体のＬおよび／またはＨ鎖の可変および／または定 常領域をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、宿主細胞の形質転換 に適する発現ベクター。
9. ９．ＤＮＡ配列が請求項３〜７のいずれか１項に記載の抗体の抗体タンパク質を コードする、請求項８に記載の発現ベクター。
10. １０．ＤＳＭに受け入れ番号ＤＳＭ６３４０の下で寄託されている、ｐＲＶＬ４ ２５と命名されている発現ベクター。
11. １１．ＤＳＭに受け入れ番号ＤＳＭ６３３９の下で寄託されている、ｐＲＶＨ４ ２５と命名されている発現ベクター。
12. １２．ネズミ由来の抗原結合部位の超可変領域（ＣＤＲ）と、ヒトまたはネズミ 由来の可変領域のＦＲと、ヒト由来のＬおよびＨ鎖の定常領域を含み、超可変領 域が次のアミノ酸配列を有することを特徴とし、Ｈ鎖の定常領域がヒト免疫グロ ブリンのγ−１鎖のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリン のк鎖のアミノ酸配列を有する、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体。 Ｌ鎖 【配列があります】 Ｈ鎖 【配列があります】
13. １３．抗原結合部位に関連していない可変領域のＦＲがヒト由来であって、次の アミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のヒト化モノクローナル抗体。 Ｌ鎖 【配列があります】Ｈ鎖 【配列があります】
14. １４．抗原結合部位に関連していない可変領域のＦＲがネズミ由来であって、次 のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のキメラモノクローナル抗体。 Ｌ鎖 【配列があります】 Ｈ鎖 【配列があります】
15. １５．請求項１２または１３に記載のヒト化モノクローナル抗体または請求項１ ２または１４に記載のキメラモノクローナル抗体のＬおよび／またはＨ鎖の可変 および／または定常領域をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、宿 主細胞の形質転換に適する発現ベクター。
16. １６．受け入れ番号ＤＳＭ６３３８の下でＤＳＭに寄託されている、ｐＣＶＬ４ ２５と命名されている発現ベクター。
17. １７．受け入れ番号ＤＳＭ６３３７の下でＤＳＭに寄託されている、ｐＣＶＨ４ ２５と命名されている発現ベクター。
18. １８．培地中で形質転換した宿主細胞培養し、発現された抗体タンパク質を精製 分離することによる、ヒト由来ではない抗原結合部位の超可変領域（ＣＤＲ）お よびヒト由来のＬおよびＨ鎖の可変領域のＦＲおよび定常領域を有するヒト化モ ノクローナル抗体の、次のように特徴づけられる調製法。 （ａ）ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグルーブのＨ鎖の異なる可変領域 （ＦＲ−１〜ＦＲ−４）に用いるアミノ酸共通配列をコードするオリゴヌクレオ チド配列を合成、または部分的に合成または分離する。ここで、用いる共通配列 は、抗原結合部位の起源であるヒト由来でない抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸 配列と比較して少なくとも７０％の相同性を有し、抗原の超可変領域への結合能 を保持するために共通配列は最高１０％までのアミノ酸の改変によって修飾され る。 （ｂ）（ａ）に記載の条件下で、ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグルー プのＬ鎖の異なる可変領域（ＦＲ−１〜ＦＲ−４）に用いるＦＲのアミノ酸共通 配列をコードする、もしくは、天然に生じる対応するアミノ酸配列をコードする 、オリゴヌクレオチド配列を合成、または一部合成または分離する。 （ｃ）それぞれの場合、元となったヒト由来でない抗体の超可変領域に対応する ＬおよびＨ鎖の超可変領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列をコードする、オリゴヌク レオチド配列を合成、または一部合成または分離する。 （ｄ）それぞれの場合、ヒト免疫グロブリンのＬおよびＨ鎖の定常領域のアミノ 酸配列をコードする、オリゴヌクレオチド配列を合成、または一部合成または分 離する。 （ｅ）それぞれの場合、少なくともブロモ−ター、複製開始点および（ａ）〜（ ｄ）によるコードＤＮＡ配列有する一つまたはいくつかの発現ベクターを構築す る。 なお、ＬおよびＨ鎖をコードするＤＮＡ配列は、一つのベクターに一緒に、ある いは代わりに、二つまたはそれ以上の異なるベクターに存在することができる。 そして、最後に、 （ｆ）（ｅ）による一つまたはそれ以上の発現ベクターで宿主細胞を形質転換す る。
19. １９．超可変領域（ＣＤＲ）を代表する次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配 列を用いる、請求項１８に記載の方法。 Ｌ鎖 【配列があります】 Ｈ鎖 【配列があります】
20. ２０．可変領域のＦＲを表す次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いる 、請求項１８または１９に記載の方法。 Ｌ鎖 【配列があります】 Ｈ鎖 【配列があります】
21. ２１．培地中で形質転換した宿主細胞を培養し、発現された抗体タンパク質を精 製分離することによる、宿主細胞が請求項１５〜１７のいずれか一つに記載の発 現ベクターで形質転換されることを特徴とする、ネズミ由来の抗原結合部位の超 可変領域（ＣＤＲ）、ネズミ由来の可変領域のＦＲおよびヒト由来のＬおよびＨ 鎖の定常領域を有する、ＥＧＦレセプターのエピトープに結合する生物学的な機 能を有するキメラモノクローナル抗体の調製法。
22. ２２．請求項１〜７または請求項１２〜１３のいずれか１項に記載のヒト化モノ クローナル抗体を含心薬剤組成物。
23. ２３．請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のキメラモノクローナル抗体を含 む薬剤組成物。
24. ２４．請求項３〜７または１２〜１４のいずれか１項に記載のヒト化またはキメ ラ抗体の、腫瘍に対する医薬物の製造のための使用。
25. ２５．請求項３〜７または１２〜１４のいずれか１項に記載のヒト化またはキメ ラ抗体の、腫瘍増殖の診断的探索および評価のための使用。
26. ２６．ネズミＭＡｂ４２５に由来する精製ヒト化およびキメラモノクローナル抗 体。