ES2370054T3

ES2370054T3 - Biomarcadores y procedimientos para determinar la sensibilidad a moduladores del receptor del factor de crecimiento epidérmico.

Info

Publication number: ES2370054T3
Application number: ES06813702T
Authority: ES
Inventors: Shirin K. Ford; Edwin A. Clark; Xin Huang
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2006-08-24
Publication date: 2011-12-12
Anticipated expiration: 2026-08-24
Also published as: JP2009505658A; US20100221754A1; US20120195889A1; WO2007025044A3; EP1917528B1; WO2007025044A2; EP1917528A4; CA2620195A1; ATE520979T1; WO2007025044A8; US8129114B2; EP1917528A2

Abstract

Un procedimiento in vitro para predecir la probabilidad de que un mamífero responda terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende administrar un modulador de EGFR que inhibe la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en el que el procedimiento comprende medir el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina en una muestra biológica de dicho mamífero, en el que un nivel de expresión elevado de dichos biomarcadores respecto a un nivel predeterminado indica una probabilidad aumentada de que el mamífero responda terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.

Description

Biomarcadores y procedimientos para determinar la sensibilidad a moduladores del receptor del factor de crecimiento epidérmico

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la farmacogenómica y, más específicamente, a procedimientos para determinar la sensibilidad a fármacos en pacientes para permitir la identificación de perfiles genéticos individualizados que contribuirán al tratamiento de enfermedades y trastornos.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una enfermedad con una heterogeneidad histoclínica amplia. Aunque las características histológicas y clínicas convencionales se han correlacionado con el pronóstico, el mismo tipo de pronóstico aparente de tumores varía ampliamente en su sensibilidad a terapia y posterior supervivencia del paciente.

Son necesarios nuevos marcadores pronósticos y predictivos que facilitarían una individualización de la terapia para cada paciente para predecir con exactitud la respuesta del paciente a tratamientos, tales como fármacos de moléculas pequeñas o moléculas biológicas, en la clínica. El problema puede resolverse mediante la identificación de nuevos parámetros que predecirían mejor la sensibilidad del paciente al tratamiento. La clasificación de muestras de pacientes es un aspecto crucial del diagnóstico y tratamiento del cáncer. La asociación de una respuesta del paciente a un tratamiento con marcadores moleculares y genéticos puede abrir nuevas oportunidades para el desarrollo de tratamientos en pacientes que no responden, o distinguir una indicación de tratamiento entre otras elecciones de tratamiento debido a una mayor confianza en la eficacia. Además, la preselección de pacientes que es probable que respondan bien a una medicina, fármaco o terapia de combinación puede reducir el número de pacientes necesarios en un estudio clínico o acelerar el tiempo necesario para completar un programa de desarrollo clínico (Cockett y col., Current Opinion in Biotechnology, 11: 602-609 (2000)).

La capacidad para predecir la sensibilidad a fármacos en pacientes es particularmente desafiante porque las respuestas a fármacos no sólo reflejan propiedades intrínsecas a las células diana, sino también las propiedades metabólicas del huésped. Los esfuerzos por usar información genética para predecir la sensibilidad a fármacos se han centrado principalmente en genes individuales que tienen amplios efectos, tales como los genes de multirresistencia a fármacos mdr1 y mrp1 (Sonneveld, J. Intern. Med., 247: 521-534 (2000)).

El desarrollo de tecnologías de micromatrices para la caracterización a gran escala del patrón de expresión de ARNm de genes ha hecho posible buscar sistemáticamente marcadores moleculares y categorizar los cánceres en distintos subgrupos no evidentes por procedimientos histopatológicos tradicionales (Khan y col., Cancer Res., 58: 5009-5013 (1998); Alizadeh y col., Nature, 403: 503-511 (2000); Bittner y col., Nature, 406: 536-540 (2000); Khan y col., Nature Medicine, 7(6): 673-679 (2001); y Golub y col., Science, 286: 531-537 (1999); Alon y col., P. N. A. S. USA, 96: 6745-6750 (1999)). Dichas tecnologías y herramientas moleculares han hecho posible controlar el nivel de expresión de un gran número de transcritos dentro de una población celular en cualquier momento dado (véase, por ejemplo, Schena y col., Science, 270: 467-470 (1995); Lockhart y col., Nature Biotechnology, 14: 1675-1680 (1996); Blanchard y col., Nature Biotechnology, 14: 1649 (1996); Patente de Estados Unidos Nº 5.569.588).

Estudios recientes demuestran que la información de la expresión génica generada por análisis de micromatrices de tumores humanos puede predecir el desenlace clínico (van’t Veer y col., Nature, 415: 530-536 (2002); Sorlie y col.,

P. N. A. S. USA, 98: 10869-10874 (2001); M. Shipp y col., Nature Medicine, 8(1): 68-74 (2002): Glinsky y col., The Journal of Clin. Invest., 113(6): 913-923 (2004)). Estos descubrimientos traen la esperanza de que el tratamiento del cáncer se mejorará enormemente prediciendo mejor la respuesta de tumores individuales a terapia.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y sus efectores de señalización aguas abajo, particularmente miembros de la ruta de Ras/Raf/MAP quinasa, desempeñan un papel importante en la biología de células epiteliales tanto normales como malignas (Normanno y col., Gene 366, 2-16 (2006)) y por lo tanto se han convertido en dianas establecidas para el desarrollo terapéutico. Mientras que el anticuerpo anti-EGFR cetuximab y los inhibidores de tirosina quinasa moleculares pequeños de EGFR (TKI) gefitinib y erlotinib han demostrado actividad en un subconjunto de pacientes (Baselga y Arteaga, J. Clin. Oncol. 23, 2445-2459 (2005)), su desarrollo clínico inicial no se ha beneficiado de una estrategia adjunta para identificar las poblaciones de pacientes que más probablemente obtendrían beneficio. La hipótesis de que sólo un número relativamente pequeño de tumores son “dependientes de la ruta de EGFR” y, por lo tanto, es probable que respondan a inhibidores de EGFR podría explicar la actividad clínica limitada que se observa con esta clase de agentes terapéuticos. Por ejemplo, en pacientes con cáncer colorrectal metastásico refractario los índices de respuesta clínica con cetuximab varían sistemáticamente del 11% en un entorno de monoterapia al 23% en un entorno de combinación con quimioterapia (Cunningham y col., N. Engl. J. Med 351, 337-345 (2004)). Hasta la fecha, esfuerzos significativos se han centrado en elucidar los mecanismos de sensibilidad o resistencia a la inhibición del EGFR, particularmente a través de la evaluación de la expresión de proteína EGFR, mutaciones de dominios quinasa y número de copias de genes.

Aunque la expresión de proteína relativa del EGFR según se mide por inmunohistoquímica (IHC) se ha demostrado

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en muchos tumores sólidos (Ciardiello y Tortora, Eur. J. Cancer 399, 1348-1354 (2003)), no se ha establecido una asociación uniforme entre la expresión de EGFR y la respuesta a inhibidores de EGFR. Estudios clínicos de cetuximab en un entorno de monoterapia y en combinación con irinotecán en pacientes con CCRm no pusieron de manifiesto ninguna asociación entre la respuesta radiográfica y la expresión de proteína EGFR según se midió por IHC (Cunningham y col., N. Engl. J. Med 351, 337-345 (2004); Saltz y col., J. Clin. Oncol. 22, 1201-1208 (2004)). Además, se han demostrado respuestas clínicas en pacientes con una expresión de proteína EGFR indetectable (Chung y col., J. Clin. Oncol., 23, 1803-1810 (2005); Lenz y col., Activity of cetuximab in patients with colorrectal cancer refractory to both irinotecan and oxaliplatin. Artículo presentado en: 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings; Saltz, Clin Colorrectal Cancer, 5 Supl. 2, S98-100 (2005)). En comparación, los estudios clínicos de erlotinib en pacientes de CPNM y gefitinib en cáncer de ovario demostraron una asociación entre la expresión de EGRF, la respuesta y la supervivencia (Schilder y col., Clin. Cancer Res., 11, 5539-5548 (2005); Tsao y col., N. Engl.

J. Med., 353, 133-144 (2005)). La presencia de mutaciones somáticas en el dominio tirosina quinasa, particularmente en el CPNM, se ha descrito ampliamente (Janne y col., J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)). En entornos tanto preclínicos como clínicos, se encuentra que estas mutaciones se correlacionan con la sensibilidad a gefitinib y erlotinib pero no con cetuximab (Janne y col., J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005); Tsuchihashi y col., N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)). Además, la ausencia de mutaciones de dominio quinasa de EGFR en pacientes de CCR sugiere que dichas mutaciones no subyacen tras la respuesta al cetuximab. También se ha evaluado el número de copias de gen de EGFR como predictor potencial de la respuesta a inhibidores de EGFR. Los estudios clínicos de gefitinib demostraron una asociación entre un número de copias de EGFR aumentado, el estado de mutación y la respuesta clínica (Cappuzzo y col., J. Natl. Cancer Inst., 97, 643-655 (2005)). Una asociación similar se identificó en un pequeño número de pacientes tratados con los anticuerpos monoclonales anti-EGFR cetuximab y panitumumab (Moroni y col., Lancet Oncol., 6, 279-286 (2005)). También se han evaluado biomarcadores predictivos potenciales adicionales. Por ejemplo, en pacientes de glioblastoma, se encontró una asociación significativa entre la coexpresión de EGFRvIII y PTEN y la respuesta a inhibidores moleculares pequeños de EGFR (Mellinghoff y col., N. Engl. J. Med., 353, 2012-2024 (2005)).

La actividad anti-tumoral del cetuximab se ha atribuido a su capacidad para bloquear la unión de ligando de EGFR y la activación de EGFR dependiente de ligando. La actividad clínica del cetuximab se ha demostrado en múltiples tipos de tumorales epiteliales (Bonner y col., N. Engl. J. Med., 354, 567-578 (2006); Cunningham y col., N. Engl. J. Med., 351, 337-345 (2004)), sin embargo, continúan observándose respuestas en sólo una fracción de los pacientes. Los intentos previos por identificar predictores de sensibilidad o resistencia como se han descrito anteriormente se han centrado en biomarcadores específicos, más que en el uso de estrategias de descubrimiento genómico. Además, rara vez se han examinado marcadores basados en ARN, ADN y proteínas en la misma población de paciente en un solo estudio, haciendo que las comparaciones supongan un reto.

Se han descrito biomarcadores útiles para determinar la sensibilidad a moduladores de EGFR en las solicitudes PCT publicadas US 2005/019785, WO2004/063709, WO2005/067667 y WO2005/094332.

Son necesarios procedimientos nuevos y alternativos para determinar la sensibilidad a fármacos en pacientes para permitir el desarrollo de perfiles genéticos individualizados que son necesarios para tratar enfermedades y trastornos basándose en la respuesta del paciente a nivel molecular.

Sumario de la invención:

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para predecir la probabilidad de que un mamífero responda terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende administrar un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en el que el procedimiento comprende:

(a): medir el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina en una muestra biológica de dicho mamífero;

(b): después de la exposición del mamífero al modulador de EGFR, medir en una muestra biológica de dicho mamífero el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores,

en el que un aumento en el nivel de dichos biomarcadores medido en la etapa (b) en comparación con el nivel de dichos biomarcadores medido en la etapa (a) indica una probabilidad aumentada de que el mamífero responda terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.

La presente invención también se refiere a un procedimiento in vitro para predecir la probabilidad de que un mamífero responda terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende administrar un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en el que el procedimiento comprende medir el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina en una muestra biológica de dicho mamífero, en el que un nivel de expresión elevado de dichos biomarcadores respecto a un nivel predeterminado indica un aumento de la probabilidad de que el mamífero responda terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.

Por lo tanto, la invención proporciona procedimientos para determinar la sensibilidad del paciente a uno o más

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moduladores del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. La invención también proporciona procedimientos de determinación o predicción de si un individuo en necesidad de terapia para una patología tal como cáncer responderá o no al tratamiento antes de la administración del tratamiento, en el que el tratamiento comprende la administración de uno o más moduladores de EGFR. El uno o más moduladores de EGFR que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR son compuestos que pueden seleccionarse de, por ejemplo, uno o más ligandos específicos de EGFR, uno o más inhibidores de EGFR moleculares pequeños o uno o más anticuerpos monoclonales de unión a EGFR.

La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra de tejido que comprende células cancerosas y el tejido está fijado, embebido en parafina, fresco o congelado.

En otro aspecto, el modulador de EGFR es cetuximab.

Una diferencia en el nivel de dichos biomarcadores que es suficiente para predecir la probabilidad de que el mamífero responda o no terapéuticamente al procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal puede determinarse fácilmente por un experto en la materia usando técnicas conocidas. El aumento o disminución en el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores puede correlacionarse para determinar si la diferencia es suficiente para predecir la probabilidad de que un mamífero responda terapéuticamente. La diferencia en el nivel de los biomarcadores que es suficiente, en un aspecto, puede predeterminarse antes de predecir la probabilidad de que el mamífero responda terapéuticamente al tratamiento. En un aspecto, la diferencia en el nivel del biomarcador es una diferencia al nivel de ARNm (medido, por ejemplo, por RT-PCR o una micromatriz), tal como al menos una diferencia de dos veces, al menos una diferencia de tres veces, o al menos una diferencia de cuatro veces en el nivel de expresión. En otro aspecto, la diferencia en el nivel del biomarcador se refiere a un valor p de <0,05 en un análisis Anova (prueba t). Como se usa en el presente documento, responder terapéuticamente se refiere al alivio o supresión del cáncer. Esto significa que la expectativa de vida de un individuo afectado con el cáncer aumentará o que uno o más de los síntomas del cáncer se reducirán o mejorarán. El término incluye una reducción en el crecimiento de células cancerosas o el volumen tumoral. Si un mamífero responde terapéuticamente puede medirse por muchos procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como formación de imágenes de PET.

El mamífero puede ser, por ejemplo, un ser humano, rata, ratón, perro, conejo, cerdo, oveja, vaca, caballo, gato, primate o mono.

El procedimiento de la invención es un procedimiento in vitro que comprende medir el nivel de los biomarcadores en la muestra biológica. La muestra biológica es una muestra biológica tomada del mamífero y la medición del nivel de los biomarcadores en la muestra biológica es para medir el nivel de los biomarcadores en el mamífero. La muestra biológica puede comprender, por ejemplo, al menos uno de suero, sangre fresca completa, células mononucleares de sangre periférica, sangre completa congelada, plasma fresco, plasma congelado, orina, saliva, piel, folículo piloso, médula ósea o tejido tumoral.

El nivel de al menos un biomarcador adicional puede ser, por ejemplo, el nivel de proteína y/o transcrito de ARNm del biomarcador. El nivel del biomarcador puede determinarse, por ejemplo, por RT-PCR u otro procedimiento basado en PCR, inmunohistoquímica, técnicas de proteómica o cualquier otro procedimiento conocido en la técnica

o su combinación.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para identificar un mamífero que responderá terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende la administración de un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en el que el procedimiento comprende: (a) medir en una muestra biológica de dicho mamífero el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina; (b) exponer una muestra biológica del mamífero al modulador de EGFR, (c) después de la exposición en la etapa (b), medir en dicha muestra biológica el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores, en el que una diferencia en el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores medido en la etapa (c) en comparación con el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores medido en la etapa (a) indica que el mamífero responderá terapéuticamente a dicho procedimiento del tratamiento del cáncer colorrectal.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para identificar un mamífero que responderá terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende administrar un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en el que el procedimiento comprende: (a) exponer una muestra biológica del mamífero al modulador de EGFR, (b) después de la exposición de la etapa (a), medir en dicha muestra biológica el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina de la Tabla 1, en el que una diferencia en el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores medido en la etapa (b), en comparación con el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores en un mamífero que no se ha expuesto a dicho modulador de EGFR, indica que el mamífero responderá terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento in vitro para ensayar o predecir si un mamífero responderá terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende administrar

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un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en el que el procedimiento comprende: (a) medir en una muestra biológica de dicho mamífero el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina; (b) exponer al mamífero al modulador de EGFR; (c) después de la exposición de la etapa (b), medir en el mamífero el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores, en el que una diferencia en el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores medido en la etapa (c) en comparación con el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores medido en la etapa (a) indica que el mamífero responderá terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.

Como se usa en el presente documento, el término “responder” incluye responder por medio de una respuesta biológica y celular, así como una respuesta clínica (tal como síntomas mejorados, un efecto terapéutico o un acontecimiento adverso) en un mamífero.

La descripción también desvela biomarcadores aislados seleccionados de los biomarcadores de la Tabla 1. Los biomarcadores comprenden secuencias seleccionadas de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos proporcionadas en la Tabla 1 y en el Listado de secuencias, así como fragmentos y variantes de los mismos.

La descripción también desvela conjuntos de biomarcadores que comprenden epirregulina y anfirregulina y, opcionalmente, uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de los biomarcadores de la Tabla 1.

La descripción también proporciona kits para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención.

En un aspecto, el kit comprende un recipiente adecuado que comprende una o más micromatrices especializadas de la invención, uno o más moduladores de EGFR que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR para su uso en el ensayo de células a partir de especímenes de tejido de paciente o muestras de paciente e instrucciones para su uso. El kit puede comprender además reactivos o materiales para controlar la expresión de un conjunto de biomarcadores a nivel de ARNm o proteína.

En otro aspecto, la descripción proporciona un kit que comprende epirregulina y anfirregulina y, opcionalmente, uno

o más biomarcadores seleccionados de los biomarcadores de la Tabla 1.

En otro aspecto más, la descripción proporciona un kit que comprende un ácido nucleico para detectar la presencia de los biomarcadores epirregulina y anfirregulina. En un aspecto, el kit comprende además instrucciones para determinar si un mamífero responderá o no terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende administrar un compuesto que inhibe la actividad de EGFR. En otro aspecto, las instrucciones comprenden las etapas de los procedimientos de la presente invención.

La descripción también proporciona ensayos de exploración para determinar si un paciente será susceptible o resistente al tratamiento con uno o más moduladores de EGFR que inhiban la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR.

La descripción también proporciona un procedimiento de control del tratamiento de un paciente que tiene cáncer colorrectal, en el que dicho cáncer colorrectal se trata mediante un procedimiento que comprende administrar uno o más moduladores de EGFR que inhiban la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR.

La descripción también proporciona perfiles genéticos individualizados que son necesarios para tratar el cáncer colorrectal basándose en la respuesta del paciente a nivel molecular.

La descripción también proporciona micromatrices especializadas, por ejemplo, micromatrices de oligonucleótidos o micromatrices de ADNc, que comprenden uno o más biomarcadores de la invención que tienen perfiles de expresión que se correlacionan con la sensibilidad o resistencia a uno o más moduladores de EGFR que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGF.

La descripción también proporciona anticuerpos, incluyendo policlonales o monoclonales, dirigidos contra uno o más biomarcadores de la invención.

La invención se entenderá mejor tras una lectura de la descripción detallada de la invención cuando se considera en relación con las figuras adjuntas.

Breve descripción de la figuras

La FIG. 1 ilustra un esquema usado para identificar los biomarcadores descritos en el presente documento. La FIG. 2 ilustra la generación de perfiles de expresión de los biomarcadores descritos en el presente documento. La FIG. 3 (FIGS. 3A y 3B) ilustra los perfiles de expresión de ARNm de epirregulina y anfirregulina en 30 pacientes. La FIG. 4 ilustra la relación biológica de biomarcadores descritos en el presente documento usando el análisis Ingenuity Pathway. La FIG. 5 ilustra una comparación de un solo modelo de biomarcador con múltiples modelos de biomarcadores. La FIG. 6 ilustra la filtración de marcadores candidato para respuesta a cetuximab. Los datos de expresión

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sobre 640 conjuntos de sondas de 164 tumores colorrectales primarios se sometieron a un agrupamiento jerárquico no supervisado. Los 164 tumores se dividieron en 3 clases principales (Clase 1, 2 y 3). Los 640 conjuntos de sondas se dividieron en 5 grupos (etiquetados de A a E). El grupo A, que contiene antígenos de cáncer tales como CEACAM 6 y CD24, también contiene EREG y AREG. El grupo A está más altamente expresado en la Clase 1a, que representa aproximadamente el 25% de los 164 especímenes de tumor colorrectal. La FIG. 7 (FIGS. 7A y 7B) ilustra los niveles de ARNm de epirregulina y anfirregulina en 80 pacientes. Los niveles de ARNm Affymetrix de epirregulina (EREG, 205767_at) y anfirregulina (AREG, 205239_at) se representan en el eje y. Los sujetos se ordenan por mejor respuesta clínica. Existe una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión génica entre el grupo de control de la enfermedad (CR, PR y SD) y el grupo que no responde (EREG p = 1,474e-05, AREG p = 2,489e-05). La FIG. 8 (FIG. 8A y 8B) ilustra las curvas de característica de funcionamiento del receptor (ROC) para la predicción de la respuesta del paciente. La FIG. 8A proporciona la ROC usando EREG para predecir en muestras de ensayo. EREG era el predictor génico individual superior usando el análisis de función de discriminación y tiene un área bajo la curva ROC (AUC) de 0,845 en el conjunto de ensayo, indicando un alto rendimiento para la predicción. La FIG. 8B proporciona la ROC usando AREG para predecir en el conjunto de ensayo. El gen AREG que se encontró que estaba regulado de forma coordinada con el gen EREG, tiene una AUC de 0,815 en el conjunto de ensayo, indicando que también tiene una buena potencia de predicción como predictor génico individual. La FIG. 9 ilustra los resultados obtenidos a partir de la validación de la expresión Affymetrix de AREG y EREG por qRT-PCR. Se observó una buena correlación entre los dos procedimientos (Pearson > 0,85, R2 > 0,7). Una alta expresión en matrices Affymetrix (eje y) se corresponde con valores de ΔCt reducidos a partir de ensayos de qPCR TaqMan para tanto AREG como EREG (eje x).

Descripción detallada de la invención:

La identificación de biomarcadores que proporcionen lecturas rápidas y accesibles de eficacia, exposición a fármaco

o respuesta clínica es cada vez más importante en el desarrollo clínico de candidatos a fármaco. Las realizaciones de la invención incluyen medir cambios en los niveles de proteínas secretadas, o biomarcadores plasmáticos, que representen una categoría de biomarcador. En un aspecto, las muestras de plasma, que representan una fuente de material fácilmente accesible, sirven como tejido sustituto para el análisis de biomarcadores.

La invención proporciona biomarcadores que responden a la modulación de una ruta de transducción de señales específica y también se correlacionan con la sensibilidad o resistencia a moduladores de EGFR. Estos biomarcadores pueden emplearse para predecir la respuesta a uno o más moduladores de EGFR. Los biomarcadores de la invención son ARNm de epirregulina y anfirregulina y, opcionalmente, al menos un biomarcador adicional seleccionado de la Tabla 1.

TABLA 1 -Biomarcadores

Título Unigene y SEC ID Nº:: Descripción Affymetrix Conjunto de sondas Affymetrix

NT5E: 5'-nucleotidasa, ecto (CD73): gb:NM_002526.1/DEF=Homo sapiens 5 203939_at

(LOC4907): nucleotidasa (CD73) (NT5), ARNm.

SEC ID Nº: 1 (ADN) y 129 (aminoácidos): /FEA=ARNm /GEN=NT5 /PROD=5

nucleotidasa /DB_XREF=gi:4505466

/UG=Hs.153952 5 nucleotidasa (CD73)

/FL=gb:NM_002526.1

EREG: epirregulina (L0C2069) SEC ID Nº: 2 (ADN) y 130 (aminoácidos): gb:NM_001432.1 /DEF=Homo sapiens epirregulina (EREG), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=EREG /PROD= precursor de epirregulina /DB_XREF=gi:4557566 /UG=Hs.115263 epirregulina /FL=gb:D30783.1 gb:NM_ 001432.1 205767_at

AREG: anfirregulina (factor de crecimiento: gb:NM_001657.1 /DEF=Homo sapiens 205239_at

derivado de schwannoma) (LOC374): anfirregulina (factor de crecimiento derivado de

SEC ID Nº: 3 (ADN) y 131 (aminoácidos): schwannoma) (AREG), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=AREG /PROD=anfirregulina (factor de crecimiento derivado de schwannoma) /DB_ XREF=gi:4502198 /UG=Hs.270833 anfirregulina (factor de crecimiento derivado de schwannoma)/FL=gb:M30704.1 gb:NM 001657.1

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(continuación)

LYZ: lisozima (amiloidosis renal) (LOC4069): Consenso incluye gb:AV711904 /FEA=EST 213975_s_at

SEC ID Nº: 4 (ADN) y 132 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:10731210 /DB_ XREF=est:AV711904 /CLON=DCAAIE08 /UG=Hs.277431 Homo sapiens ADNc: FLJ23356 fis, clon HEP14919

BST2: antígeno de célula estromal de médula: gb:NM_004335.2 /DEF=Homo sapiens 201641_at 2

ósea 2 (LOC684): antígeno de célula estromal de médula ósea

SEC ID Nº: 5 (ADN) y 133 (aminoácidos): (BST2), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=BST2 /PROD= antígeno de célula estromal de médula ósea 2 /DB_XREF=gi: 7262372 /UG=Hs.118110 antígeno de célula estromal de médula ósea 2 /FL=gb:D28137.1 gb: NM_004335.2

DUSP6: fosfatasa de especificidad doble 6: gb:BC005047.1 /DEF=Homo sapiens, clon 208893_s_at

(LOC1848): MGC: 12852, ARNm, cds completa.

SEC ID Nº: 6 (ADN) y 134 (aminoácidos): /FEA=ARNm /PROD=Desconocido (proteína para MGC:12852) /DB_XREF=gi:13477170 /UG=Hs.180383 fosfatasa de especificidad doble 6 /FL=gb:BC003562.1 gb:BC003143.1 gb: BC005047.1 gb:AB013382.1 gb:NM 001946.1

VAV3: oncogén vav 3 (LOC10451) SEC ID: gb:NM_006113.2 /DEF=Homo sapiens 218807_at

Nº: 7 (ADN) y 135 (aminoácidos): oncogén vav 3 (VAV3), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=VAV3 /PROD= oncogén vav 3 /DB_

XREF=gi:7262390 /UG=Hs.267659 oncogén

vav 3 /FL=gb:AF067817.1 gb: AF118887.1

gb:NM_006113.2

VAV3: oncogén vav 3 (LOC10451) SEC ID Nº: 8 (ADN) y 136 (aminoácidos): gb:AF118887.1 /DEF=Homo sapiens proteína VAV-3 (VAV-3) ARNm, corte y empalme alternativo, cds completa. /FEA=ARNm /GEN=VAV-3 /PROD= proteína VAV-3 /DB_XREF=gi: 4416407 /UG=Hs.267659 oncogén vav 3 /FL=gb:AF067817.1 gb:AF118887.1 gb:NM 006113.2 218806_s_at

CCL2: ligando de quimiocina (motivo C-C) 2: Consenso incluye gb:S69738.1 /DEF=MCP 216598_s_at

(LOC6347): 1=proteína quimiotáctica de monocitos

SEC ID Nº: 9 (ADN) y 137 (aminoácidos): humana, células endoteliales aórticas, ARNm, 661 nt. /FEA=ARNm /GEN=MCP-1 /PROD=MCP-1 /DB_XREF=gi: 545464/UG=Hs.303649 citocina inducible pequeña A2 (proteína quimiotáctica de monolitos 1, homóloga a Sig-je de ratón)

13-10-2011

(continuación)

SATB2: miembro de la familia SATB 2: Consenso incluye gb:AB028957.1 /DEF=Homo 213435_at

(LOC23314) SEC ID Nº: 10 (ADN) y 138: sapiens ARNm para proteína KIAA1034, cds

(aminoácidos): parcial. /FEA=ARNm /GEN=KIAA1034

/PROD=proteína KIAA1034

/DB_XREF=gi:5689404 /UG=Hs.12896

proteína KIAA1034

AKAP12: proteína de anclaje de quinasa A: gb:AB003476.1 /DEF=Homo sapiens ARNm 210517_s_at

(PRKA) (gravina) 12 (LOC9590): para gravina, cds completa. /FEA=ARNm

SEC ID Nº: 11 (ADN) y 139 (aminoácidos): /PROD=gravina /DB_XREF=gi:2081606 /UG=Hs.788 proteína de anclaje de quinasa A (PRKA) (gravina) 12 /FL=gb:AB003476.1

GCNT3: glucosaminil (N-acetil) transferasa 3,: gb:NM_004751.1 /DEF=Homo sapiens 219508_at

tipo mucina (LOC9245) SEC ID Nº: 12 (ADN): glucosaminil (N-acetil) transferasa 3, tipo

y 140 (aminoácidos): mucina (GCNT3), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=GCNT3 /PROD=glucosaminil (N-acetil)

transferasa 3, tipo mucina /DB_

XREF=gi:4758421 /UG=Hs.194710

glucosaminil (N-acetil) transferasa 3, tipo

mucina /FL=gb:AF102542.1 gb:AF038650.1

gb: NM 004751.1

SCRN1: secernina 1 (LOC9805): gb:NM_014766.1 /DEF=Homo sapiens 201462_at

SEC ID Nº: 13 (ADN) y 141 (aminoácidos): producto génico KIAA0193 (KIAA0193),

ARNm. /FEA=ARNm /GEN=hIAA0193

/PROD= producto génico kIAA0193 /DB_

XREF=gi:7661983 /UG=Hs.75137 producto

génico KIAA0193 /FL=gb:D83777.1 gb:NM

014766.1

FGFR3: receptor del factor de crecimiento de: gb:NM_000142.2 /DEF=Homo sapiens 204379_s_at3

fibroblastos 3 (acondroplasia, enanismo: receptor del factor de crecimiento de

tanatofórico) (LOC2261): fibroblastos (acondroplasia, enanismo

SEC ID Nº: 14 (ADN) y 142 (aminoácidos): tanatofórico) (FGFR3), variante de transcripción 1, ARNm. /FEA=ARNm /GEN=FGFR3 /PROD=receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 3, precursor de isoforma 1 /DB_XREF=gi:13112046 /UG=Hs.1420 receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 3 (acondroplasia, enanismo tanatofórico) /FL=gb:NM 000142.2 gb: M58051.1

LY96: antígeno linfocitario 96 (LOC23643): gb:NM 015364.1 /DEF=Homo sapiens proteína 206584_at

SEC ID Nº: 15 (ADN) y 143 (aminoácidos): MD-2 (MD-2), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=MD

2 /PROD=proteína MD-2 /DB_

XREF=gi:7662503 /UG=Hs.69328 proteína

MD-2 /FL=gb:AB018549.1 gb:NM_ 015364.1

gb:AF168121.1

13-10-2011

(continuación)

CKB: creatina quinasa, cerebro (LOC1152): gb:NM_001823.1 /DEF=Homo sapiens 200884_at

SEC ID Nº: 16 (ADN) y 144 (aminoácidos): creatina quinasa, cerebro (CKB), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=CKB /PROD=creatina quinasa, cerebro /DB_XREF=gi:4502850 /UG=Hs.173724 creatina quinasa, cerebro /FL=gb:L47647.1 gb:BC001190.1 gb: BC004914.1 gb:M16364.1 gb:M16451.1 gb: NM 001823.1

IFI16: proteína inducible por interferón: gb:NM_005531.1 /DEF=Homo sapiens 206332_s_at16

gamma 16 (LOC3428): proteína inducible por interferón gamma

SEC ID Nº: 17 (ADN) y 145 (aminoácidos): (IFI16), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=IFI16 /PROD=proteína inducible por interferón gamma 16 /DB_XREF=gi:5031778 /UG=Hs.155530 proteína inducible por interferón gamma 16 /FL=gb:M63838.1 gb:NM_005531.1

PRSS8: serina proteasa 8 (prostasina): gb:NM_002773.1 /DEF=Homo sapiens serina 202525_at

(LOC5652): proteasa 8 (prostasina) (PRSS8), ARNm.

SEC ID Nº: 18 (ADN) y 146 (aminoácidos): /FEA=ARNm /GEN=PRSS8 /PROD=serina

proteasa 8 (prostasina) /DB_

XREF=gi:4506152 /UG=Hs.75799 serina

proteasa 8 (prostasina) /FL=gb:BC001462.1

gb: NM_002773.1 gb:L41351.1

IL1R2: receptor de interleucina 1, tipo II: gb:NM_004633.1 /DEF=Homo sapiens 205403_at

(LOC7850): receptor de interleucina 1, tipo II (IL1R2),

SEC ID Nº: 19 (ADN) y 147 (aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=IL1R2

/PROD=receptor de interleucina 1, tipo II /DB_

XREF=gi:4758597 /UG=Hs.25333 receptor de

interleucina 1, tipo II /FL=gb:U74649.1 gb:NM_

004633.1

BHLHB3: que contiene dominio de hélice-: Consenso incluye gb:BE857425 /FEA=EST 221530_s_at

bucle-hélice básico, clase B, 3 (LOC79365): /DB_XREF=gi:10371439 /DB_

SEC ID Nº: 20 (ADN) y 148 (aminoácidos): XREF=est:7f97a11.x1 /CLON=IMAGE:

3304892 /UG=Hs.33829 proteína bHLH DEC2

/FL=gb:AB044088.1

HLA-DRB4: complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DR beta 4 (LOC3126) SEC ID Nº: 21 (ADN) y 149 (aminoácidos): gb:BC005312.1 /DEF=Homo sapiens, clon MGC:12387, ARNm, cds completa. /FEA=ARNm /PROD=Desconocido (proteína para MGC:12387) /DB_XREF=gi:13529055 /UG=Hs.318720 Homo sapiens, clon MGC: 12387, ARNm, cds completa /FL=gb: BC005312.1 gb:M16942.1 209728 at

CD163: antígeno CD163 (LOC9332) SEC ID Nº: 22 (ADN) y 150 (aminoácidos): Consenso incluye gb:Z22969.1 /DEF=H.sapiens ARNm para variante citoplásmica de antígeno 1. /FEA=ARNm /PROD=M130 variante citoplásmica de antígeno 1 /DB_XREF=gi:312143 /UG=Hs.74076 antígeno CD163 215049_x_atM130

13-10-2011

(continuación)

CD163: antígeno CD163 (LOC9332) . SEC ID: gb:NM_004244.1 /DEF=Homo sapiens 203645_s_at

Nº: 23 (ADN) y 151 (aminoácidos): antígeno CD163 (CD163), ARNm.

/FEA=ARNm /GEN=CD 163 /PROD= antígeno

CD163 /DB_XREF=gi:47S8721 /UG=Hs.

74076 antígeno CD163 /FL=gb:NM_004244.1

C13orf18: fase de lectura abierta 18 del: gb:NM_025113.1 /DEF=Homo sapiens 219471_at

cromosoma 13 (LOC80183): proteína hipotética FLJ21562 (FLJ21562),

SEC ID Nº: 24 (ADN) y 152 (aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=FLJ21562

/PROD= proteína hipotética FLJ21562 /DB_

XREF=gi:13376686 /UG=Hs.288708 proteína

hipotética FLJ21562 /FL=gb:NM 025113.1

CCL11 : ligando de quimiocina (motivo C-C): gb:D49372.1 /DEF=ARNm para eotaxina 210133_at

11 (LOC6356): humana, cds completa. /FEA=ARNm

SEC ID Nº: 25 (ADN) y 153 (aminoácidos): /PROD=eotaxina /DB_XREF=g i: 1552240 /UG=Hs.54460 subfamilia de citosina inducible pequeña A (Cys-Cys), miembro 11 (eotaxina) /FL=gb:U46573.1 gb:D49372.1 gb:NM 002986.1

SLC26A2: familia de transportador de soluto: Consenso incluye gb:AI025519 /FEA=EST 205097_at

26 (transportador de sulfato), miembro 2: /DB_XREF=gi:3241132 /DB_XREF=est:

(LOC1836) SEC ID Nº: 26 (ADN) y 154: ov75c04.x1 /CLON=IMAGE:1643142

(aminoácidos): /UG=Hs.29981 familia de transportador de

soluto 26 (transportador de sulfato), miembro 2

/FL=gb:NM 000112.1 gb:U14528.1

HLA-DQB1: complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ beta 1 (LOC3119) SEC ID Nº: 27 (ADN) y 155 (aminoácidos): gb:M32577.1 /DEF= ARNm MHC HLA-DQ beta humano, cds completa. /FEA=ARNm /GEN=HLA-DQB 1 /DB_XREF=gi: 188194/FL=gb:M32577.1 211656_x_at

ENPP2: ectonucleótido pirofosfatasa/: gb:L35594.1 /DEF= ARNm autotaxina 209392_at

fosfodiesterasa 2 (autotaxina) (LOC5168): humana, cds completa. /FEA=ARNm

SEC ID Nº: 28 (ADN) y 156 (aminoácidos): /PROD=autotaxina /DB_XREF=gi:537905 /UG=Hs.174185 ectonucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa 2 (autotaxina) /FL=gb:L35594.1

PRSS3: serina proteasa 3 (mesotripsina): gb:NM_002770.1 /DEF=Homo sapiens serina 205402_x_at

(LOC5646): proteasa 2 (tripsina 2) (PRSS2), ARNm.

SEC ID Nº: 29 (ADN) y 157 (aminoácidos): /FEA=ARNm /GEN=PRSS2 /PROD=serina

proteasa 2 (tripsina 2) /DB_ XREF=gi:4506146

/UG=Hs.241561 serina proteasa 2 (tripsina 2)

/FL=gb:NM_ 002770.1 gb:M27602.1

CXCR4: receptor de quimiocina (motivo C-X-: Consenso incluye gb:AJ224869 /DEF=Homo 217028_at

C) 4 (LOC7852): sapiens CXCR4 receptor codificante de gen

SEC ID Nº: 30 (ADN) y 158 (aminoácidos): CXCR4 /FEA=ARNm /DB_ XREF=gi:3059119

/UG=Hs.89414 receptor de quimiocina (motivo

C-X-C) 4 (fusina)

SERPINB5: inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado B (ovoalbúmina), miembro 5 (LOC5268) SEC ID Nº: 31 (ADN) y 159 (aminoácidos): gb:NM_002639.1 /DEF=Homo sapiens inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado B (ovoalbúmina), miembro 5 (SERPINB5), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=SERPINB5 /PROD=inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado B (ovoalbúmina), miembro 5 /DB_ XREF=gi:4505788 /UG=Hs.55279 inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado B (ovoalbúmina), miembro 5 /FL=gb:NM 002639.1 gb:U04313.1 204855_at

13-10-2011

(continuación)

HLA-DPB1: complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DP beta 1 (LOC3115) SEC ID Nº: 32 (ADN) y 160 (aminoácidos): gb:NM_002121.1/DEF=Homo sapiens complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DP beta 1 (HLA-DPB1), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=HLA-DPB1 /PROD=complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DPbeta 1 /DB_XREF=gi:4504404 /LTG=Hs.814 complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DP beta 1 /FL=gb:J03041.1 gb:M57466.1 gb: M83664.1 gb:NM_002121.1 gb:M28200.1 gb:M28202.1 201137_s_at

AIF1: factor inflamatorio de aloinjerto 1: Consenso incluye gb:BF213829 /FEA=EST 215051_x_at

(LOC199): /DB_XREF=gi:11107415 /DB_

SEC ID Nº: 33 (ADN) y 161 (aminoácidos): XREF=est:601848003F1 /CLON=IMAGE:

4078849 /UG=Hs.76364 factor inflamatorio de

aloinjerto 1

IL8: interleucina 8 (LOC3576): gb:NM_000584.1 /DEF=Homo sapiens 202859_x_at

SEC ID Nº: 34 (ADN) y 162 (aminoácidos): interleucina 8 (IL8), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=IL8 /PROD=interleucina 8 /DB_

XREF=gi:10834977 /UG=Hs.624 interleucina 8

/FL=gb:NM_000584.1 gb:M17017.1 gb:

M26383.1

IL8: interleucina 8 (LOC3576): gb:AF043337.1 /DEF=Homo sapiens ARNm 211506_s-at (IL8)

SEC ID Nº: 35 (ADN) y 163 (aminoácidos): de variante C-terminal de interleucina 8, cds

completa. /FEA=ARNm /GEN=IL8 /PROD=

variante C-terminal de interleucina 8/DB_

XREF=gi:12641914 /UG=Hs.624 interleucina 8

/FL=gb:AF043337.1

LY6G6D: complejo de antígeno linfocitario 6,: gb:NM_021246.1 /DEF=Homo sapiens 207457_s_at

locus G6D (LOC58530): proteína de transcrito de gen potenciado en

SEC ID Nº: 36 (ADN) y 164 (aminoácidos): megacariocitos 1 (MEGT1), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=MEGT1 /PROD= proteína de transcrito de gen potenciado en megacariocitos 1 /DB_ XREF=gi:10864054 /UG=Hs.241587 proteína de transcrito de gen potenciado en megacariocitos 1 /FL=gb:NM_021246.1 gb: AF195764.1

CYP3A5: citocromo P450, familia 3,: gb:NM_000777.1 /DEF=Homo sapiens 205765_at

subfamilia A, polipéptido 5 (LOC1577) SEC: citocromo P450, subfamilia IIIA (nifedipina

ID Nº: 37 (ADN) y 165 (aminoácidos): oxidasa), polipéptido 5 (CYP3A5), ARNm.

/FEA=ARNm /GEN=CYP3A5

/PROD=citocromo P450, subfamilia IIIA,

polipéptido 5 /DB_XREF=gi:4503230

/LJG=Hs.104117 citocromo P450, subfamilia

IIIA (nifedipina oxidasa), polipéptido 5

/FL=gb:J04813.1 gb:NM 000777.1

CSPG2: proteoglicano de sulfato de: Consenso incluye gb:BF590263 /FEA=EST 204619_s_at

condroitina 2: /DB_XREF=gi:11682587 /DB_

(versicán) (LOC 1462): XEF=est:nab22b12.x1 /CLON=IMAGE:

SEC ID Nº: 38 (ADN) y 166 (aminoácidos): 3266638 /UG=Hs.81800 proteoglicano de

sulfato de condroitina 2 (versicán) /FL=gb:NM

004385.1

13-10-2011

(continuación)

CA9: anhidrasa carbónica IX (LOC768) SEC: gb:NM_001216.1 /DEF=Homo sapiens 205199 at

ID Nº: 39 (ADN) y 167 (aminoácidos): anhidrasa carbónica IX (CA9), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=CA9 /PROD=anhidrasa carbónica LX precursor /DB_XREF=gi: 9955947 /UG=Hs.63287 anhidrasa carbónica IX /FL=gb:NM_001216.1

ACE2: enzima conversora de angiotensina I: gb:NM_021804.1 /DEF=Homo sapiens enzima 219962_at

(peptidil-dipeptidasa A) 2 (LOC59272) SEC: conversora de angiotensina I (peptidil-

ID Nº: 40 (ADN) y 168 (aminoácidos): dipeptidasa A) 2 (ACE2), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=ACE2 /PROD=enzima conversora de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 2 /DB_XREF=gi: 11225608 /UG=Hs.178098 enzima conversora de angiotensina I (peptidildipeptidasa A) 2 /FL=gb:NM_021804.1 gb:AB046569.1 gb: AF241254.1 gb:AF291820.1

CXCL13: ligando de quimiocina (motivo C-X-C) 13 (Quimioatrayente de células B) (LOC10563) SEC ID Nº: 41 (ADN) y 169 (aminoácidos): gb:NM_006419.1 /DEF=Homo sapiens subfamilia de citocina inducible pequeña B (motivo Cys-X-Cys), miembro 13 (Quimioatrayente de células B) (SCYB 13), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=SCYB13 /PROD=subfamilia de citocina inducible pequeña B (motivo Cys-X-Cys), miembro 13 (Quimioatrayente de células B) /DB_ XREF=gi:5453576 /UG=Hs.100431 subfamilia de citocina inducible pequeña B (motivo CysX-Cys), miembro 13 (Quimioatrayente de células B) /FL=gb:AF044197.1 gb:AF029894.1 gb:NM_ 006419.1 205242_at

COL10A1 : colágeno, tipo X, alfa 1 (Condrodisplasia metafiseal tipo Schmid) (LOC1300) SEC ID Nº: 42 (ADN) y 170 (aminoácidos): Consenso incluye gb:X98568 /DEF=H.sapiens gen de colágeno de tipo X /FEA=ARNm /DB_XREF=gi:1405722 /UG=Hs.179729 colágeno, tipo X, alfa 1 (Condrodisplasia metafiseal tipo Schmid) 217428_s_at

CPNE1: copina I (LOC8904): gb:NM_003915.1 /DEF=Homo sapiens copina 206918_s_at

SEC ID Nº: 43 (ADN) y 171 (aminoácidos): I (CPNE1), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=CPNE1 /PROD=copina I /DB_

XREF=gi:4503012 /UG=Hs.166887 copina I

/FL=gb:U83246.1 gb:NM 003915.1

C13orf18: fase de lectura abierta 18 del: Grupo Incl. AI129310:qc48a05.x1 Homo 44790_s_at

cromosoma 13 (LOC80183): sapiens ADNc, extremo 3 /clon=IMAGE-

SEC ID Nº: 44 (ADN) y 172 (aminoácidos): 1712816 /clon

extremo=3'/gb=AI129310/gi=3597824 /ug=Hs.

234923 /lon=811

GREM1: homólogo de gremlina 1,: gb:NM_013372.1 /DEF=Homo sapiens 218469_at

superfamilia de nudo de cisteína (Xenopus: superfamilia de nudo de cisteína 1,

laevis) (LOC26585) SEC ID Nº: 45 (ADN) y: antagonista BMP 1 (CKTSF1B1), ARNm.

173 (aminoácidos): /FEA=ARNm /GEN=CKTSF1B1

/PROD=superfamilia de nudo de cisteína 1,

antagonista BMP 1 /DB_ XREF=gi:7019348

/UG=Hs.40098 superfamilia de nudo de

cisteína 1, antagonista BMP 1 /FL=gb:

AF154054.1 gb:AF045800.1 gb:AF110137.2

gb:NM_013372.1

13-10-2011

(continuación)

HLA-DQB1: complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ beta 1 (LOC3119) SEC ID Nº: 46 (ADN) y 174 (aminoácidos): gb:M17955.1 /DEF= ARNm MHC clase II HLADQ-beta humano, cds completa. /FEA=ARNm /DB_XREF=gi:188178 /UG=Hs.73931 complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ beta 1 /FL=gb: M33907.1 gb:M17955.1 gb:M17563.1 gb: M26042.1 gb:M20432.1 gb:M16996.1 209823_x_at

TCN1: transcobalamina I (proteína de unión a vitamina B 12, familia de agente de unión R) (LOC6947) SEC ID Nº: 47 (ADN) y 175 (aminoácidos): gb:NM_001062.1 /DEF=Homo sapiens transcobalamina I (proteína de unión a vitamina B 12, familia de agente de unión R) (TCN1), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=TCN1 /PROD=transcobalamina I (proteína de unión a vitamina B12, familia de agente de unión R) /DB_ XREF=gi:4507406 /UG=Hs.2012 transcobalamina I (proteína de unión a vitamina B12, familia de agente de unión R) /FL=gb:J05068.1 gb:NM 001062.1 205513_at

PIGR: receptor de inmunoglobulina polimérico (LOC5284) SEC ID Nº: 48 (ADN) y 176 (aminoácidos): gb:NM_002644.1 /DEF=Homo sapiens receptor de inmunoglobulina polimérico (PIGR), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=PIGR /PROD=receptor de inmunoglobulina polimérico /DB_XREF=gi:11342673 /UG=Hs.288579 receptor de inmunoglobulina polimérico /FL=gb: NM 002644.1 204213_at

COL10A1 : colágeno, tipo X, alfa 1 (Condrodisplasia metafiseal tipo Schmid) (LOC1300) SEC ID Nº: 49 (ADN) y 177 (aminoácidos): Consenso incluye gb:AI376003 /FEA=EST /DB_XREF=gi:4175993 /DB_XREF=est: tc30d11.x1 /CLON=IMAGE:2066133 /UG=Hs.179729 colágeno, tipo X, alfa 1 (Condrodisplasia metafiseal tipo Schmid) /FL=gb:NM 000493.1 205941_s_at

KCTD12: que contiene dominio de: Consenso incluye gb:AI718937 /FEA=EST 212192_at

tetramerización de canal de potasio 12: /DB_XREF=gi:5036193 /DB_XREF=est:

(LOC115207): as50b04.x1 /CLON=IMAGE:2320591

SEC ID Nº: 50 (ADN) y 178 (aminoácidos): /UG=Hs.109438 Homo sapiens clon 24775 secuencia de ARNm

LCK: proteína tirosina quinasa específica de linfocitos (LOC3932) SEC ID Nº: 51 (ADN) y 179 (aminoácidos): gb:NM_005356.1 /DEF=Homo sapiens proteína tirosina quinasa específica de linfocitos (LCK), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=LCK /PROD=proteína tirosina quinasa específica de linfocitos /DB_XREF=gi:4885448/UG=Hs. 1765 proteína tirosina quinasa específica de linfocitos /FL=gb:M36881.1 gb:U07236.1 gb:NM_ 005356.1 204891_s_at

LAPTM4B: transmembrana de proteína asociada a lisosoma 4 beta (LOC55353) SEC ID Nº: 52 (ADN) y 180 (aminoácidos): gb:NM_018407.1 /DEF=Homo sapiens supuesto transportador integral de membrana (LC27), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=LC27 /PROD= supuesto transportador integral de membrana /DB_XREF=gi:8923827 /FL=gb: NM 018407.1 208029_s_at

13-10-2011

(continuación)

CEACAM5: molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 (LOC1048) SEC ID Nº: 53 (ADN) y 181 (aminoácidos): gb:NM_004363.1 /DEF=Homo sapiens molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 (CEACAM5), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=CEACAM5 /PROD= molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 /DB_XREF=gi: 11386170 /UG=Hs.220529 molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 /FL=gb:NM 004363.1 gb:M29540.1 201884_at

LDHB: lactato deshidrogenasa B (LOC3945): gb:NM_002300.1 /DEF=Homo sapiens lactato 201030_x_at

SEC ID Nº: 54 (ADN) y 182 (aminoácidos): deshidrogenasa B (LDHB), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=LDHB /PROD=lactato deshidrogenasa B /DB_XREF=gi:4557031 /UG=Hs.234489 lactato deshidrogenasa B /FL=gb:BC002362.1 gb:NM 002300.1

IFI27: proteína inducible de interferón alfa 27: gb:NM_005532.1 /DEF=Homo sapiens 202411_at

(LOC3429): proteína inducible de interferón alfa 27 (IFI27),

SEC ID Nº: 55 (ADN) y 183 (aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=IFI27 /PROD=proteína inducible de interferón alfa 27 /DB_XREF=gi:5031780/UG=Hs.278613 proteína inducible de interferón alfa 27 /FL=gb: NM 005532.1

EPHB2: EphB2 (LOC2048): gb:D31661.1 /DEF= ARNm humano para 211165_x_at

SEC ID Nº: 56 (ADN) y 184 (aminoácidos): tirosina quinasa, cds completa. /FEA=ARNm /GEN=ERK /PROD=precursor de tirosina quinasa /DB_XREF=gi:495677 /UG=Hs. 125124 EphB2 /FL=gb:D31661.1

ACACA acetil coenzima A carboxilasa alfa: Consenso incluye gb:BE855983 /FEA=EST 212186_at

(LOC31): /DB_XREF=gi: 10368561 /DB_

SEC ID Nº: 57 (ADN) y 185 (aminoácidos): XREF=est:7f85g11.x1 /CLON=IMAGE:

3303812 /UG=Hs.7232 acetil coenzima A

carboxilasa alfa /FL=gb:NM_000664.1 gb:

U19822.1

CD14: antígeno CD14 (LOC929): gb:NM_000591.1 /DEF=Homo sapiens 201743_at

SEC ID Nº: 58 (ADN) y 186 (aminoácidos): antígeno CD14 (CD14), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=CD14 /PROD=precursor de antígeno

CD 14 /DB_XREF=gi:4557416 /UG=Hs. 75627

antígeno CD14 /FL=gb:M86511.1 gb:

AF097942.1 gb:NM_000591.1

ABHD2: que contiene dominio abhidrolasa 2: Grupo Incl. AI832249:td14g10.x1 Homo 87100_at

(LOC11057): sapiens ADNc, extremo 3 /clon=IMAGE-

SEC ID Nº: 59 (ADN) y 187 (aminoácidos): 2075682 /extremo_clon=3' /gb=AI832249

/gi=5452920 /ug=Hs.211522 /lon=545

TNFRSF6B: superfamilia del receptor del: gb:NM_003823.1/DEF=Homo sapiens 206467_x_at

factor de necrosis tumoral, miembro 6b,: superfamilia del receptor del factor de necrosis

señuelo (LOC8771) SEC ID Nº: 60 (ADN) y: tumoral, miembro 6b, señuelo (TNFRSF6B),

188 (aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=TNFRSF6B /PROD= receptor de señuelo 3 /DB_XREF=gi: 4507584 /UG=Hs.278556 superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 6b, señuelo /FL=gb:AF104419.1 gb:NM_003823.1 gb:AF134240.1 gb:AF217794.1

13-10-2011

(continuación)

GREM1: homólogo de gremlina 1, superfamilia de nudo de cisteína (Xenopus laevis) (LOC26585) SEC ID Nº: 61 (ADN) y 189 (aminoácidos): gb:AF154054.1 /DEF=Homo sapiens DRM (DRM) ARNm, cds completa. /FEA=ARNm /GEN=DRM /PROD=DRM /DB_XREF=gi: 10863087 /UG=Hs.40098 superfamilia de nudo de cisteína 1, antagonista de BMP 1/FL=gb: AF154054.1 gb:AF045800.1 gb:AF110137.2 gb:NM_013372.1 218468_s_at

ACE2: enzima conversora de angiotensina I: Consenso incluye gb:AK026461.1 /DEF=Homo 222257_s_at

(peptidil-dipeptidasa A) 2 (LOC59272) SEC: sapiens ADNc: FLJ22808 fis, clon KAIA2925.

ID Nº: 62 (ADN) y 190 (aminoácidos): /FEA=ARNm /DB_ XREF=gi:10439331

/UG=Hs.178098 enzima conversora de

angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 2

COL5A2: colágeno, tipo V, alfa 2 (LOC1290): Consenso incluye gb:NM_000393.1 221730_at

SEC ID Nº: 63 (ADN) y 191 (aminoácidos): /DEF=Homo sapiens colágeno, tipo V, alfa 2

(COL5A2), ARNm. /FEA=CDS /GEN=COL5A2

/PROD=colágeno, tipo V, alfa 2

/DB_XREF=gi:4502958 /UG=Hs. 82985

colágeno, tipo V, alfa 2 /FL=gb:NM_ 000393.1

CXCL9: ligando de quimiocina (motivo C-X-C): gb:NM_002416.1 /DEF=Homo sapiens 203915_at

9 (LOC4283): monocina inducida por interferón gamma

SEC ID Nº: 64 (ADN) y 192 (aminoácidos): (MIG), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=MIG /PROD=monocina inducida por interferón gamma /DB_XREF=gi:4505186 /UG=Hs. 77367 monocina inducida por interferón gamma /FL=gb:NM_002416.1

HOXC6: caja homeo C6 (LOC3223) SEC ID: gb:NM_004503.1 /DEF=Homo sapiens caja 206858_s_at

Nº: 65 (ADN) y 193 (aminoácidos): homeo C6 (HOXC6), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=HOXC6 /PROD=caja homeo C6

/DB_XREF=gi:4758553 /UG=Hs.820 caja

homeo C6 /FL=gb:NM 004503.1

KCNMA1: canal activado por calcio de gran conductancia de potasio, subfamilia M, alfa miembro 1 (LOC3778) SEC ID Nº: 66 (ADN) y 194 (aminoácidos): gb:U11058.2 /DEF=Homo sapiens subunidad alfa de canal de potasio dependiente de voltaje y de gran conductancia de calcio (MaxiK) ARNm, cds completa. /FEA=ARNm /GEN=MaxiK /PROD= subunidad alfa de canal de potasio dependiente de voltaje y de gran conductancia de calcio /DB_XREF=gi: 7914977 /UG=Hs.89463 canal activado por calcio de gran conductancia de potasio, subfamilia M, alfa miembro 1 /FL=gb: AF025999.1 gb:NM_002247.1 gb: AF118141.1 gb:U13913.1 gb:U11717.1 gb: U23767.1 gb:U11058.2 221584_s_at

MMP1: metaloproteinasa de la matriz 1: gb:NM_002421.2 /DEF=Homo sapiens 204475_at

(colagenasa intersticial) (LOC4312) SEC ID: metaloproteinasa de la matriz 1 (colagenasa

Nº: 67 (ADN) y 195 (aminoácidos): intersticial) (MMP1), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=MMP1 /PROD=preproproteína de

metaloproteinasa de la matriz 1 /DB_

XREF=gi:13027798 /UG=Hs.83169

metaloproteinasa de la matriz 1 (colagenasa

intersticial) /FL=gb:NM_002421.2 gb:M13509.1

13-10-2011

(continuación)

PLCB4: fosfolipasa C, beta 4 (LOC5332) SEC: Consenso incluye gb:AL535113 /FEA=EST 203895_at

ID Nº: 68 (ADN) y 196 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:12798606 /DB_

XREF=est:AL535113 /CLON=CS0DF008YC23

(3 prima) /UG=Hs.283006 fosfolipasa C, beta 4

/FL=gb:NM 000933.1 gb:L41349.1

PTPRD: proteína tirosina fosfatasa,: Consenso incluye gb:BF062299 /FEA=EST 214043_at

receptor tipo, D (LOC5789): /DB_XREF=gi:10821197 /DB_

SEC ID Nº: 69 (ADN) y 197 (aminoácidos): XREF=est:7k76c03.x1 /CLON=IMAGE:

3481325 /UG=Hs.323079 Homo sapiens

ARNm; ADNc DKFZp564P116 (del clon

DKFZp564P116)

KCNK1: canal de potasio, subfamilia K,: gb:U90065.1/DEF= ARNm canal de potasio 204678_s_at

miembro 1 (LOC3775): humano KCNO1, cds completa. /FEA=ARNm

SEC ID Nº: 70 (ADN) y 198 (aminoácidos): /PROD= canal de potasio KCNO1

/DB_XREF=gi:1916294 /UG=Hs. 79351 canal

de potasio, subfamilia K, miembro 1 (TWIK-1)

/FL=gb:U33632.1 gb: U90065.1 gb:U76996.1

gb:NM_002245.1

ALOX5: araquidonato 5-lipooxigenasa: gb:NM_000698.1 /DEF=Homo sapiens 204446_s_at

(LOC240): araquidonato 5-lipooxigenasa (ALOX5),

SEC ID Nº: 71 (ADN) y 199 (aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=ALOX5

/PROD=araquidonato 5-lipooxigenasa /DB_

XREF=gi:4502056 /UG=Hs.89499

araquidonato 5-lipooxigenasa /FL=gb:

J03600.1 gb:J03571.1 gb:NM 000698.1

CXCL10: ligando de quimiocina (motivo C-X: gb:NM_001565.1 /DEF=Homo sapiens 204533_at

C) 10 (LOC3627): subfamilia de citocina inducible pequeña B

SEC ID Nº: 72 (ADN) y 200 (aminoácidos): (Cys-X-Cys), miembro 10 (SCYB10), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=SCYB 10 /PROD=precursor inducido por interferón gamma /DB XREF=gi:4504700 /UG=Hs.2248 subfamilia de citocina inducible pequeña B (Cys-X-Cys), miembro 10 /FL=gb: NM 001565.1

TMPRSS2: serina proteasa transmembrana 2: gb:AF270487.1 /DEF=Homo sapiens precursor 211689_s_at

(LOC7113): de serina proteasa regulada por andrógenos

SEC ID Nº: 73 (ADN) y 201 (aminoácidos): TMPRSS2 (TMPRSS2) ARNm, cds completa. /FEA=ARNm /GEN=TMPRSS2 /PROD= precursor de serina proteasa regulada por andrógenos TMPRSS2/DB_XREF=gi:13 540003 /FL=gb:AF270487.1

PRG1: proteoglicano 1, gránulo secretor: gb:J03223.1 /DEF= ARNm núcleo peptídico de 201858_s_at

(LOC5552): proteoglicano de gránulo secretor humano, cds

SEC ID Nº: 74 (ADN) y 202 (aminoácidos): completa. /FEA=ARNm /GEN=PRG1 /DB_ XREF=gi:190419 /UG=Hs.1908 proteoglicano 1, gránulo secretor /FL=gb: J03223.1 gb:NM_002727.1

HLA-DQA1: complejo mayor de: Consenso incluye gb:BG397856 /FEA=EST 212671_s_at

histocompatibilidad, clase II, DQ alfa 1: /DB_XREF=gi:13291304 /DB_

(LOC3117) SEC ID Nº: 75 (ADN) y 203: XREF=est:602438950F1 /CLON=IMAGE:

(aminoácidos): 4564956 /UG=Hs.198253 complejo mayor de

histocompatibilidad, clase II, DQ alfa 1

13-10-2011

(continuación)

NR4A2: subfamilia del receptor nuclear 4,: Consenso incluye gb:S77154.1 /DEF=TINUR= 216248_s_at

grupo A, miembro 2 (LOC4929): NGFI-Bnur77 homólogo de factor de

SEC ID Nº: 76 (ADN) y 204 (aminoácidos): transcripción de tipo beta humano, línea celular linfoide T, PEER, ARNm, 2469 nt. /FEA=ARNm /GEN=TINUR /DB_XREF=gi: 913966 /UG=Hs.82120 subfamilia del receptor nuclear 4, grupo A, miembro 2

KCTD12: que contiene dominio de: Consenso incluye gb:AA551075 /FEA=EST 212188_art

tetramerización de canales de potasio 12: /DB_XREF=gi:2321327 /DB_

(LOC115207): XREF=est:nk74h06.s1 /CLON=IMAGE:

SEC ID Nº: 77 (ADN) y 205 (aminoácidos): 1019291 /UG=Hs.109438 Homo sapiens clon

24775 secuencia de ARNm

RARRES3: elemento de respuesta de receptor de ácido retinoico (inducido por tazaroteno) 3 (LOC5920) SEC ID Nº: 78 (ADN) y 206 (aminoácidos): gb:NM_004585.2 /DEF=Homo sapiens elemento de respuesta de receptor de ácido retinoico (inducido por tazaroteno) 3 (RARRES3), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=RARRES3 /PROD=elemento de respuesta de receptor de ácido retinoico (inducido por tazaroteno) 3 /DB XREF=gi:8051633/UG=Hs.17466 elemento de respuesta de receptor de ácido retinoico (inducido por tazaroteno) 3 /FL=gb:AF060228.1 gb: AF092922.1 gb:NM 004585.2 gb: AB030815.1 204070_at

LDHB: lactato deshidrogenasa B (LOC3945): Consenso incluye gb:BE042354 /FEA=EST 213564_x_at

SEC ID Nº: 79 (ADN) y 207 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:8359407 /DB_ XREF=est:ho19b09.x1 /CLON=IMAGE: 3037817 /UG=Hs.234489 lactato deshidrogenasa B

CLECSF2: lectina tipo C (dominio de reconocimiento de carbohidrato, dependiente de calcio), miembro de superfamilia 2 (inducida por activación) (LOC9976) SEC ID Nº: 80 (ADN) y 208 (aminoácidos): gb:BC005254.1/DEF=Homo sapiens, Similar a lectina tipo C (dominio de reconocimiento de carbohidrato, dependiente de calcio), miembro de superfamilia 2 (inducida por activación), clon MGC: 12289, ARNm, cds completa. /FEA=ARNm /PROD=Similar a lectina tipo C (dominio de reconocimiento de carbohidrato, dependiente de calcio), miembro de superfamilia 2 (inducida por activación) /DB_XREF=gi: 13528920 /UG=Hs.85201 lectina tipo C (dominio de reconocimiento de carbohidrato, dependiente de calcio), miembro de superfamilia 2 (inducida por activación) /FL=gb:BC005254.1 gb: AB015628.1 gb:NM 005127.1 209732_at

FLNA: filamina A, alfa (proteína de unión a: Consenso incluye gb:AW051856 /FEA=EST 213746_s_at

actina 280) (LOC2316): /DB_XREF=gi:5914215 /DB_

SEC ID Nº: 81 (ADN) y 209 (aminoácidos): XREF=est:wz04a05.x 1 /CLON=IMAGE:

2557040 /UG=Hs.195464 filamina A, alfa

(proteína de unión a actina 280)

CXCL5: ligando de quimiocina (motivo C-X-C): Consenso incluye gb:AK026546.1 /DEF=Homo 214974_x_at

5 (LOC6374): sapiens ADNc: FLJ22893 fis, clon KAT04792.

SEC ID Nº: 82 (ADN) y 210 (aminoácidos): /FEA=ARNm /DB_ XREF=gi:10439427

/UG=Hs.287716 Homo sapiens ADNc:

FLJ22893 fis, clon Kart04792

13-10-2011

(continuación)

AEBP1: proteína de unión a AE 1 (LOC165): gb:NM_001129.2 /DEF=Homo sapiens 201792-at

SEC ID Nº: 83 (ADN) y 211 (aminoácidos): proteína de unión a AE 1 (AEBP1), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=AEBP1 /PROD= precursor de proteína de unión a potenciador de adipocitos 1 /DB_XREF=gi:4755145 /UG=Hs. 118397 proteína de unión a AE 1 /FL=gb: DS6479.1 gb:AF053944.1 gb:NM 001129.2

BGN: biglicano (LOC633): Consenso incluye gb:AA845258 /FEA=EST 213905_x_at

SEC ID Nº: 84 (ADN) y 212 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:2931709 /DB_

XREF=est:ak84a11.s1 /CLON=IMAGE:

1414556 /UG=Hs.821 biglicano

SULF1 : sulfatasa 1 (LOC23213): Consenso incluye gb:AI479175 /FEA=EST 212353_at

SEC ID Nº: 85 (ADN) y 213 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:4372343 /DB_XREF=est:

tm55c05.x1 /CLON=IMAGE:2162024

/UG=Hs.70823 proteína KIAA1077

COL6A2: colágeno, tipo VI, alfa 2 (LOC1292): gb:AY029208.1 /DEF=Homo sapiens ARNm 209156_s_at

SEC ID Nº: 86 (ADN) y 214 (aminoácidos): de precursor de cadena de colágeno alfa 2 tipo VI (COL6A2), cds completa, corte y empalme alternativo. /FEA=ARNm /GEN=COL6A2 /PROD= precursor de cadena de colágeno alfa 2 tipo VI /DB_ XREF=gi:13603393 /UG=Hs.159263 colágeno, tipo VI, alfa 2 /FL=gb: AY029208.1

THBS2: trombospondina 2 (LOC7058) SEC: gb:NM_003247.1 /DEF=Homo sapiens 203083_at

ID Nº: 87 (ADN) y 215 (aminoácidos): trombospondina 2 (THBS2), ARNm.

/FEA=ARNm /GEN=THBS2

/PROD=trombospondina 2 /DB XREF=gi:

4507486 /UG=Hs.108623 trombospondina 2

/FL=gb:L12350.1 gb:NM_003247.1

PLCB4: fosfolipasa C, beta 4 (LOC5332) SEC: gb:NM_000933.1 /DEF=Homo sapiens 203896_s_at

ID Nº: 88 (ADN) y 216 (aminoácidos): fosfolipasa C, beta 4 (PLCB4), ARNm.

/FEA=ARNm /GEN=PLCB4

/PROD=fosfolipasa C, beta 4 /DB_

XREF=gi:4505866 /UG=Hs.283006 fosfolipasa

C, beta 4/FL=gb:NM_ 000933.1 gb:L41349.1

CALD1: caldesmón 1 (LOC800): gb:NM_004342.2 /DEF=Homo sapiens 201617_x_at

SEC ID Nº: 89 (ADN) y 217 (aminoácidos): caldesmón 1 (CALD1), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=CALD1 /PROD=caldesmón 1 /DB_

XREF=gi:11091984 /UG=Hs.325474

caldesmón 1 /FL=gb:NM 004342.2 gb:

M64110.1

NGFRAP1: proteína asociada al receptor del: gb:NM_014380.1/DEF=Homo sapiens ejecutor 217963_s_at

factor de crecimiento nervioso 1 (TNFRSF16): de muerte celular asociado a p75NTR;

(LOC27018): proteína de células de la granulosa ovárica

SEC ID Nº: 90 (ADN) y 218 (aminoácidos): (13kD) (DXS6984E), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=DXS6984E /PROD= ejecutor de muerte celular asociado a p75NTR; proteína de células de la granulosa ovárica (13kD) /DB_ XREF=gi:7657043/UG=Hs.17775 ejecutor de muerte celular asociado a p75NTR; proteína de células de la granulosa ovárica (13kD) /FL=gb:NM-014380.1 gb:AF187064.1

13-10-2011

(continuación)

IFI16: proteína inducible por interferón: Consenso incluye gb:BG256677 /FEA=EST 208965_s_at

gamma 16 (LOC3428): /DB_XREF=gi:12766493 /DB_

SEC ID Nº: 91 (ADN) y 219 (aminoácidos): XREF=est:602370865F1 /CLON=IMAGE:

4478872 /UG=Hs.155530 proteína inducible

por interferón gamma 16 /FL=gb:AF208043.1

RAB31: RAB31, miembro de la familia del: gb:NM_006868.1 /DEF=Homo sapiens RAB31, 217763_s_at

oncogén RAS (LOC11031): miembro de la familia del oncogén RAS

SEC ID Nº: 92 (ADN) y 220 (aminoácidos): (RAB31), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=RAB31 /PROD=RAB31, miembro de la familia del oncogén RAS /DB _XREF=gi:5803130 /UG=Hs.223025 RAB31, miembro de la familia del oncogén RAS /FL=gb:AF234995.1 gb: BC001148.1 gb:U59877.1 gb:US7091.1 gb: NM_006868.1 gb:AF183421.1

COLSA1: colágeno, tipo V, alfa 1 (LOC1289): Consenso incluye gb:AI130969 /FEA=EST 203325_s_at

SEC ID Nº: 93 (ADN) y 221 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:3600985 /DB_XREF=est:

qc15e01.x1 /CLON=IMAGE:1709688

/UG=Hs.146428 colágeno, tipo V, alfa 1

/FL=gb:M76729.1 gb:D90279.1 gb:NM_

000093.1

KLK10: calicreína 10 (LOC5655): gb:BC002710.1 /DEF=Homo sapiens, 209792_s_at

SEC ID Nº: 94 (ADN) y 222 (aminoácidos): calicreína 10, clon MGC:3667, ARNm, cds

completa. /FEA=ARNm /PROD=calicreína 10

/DB_XREF=gi: 12803744 /UG=Hs.69423

calicreína 10 /FL=gb:BC002710.1

PCP4: proteína de células de Purkinje 4: gb:NM_006198.1 /DEF=Homo sapiens 205549_at

(LOC5121) SEC ID Nº: 95 (ADN) y 223: proteína de células de Purkinje 4 (PCP4),

(aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=PCP4

/PROD=proteína de células de Purkinje 4

/DB_XREF=gi:5453857 /UG=Hs.80296

proteína de células de Purkinje 4 /FL=gb:

U52969.1 gb:NM 006198.1

NR4A2: subfamilia del receptor nuclear 4,: gb:NM_006186.1 /DEF=Homo sapiens 204622_x_at

grupo A, miembro 2 (LOC4929): subfamilia del receptor nuclear 4, grupo A,

SEC ID Nº: 96 (ADN) y 224 (aminoácidos): miembro 2 (NR4A2), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=NR4A2 /PROD=subfamilia del receptor

nuclear 4, grupo A, miembro 2 /DB_

XREF=gi:5453821 /UG=Hs.82120 subfamilia

del receptor nuclear 4, grupo A, miembro 2

/FL=gb:NM_006186.1

IGFBP3: proteína de unión a factor de: gb:M31159.1 /DEF= ARNm proteína de unión 210095_s_at

crecimiento de tipo insulina 3 (LOC3486): a factor de crecimiento de tipo insulina

SEC ID Nº: 97 (ADN) y 225 (aminoácidos): dependiente de hormona de crecimiento humana, cds completa. /FEA=ARNm /GEN=IGFBP1 /DB_XREF=gi:183115 /UG=Hs.77326 proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina 3 /FL=gb:BC000013.1 gb: M31159.1

STAT1 : transductor de señales y activador: gb:BC002704.1/DEF=Homo sapiens, Similar a 209969_s_at y

de la transcripción 1, 91kDa (LOC6772): transductor de señales activador de la

SEC ID Nº: 98 (ADN) y 226 (aminoácidos): transcripción 1, 91 kD, clon MGC:3493, ARNm, cds completa. /FEA=ARNm /PROD=Similar a transductor de señales y activador de la transcripción 1, 91kD /DB_XREF=gi:12803734 /UG=Hs. 21486 transductor de señales y activador de la transcripción 1,91kD /FL=gb:BC002704.1

13-10-2011

(continuación)

CYP1B1: citocromo P450, familia 1,: Consenso incluye gb:AU144855 /FEA=EST 202436_s_at

subfamilia B, polipéptido 1 (LOC1545) SEC: /DB_XREF=gi:11006376 /DB_

ID Nº: 99 (ADN) y 227 (aminoácidos): XREF=est:AU144855

/CLON=HEMBA1003161 /UG=Hs.154654

citocromo P450, subfamilia I (inducible por

dioxina), polipéptido 1 (glaucoma 3, infantil

primario) /FL=gb:NM_000104.2 gb: U03688.1

COL1A1: colágeno, tipo I, alfa 1 (LOC1277): Consenso incluye gb:AI743621 /FEA=EST 202311_s_at

SEC ID Nº: 100 (ADN) y 228 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:5111909 /DB_XREF=est:

wg51h09.x1 /CLON=IMAGE:2368673

/UG=Hs.172928 colágeno, tipo I, alfa 1

/FL=gb:NM 000088.1

DKFZP434F0318: proteína hipotética: gb:NM_030817.1 /DEF=Homo sapiens 221031_s_at

DKFZp434F0318 (LOC81575): proteína hipotética DKFZp434F0318

SEC ID Nº: 101 (ADN) y 229 (aminoácidos): (DKFZP434F0318), ARNm. /FEA=ARNm

/GEN=DKFZP434F0318 /PROD=proteína

hipotética DKFZp434F0318

/DB_XREF=gi:13540611

/FL=gb:NM_030817.1

TUBA3: tubulina, alfa 3 (LOC7846) SEC ID: gb:AF141347.1 /DEF=Homo sapiens ARNm 209118 s at

Nº: 102 (ADN) y 230 (aminoácidos): de tubulina alfa hum-a-tub2, cds completa. /FEA=ARNm /PROD=tubulina alfa/DB_ XREF=gi:4929133 /UG=Hs.272897 Tubulina, alfa, específica de cerebro /FL=gb:AF141347.1 gb: NM_006009.1

GZMB: granzima B (granzima 2, serina: gb:J03189.1 /DEF=Gen de proteína tipo serina 210164_at

esterasa asociada a linfocito T citotóxico 1): esterasa proteolítica humana (SECT), cds

(LOC3002): completa. /FEA=ARNm /DB_XREF=gi:338010

SEC ID Nº: 103 (ADN) y 231 (aminoácidos): /UG=Hs.1051 granzima B (granzima 2, serina esterasa asociada a linfocito T citotóxico 1) /FL=gb:J04071.1 gb:J03189.1 gb:M17016.1 gb:NM_004131.2

ROBO1: rodeo, receptor de guía de axones,: Consenso incluye gb:BF059159 /FEA=EST 213194_at

homólogo 1 (Drosophila) (LOC6091): /DB_XREF=gi:10813055 /DB_

SEC ID Nº: 104 (ADN) y 232 (aminoácidos): XREF=est:7k66g04.x1 /CLON=IMAGE:

3480391 /UG=Hs.301198 rodeo (receptor de

guía de axones, Drosophila) homólogo 1

/FL=gb:AF040990.1 gb:NM_002941.1

CHGA: cromogranina A (proteína secretora paratiroidea 1) (LOC1113) SEC ID Nº: 105 (ADN) y 233 (aminoácidos): gb:NM_001275.2 /DEF=Homo sapiens cromogranina A (proteína secretora paratiroidea 1) (CHGA), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=CHGA /PROD=cromogranina A /DB_ XREF=gi:10800418 /UG=Hs.172216 cromogranina A (proteína secretora paratiroidea 1) /FL=gb:NM_001275.2 gb: BC001059.1 gb:J03483.1 gb:J03915.1 204697_s_at

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(continuación)

SLC7A8: familia de transportador de soluto 7 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+), miembro 8 (LOC23428) SEC ID Nº: 106 (ADN) y 234 (aminoácidos): gb:NM_012244.1 /DEF=Homo sapiens familia de transportador de soluto 7 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+), miembro 8 (SLC7A8), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=SLC7A8 /PROD= familia de transportador de soluto 7 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+), miembro 8 /DB_ XREF=gi:6912669 /UG=Hs.22891 familia de transportador de soluto 7 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+), miembro 8 /FL=gb: AB037669.1 gb:AF171669.1 gb:NM 012244.1 202752_x_at

GPA33: glicoproteína A33 (transmembrana): gb:NM_005814.1 /DEF=Homo sapiens 205929_at

(LOC10223): glicoproteína A33 (transmembrana)(GPA33),

SEC ID Nº: 107 (ADN) y 235 (aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=GPA33 /PROD= precursor de glicoproteína transmembrana A33 /DB XREF=gi:5031560 /UG=Hs. 13131 glicoproteína A33 (transmembrana) /FL=gb:U79725.1 gb:NM 005814.1

QPRT:quinolinato fosforribosiltransferasa (nicotinato-nucleótido pirofosforilasa (carboxilante)) (LOC23475) SEC ID Nº: 108 (ADN) y 236 (aminoácidos): gb:NM_014298.2 /DEF=Homo sapiens quinolinato fosforribosiltransferasa (nicotinatonucleótido pirofosforilasa (carboxilante)) (QPRT), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=QPRT /PROD=quinolinato fosforribosiltransfersa /DB_XREF=gi: 9257236 /UG=Hs.8935 quinolinato fosforribosiltransfersa (nicotinato-nucleótido pirofosforilasa (carboxilante)) /FL=gb:D78177.1 gb: BC005060.1 gb:NM 014298.2 204044_at

DDC: dopa descarboxilasa (descarboxilasa: gb:NM_000790.1 /DEF=Homo sapiens dopa 205311_at

de L-aminoácido aromático) (LOC1644) SEC: descarboxilasa (descarboxilasa de L-

ID Nº: 109 (ADN) y 237 (aminoácidos): aminoácido aromático) (DDC), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=DDC /PROD=dopa descarboxilasa (descarboxilasa de Laminoácido aromático) /DB_ XREF=gi:4503280 /UG=Hs.150403 dopa descarboxilasa (descarboxilasa de Laminoácido aromático) /FL=gb:BC000485.1 gb: M76180.1 gb:M88700.1 gb:NM_000790.1

COL11A1 : colágeno, tipo XI, alfa 1: gb:NM_001854.1 /DEF=Homo sapiens 204320_at

(LOC1301): colágeno, tipo XI, alfa 1 (COL11A1), ARNm.

SEC ID Nº: 110 (ADN) y 238 (aminoácidos): /FEA=ARNm /GEN=COL11A1

/PROD=colágeno, tipo XI, alfa 1 /DB_

XREF=gi:4502938 /UG=Hs.82772 colágeno,

tipo XI, alfa 1 /FL=gb:J04177.1 gb:NM_

001854.1

C2orf23: fase de lectura abierta 23 del: Consenso incluye gb:BE535746 /FEA=EST 204364_s_at

cromosoma 2 (LOC65055): /DB_XREF=gi:9764391 /DB_

SEC ID Nº: 111 (ADN) y 239 (aminoácidos): XREF=est:601060419F1 /CLON=IMAGE:

3446788 /UG=Hs.7358 proteína hipotética

FLJ13110/FL=gb:NM 022912.1

SULF1 : sulfatasa 1 (LOC23213): Consenso incluye gb:BE500977 /FEA=EST 212354_at

SEC ID Nº: 112 (ADN) y 240 (aminoácidos): /DB_XREF=gi:9703385 /DB

XREF=est:7a33h02.x1/CLON=IMAGE:

3220563 /UG=Hs.70823 proteína KIAA1077

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(continuación)

PCOLCE: potenciador de procolágeno Cendopeptidasa (LOC5118) SEC ID Nº: 113 (ADN) y 241 (aminoácidos): gb:NM_002593.2 /DEF=Homo sapiens potenciador de procolágeno C-endopeptidasa (PCOLCE), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=PCOLCE /PROD= potenciador de procolágeno C-endopeptidasa /DB_XREF=gi: 7262388 /UG=Hs.202097 potenciador de procolágeno C-endopeptidasa /FL=gb: BC000574.1 gb:AB008549.1 gb:L33799.1 gb:NM 002593.2 202465_at

C14orf78: fase de lectura abierta 78 del: Consenso incluye gb:AI935123 /FEA=EST 212992_at

cromosoma14 (LOC113146): /DB_XREF=gi:5673993 /DB_XREF=est:

SEC ID Nº: 114 (ADN) y 242 (aminoácidos): wp13h09.x1 /CLON=IMAGE:2464769

/UG=Hs.57548 EST

CXCR4: receptor de quimiocina (motivo C-X: gb:L01639.1 /DEF= ARNm de receptor de 209201_x_at

C) 4 (LOC7852): neuropéptido Y humano (clon HSY3RR)

SEC ID Nº: 115 (ADN) y 243 (aminoácidos): (NPYR), cds completa. /FEA=ARNm /GEN=NPYR /PROD=receptor de neuropéptido Y /DB_ XREF=gi:189313 /UG=Hs.89414 receptor de quimiocina (motivo C-X-C) 4 (fusina) /FL=gb: L01639.1 gb:AF025375.1 gb:M99293.1 gb: L06797.1 gb:NM_003467.1 gb:AF147204.1

CSPG2: proteoglicano de sulfato de: Consenso incluye gb:R94644 /FEA=EST 215646_s_at

condroitina 2: /DB_XREF=gi:970039 /DB_XREF=est:

(versicán) (LOC1462): yq42a12.r1 /CLON=IMAGE:198430

SEC ID Nº: 116 (ADN) y 244 (aminoácidos): /UG=Hs.306542 Homo sapiens isoforma Vint de versicán, ARNm, cds parcial

SERPINF1: inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado F (alfa-2 antiplasmina, factor derivado del epitelio pigmentario), miembro 1 (LOC5176) SEC ID Nº: 117 (ADN) y 245 (aminoácidos): gb:NM_002615.1 /DEF=Homo sapiens inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado F (alfa-2 antiplasmina, factor derivado del epitelio pigmentario), miembro 1 (SERPINF1), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=SERPINF1 /PROD= inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado F (alfa-2 antiplasmina, factor derivado del epitelio pigmentario), miembro 1 /DB_XREF=gi:4505708 /UG=Hs.173354 inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado F (alfa-2 antiplasmina, factor derivado del epitelio pigmentario), miembro 1 /FL=gb:M90439.1 gb:BC000522.1 gb:M76979.1 gb:NM_ 002615.1 202283_at

SPON1: espondina 1, proteína de la matriz: Consenso incluye gb:AB018305.1 /DEF=Homo 209436_at

extracelular (LOC10418): sapiens ARNm para proteína KIAA0762, cds

SEC ID Nº: 118 (ADN) y 246 (aminoácidos): parcial. /FEA=ARNm /GEN=KIAA0762

/PROD=proteína KIAA0762

/DB_XREF=gi:3882244 /UG=Hs.5378

espondina 1, (f-espondina) proteína de la

matriz extracelular /FL=gb:AB051390.1

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(continuación)

COL11A1 : colágeno, tipo XI, alfa 1: Cluster Incl. J04177: ARNm de colágeno tipo 37892_at

(LOC1301): XI alfa 1 humano (COL11A1), cds completa

SEC ID Nº: 119 (ADN) y 247 (aminoácidos): /cds=(161,5581) /gb=J04177 /gi=179729

/ug=Hs.82772 /lon=6158

MAFB: homólogo B de oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf (aviar) (LOC9935) SEC ID Nº: 120 (ADN) y 248 (aminoácidos): gb:NM_005461.1 /DEF=Homo sapiens homólogo de cremallera de leucina relacionada con maf (ratón) Kreisler (KRML), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=KRML /PROD= homólogo de cremallera de leucina relacionada con maf (ratón) Kreisler /DB_ XREF=gi:4885446 /UG=Hs.169487 homólogo de cremallera de leucina relacionada con maf (ratón) Kreisler /FL=gb:AF134157.1 gb:NM 005461.1 218559_s_at

DDX17: polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-: Consenso incluye gb:AW188131 /FEA=EST 213998_s_at

Ala-Asp) 17 (LOC10521): /DB XREF=gi:6462567 /DB_

SEC ID Nº: 121 (ADN) y 249 (aminoácidos): XREF=est:xj92f11.x1 /CLON=IMAGE:

2664717 /UG=Hs.6179 polipéptido de caja

DEADH (Asp-Glu-Ala-AspHis) 17 (72kD)

PHLDA1: dominio de tipo homología con: Consenso incluye gb:NM_007350.1 217999_s_at

pleckstrina, familia A, miembro 1 (LOC22822): /DEF=Homo sapiens dominio de tipo

SEC ID Nº: 122 (ADN) y 250 (aminoácidos): homología con pleckstrina, familia A, miembro 1 (PHLDA1), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=PHLDA1 /PROD= dominio de tipo homología con pleckstrina, familia A, miembro 1 /DB_XREF=gi:6679302 /UG=Hs.82101 dominio de tipo homología con pleckstrina, familia A, miembro 1 /FL=gb:NM 007350.1

ETV5: gen variante de ets 5 (molécula: gb:NM_004454.1 /DEF=Homo sapiens gen 203349_s_at

relacionada con ets) (LOC2119): variante de ets 5 (molécula relacionada con

SEC ID Nº: 123 (ADN) y 251 (aminoácidos): ets) (ETV5), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=ETV5 /PROD=gen variante de ets 5 (molécula relacionada con ets) /DB_XREF=gi:4758315 /UG=Hs. 43697 gen variante de ets 5 (molécula relacionada con ets) /FL=gb:NM_004454.1

DUSP4: fosfatasa de especificidad doble 4: gb:BC002671.1 /DEF=Homo sapiens, 204015_s_at

(LOC1846): fosfatasa de especificidad doble 4, clon

SEC ID Nº: 124 (ADN) y 252 (aminoácidos): MGC:3713, ARNm, cds completa. /FEA=ARNm /PROD=fosfatasa de especificidad doble 4 /DB_ XREF=gi:12803670 /UG=Hs.2359 fosfatasa de especificidad doble 4 /FL=gb:U48807.1 gb:NM_001394.2 gb:BC002671.1 gb: U21108.1

DUSP4: fosfatasa de especificidad doble 4: gb:NM_001394.2 /DEF=Homo sapiens 204014_at

(LOC 1846): fosfatasa de especificidad doble 4 (DUSP4),

SEC ID Nº: 125 (ADN) y 253 (aminoácidos): ARNm. /FEA=ARNm /GEN=DUSP4

/PROD=fosfatasa de especificidad doble 4

/DB_XREF=gi: 12707552 /UG=Hs.2359

fosfatasa de especificidad doble 4

/FL=gb:U48807.1 gb:NM_ 001394.2

gb:BC002671.1 gb:U21108.1

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(continuación)

POFUT1: proteína O-fucosiltransferasa 1: Consenso incluye gb:AL045513 /FEA=EST 212349 at

(LOC23509): /DB_XREF=gi:5433649 /DB_

SEC ID Nº: 126 (ADN) y 254 (aminoácidos): XREF=est:DKFZp434J015_r1

/CLON=DKFZp434J015 /UG=Hs.178292

proteína KIAA0180

TBXAS1: tromboxano A sintasa 1: gb:NM_030984.1 /DEF=Homo sapiens 20813_s_at

(plaquetas, citocromo P450, familia 5,: tromboxano A sintasa 1 (plaquetas, citocromo

subfamilia A) (LOC6916): P450, subfamilia V) (TBXAS1), variante de

SEC ID Nº: 127 (ADN) y 255 (aminoácidos): transcripción TXS-II, ARNm. /FEA=ARNm /GEN=TBXAS1 /PROD=tromboxano A sintasa 1 (plaquetas, citocromo P450, subfamilia V), isoforma TXS-II /DB_XREF=gi:13699839 /FL=gb:NM_ 030984.1

KCNK5: canal de potasio, subfamilia K,: gb:NM_003740.1 /DEF=Homo sapiens canal 219615_s_at

miembro 5 (LOC8645): de potasio, subfamilia K, miembro 5 (TASK-2)

SEC ID Nº: 128 (ADN) y 256 (aminoácidos): (KCNK5), ARNm. /FEA=ARNm /GEN=KCNK5 /PROD=canal de potasio, subfamilia K, miembro 5(TASK-2) /DB XREF=gi:4504850/UG=Hs.127007 canal de potasio, subfamilia K, miembro 5 (TASK-2) /FL=gb:AF084830.1 gb:NM 003740.1

A los biomarcadores proporcionados en la Tabla 1, que incluyen las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº: 1128 y las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 129-256, se hace referencia en el presente documento como a un total de 128 biomarcadores con referencia al Título Unigene.

Los biomarcadores tienen niveles de expresión en células que pueden depender de la actividad de la ruta de transducción de señales de EGFR, y que también están altamente correlacionados con la sensibilidad a modulador de EGFR mostrada por las células. Los biomarcadores sirven como herramientas moleculares útiles para predecir la probabilidad de una respuesta a moduladores de EGFR, preferentemente moléculas biológicas, moléculas pequeñas y similares que afectan a la actividad quinasa de EGFR por inhibición directa o indirecta o antagonismo de la función

o actividad quinasa de EGFR.

K-RAS DE TIPO SILVESTRE Y K-RAS MUTADO

Como se usa en el presente documento, el K-Ras de tipo silvestre puede seleccionarse de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de K-Ras variante a y variante b. El K-Ras variante de tipo silvestre a tiene una secuencia de nucleótidos que es de 5436 nucleótidos (Nº Acceso GenBank NM_033360.2) y codifica una proteína que es de 189 aminoácidos (Nº Acceso GenBank NP_203524.1). El K-Ras variante b de tipo silvestre tiene una secuencia de nucleótidos que es de 5312 nucleótidos (Nº Acceso GenBank NM_004985.3) y codifica una proteína que es de 188 aminoácidos (Nº Acceso GenBank NP_004976.2).

Una forma mutada de K-Ras es una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que difiere del K-Ras de tipo silvestre al menos en una posición, preferentemente al menos una posición de nucleótido que codifica un aminoácido que difiere del K-Ras de tipo silvestre. En un aspecto, la forma mutada de K-Ras incluye al menos una mutación en el exón 2. En otro aspecto, la forma mutada de K-Ras incluye al menos una de la mutaciones siguientes en el exón 2 (cambio de base (cambio de aminoácido)): 200G>A (V7M); 216G>C (G12A); 215G>T (G12C); 216G>A (G12D); 215G>C (G12R); 215G>A (G12S); 216G>T (G12V); 218G>T (G13C); 219G>A (G13D).

Los procedimientos para detectar mutaciones de K-Ras son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los procedimientos descritos en la Publicación PCT Nº WO2005/118876.

MODULADORES DE EGFR

Como se usa en el presente documento, la expresión “modulador de EGFR” pretende significar un compuesto o fármaco que es una molécula biológica o una molécula pequeña que directa o indirectamente modula la actividad de EGFR o la ruta de transducción de señales de EGFR por inhibición de la unión de EGF a EGFR o de la actividad quinasa de EGFR.

Los moduladores de EGFR incluyen, por ejemplo, ligandos específicos de EGFR, inhibidores de EGFR moleculares pequeños y anticuerpos monoclonales contra EGFR. En un aspecto, el modulador de EGFR inhibe la actividad de

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EGFR y/o inhibe la ruta de transducción de señales de EGFR. En otro aspecto, el modulador de EGFR es un anticuerpo monoclonal de EGFR que inhibe la actividad de EGFR y/o inhibe la ruta de transducción de señales de EGFR.

Los moduladores de EGFR incluyen moléculas biológicas o moléculas pequeñas. Las moléculas biológicas incluyen todos los lípidos y polímeros de monosacáridos, aminoácidos y nucleótidos que tienen un peso molecular superior a

450. Por lo tanto, las moléculas biológicas incluyen, por ejemplo, oligosacáridos y polisacáridos; oligopéptidos, polipéptidos, péptidos y proteínas; y oligonucleótidos y polinucleótidos. Los oligonucleótidos y polinucleótidos incluyen, por ejemplo, ADN y ARN.

Las moléculas biológicas incluyen además derivados de cualquiera de las moléculas descritas anteriormente. Por ejemplo, los derivados de moléculas biológicas incluyen derivados lipídicos y de glicosilación de oligopéptidos, polipéptidos, péptidos y proteínas.

Los derivados de moléculas biológicas incluyen además derivados lipídicos de oligosacáridos y polisacáridos, por ejemplo, lipopolisacáridos. Más típicamente, las moléculas biológicas son anticuerpos o equivalentes funcionales de anticuerpos. Los equivalentes funcionales de anticuerpos tienen características de unión comparables con las de anticuerpos e inhiben el crecimiento de células que expresan EGFR. Dichos equivalentes funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos quimerizados, humanizados y de cadena sencilla, así como fragmentos de los mismos.

Los equivalentes funcionales de anticuerpos también incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a las secuencias de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables de los anticuerpos. Una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente igual a otra secuencia, pero que difiere de la otra secuencia por medio de una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones se considera que es una secuencia equivalente. Preferentemente, menos del 50%, más preferentemente menos del 25% y aún más preferentemente menos del 10% del número de restos de aminoácidos en una secuencia se sustituyen, se añaden a o se delecionan de la proteína.

El equivalente funcional de un anticuerpo es preferentemente un anticuerpo quimerizado o humanizado. Un anticuerpo quimerizado comprende la región variable de un anticuerpo no humano y la región constante de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado comprende la región hipervariable (CDR) de un anticuerpo no humano. La región variable distinta de la región hipervariable, por ejemplo, la región variable flanqueante y la región constante de un anticuerpo humanizado, son las de un anticuerpo humano.

Las regiones variables e hipervariables adecuadas de anticuerpos no humanos pueden proceder de anticuerpos producidos por cualquier mamífero no humano en el que se generan anticuerpos monoclonales. Los ejemplos adecuados de mamíferos distintos de seres humanos incluyen, por ejemplo, conejos, ratas, ratones, caballos, cabras

o primates.

Los equivalentes funcionales incluyen además fragmentos de anticuerpos que tienen características de unión que son las mismas que, o que son comparables a las del anticuerpo completo. Los fragmentos adecuados del anticuerpo incluyen cualquier fragmento que comprende una porción suficiente de la región hipervariable (es decir, determinante de complementariedad) que se une específicamente y con una afinidad suficiente a la tirosina quinasa de EGFR para inhibir el crecimiento de células que expresan dichos receptores.

Dichos fragmentos pueden, por ejemplo, contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab’)2. Preferentemente, el fragmento de anticuerpo contiene las seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo completo, aunque también se incluyen fragmentos funcionales que contienen menos que todas dichas regiones, tal como tres, cuatro o cinco CDR.

En un aspecto, los fragmentos son anticuerpos de cadena sencilla o fragmentos Fv. Los anticuerpos de cadena sencilla son polipéptidos que comprenden al menos la región variable de la cadena pesada del anticuerpo unida a la región variable de la cadena ligera, con o sin un engarce de interconexión. Por lo tanto, el fragmento Fv comprende el sitio de combinación del anticuerpo completo. Estas cadenas pueden producirse en bacterias o en células eucariotas.

Los anticuerpos equivalentes funcionales pueden ser miembros de cualquier clase de inmunoglobulinas, tal como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE y las subclases de las mismas. En un aspecto, los anticuerpos son miembros de la subclase IgG1. Los equivalentes funcionales también pueden ser equivalentes de combinaciones de cualquiera de las clases y subclases anteriores.

En un aspecto, los anticuerpos contra EGFR pueden seleccionarse de anticuerpos quimerizados, humanizados, totalmente humanos y de cadena sencilla derivados del anticuerpo murino 225 descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.943.533.

En otro aspecto, el anticuerpo contra EGFR es cetuximab (IMC-C225) que es un anticuerpo monoclonal IgG quimérico (humano/ratón) también conocido con el nombre comercial ERBITUX. El Fab de cetuximab contiene el fragmento Fab del cetuximab, es decir, las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo

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murino M225 (Solicitud de Estados Unidos Nº 2004/0006212, incorporada en el presente documento por referencia) con los dominios constantes de cadena ligera kappa y pesada CH1 de IgG1 humana. El cetuximab incluye los tres dominios constantes de cadena pesada de IgG1.

En otro aspecto, el anticuerpo contra EGFR puede seleccionarse de los anticuerpos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 6.235.883, Patente de Estados Unidos Nº 5.558.864 y Patente de Estados Unidos Nº 5.891.996. El anticuerpo contra EGFR puede ser, por ejemplo, AGX-EGF (Amgen Inc.) (también conocido como panitumumab), que es un anticuerpo monoclonal IgG2 totalmente humano. La secuencia y la caracterización de ABX-EGF, que se conocía antiguamente como clon E7.6.3, se desvelan en la Patente de Estados Unidos Nº 6.235.883 en la columna 28 línea 62 a la columna 29 línea 36 y las Figuras 29-34, que se incorpora por referencia en el presente documento. El anticuerpo contra EGFR también puede ser, por ejemplo, EMD72000 (Merck KGaA), que es una versión humanizada del anticuerpo contra EGFR murino EMD 55900. El anticuerpo contra EGFR también puede ser, por ejemplo: h-R3 (TheraCIM), que es una anticuerpo monoclonal contra EGFR humanizado; Y10 que es un anticuerpo monoclonal murino generado contra un homólogo murino de la mutación EGFRvIII humana; o MDX-447 (Medarex Inc.).

Además de las moléculas biológicas analizadas anteriormente, los moduladores de EGFR útiles en la invención también pueden ser moléculas pequeñas. Cualquier molécula que no sea una molécula biológica se considera en el presente documento una molécula pequeña. Algunos ejemplos de moléculas pequeñas incluyen compuestos orgánicos, compuestos organometálicos, sales de compuestos orgánicos y organometálicos, sacáridos, aminoácidos y nucleótidos. Las moléculas pequeñas incluyen además moléculas que de otro modo se considerarían moléculas biológicas, excepto por que su peso molecular no es superior a 450. Por lo tanto, las moléculas pequeñas pueden ser lípidos, oligosacáridos, oligopéptidos y oligonucleótidos y sus derivados, que tienen un peso molecular de 450 o menos.

Se enfatiza que las moléculas pequeñas pueden tener cualquier peso molecular. Simplemente se denominan moléculas pequeñas porque típicamente tienen pesos moleculares inferiores a 450. Las moléculas pequeñas incluyen compuestos que se encuentran en la naturaleza, así como compuestos sintéticos. En una realización, el modulador de EGFR es una molécula pequeña que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan EGFR. En otra realización, el modulador de EGFR es una molécula pequeña que inhibe el crecimiento de células tumorales refractarias que expresan EGFR.

Se han descrito numerosas moléculas pequeñas que son útiles para inhibir el EGFR.

Un ejemplo de un antagonista de EGFR de molécula pequeña es IRESSA(ZD1939), que es un derivado de quinozalina que funciona como un mimético de ATP para inhibir el EGFR. Véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.616.582; documento WO 96/33980 en la página 4. Otro ejemplo de un antagonista de EGFR de molécula pequeña es TARCEVA (OSI-774), que es un inhibidor de EGFR de [clorhidrato de 6,7-Bis(2-metoxi-etoxi)-quinazolin-4-il]-(3etinil-1-fenil)amina] derivado de 4-(fenilamino-sustituída)quinozalina. Véase el documento WO 96/30347 (Pfizer Inc.) a, por ejemplo, la página 2, línea 12 a la página 4, línea 34 y la página 19, líneas 14-17. El TARCEVA puede funcionar inhibiendo la fosforilación de EGFR y sus rutas de transducción de señales de PI3/Akt y MAP (proteína activada por mitógeno) quinasa aguas abajo, dando como resultado la detención del ciclo celular mediada por p27. Véase Hidalgo y col., Resumen 281 presentado en la 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 mayo 2001.

También se describe que otras moléculas pequeñas inhiben el EGFR, muchas de las cuales se cree que son específicas para el dominio tirosina quinasa de un EGFR. Algunos ejemplos de dichos antagonistas de EGFR de molécula pequeña se describen en los documentos WO 91/116051, WO96/30347, WO96/33980, WO97/27199, WO97/30034, WO97/42187, WO97/49688, WO98/33798, WO00/18761 y WO00/31048. Los ejemplos de antagonistas de EGFR de molécula pequeña específicos incluyen C1-1033 (Pfizer Inc.), que es una quinozalina (N[4-(3-anillo monocíclico con uno o dos heteroátomos, o un anillo bicíclico con de 1 a aproximadamente 4 heteroátomos, estando el compuesto opcionalmente sustituido o polisustituido.

Las moléculas pequeñas adicionales que se ha descrito que inhiben el EGFR y que por lo tanto se incluyen dentro del alcance de la presente invención son compuestos bis mono y/o bicíclicos arilo heteroarilo, carbocíclicos y heterocarbocíclicos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.646.153.

Las moléculas pequeñas adicionales que se ha descrito que inhiben el EGFR y que por lo tanto están dentro del alcance de la presente invención son el compuesto proporcionado en la Figura 1 de Fry y col., Science 265, 10931095 (1994) que inhibe el EGFR.

Las moléculas pequeñas adicionales que se ha descrito que inhiben el EGFR y que por lo tanto se incluyen dentro del alcance de la presente invención son tirfostinas que inhiben EGFR/HER1 y HER 2, particularmente las de las Tablas I, II, III y IV descritas en Osherov y col., J. Biol. Chem., 25; 268(15):11134-42 (1993).

Las moléculas pequeñas adicionales que se ha descrito que inhiben el EGFR y que por lo tanto se incluyen dentro del alcance de la presente invención son un compuesto identificado como PD 166285 que inhibe las familias de receptores EGFR, PDGFR y FGFR. El PD166285 se identifica como 6-(2,6-diclorofenil)-2-(4-(2

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dietilaminoetioxi)fenilamino)-8-metil-8H-pirido(2,3-d)pirimidin-7-ona que tiene la estructura mostrada en la Figura 1 en la página 1436 de Panek y col., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 283, 1433-1444 (1997).

Debería apreciarse que las moléculas pequeñas útiles que se usan en la invención son inhibidores de EGFR, pero no tienen que ser completamente específicos para EGFR.

BIOMARCADORES Y CONJUNTOS DE BIOMARCADORES

Se desvelan biomarcadores individuales y conjuntos de biomarcadores que tiene valor tanto de diagnóstico como pronóstico en áreas patológicas en las que la señalización a través de EGFR o de la ruta de EGFR es importante, por ejemplo, en cánceres o tumores, en trastornos, afecciones o disfunciones inmunológicas o en patologías en las que los controles de señalización celular y/o la proliferación celular son anormales o aberrantes. Los conjuntos de biomarcadores comprenden una pluralidad de biomarcadores tales como, por ejemplo, una pluralidad de los biomarcadores proporcionados en la Tabla 1, que se correlacionan altamente con la resistencia o sensibilidad a uno

o más moduladores de EGFR.

Los biomarcadores y conjuntos de biomarcadores de la invención permiten predecir o pronosticar de forma razonable el efecto probable de uno u más moduladores de EGFR que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR en diferentes sistemas biológicos o para respuestas celulares. Los biomarcadores y conjuntos de biomarcadores pueden usarse en ensayos in vitro de la respuesta al modulador de EGFR mediante células de ensayo para predecir el resultado in vivo. De acuerdo con la invención, los diversos biomarcadores y conjuntos de biomarcadores descritos en el presente documento, o la combinación de estos conjuntos de biomarcadores con otros biomarcadores o marcadores puede usarse, por ejemplo, para predecir cómo podrían responder los pacientes con cáncer a la intervención terapéutica con uno o más moduladores de EGFR que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR.

Un biomarcador y un conjunto de biomarcadores de patrones de expresión génica celulares que se correlacionan con la sensibilidad o resistencia de células después de la exposición de las células a uno o más moduladores de EGFR, que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, proporcionan una herramienta útil para explorar una o más muestras tumorales antes del tratamiento con el modulador de EGFR. La exploración permite la exploración de células de una muestra tumoral expuesta a uno o más moduladores de EGFR, que inhiben la unión de EGF a GFR o la actividad quinasa de EGFR, basándose en los resultados de expresión del biomarcador y conjunto de biomarcadores, de si el tumor, y por lo tanto un paciente que alberga el tumor, responderá o no responderá al tratamiento con el modulador de EGFR.

El biomarcador o conjunto de biomarcadores también puede usarse como se describe en el presente documento para controlar la evolución de un tratamiento o terapia de enfermedad en aquellos pacientes que se están sometiendo a un tratamiento para una enfermedad que implica un modulador de EGFR, que inhibe la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR.

Los biomarcadores también sirven como dianas para el desarrollo de terapias para el tratamiento de enfermedades. Dichas dianas pueden ser particularmente aplicables al tratamiento del cáncer colorrectal. De hecho, debido a que estos biomarcadores se expresan de forma diferencial en células sensibles y resistentes, sus patrones de expresión están correlacionados con la sensibilidad intrínseca relativa de las células al tratamiento con moduladores de EGFR, que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. Por consiguiente, los biomarcadores altamente expresados en células resistentes pueden servir como dianas para el desarrollo de nuevas terapias para los tumores, que son resistentes a moduladores de EGFR, que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, particularmente inhibidores de EGFR.

El nivel de proteína y/o ARNm de biomarcador puede determinarse usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la cuantificación de proteína puede llevarse a cabo usando procedimientos tales como ELISA, SDS-PAGE bidimensional, transferencia de Western, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o citometría de flujo. La cuantificación del ARNm puede llevarse a cabo usando procedimientos tales como PCR, hibridación de matrices, transferencia de Northern, hibridación in situ, transferencia puntual, Taqman o ensayo de protección frente a ARNasa.

MICROMATRICES

La divulgación también incluye micromatrices especializadas, por ejemplo, micromatrices de oligonucleótidos o micromatrices de ADNc, que comprenden uno o más biomarcadores, que muestran perfiles de expresión que se correlacionan con la sensibilidad o resistencia a uno o más moduladores de EGFR, que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. Dichas micromatrices pueden emplearse en ensayos in vitro para evaluar el nivel de expresión de los biomarcadores en las células de ensayo a partir de biopsias de tumores y determinar si es probable que estas células de ensayo sean resistentes o sensibles a moduladores de EGFR que inhiban la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. Por ejemplo, puede prepararse una micromatriz especializada usando todos los biomarcadores, o subconjuntos de los mismos, que se describen en el presente documento y se muestran en la Tabla 1. Las células de una biopsia de tejido u órgano pueden aislarse y exponerse a uno o más de los moduladores de EGFR. En un aspecto, después de la aplicación de ácidos nucleicos aislados de células tanto no

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tratadas como tratadas a una o más de las micromatrices especializadas, el patrón de expresión génica de las células ensayadas puede determinarse y compararse con el del patrón de biomarcadores del panel de control de células usado para crear el conjunto de biomarcadores en la micromatriz. Basándose en los resultados del patrón de expresión génica de las células que se sometieron a ensayo, puede determinarse si las células muestran un perfil resistente o sensible de expresión génica. Después puede determinarse o evaluarse si las células ensayadas de una biopsia de tejido u órgano responderán o no a uno o más de los moduladores de EGFR que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, y el ciclo de tratamiento o terapia basándose en la información recogida a partir de los resultados del análisis de micromatrices especializadas.

ANTICUERPOS

La divulgación también incluye anticuerpos, incluyendo policlonales o monoclonales, dirigidos contra uno o más de los biomarcadores polipeptídicos. Dichos anticuerpos pueden usarse en una diversidad de formas, por ejemplo, para purificar, detectar y dirigir los biomarcadores de la invención, incluyendo procedimientos de diagnóstico, detección, exploración y/o terapéuticos tanto in vitro como in vivo.

KITS

La divulgación también incluye kits para determinar o predecir si un paciente sería susceptible o resistente a un tratamiento que comprende uno o más moduladores de EGFR que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. El paciente puede tener cáncer colorrectal. Dichos kits serían útiles en un entorno clínico para su uso en el ensayo de un tumor biopsiado de un paciente u otras muestras de cáncer, por ejemplo, para determinar o predecir si el tumor o cáncer del paciente será resistente o sensible a un tratamiento o terapia dada con un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. El kit comprende un recipiente adecuado que comprende: una o más micromatrices, por ejemplo, micromatrices de oligonucleótidos o micromatrices de ADNc, que comprenden los marcadores que se correlacionan con la resistencia o sensibilidad a moduladores de EGFR, que inhiben la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, particularmente inhibidores de EGFR; uno o más de los moduladores de EGFR para su uso en el ensayo de células a partir de especímenes de tejido de paciente o muestras de pacientes; e instrucciones para su uso. Además, los kits contemplados por la invención pueden incluir además, por ejemplo, reactivos o materiales para controlar la expresión de biomarcadores de la invención a nivel de ARNm o proteína, usando otras técnicas y sistemas realizados en la técnica, tales como, por ejemplo, ensayos de RT-PCR, que emplean cebadores diseñados basándose en uno o más de los biomarcadores descritos en el presente documento, inmunoensayos, tales como ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunotransferencia, por ejemplo, transferencias de Western o hibridación in situ y similares.

APLICACIÓN DE BIOMARCADORES Y CONJUNTOS DE BIOMARCADORES

Los biomarcadores y conjuntos de biomarcadores pueden usarse en diferentes aplicaciones. Los conjuntos de biomarcadores pueden formarse a partir de cualquier combinación de epirregulina y anfirregulina y, opcionalmente, biomarcadores enumerados en la Tabla 1, para realizar predicciones acerca del efecto de un modulador de EGFR en diferentes sistemas biológicos. Los diversos biomarcadores y conjuntos de biomarcadores descritos en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, como indicadores de diagnóstico o pronóstico en el tratamiento de una enfermedad, para predecir cómo podrían responder pacientes con cáncer colorrectal a la intervención terapéutica con compuestos que modulan el EGFR, y para predecir cómo podrían responder pacientes a la intervención terapéutica que modula la señalización a través de la ruta reguladora de EGFR completa.

Los biomarcadores tienen valor tanto diagnóstico como pronóstico en áreas patológicas en las que la señalización a través de EGFR o la ruta de EGFR sea importante, por ejemplo, en inmunología, o en cánceres o tumores en los que han fracasado los controles de la señalización y/o proliferación celular.

En un aspecto, las células de una muestra tisular de un paciente, por ejemplo, una biopsia de tumor o cáncer colorrectal, pueden ensayarse para determinar el patrón de expresión de uno o más biomarcadores antes del tratamiento con uno o mas moduladores de EGFR. El éxito o fracaso de un tratamiento puede determinarse basándose en el patrón de expresión de biomarcadores de las células del tejido de ensayo (células de ensayo), por ejemplo, biopsia de tumor o cáncer, que sea relativamente similar o diferente del patrón de expresión de un conjunto de control del uno o mas biomarcadores. Por lo tanto, si las células de ensayo muestran un perfil de expresión de biomarcadores que se corresponde con el de los biomarcadores en el panel de control de células que son sensibles al modulador de EGFR, es altamente probable o esperado que el cáncer o tumor del individuo responda favorablemente al tratamiento con el modulador de EGFR. Por el contrario, si las células de ensayo muestran un patrón de expresión de biomarcadores correspondiente al de los biomarcadores del panel de control de células que son resistentes al modulador de EGFR, es altamente probable o esperado que el cáncer o tumor del individuo no responda al tratamiento con el modulador de EGFR.

La divulgación también proporciona un procedimiento de control del tratamiento de un paciente que tiene un tumor o cáncer colorrectal tratable mediante uno o más moduladores de EGFR que inhiban la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. Las células de ensayo aisladas de la muestra de tejido de paciente, por ejemplo, una

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biopsia de tumor o muestra de tumor, pueden ensayarse para determinar el patrón de expresión de uno o más biomarcadores antes y después de la exposición a un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en la que, preferentemente, el modulador de EGFR es un perfil de expresión de biomarcadores de EGFR de las células de ensayo antes y después del tratamiento que se compara con el de uno o más biomarcadores según se describen y se muestran en el presente documento, que están altamente expresados en el panel de control de células que son resistentes o sensibles a un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR. Por lo tanto, si la respuesta de un paciente es sensible al tratamiento mediante un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, basándose en la correlación del perfil de expresión del uno o más biomarcadores, el pronóstico de tratamiento del paciente puede calificarse de favorable y el tratamiento puede continuar. Además, si después del tratamiento con un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR las células de ensayo no muestran un cambio en el perfil de expresión de biomarcadores correspondiente al panel de control de células que son sensibles al modulador de EGFR, puede servir como indicador de que el tratamiento actual debería modificarse, cambiarse o incluso interrumpirse. Este procedimiento de control puede indicar el éxito o fracaso del tratamiento de un paciente con un modulador de EGFR que inhiba la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR y dichos procedimientos de control pueden repetirse según sea necesario o se desee.

Ejemplos:

EJEMPLO 1 -Identificación de biomarcadores por análisis Interim

El ensayo de farmacogenómica CA225-045 es un estudio exploratorio aleatorizado de fase II de monoterapia con ERBITUX (cetuximab) en pacientes con cáncer colorrectal metastásico refractario (CCRm). Se realizó un análisis Interim de datos de muestras obtenidas de este ensayo para examinar los marcadores descubiertos preclínicamente en las muestras clínicas y para identificar marcadores de predicción de respuesta de novo.

Muestras clínicas:

49 muestras de pacientes de ARN aisladas de biopsias de tumores pretratamiento del sitio metastásico se aleatorizaron en cinco bloques y se generó su perfil en microplacas U133A v2.0 (Affymetrix, Santa Clara, California). Los datos de generación de perfiles de 30/49 pacientes se incluyeron en el análisis basándose en el cumplimiento de los criterios siguientes: finalización de al menos dos ciclos de terapia, disponibilidad de suficientes datos clínicos para evaluar la respuesta; presencia de células tumorales en la muestra de biopsia; y datos de generación de perfiles de buena calidad a partir de la microplaca.

Los 30 perfiles de expresión de pacientes consistían en 24 metástasis en hígado y 6 tipos tisulares distintos. La información de mejor respuesta clínica de los 30 pacientes identificó 4 pacientes que respondían de forma parcial (PR), 5 con enfermedad estable (SD) y 21 con enfermedad progresiva (PD). Se realizaron evaluaciones de la respuesta de acuerdo con una versión modificada de los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Miller y col., Cancer, 47:207-214 (1981)). La respuesta global se determinó basándose en la evaluación de lesiones diana, no diana y nuevas. La respuesta parcial (PR) se definió como al menos una disminución del 50% en la suma del producto de los diámetros (SPD) de lesiones diana, tomando como referencia los SPD basales. La enfermedad progresiva (PD) se definió como un aumento del 25% o superior en los SPD de lesiones diana, tomando como referencia los SPD más pequeños registrados desde que comenzó el tratamiento o la aparición de nuevas lesiones. La enfermedad estable (SD) se definió como ni encogimiento suficiente para calificarla como PR ni aumento suficiente para calificarla como PD.

Generación de perfiles de expresión génica:

Se obtuvieron biopsias pretratamiento del sitio metastásico para aislamiento del ARN. El ARN se aisló a partir de las biopsias pretratamiento usando el mini-kit RNeasy (Qiagen, Valencia, California). La calidad del ARN se comprobó midiendo la relación de ARN ribosómico 28S:18S usando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Rockville, Maryland). La concentración de ARN total se determinó espectrofotométricamente. Se usó 1 µg de ARN total para preparar sondas biotiniladas de acuerdo con el Manual Técnico de Análisis de Expresión Genechip de Affymetrix. Las dianas se hibridaron con microplacas de genes HG-U133A v2.0 humanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se preprocesaron usando el software MAS 5.0 (Affymetrix, Santa Clara, California).

Análisis de datos:

De los 22.215 conjuntos de sondas presentes en la microplaca U133A v2.0, 17.261 conjuntos de sondas que tenían marcas presentes en al menos dos tejidos metastásicos de hígado se incluyeron para análisis de datos. Los datos se analizaron realizando una prueba t de varianza desigual bilateral con análisis en Microsoft Excel o Anova usando software de reconocimiento de patrones PartekPro (Partek, St. Charles, Missouri). Los análisis estadísticos se realizaron usando valores normalizados por cuantiles MAS 5.0 para intensidad de señal para 17.261 conjuntos de sondas.

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Análisis de biomarcadores usando prueba t y análisis ANOVA:

La primera etapa era examinar 42 conjuntos de sondas que se identificaron preclínicamente (FIG. 1) en los perfiles de transcripción de 30 tumores metastásicos. Esto se realizó para examinar si los marcadores preclínicos se expresan de forma diferencial entre pacientes que obtienen beneficio clínico (PR y SD) del tratamiento con ERBITUX

5 y los que no (PD).

Se realizó una prueba t de varianza desigual bilateral entre los 9 pacientes que obtienen beneficio clínico y los 21 pacientes que tienen enfermedad progresiva. Tres conjuntos de sondas de los 42 se expresan de forma diferencial entre 9 pacientes (PR + SD) y 21 pacientes (PD) (p < 0,05). Estos conjuntos de sondas representan la expresión de ARNm de anexina A1 (ANXA1 201012_at), inhibidor de serina proteasa clado B miembro 5 (SERPINB5 204855_at)

10 y receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 3 (FGFR3 204379_s_at).

A continuación, se examinó una lista más amplia de 640 genes de la que se ha obtenido la lista de 42 conjuntos de sondas (FIG. 1). 635 de los 640 conjuntos de sondas estaban presentes en los 17.261 conjuntos de sondas que se incluyen en el análisis. Se identificó que los 635 conjuntos de sondas se expresaban de forma altamente variable en perfiles de transcripción de 164 tumores CCR primarios no tratados. Se expresan a un nivel de moderado a elevado

15 en tumores de colon (al menos un valor de expresión de dos veces el valor medio para la matriz, es decir, 3000 unidades de expresión) y con un valor de varianza de población de > 0,1.

Los 635 conjuntos de sonda se examinaron en perfiles de transcripción de 30 tumores metastásicos del ensayo CA225-045. Se encontró que 39 de los 635 conjuntos de sondas se expresaban de forma diferencial entre 9 (PR + SD) y 21 (PD), p < 0,05 y se describen en la Tabla 2. 19 de los 39 conjuntos de sondas son marcadores de

20 resistencia para ERBITUX y 20 de estos son marcadores de sensibilidad para ERBITUX (FIG. 2).

TABLA 2 -39 marcadores para predicción de respuesta a ERBITUX 5

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

1: 205767_at 0,0002 epirregulina EREG

2: 201012_at 0,006 anexina A1 ANXA1

3: 205239_at 0,0068 anfirregulina AREG

4: 213435_at 0,0098 miembro de la familia de SATB 2 SATB2

5: 209260_at 0,0122 estratifina SFN

6: 204379_s_at 0,0129 receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 3 FGFR3

7: 205295_at 0,0143 creatina quinasa, mitocondrial 2 CKMT2

8: 204678_s_at 0,0148 canal de potasio, subfamilia K, miembro1 KCNK1

9: 204044_at 0,0151 quinolinato fosforribosiltransferasa QPRT

10: 203726_s_at 0,0154 laminina, alfa 3 LAMA3

11: 219555_s_at 0,0165 proteína de médula ósea no caracterizado BM039 BM039

12: 216598_s_at 0,0188 ligando de quimiocina (motivo C-C) 2 CCL2

13: 209425_at 0,0195 alfa-metilacil-CoA racemasa AMACR

14: 204855_at 0,0207 inhibidor de serina proteasa, clado B, miembro 5 SERPINB 5

15: 218807_at 0,0213 oncogén vav 3 VAV3

16: 210764_s_at 0,0261 inductor angiogénico rico en cisteína 61 CYR61

17: 210511_s_at 0,0265 inhibina, beta A INHBA

18: 220834_at 0,0266 4 dominios transmembrana, subfamilia A, 12 MS4A12

19: 210809_s_at 0,0268 periostina, factor específico de osteoblastos POSTN

20: 213385_at 0,0304 quimerina 2 CHN2

21: 218468_s_at 0,0323 homólogo de gremlina 1, superfamilia de nudo de cisteína GREM1

22: 202859_x_ at 0,033 interleucina 8 IL8

23: 206754_s_at 0,0337 citocromo P450, 2B6 CYP2B6

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(continuación)

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

24: 218806_s_at 0,034 oncogén vav 3 VAV3

25: 218469_at 0,0342 homólogo de gremlina 1, superfamilia de nudo de cisteína GREM1

26: 219508_at 0,0347 glucosaminil (N-acetil) transferasa 3, tipo mucina GCNT3

27: 204364_s_at 0,0367 fase de lectura abierta 23 del cromosoma 2 C2orf23

28: 219471_at 0,0376 fase de lectura abierta 18 del cromosoma 13 C13orf18

29: 219014_at 0,0396 específico de placenta 8 PLAC8

30: 203939_at 0,04 5’-nucleotidasa, ecto (CD73) NT5E

31: 211506_s_at 0,0401 interleucina 8 IL8

32: 206143_at 0,0404 familia de transportador de soluto 26, miembro 3 SLC26A3

33: 44790_s_at 0,0425 fase de lectura abierta 18 del cromosoma 13 C13orf18

34: 202075_s_at 0,0427 proteína de transferencia de fosfolípidos PLTP

35: 201650_at 0,0436 queratina 19 KRT19

36: 205259_at 0,046 subfamilia del receptor nuclear 3, C2 NR3C2

37: 208893_s_at 0,0466 fosfatasa de especificidad doble 6 DUSP6

38: 209436_at 0,048 espondina 1, proteína de la matriz extracelular SPON1

39: 218087_s_at 0,0496 que contiene dominio sorbina y SH3 1 SORBS 1

Los 3 marcadores superiores basándose en el menor valor p eran epirregulina (EREG, 205767_at), anexina A1 (ANXA1 201012_at) y anfirregulina (AREG, 205239_at). Curiosamente, la epirregulina y la anfirregulina son ligandos para EGFR. El examen de sus perfiles de expresión de ARNm individuales indica que parecen estar más altamente expresados en pacientes que obtienen beneficio clínico del tratamiento con ERBITUX (FIGS. 3A y 3B). Esto sugiere que los pacientes que tienen altos niveles de epirregulina y anfirregulina tienen tumores que son adictos a la ruta de señalización de EGFR que está siendo dirigida por estos dos ligandos.

Los niveles de expresión del factor de crecimiento epidérmico (EGF, 206254_at), factor de crecimiento transformante alfa (TGFα, 205016_at), betacelulina (BTC, 207326_at) y EGF de unión a heparina (HB-EGF, 203821_ a), que son los otros ligandos conocidos para EGFR, se examinaron también. Sus niveles de expresión no mostraron correlación con la respuesta a ERBITUX.

Determinación de relaciones biológicas entre 39 biomarcadores:

La aplicación basada en web Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems Inc., Mountain View, California) se usó para ensayar la relación biológica entre los 39 biomarcadores de la Tabla 2. Esta solicitud hace uso de la base de conocimiento Ingenuity, una base de datos curada que consiste en millones de relaciones modeladas individualmente entre proteínas, genes, complejos, células, tejidos, fármacos y enfermedades. Los 39 genes se introdujeron en la aplicación Pathway Analysis. La base de conocimiento Ingenuity tenía información de 25 de los 39 genes. Sorprendentemente, de los 25 genes “elegibles por red”, 17 mapeaban en la red de EGFR (FIG. 4, 17 genes están sombreados) indicando un fuerte vínculo entre el estado de señalización de EGFR en los tumores y la respuesta a ERBITUX. Ninguna otra red surgía del análisis de los 39 genes. De los 17 genes, DUSP6 es un miembro de la ruta de señalización de ERK/MAPK y SFN es un miembro de la ruta de señalización de PI3K/AKT, que son las dos rutas clave aguas abajo de la señalización de EGFR.

Análisis multivariable:

La prueba t y el análisis ANOVA se usaron para evaluar la capacidad de los biomarcadores individuales para separar los pacientes PR/SD de los pacientes PD. Se usó un análisis de discriminación multivariable para evaluar la potencia de predicción de los 39 marcadores sobre la respuesta del paciente e identificar el conjunto de variables/biomarcadores que serían los mejores predictores de la respuesta al tratamiento con ERBITUX.

Se aplicó un análisis de función de discriminación SAS (SAS Scientific Discovery Solutions, release 8.02, SAS Institute Inc., Cary, Noth Carolina) al conjunto de datos de 39 marcadores. El análisis de función de discriminación se dividió en un procedimiento de 2 etapas: (1) ensayo de la significación de un conjunto de funciones de discriminación; y (2) uso de estas funciones para clasificar los objetos de muestra en los grupos de respuesta

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correspondientes. La primera etapa se efectuó mediante un procedimiento SAS “por etapas” usando el procedimiento de selección de variables hacia delante. Las funciones de discriminación derivadas se pasaron al segundo procedimiento de SAS, denominado el procedimiento “discrim” para la clasificación de las muestras dadas.

Dado el pequeño tamaño de muestra de 30 pacientes, las muestras no se repartieron en conjuntos de datos de entrenamiento y de ensayo separados. En su lugar se usó un solo conjunto de datos y se aplicó el procedimiento de validación cruzada dejando uno fuera para ensayar la potencia de predicción de los predictores de biomarcadores identificados. Se desarrolló un protocolo de validación cruzada de SAS que aplicaba un procedimiento de validación cruzada dejando uno fuera en un programa SAS y se procesó sobre este conjunto de datos para definir el número de predictores que podían usarse para construir los modelos de función de discriminación. Este procedimiento permitió una comparación de un modelo de un solo biomarcador con modelos de múltiples biomarcadores (hasta 15 biomarcadores) (FIG. 5). El modelo de predictor de gen único se descubrió que tenía una potencia de predicción de 0,7037 según se midió por la cobertura de la AUC (área bajo la curva de característica de funcionamiento del receptor (ROC) que muestra la compensación entre sensibilidad y especificidad). Un área de 1 representa una predicción totalmente precisa. Cuando el número de predictores incluidos en el modelo llega a tres biomarcadores, la potencia de predicción aumenta hasta 0,9. Cuando el número de predictores incluidos en el modelo supera los tres, tiende a haber una disminución en la potencia de predicción. Estos resultados indican que la mejor potencia de predicción se consigue por construcción de un modelo de función de discriminación con 3 de los 39 biomarcadores.

Correlación de los 39 biomarcadores:

El análisis Ingenuity Pathway sugería que al menos 17 de los 39 biomarcadores identificados pertenecen a una sola red de interacción. Un análisis de correlación usando el procedimiento de SAS “corr” se aplicó para investigar la correlación de genes identificados a partir del análisis de discriminación. La Tabla 3 muestra un ejemplo de una matriz de correlación de algunos de los predictores superiores seleccionados por el procedimiento SAS. Algunos de los genes muestran valores de coeficiente de correlación muy altos que sugiere que están altamente correlacionados. Por ejemplo, se descubrió que 205767_at (EREG) y 205239_at (AREG), o 205767_at (EREG) y 218807_at (VAV3) o 206754_s_at (CYP2B6) y 209260_at (SFN) están altamente correlacionados. Los genes altamente correlacionados podrían reemplazarse entre sí para explicar una cierta proporción de la variación entre los grupos de pacientes que obtienen beneficio clínico y los que no. Estos resultados muestran una concordancia excelente entre el posible mecanismo biológico según se elucida por el análisis Ingenuity Pathway y la bibliografía, y la predicción estadística según se determina por el procedimiento SAS.

TABLA 3 -Coeficientes de correlación de Pearson en los 7 conjuntos de sondas más frecuentes que se identificaron como variables superiores para análisis de discriminación

ID Affymetrix: 205767_at 201012_at 205239_at 206754_at 209260_at 205259_at 218807_at

205767_a t: 1 -0,28587 0,84089 -0,16409 -0,04261 -0,02338 0,64133

201012_a -t: 0,28587 1 -0,16652 -0,41722 0,31615 -0,45851 0,28141

205239_a t: 0,84089 -0,16652 1 -0,21894 0,07064 -0,19815 0,60752

206754_s at: -0,16409 -0,41722 -0,21894 1 -0,47769 0,53511 -0,21663

209260_a -t: 0,04261 0,31615 0,07064 -0,47769 1 -0,26621 0,26204

205259_a -t: 0,02338 -0,45851 -0,19815 0,53511 -0,26621 1 -0,02668

218807_a t: 0,64133 -0,28141 0,60752 -0,21663 0,26204 -0,02668 1

Modelos de mejor predicción:

Los modelos de mejor predicción se determinaron usando el procedimiento de SAS por etapas. El 205767_at (EREG) se escogió siempre primero. Esto sugiere que la expresión del ligando de EGFR epirregulina puede explicar la mayoría de la variación que existe entre el grupo de pacientes que son PR/SD y el grupo de pacientes que son PD. El segundo predictor contribuye a escoger la mayor proporción de la variación no explicada de la primera función de variable (predictor) y así sucesivamente. Los índices de clasificación errónea de los mejores modelos seleccionados por SAS eran:

Modelo: Índice de error

205767_at (EREG): 0,2143

205767_at (EREG), 206754_s_at (CYP2B6): 0,127

205767_at (EREG), 206754_s_at (CYP2B6), 201650_at (KRT19): 0,1032

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(continuación)

Modelo: Índice de error

205767_at (EREG), 206754_s_at (CYP2B6), 201650_at (KRT19), 204678_at (KCNK1): 0,1032

También se seleccionaron biomarcadores basándose en su información biológica, funcional y de co-regulación, y las funciones de predicción derivadas se usaron para clasificar el conjunto de datos de 30 muestras usando el procedimiento de SAS “discrim”. Usando esta estrategia, se identificaron algunas combinaciones óptimas de variables de biomarcadores y sus índices de clasificación errónea correspondientes, tales como:

Modelo: Índice de error

205767_at (EREG), 206754_s_at (CYP2B6) 201650_at (KRT19): 0,1032

205767_at (EREG), 209260_at (SFN), 205259_at (NR3C2): 0,079

201012_at (ANXA1), 205239_at (AREG), 209260_at (SFN), 205259_at (NR3C2), 218807_at (VAV3): 0,07

209260_at (SFN), 218807_at (VAV3): 0,1270

Ejemplo 2 -identificación de biomarcadores después del análisis Interim

Como se ha mencionado anteriormente, el ensayo de farmacogenómica CA225-045 es un estudio exploratorio aleatorizado de fase II de monoterapia con ERBITUX (cetuximab) en pacientes con cáncer colorrectal metastásico refractario (CCRm). En este ensayo se inscribieron 111 pacientes. Se siguió un régimen de dosificación de cetuximab convencional durante las primeras 3 semanas de terapia, después de eso los pacientes cumplían los requisitos para el aumento a escala de la dosis cada 3 semanas hasta una dosis máxima de 400 mg/m2 con tal de que no hubieran experimentado una erupción cutánea >grado 2. Durante la fase de pretratamiento, todos los pacientes se sometieron a un procedimiento de biopsia tumoral que implicaba tres pases con una aguja de calibre 18 de una sola lesión metastásica. Se almacenaron dos biopsias con aguja de núcleo pretratamiento en un solo tubo de RNALater a temperatura ambiente y una biopsia con aguja de núcleo se fijó en formalina y se embebió en parafina para análisis posteriores. Todos los sujetos se sometieron también a una extracción de sangre pretratamiento. Todos los especímenes se obtuvieron de pacientes con el consentimiento informado apropiado y autorización del IRB.

Se evaluó la respuesta tumoral cada nueve semanas (un ciclo de terapia) de acuerdo con los criterios modificados de la Organización Mundial de la salud (Miller y col., Cancer, 47, 207-214 (1981)). La respuesta global se determinó basándose en la evaluación de lesiones diana, no diana y nuevas. Para este análisis, los sujetos que experimentaron una respuesta completa (CR) o parcial (PR) o enfermedad estable (SD) se agruparon como el grupo de control de la enfermedad; los sujetos con enfermedad progresiva (PD) y selección incapaz de determinarse (UTD) se agruparon como que no respondían. Los sujetos UTD que se incluyeron en el grupo que no respondía para su análisis fueron los que murieron antes de la evaluación de la respuesta. Todos los demás sujetos UTD se excluyeron del análisis.

Extracción de ARN y ADN:

Para cada muestra de tumor de sujeto, se aisló el ARN y ADN de dos biopsias con aguja de núcleo pretratamiento proporcionadas en un solo tubo de RNALater a temperatura ambiente en los siete días siguientes a la fecha del procedimiento de biopsia. Se aisló el ARN usando el mini-kit RNeasy (Qiagen, Valencia, California). La calidad del ARN se comprobó midiendo la relación de ARN ribosómico 28S:18S usando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Rockville, Maryland). Se aisló el ADN a partir del flujo a través recogido durante el procedimiento de aislamiento de ARN usando el mini-kit DNeasy (Qiagen). La concentración de ARN y ADN se determinó espectrofotométricamente.

Generación de perfiles de expresión génica y análisis estadístico:

Para cada muestra de la que había suficiente ARN disponible, se usó 1 µg de ARN total para preparar sondas biotiniladas de acuerdo con el manual técnico de análisis de expresión GeneChip de Affymetrix. Se hibridaron dianas a GeneChips HG-U133A v2.0 humanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se preprocesaron usando el software MAS 5.0 (Affymetrix, Santa Clara, California) y se realizaron análisis estadísticos usando valores normalizados por cuantiles para la intensidad de señal. Se realizó un análisis univariable usando una prueba t de varianza desigual bilateral. Para un análisis multivariable las muestras se repartieron aleatoriamente 50-50 en un conjunto de entrenamiento y un conjunto de ensayo. Se seleccionaron predictores candidatos superiores del conjunto de entrenamiento usando una prueba t. Esto se siguió de la construcción de un modelo usando un análisis de discriminación por etapas (v8.2, SAS, Cary, North Carolina). Se evaluó la predicción de clase usando una validación cruzada de 10 veces. Los modelos desarrollados a partir del conjunto de entrenamiento se evaluaron

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usando un conjunto de ensayo.

Además de la generación de perfiles de ARN a partir del estudio clínico, se examinó una base de datos de expresión de 164 tumores colorrectales primarios (Banerjea y col., Mol. Cancer, 3, 21 (2004)) para identificar marcadores predictivos potenciales. Los datos de los 640 conjuntos de sondas que pasaron las etapas de filtración descritas anteriormente en los resultados se sometieron después a un agrupamiento jerárquico de conexión promedia no supervisado usando CLUSTER y los resultados se presentaron usando TREEVIEW.

RT-qPCR para análisis de la expresión génica:

Para cada muestra de la que había disponible ARN, aproximadamente 100 ng de ARN se convirtieron en ADNc por el procedimiento de cebado aleatorio usando la transcriptasa inversa MultiScribe de acuerdo con las instrucciones del fabricante (reactivos de transcripción inversa TaqMan, Applied Biosystems Inc. ((ABI), Foster City, California). El ADNc resultante se midió en el sistema de detección de secuencias ABI 7900HT usando conjuntos de cebadores/sondas ABI Assay-on-Demand dirigidos contra los genes de anfirregulina (Hs00155832_ml) y epirregulina (Hs00154995_ml). Los niveles de expresión relativa se calcularon usando el procedimiento ΔCt en el que se compararon valores promedio de reacciones por duplicado, sirviendo GAPDH (Hs001266705_g1) como referencia interna. En este diseño experimental, bajos valores de ΔCt corresponden a altos niveles de expresión.

Análisis de la secuencia de nucleótidos:

Se realizaron análisis de mutaciones de EGFR, K-RAS y BRAF usando ADN genómicos disponibles aislados de especímenes de tumores. Los cebadores usados para los exones 18-21 de EGFR, que codifican el dominio TK, se publicaron previamente (Lynch y col., N. Engl. J. Med, 350, 2129 2139 (2004)). Los cebadores usados para evaluar el exón 2 de K-RAS y el exón 15 de BRAF eran los siguientes: K-RAS F 5’-TAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’ (SEC ID Nº: 257) y K-RAS R 5’-TGGTCCTGCACCAGTAA TATGC-3’ (SEC ID Nº: 258); BRAF F 5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’ (SEC ID Nº: 259) y BRAF R 5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’ (SEC ID Nº: 260). Se realizó una PCR usando las condiciones que se han descrito anteriormente (Chen y col, Hum. Mutat., 27, 427-435 (2006)). Los fragmentos de PCR se limpiaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen), se secuenciaron en un analizador genético capilar ABI 3100A (Applied Biosystems Inc.) y se analizaron en las direcciones tanto con sentido como antisentido para determinar la presencia de mutaciones heterocigotas. Se realizó un análisis de la secuencia de ADN usando SEQUENCHER v4.2 (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan), seguido de análisis visual de cada electroferograma por dos revisores independientes. Se incluyeron controles positivos y negativos apropiados para cada uno de los exones evaluados. Los análisis de mutaciones se realizaron sin conocimiento del desenlace clínico incluyendo, la respuesta tumoral.

RESULTADOS

Características de los pacientes y desenlace clínico:

El objetivo primario de este estudio era identificar marcadores predictivos de respuesta a la terapia con cetuximab en el CCR. Estaban disponibles muestras de ARN y/o ADN y/o plasma evaluables para 103 de los 111 sujetos. La determinación de respuesta objetiva para estos 103 sujetos era: una respuesta completa (CR), seis respuestas parciales (PR), veintiocho con enfermedad estable (SD), cincuenta y seis con enfermedad progresiva (PD) y doce pacientes que murieron antes de su primera evaluación radiográfica y, por lo tanto, incapaces de determinarse (UTD). El treinta y cuatro por ciento de los sujetos respondían o tenían una estabilización de la enfermedad, mientras que el 66% restante se clasificaron como que no respondían.

Análisis genómico de ARN derivados de tumores:

Para identificar genes que se expresasen de forma diferencial entre los grupos de control de la enfermedad y que no responden se llevó a cabo una generación de perfiles de expresión génica sobre ARN aislado de 95 biopsias pretratamiento. El setenta por ciento de las biopsias se tomaron del tejido metastásico hepático y el 30% de las biopsias se tomaron de sitios de tejido no hepático. 91 de las 95 muestras produjeron >500 ng de ARN y se aleatorizaron en diez bloques y se generaron perfiles en microplacas U133A v2.0 (Affymetrix). Se obtuvieron datos de generación de perfiles de transcripción de alta calidad de 87 pacientes. Siete pacientes se excluyeron de un análisis adicional porque se retiraron del estudio antes de la primera evaluación, experimentaron hipersensibilidad o retiraron su consentimiento. El análisis de datos final se llevó a cabo usando evaluaciones de la mejor respuesta clínica para los 80 pacientes restantes y los perfiles de expresión de estos pacientes se incluyeron en el análisis estadístico. Estos 80 pacientes incluían 1 CR, 5 PR, 19 SD, 43 PD y 12 UTD.

Se identificó un conjunto de genes candidatos inicial que se expresaba de forma variable en un conjunto independiente de 164 tumores colorrectales primarios por filtración de los datos de transcripción de los 22.215 conjuntos de sondas. Esta filtración produjo 640 conjuntos de sondas que se expresaban a un nivel de moderado a elevado en tumores de colon (al menos un valor de expresión de dos veces el valor medio para la matriz, es decir, 3000 unidades de expresión) y con un valor de varianza de población de >0,1. Se propuso que estos 640 conjuntos de sondas que tenían un intervalo de expresión altamente dinámico a lo largo de una población de tumores CCR era más probable que produjeran marcadores que fueran útiles para la selección de pacientes. Un agrupamiento

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jerárquico no supervisado de los 640 conjuntos de sondas a lo largo de los 164 tumores de colon primarios mostró que genes biológicamente interesantes que podrían ser predictivos de la respuesta a cetuximab se expresaban preferentemente en un subconjunto de tumores colorrectales (FIG. 6). En la FIG. 6, los 164 tumores se dividieron en 3 clases principales (clase 1, 2 y 3). Los 640 conjuntos de sondas se dividieron en 5 grupos (etiquetados de A a E).

5 El grupo A, que contiene antígenos de cáncer tales como CEACAM 6 y CD24, también contiene los ligandos de EGFR EREG y AREG. El grupo A está más altamente expresado en la Clase 1a, que representa aproximadamente el 25% de los 164 especímenes de tumor colorrectal.

De los 22.215 conjuntos de sondas, se realizó análisis de datos en 17.137 conjuntos de sondas que se descubrió que se expresaban en al menos el 10% de las muestras de pacientes con metástasis en hígado. 629 de los 640

10 conjuntos de sondas identificados previamente estaban presentes en la lista de 17.137 conjuntos de sondas. Sus perfiles de expresión génica se examinaron en los datos de 80 pacientes y se correlacionaron con las evaluaciones de respuesta. Se descubrió que 121 de los 629 conjuntos de sondas se expresaban de forma diferencial entre 25 pacientes con control de la enfermedad y 55 que no respondían, p < 0,05 (prueba t del grupo de enfermedad (CR, PR, SD) frente a los que no responden) como se muestra en la Tabla 4.

15 TABLA 4 -121 conjuntos de sondas expresadas de forma diferencial entre 25 pacientes con control de la enfermedad y 55 que no responden, p<0,05

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

203939_at: 3,787 E-07 5'-nucleotidasa, ecto (CD73) NT5E

205767_at: 1,474 E-05 epirregulina EREG

205239 _at: 2,489E-05 derivado anfirregulina (factor de crecimiento de schwannoma) AREG

213975_s_at: 3,617E-05 leucocito lisozima (amiloidosis renal) /// receptor de tipo inmunoglobulina, subfamilia B (con dominios TM e ITIM), miembro 1 LYZ /// LILRB1

201641_at: 9,146E-05 antígeno de célula estromal de medula ósea 2 BST2

208893_s_at: 0,000257 fosfatasa de especificidad doble 6 DUSP6

218807_at: 0,000507 oncogén vav 3 VAV3

218806_s_at: 0,000513 oncogén vav 3 VAV3

216598_s_at: 0,000680 ligando de quimiocina (motivo C-C) 2 CCL2

213435_at: 0,000909 miembro de la familia de SATB 2 SATB2

210517_s_at: 0,00163 6 proteína de anclaje a quinasa A (PRKA) (gravina) 12 AKAP12

219508_at: 0,00193 5 3, tipo mucina glucosaminil (N-acetil) transferasa GCNT3

201462_at: 0,001937 secernina 1 SCRN1

204379_s_at: 0,002008 receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 3 (acondroplasia, enanismo tanatofórico) FGFR3

206584_at: 0,002018 antígeno linfocitario 96 LY96

200884_at: 0,002042 creatina quinasa, cerebro CKB

206332_s_at: 0,002612 proteína inducible por interferón gamma 16 IFI16

202525_at: 0,002630 serina proteasa 8 (prostasina) PRSS8

205403_at: 0,002869 receptor de interleucina 1, tipo II IL1R2

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(continuación)

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

221530_s_at: 0,002881 que contiene dominio de hélice-bucle-hélice básico, clase B, 3 BHLHB3

209728_at: 0,003260 complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DR beta 4 /// complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DR beta 4 HLA-DRB4

215049_x_at: 0,004039 antígeno CD163 CD163

203645_s_at: 0,004182 antígeno CD163 CD163

219471_at: 0,004627 fase de lectura abierta 18 del cromosoma 13 C13orf18

210133_at: 0,004790 ligando de quimiocina (motivo C-C) 11 CCL11

205097_at: 0,005553 familia de transportador de soluto 26 (transportador de sulfato), miembro 2 SLC26A2

211656_x_at: 0,006050 complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ beta 1 /// complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ beta 1 HLA-DQB1

209392_at: 0,006150 ectonucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 2 (autotaxina) ENPP2

205402_x_at: 0.006181 serina proteasa 2 (tripsina 2) PRSS2

217028_at: 0,006582 receptor de quimiocina (motivo C-X-C) 4 CXCR4

204855_at: 0,006615 inhibidor de serpina peptidasa, clado B (ovoalbúmina), miembro 5 SERPINBS

201137_s_at: 0,007369 complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DP beta 1 HLA-DPB1

215051_x_at: 0,007563 factor inflamatorio de aloinjerto 1 AIF1

202859_x_at: 0,007872 interleucina 8 IL8

211506_s_at: 0,008119 interleucina 8 IL8

207457_s_at: 0,008600 complejo de antígeno linfocitario 6, locus G6D LY6G6D

205765_at: 0,009101 citocromo P450, familia 3, subfamilia A, polipéptido 5 CYP3A5

204619_s_at: 0,009733 (versicán) proteoglicano de sulfato de condroitina 2 CSPG2

205199_at: 0,010621 anhidrasa carbónica IX CA9

219962_at: 0,010751 enzima conversora de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 2 ACE2

205242_at: 0,01102213 ligando de quimiocina (motivo C-X-C) (quimioatrayente de linfocitos B) CXCL13

217428_s_at: 0,011274 colágeno, tipo X, alfa 1(condrodisplasia metafiseal tipo Schmid) COL10A1

206918_s_ at: 0,011540 copina I CPNE1

44790_s_at: 0,011645 fase de lectura abierta 18 del cromosoma 13 C13orf18

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(continuación)

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

218469_at: 0,011704 gremlina 1, superfamilia de nudo de cisteína, homólogo (Xenopus laevis) GREM1

209823_x_at: 0,011862 complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ beta 1 HLA-DQB1

205513_at: 0,0118 67 unión transcobalamina I (proteína vitamina B12, familia de agente de unión R) TCN1

204213_at: 0,012198 receptor polimérico de inmunoglobulina PIGR

205941_s_at: 0 ,012335 colágeno, tipo X, alfa 1(condrodisplasia metafiseal tipo Schmid) COL10A1

212192_at: 0,012522 dominio que contiene tetramerización de canal de potasio 12 KCTD12

204891_s_at: 0,012755 proteína tirosina quinasa específica de linfocitos LCK

208029_s_at: 0,012800 proteína transmembrana asociada a lisosoma 4 beta /// proteína transmembrana asociada a lisosoma 4 beta LAPTM4B

201884_at: 0,013032 molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 CEACAM5

201030_x_at: 0,013074 lactato deshidrogenasa B LDHB

202411_at: 0,013302 27 proteína inducible por interferón alfa IFI27

211165_x_at: 0,013671 receptor de EPH B2 EPHB2

212186_at: 0,014902 acetil-Coenzima A carboxilasa alfa ACACA

201743_at: 0,015156 antígeno CD14 /// antígeno CD14 CD14

87100_at: 0,015 861 -- --

206467_x_at: 0,015975 superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 6b, señuelo /// regulador de helicasa de elongación de telómeros 1 TNFRSF6B /// RTEL1

218468_s_at: 0,016329 gremlina 1, superfamilia de nudo de cisteína, homólogo (Xenopus laevis) GREM1

222257_s_at: 0,016397 enzima conversora de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 2 ACE2

221730_at: 0,016992 colágeno, tipo V, alfa 2 COL5A2

203915_at: 0,017412 ligando de quimiocina (motivo C-X-C) 9 CXCL9

206858_s_at: 0,01749 2 caja homeo C6 HOXC6

221584_s_at: 0,0175 54 canal activado por calcio de gran conductancia de potasio, subfamilia M miembro alfa 1 KCNMA1

204475_at: 0,018085 metalopeptidasa de la matriz 1 (colagenasa intersticial) MMP1

203895_at: 0,018353 fosfolipasa C, beta 4 PLCB4

13-10-2011

(continuación)

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

214043_at: 0,018926 proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, D PTPRD

204678_s_at: 0,019645 canal de potasio, subfamilia K, miembro 1 KCNK1

204446_s_at: 0,019912 araquidonato 5-lipooxigenasa ALOX5

204533_at: 0,020226 ligando de quimiocina (motive C-X-C) 10 CXCL10

211689_s_at: 0,020262 serina proteasa transmembrana 2 /// serina proteasa transmembrana 2 TMPRSS2

201858_s_at: 0,020471 proteoglicano 1, gránulo secretor PRG1

212671_s_at: 0,020852 complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ alfa 1 /// complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ alfa 2 HLA-DQA1 /// HLA-DQA2

216248_s_at: 0,021062 A, subfamilia del receptor nuclear 4, miembro de grupo 2 NR4A2

212188_at: 0,021225 dominio que contiene tetramerización de canal de potasio 12 /// que contiene tetramerización de canal de potasio 12 KCTD12

204070_at: 0,021833 (tazaroteno elemento de respuesta a receptor de ácido retinoico inducido) 3 RARRES3

213564_x_at: 0,022061 lactato deshidrogenasa B LDHB

209732_at: 0,022699 familia de dominio de lectina tipo C 2, miembro B CLEC2B

213746_s_at: 0,023141 filamina A, alfa (proteína de unión a actina 280) FLNA

214974_x_at: 0,023351 ligando de quimiocina (motivo C-X-C) 5 CXCL5

201792_at: 0,023592 proteína de unión a AE 1 AEBP1

213905_x_at: 0,023638 biglicano /// antígeno de cáncer de colon definido serológicamente 33 BGN /// SDCCAG33

212353_at: 0,024175 sulfatasa 1 SULF1

209156_s_at: 0,024926 colágeno, tipo VI, alfa 2 COL6A2

203083_at: 0,025140 trombospondina 2 THBS2

203896_s_at: 0,025311 fosfolipasa C, beta 4 PLCB4

201617_x_at: 0,025316 caldesmón 1 CALD1

217963_s_at: 0,025667 proteína asociada al receptor del factor de crecimiento nervioso (TNFRSF16) 1 NGFRAP1

208965_s_at: 0,025706 proteína inducible por interferón gamma 16 IFI16

217763_s_at: 0,026315 RAB31, miembro de la familia de oncogén RAS RAB31

203325_s_at: 0,026698 colágeno, tipo V, alfa 1 COL5A1

209792_s_at: 0,026893 calicreína 10 KLK10

205549_at: 0,027028 proteína de células de Purkinje 4 PCP4

13-10-2011

(continuación)

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

204622_x_at: 0,028026 A, subfamilia del receptor nuclear 4, miembro de grupo 2 NR4A2

210095_s_at: 0,030712 proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina 3 IGFBP3

209969_s_at: 0,031010 transductor de señales y activador de la transcripción 1, 91 kDa STAT1

202436_s_at: 0,031792 citocromo P450, familia 1, subfamilia B, polipéptido 1 CYP1B1

202311_ s_at: 0,032306 colágeno, tipo I, alfa 1 COL1A1

221031_s_at: 0,0324 15 DKFZp434F0318 proteína hipotética /// proteína hipotética DKFZp434F0318 DKFZP434F0318

209118_ s_at: 0,032949 tubulina, alfa 3 TUBA3

210164_at: 0,033266 granzima B (granzima 2, serina esterasa asociada a linfocitos T citotóxicos 1) /// granzima B (granzima 2, serina esterasa asociada a linfocitos T citotóxicos 1) GZMB

213194_at: 0,034686 rodeo, receptor de guía de axones, homólogo 1 (Drosophila) ROBO1

204697_s_at: 0,034934 cromogranina A (proteína secretora paratiroidea 1) CHGA

202752_x_at: 0,035921 familia de transportador de soluto 7 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+), miembro 8 SLC7A8

205929_at: 0,037216 glicoproteína A33 (transmembrana) GPA33

204044_at: 0,037293 quinolinato fosforribosiltransferasa (nicotinato-nucleótido pirofosforilasa (carboxilante)) QPRT

205311_at: 0,037673 dopa descarboxilasa (descarboxilasa de Laminoácidos aromáticos) DDC

204320_at: 0,038710 colágeno, tipo XI, alfa 1 COL11A1

204364_s_at: 0,040104 fase de lectura abierta 23 del cromosoma 2 C2orf23

212354_at: 0,040347 sulfatasa 1 SULF1

202465_at: 0,040639 potenciador de procolágeno Cendopeptidasa PCOLCE

212992_at: 0,041178 fase de lectura abierta78 del cromosoma 14 C14orf78

209201_x_at: 0,0421264 receptor de quimiocina (motivo C-X-C) CXCR4

215646_s_at: 0,043050 proteoglicano de sulfato de condroitina 2 (versicán) /// proteoglicano de sulfato de condroitina 2 (versicán) CSPG2

202283_at: 0,045795 (alfa-2 inhibidor de serpina peptidasa, antiplasmina de clado F, factor derivado de epitelio pigmentario), miembro 1 SERPINF1

13-10-2011

(continuación)

ID Affymetrix: Valor p Nombre de gen Símbolo

209436_at: 0,046099 espondina 1, proteína de la matriz extracelular SPON1

37892_at: 0,048675 colágeno, tipo XI, alfa 1 COL11A1

218559_s_at: 0,048679 homólogo de oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf B (aviar) MAFB

213998_s_at: 0, 049742 polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 17 DDX17

Los tres marcadores candidatos superiores basándose en el menor valor p eran 5’ nucleotidasa ecto (CD73, 203939_at), epirregulina (EREG, 205767_at) y anfirregulina (AREG, 205239_at). CD73 es una enzima metabolizante de purina que puede tener valor pronóstico en el cáncer colorrectal y pancreático (Eroglu y col., Med. Oncol., 17, 5 319-324 (2000); Giovannetti y col., Cancer Res., 66, 3928-3935 (2006)). El examen de su perfil de ARNm mostró que se expresa a mayores niveles en el grupo que no responde. La epirregulina y la anfirregulina son ligandos para EGFR (Singh y Harris, Cell Signal, 17, 1183-1193 (2005)). El examen de sus perfiles de expresión de ARNm individuales puso de manifiesto que se expresaban más altamente en pacientes en el grupo de control de la enfermedad (FIG. 7A y 7B). Las FIG. 7A y 7B proporcionan niveles de ARNm de los ligandos de EGFR epirregulina 10 y anfirregulina. Los niveles de ARNm Affymetrix de epirregulina (EREG, 205767_at) y anfirregulina (AREG, 205239_at) se representan en el eje y. Existe una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión génica entre el grupo de control de la enfermedad (CR, PR y SD) y el grupo que no responde (EREG p = 1,474e-05, AREG p = 2,489e-05). Estos resultados sugieren que los pacientes que tienen altos niveles de EREG y AREG tienen tumores que son adictos a la ruta de señalización de EGFR y, por lo tanto, es más probable que

15 experimenten control de la enfermedad en el tratamiento con cetuximab.

Además de la estrategia de filtración de genes descrita anteriormente, se realizó un análisis de novo sobre los perfiles de transcripción de los mismos 80 pacientes. Se realizó una prueba t de varianza desigual bilateral sobre los

17.137 conjuntos de sondas. Los 10 genes superiores se proporcionan en la Tabla 5.

TABLA 5 -10 genes superiores del análisis de novo

ID Affymetrix: valor p Nombre de gen Símbolo

203939_at 07: 3,787E 5'-nucleotidasa, ecto (CD73) NT5E

217999_s_at 06: 7,056E dominio de tipo homología con pleckstrina, familia A, miembro 1 PHLDA1

205767_at 05: 1,474E epirregulina EREG

203349_s_at 05: 1,704E gen variante de ets 5 (molécula relacionada con ets) ETV5

204015_s_at: 1,812E-05 fosfatasa de especificidad doble 4 DUSP4

204014_at: 1,856E-05 fosfatasa de especificidad doble 4 DUSP4

212349_at 05: 2,395E proteína O-fucosiltransferasa 1 POFUT1

205239_at 05: 2,489E anfirregulina (factor de crecimiento derivado de schwannoma) AREG

208130_s_at: 2, 646E-05 tromboxano A sintasa 1 (plaquetas, citocromo P450, familia 5, subfamilia A) /// tromboxano A sintasa 1 (plaquetas, citocromo P450, familia 5, subfamilia A) TBXAS1

219615_s_at: 3,153 E-05 canal de potasio, subfamilia K, miembro 5 KCNK5

20 El examen de los 10 genes superiores con el menor valor p puso de manifiesto que se encontró una vez más que ERG y AERG eran marcadores de sensibilidad superiores. Se encontró que CD73, fosfatasa de especificidad doble 4 (DUSP4, 204015_s_at y 204014_at) y el dominio de tipo homología con pleckstrina A1 (PHLDA1, 217999_s_at) eran marcadores de resistencia superiores. Los niveles de expresión de ARNm del factor de crecimiento epidérmico (EGF, 206254_at), factor de crecimiento transformante alfa (TGFα, 205016_at), betacelulina (BTC, 207326_at) y

13-10-2011

EGF de unión a heparina (HB-EGF, 203821_at), algunos de los otros ligandos conocidos para EGFR, se revisaron también. Sus niveles de expresión no mostraron correlación con la respuesta a cetuximab. También vale la pena señalar que no se observó correlación entre los niveles de ARNm de EGFR (201983_s_at) y la respuesta a cetuximab. Estos resultados sugieren que un análisis de novo usando sólo los datos de generación de perfiles de

5 transcripción reunidos a partir de este estudio clínico podría encontrar los marcadores candidato EREG y AREG. Sin embargo, dada la cuestión de múltiples comparaciones de ensayo, la identificación de EREG y AREG usando una estrategia de filtración independiente descrita anteriormente presta un apoyo adicional a que sean candidatos para predecir la respuesta a cetuximab.

A partir de los análisis de prueba t, podía evaluarse la capacidad de biomarcadores individuales para separar el

10 grupo de control de la enfermedad de los que no respondían. Usando un análisis de función de discriminación, se evaluó la potencia de predicción del conjunto de los 100 marcadores candidatos superiores para la respuesta del paciente para identificar el conjunto de variables que serían los mejores predictores de control de la enfermedad con el tratamiento con cetuximab. Los valores de la AUC (área bajo la curva de característica de funcionamiento del receptor) de los diferentes modelos multigén mostraron que a medida que aumentaba el número de genes en el

15 modelo de uno a quince la potencia predictiva del modelo no mejoraba. El valor de la AUC de un modelo de un solo gen era de >0,8. Se realizó un ensayo independiente para evaluar el rendimiento del gen identificado más frecuentemente, EREG, y también de AREG, como predictores individuales. EREG tiene un valor de AUC de 0,845 y AREG tiene un valor de AUC de 0,815, indicando que ambos son marcadores predictivos altamente potentes para la selección de pacientes (FIG. 8A y 8B).

20 Análisis de los marcadores candidato epirregulina y anfirregulina:

Para verificar independientemente la expresión génica con una plataforma de tecnología diferente que en última instancia puede ser más fácil de transferir a un ensayo de diagnóstico, se midieron los niveles de transcritos de AREG y EREG usando ensayos de RT-PCR cuantitativa TaqMan. Se obtuvieron los niveles de expresión de estos genes para muestras tumorales de 73 de los sujetos usando procedimientos tanto basados en matrices como de

25 qRT-PCR (Tabla 6).

TABLA 6 -Niveles de expresión de anfirregulina y epirregulina mediante ensayos de RT-PCR cuantitativa TaqMan

Evaluación de mejor respuesta clínica: Expresión de AREG AffyQ Expresión de EREG AffyQ dCt de qRT-PCR AREG dCt de qRT-PCR EREG Cambio de base de codón por mutación KRAS Cambio de aminoácido por mutación KRAS Orden de muestra en FIG. 7

CR: 2573,74 1659,91 5,80 5,32 1

PD: 949,81 450,25 7,79 7,20 WT 36

SD: 3353, 93 2336,8 9,58 8,89 c.35G> T G12V 7

SD: 105,82 89,23 9,35 9,31 WT 8

UTD: 1581,54 603,27 6,48 6,20 c.35G>A G12D 73

SD

PD: 1626,87 668,84 5,40 5,48 c.35G>T G12V 32

PD: 122,3 46,36 58

UTD: 321,51 56,59 9,20 9,31 c.35G>A G12D 69

SD

SD

PD: 177,95 128,85 9,01 8,76 c.35G>A G12D 67

PD: 2550,49 655,04 4,57 5,64 WT 30

PR: 3974,98 1108,91 3,23 4,38 WT 2

PD: 1084,91 622,01 5,35 5,46 WT 26

PD: 611,84 573,66 6,17 5,60 WT 47

13-10-2011

(continuación)

SD: 955,24 292,33 6,22 7,30 WT 11

PR: 5083,12 1166,18 WT 5

PD

SD: 2481,22 1154, 9 4,56 4,99 WT 12

SD: 2527,86 1395,95 5,37 4,35 WT 13

SD: WT

PD: c.35G>A G12D

PD: 402,53 419,27 9,34 6,14 c.35G>A G12D 62

PR: 3395,09 1447,49 3,7 6 4,14 WT 3

PD: 2134,23 906,03 7,11 6,45 c.35G>T G12V 37

PD: 1163,17 100,48 6,39 9,52 c.35G>T G12V 27

UTD: 1086,48 113,14 UTD UTD WT 70

UTD: 301,36 241,05 8,82 8,30 WT 74

SD: 4414,67 1331,61 > 3,77 4,67 WT 14

SD: 609,57 62,96 c.35G>A G12D 15

PD: WT

PD: 901,86 459,6 8,30 7,43 W T 68

PD: WT

PR: 3332,21 2042,92 5,17 3,47 WT 6

PD: 42,03 78,71 1 1,81 9,19 WT 48

SD: WT

PD: c.35G>C G12A

PR: 1418,75 2411,15 4,91 3,40 WT 4

UTD: 872,72 469,76 6,32 5 ,55 c.35G>A G12D 71

SD: 1384,71 632,61 5,75 5 ,60 na 9

PD: 50 3,53 206,2 6,83 7,10 na 59

PD: 75,64 50,98 10,33 9,52 61

PD: 1879,09 587,4 7,50 7 ,25 na 41

PD: 4 71,68 36,46 5,60 4,77 34

PD: 39,27 8,15 12,33 13,18 WT 55

PD: 111,94 107,83 10,02 8,30 WT 43

PD: na

13-10-2011

(continuación)

PR: na

PD: 1464,45 298,7 5,94 7,16 W T 51

SD: 5533,18 2232,8 na 10

PD: 236,8 42,59 8,96 UTD 54

SD: 1416,68 819,85 WT 16

PD: 719,16 550,72 6,38 5 ,90 c.35G>A G12D 42

PD

U TD: 127,95 12,85 9,86 10,64 c.35G>A G12D 72

P D: 331,54 307,55 8,22 6,83 WT 33

PD: 936,71 64,49 8,28 10,95 WT 65

PD: 132,01 28,72 10,55 12,04 c.35G>A G12D 35

UTD: 760,08 221,16 6,27 8,55 . 75

PD: 162,74 71,16 10,21 11,17 WT 28

UTD: 865,02 258,5 7,95 8,94 c .34G>A G12S 76

PD: 489,57 224,81 8,17 7,70 c. 35G>T G12V 46

PD: 813,24 529,95 7,16 6,79 c.3 5G>A G12D 38

PD

PD

PD: 1556,84 703,23 5,70 5,40 c.35G>C G12A 60

SD

PD: 1646,55 1127,43 6,44 5,39 WT 5 7

PD

PD: 27,71 1,05 13,23 UTD WT 56

PD: 1182,47 76,66 7,48 10,91c,34 G>A G12S 50

PD

PD: 532,55 171,22 8,87 8,79 c.35 G>C G12A 45

PD: 12,43 13,62 UTD 13,67 WT 63

SD: 2809,16 804, 93 6,13 5,20 WT 17

UTD: 1656,76 665,01 6,14 5,07 c.38G>A G13D 77

SD: 18,88 2,2 10,67 12,31 WT 18

13-10-2011

(continuación)

SD: 1479,28 799,93 5,74 6,28 WT 19

PD: 1034,32 384,07 6,64 7,29 WT 53

UTD: 24,18 15,47 UTD UTD WT 78

UTD: 54,13 11,49 9,44 11,32 WT 79

SD: 155 4,57 646,2 5,23 5,86 WT 20

SD: 3536,88 1764 ,91 5,82 3,45 WT 21

SD: WT

SD: 6390,33 3078,94 3, 47 4,02 WT 22

PD

PD: 801,39 486,2 6,81 7,14 WT 40

SD: c.35G>A G12D

UTD: 1945,99 240,5 8,21 10,16 c.38G>A G13D 80

PD: 1984,72 897,89 4,21 4,31 c.35G>T G12V 64

SD: 5830,27 1980,37 2,58 3,11 WT 23

PD: 2321 784,77 5,41 5,21 c.35G>T G12V 29

PD: WT

PD: 1095,66 468,77 9,03 7,75 c.38G>A G13D 66

PD: 442,29 77,8 9,84 10,39 c.35G>A G12D 49

SD: 1610,75 442,09 5,25 6,21 WT 24

SD: 2615,62 1113,89 5,67 7,03 WT 25

PD: 1737,75 694,22 6,05 7,01 WT 44

SD: WT

PD: 2271,37 634,05 5,32 5,61 c. 35G>A G12D 39

PD: 1858,06 870,14 6,27 6,34 c. 35G>A G12D 52

PD: 1018,25 859,41 8,08 5,91 WT 31

Había buena correlación entre los dos procedimientos (para datos de matrices transformados por log2, Pearson > 0,85, R2 > 0,7), con alta expresión en matrices Affymetrix que corresponde a valores reducidos de ∆Ct de ensayos TaqMan para tanto anfirregulina como epirregulina (FIG. 9).

5 Análisis genético de ADN aislado de biopsias de tumores y sangre completa:

Se encuentra que las mutaciones somáticas en el dominio tirosina quinasa de EGFR están fuertemente asociadas con la sensibilidad a gefitinib y erlotinib en CPNM (Janne y col., J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)). Se ha descrito que las mutaciones somáticas en el domino TK de EGFR no son necesarias para la respuesta al cetuximab, ni parecen ser predictivas de la respuesta al cetuximab (Tsuchihashi y col., N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)). 10 Las mutaciones somáticas en K-RAS están asociadas con una ausencia de sensibilidad a gefitinib y erlotinib en el CPNM, pero su papel en la sensibilidad al cetuximab en el CCR no está claro (Moroni y col., Lancet Oncol., 6, 279

60 E06813702

13-10-2011

286 (2005); Pao y col., PLoS Med., 2, e17 (2005)). Se evaluó ADN de 80 biopsias de tumores para determinar mutaciones en EGFR, K-RAS y BRAF. No se detectó ni una sola mutación heterozigota en el dominio quinasa de EGFR ni en el exón 15 del BRAF. Se detectaron 2 mutaciones en el exón 2 de K-RAS que afectaban al codón 12 y 13 en 30 de las 80 (38%) muestras analizadas (Tabla 6). Se detectaron mutaciones de K-RAS en sólo 3 pacientes con enfermedad estable de los 27 pacientes del grupo de control de la enfermedad (5 PR y 22 SD) ensayados. Por otro lado, se detectaron mutaciones de K-RAS en 27 de los 53 que no respondían (51%). Los datos muestran claramente que la presencia de una mutación de K-RAS se correlaciona con una ausencia de respuesta a la terapia con cetuximab.

Discusión:

Los descubrimientos clave del análisis de las biopsias pretratamiento son que los pacientes cuyos tumores expresan altos niveles de los ligandos de EGFR epirregulina y anfirregulina es más probable que se beneficien de la terapia con cetuximab. Además, se descubrió que los pacientes cuyos tumores no tenían mutaciones de K-RAS tienen un índice de control de enfermedad significativamente mayor que aquellos con mutaciones de K-RAS.

Los genes para los ligandos de EGFR epirregulina y anfirregulina se colocalizan en el cromosoma 4q13.3 (Conti y col., Mol. Endocrinol., 20, 715-723 (2006)). Se observó que la expresión de epirregulina y anfirregulina estaba regulada de forma coordinada (correlación de Pearson = 0,85). Se sabe que la epirregulina se une más débilmente a EGFR y ERBB4 que el ligando EGF, pero es un mitógeno mucho más potente que EGF y conduce a un estado prolongado de activación del receptor (Shelly y col., J. Biol. Chem., 273, 10496-10505 (1998)). La expresión elevada de epirregulina y/o anfirregulina puede desempeñar un papel importante en el crecimiento tumoral y la supervivencia por estimulación de un bucle autocrino a través de EGFR. Esto puede caracterizar a un tumor que sea “dependiente de EGFR” y, por lo tanto, sensible a la capacidad del cetuximab para bloquear la interacción de ligando-receptor. Las observaciones de que la expresión constitutiva de epirregulina y anfirregulina en células L2987 se disminuye tras el tratamiento con inhibidor de EGFR, se estimula por tratamiento con EGF, y que el tratamiento con cetuximab bloquea el crecimiento de células L2987 confirma la hipótesis de que estos ligandos de EGFR son balizas de una ruta de EGFR activado y quizá estimuladores autocrinos. Esta hipótesis también se confirma por resultados en un modelo de ratón de cáncer de pulmón en el que una alta expresión de epirregulina y anfirregulina, así como de ERBB3, dependía de la activación de EGFR (Fujimoto y col., Cancer Res., 65, 11478-11485 (2005)).

No es sorprendente que los descubrimientos de la expresión de ARN de epirregulina y anfirregulina no se tradujeran en ensayos basados en proteínas. Los transcritos de ARNm pueden codificar las formas precursoras ancladas a membrana que en última instancia se escinden para generar formas solubles. En el caso de la anfirregulina, se ha demostrado que la isoforma anclada a membrana, así como la forma soluble, son biológicamente activas y pueden inducir una señalización yuxtacrina, autocrina o paracrina (Singh y Harris, Cell Signal, 17, 1183-1193 (2005)). Es interesante señalar que al contrario que estos descubrimientos, se ha descrito que niveles séricos elevados de anfirregulina y TGFα predicen una respuesta escasa a gefitinib en pacientes con CPNM avanzado. (Ishikawa y col., Cancer Res., 65, 9176-9184 (2005)). Todavía está por determinar si los tumores de los pacientes con altos niveles séricos de anfirregulina y TGFα descritos en ese estudio pueden tener otras aberraciones genéticas tales como una mutación de K-RAS que pueda permitir evitar su dependencia de la señalización de EGFR para su crecimiento y supervivencia.

La epirregulina y anfirregulina pueden usarse para identificar otros tipos tumorales que podrían ser sensibles a cetuximab. La expresión de epirregulina y anfirregulina se aumenta en células de cáncer de próstata independiente de andrógenos, y después de la castración en un xenoinjerto de cáncer de próstata sensible a andrógenos (Torring y col., Prostate, 64, 1-8 (2005); Torring y col., Anticancer Res., 20, 91-95 (2000)). La expresión de epirregulina es superior en el cáncer pancreático, donde estimula el crecimiento de células (Zhu y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 273, 1019-1024 (2000)) y en pacientes con cáncer de vejiga, donde se correlaciona con la supervivencia (Thogersen y col., Cancer Res., 61, 6227-6233 (2001)). La expresión aumentada de anfirregulina se encuentra que está significativamente correlacionada con la supervivencia global en el cáncer pulmonar no microcítico (CPNM) (Fontanini y col., Clin. Cancer Res., 4, 241-249 (1998)). La expresión de anfirregulina es mayor en células de mieloma múltiple que expresan receptores de ERBB y promueve su crecimiento (Mahtouk y col., Oncogene, 24, 3512-3524 (2005)). Recientemente, se ha descubierto que altos niveles de hormona luteinizante pueden elevar el riesgo de cánceres de ovario y de mama a través de la estimulación de epirregulina y anfirregulina, que a su vez podrían estimular la señalización mitogénica de EGFR (Freimann y col., Biochem. Pharmacol., 68, 989-996 (2004)). Por último, la observación de que EGFR y el receptor de estrógenos (ERα) median la expresión de anfirregulina (Britton y col., Breast Cancer Res. Treat., 96, 131-146 (2006)) sugiere que un subconjunto de pacientes con cáncer de mama (EGFR+, ER+, anfirregulina+) pueden beneficiarse de la terapia con cetuximab. Es notable que entre los pacientes con cáncer de mama metastásico tratados con el inhibidor de EGFR gefitinib en combinación con taxotere, se observaron índices de respuesta significativamente mejores en los tumores positivos a ER que en los tumores negativos a ER (Ciardiello y col., Br. J. Cancer, 94, 1604-1609 (2006)).

Además de la observación de que los dos ligandos de EGFR son predictivos de la respuesta a cetuximab, se descubrió que los pacientes sin mutaciones de K-RAS tienen un mayor índice de control de la enfermedad (48%) que aquellos con mutaciones de K-RAS (10%). Este resultado confirma los descubrimientos de un estudio recientemente descrito que muestra que los pacientes sin mutaciones de K-RAS tienen un mayor índice de control

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de la enfermedad (76%) que aquellos con mutaciones de K-RAS (31%) (Lievre y col., Cancer Res., 66, 3992-3995 (2006)). Curiosamente, una mayoría de los pacientes descritos en el estudio previo se trataron con una combinación de cetuximab y quimioterapia, sugiriendo que las mutaciones de K-RAS son predictivas de la progresión de enfermedad en los entornos tanto de monoterapia como de terapia de combinación. K-RAS desempeña un papel crucial en la ruta de RAS/MAPK que se localiza aguas debajo de EGFR y otros receptores de factores de crecimiento, y está implicado en la proliferación celular. Podría esperarse que la presencia de mutaciones activantes en K-RAS salvase la actividad inhibidora del cetuximab. También se ha descubierto que las mutaciones de K-RAS están asociadas con la resistencia a gefitinib y erlotinib en CPNM (Pao y col., PLoS Med., 2, e17 (2005)). Estos datos confirman sistemáticamente el papel de las mutaciones de K-RAS en la predicción de la respuesta a cetuximab y/u otros inhibidores de EGFR y debería seguirse evaluando en cánceres en los que las mutaciones de RAS son prevalentes, tales como CCR, CPNM y cáncer pancreático (Minamoto y col., Cancer Detect. Prev., 24, 1-12 (2000)).

Al contrario de lo que se ha observado en pacientes con CPNM (Janne y col., J. Clin. Oncol., 23, 3227-3234 (2005)), no se detectaron mutaciones en el gen de EGFR (exones 18-21) en los pacientes que se inscribieron en este estudio de CCR, confirmando la escasez de mutaciones en pacientes con CCR (Tsuchihashi y col., N. Engl. J. Med., 353, 208-209 (2005)). No se detectaron mutaciones en BRAF (exón 15) aunque dichas mutaciones se han observado a baja frecuencia (<5%) en otros estudios (Moroni y col., Lancet Oncol., 6,279-286 (2005)). Se observó un aumento en el número de copias de gen de EGFR en menos del 10% de los pacientes evaluados en este estudio y aunque había una tendencia hacia un mayor número de copias en los pacientes con control de la enfermedad, los resultados estaban más en línea con los de Lievre y col. (10% de los pacientes tenían amplificación) que con Moroni y col. (31% de los pacientes tenían amplificación). La evaluación del rendimiento un modelo usando la combinación del estado de mutación de K-RAS y los niveles de expresión de ARNm de epirregulina mostraba una potencia de predicción excelente (valor de AUC de 0,89).

EJEMPLO 3 -PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LOS BIOMARCADORES

Pueden prepararse anticuerpos contra los biomarcadores mediante una diversidad de procedimientos. Por ejemplo, pueden administrarse células que expresan un polipéptido biomarcador a un animal para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales dirigidos contra los polipéptidos expresados. En un aspecto, la proteína biomarcadora se prepara y se aísla o se purifica de otro modo para hacer que esté sustancialmente libre de contaminantes naturales, usando procedimientos realizados comúnmente en la técnica. Dicha preparación se introduce después en un animal para producir antisueros policlonales de mayor actividad específica para el polipéptido expresado y aislado.

En un aspecto, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión a proteína de los mismos). Pueden cultivarse células que expresan el polipéptido biomarcador en cualquier medio de cultivo tisular adecuado, sin embargo, es preferible cultivar células en medio de Eagle modificado por Earle complementado para contener suero bovino fetal al 10% (inactivado a aproximadamente 56ºC) y complementado para contener aproximadamente 10 g/l de aminoácidos no esenciales, aproximadamente 1,00 U/ml de penicilina y aproximadamente 100 µg/ml de estreptomicina.

Los esplenocitos de ratones inmunizados (y reforzados) pueden extraerse y fusionarse con una línea celular de mieloma adecuada. Puede emplearse cualquier línea celular de mieloma adecuada de acuerdo con la invención, sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma parental (SP2/0) disponible en la ATCC (Manassas, VA). Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y después se clonan por dilución limitante como se describe por Wands y col. (1981, Gastroenterology, 80: 225-232). Las células de hibridoma obtenidas a través de dicha selección se ensayan después para identificar aquellos clones de células que secretan anticuerpos capaces de unirse al inmunógeno polipeptídico o a una porción del mismo.

Como alternativa, pueden producirse anticuerpos adicionales capaces de unirse al polipéptido biomarcador en un procedimiento de dos etapas usando anticuerpos anti-idiotípicos. Dicho procedimiento hace uso del hecho de que los anticuerpos son de por sí antígenos y, por lo tanto, es posible obtener un anticuerpo que se una a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este procedimiento, pueden usarse anticuerpos específicos de proteína para inmunizar a un animal, preferentemente un ratón. Los esplenocitos de dicho animal inmunizado se usan después para producir células de hibridoma, y las células de hibridoma se exploran para identificar clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico de proteína puede bloquearse por el polipéptido. Dichos anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos contra el anticuerpo específico de proteína y pueden usarse para inmunizar a un animal para inducir la formación de anticuerpos específicos de proteína adicionales.

EJEMPLO 4 -ENSAYOS DE INMUNOFLUORESCENCIA

Puede usarse el siguiente protocolo de inmunofluorescencia, por ejemplo, para verificar la expresión de proteína biomarcadora de EGFR en células o, por ejemplo, para comprobar la presencia de uno o más anticuerpos que se unen a biomarcadores de EGFR expresados en la superficie de células. En resumen, portaobjetos de cámara LAP-Tek II se revisten durante una noche a 4ºC con 10 microgramos/mililitro (µg/ml) de colágeno bovino Tipo II en DPBS que contiene calcio y magnesio (DPBS++-). Los portaobjetos se lavan después dos veces con DPBS++ frío y se

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siembran con 8000 células transfectadas CHO-CCR5 o CHO pC4 en un volumen total de 125 µl y se incuban a 37ºC en presencia de oxígeno al 95%/dióxido de carbono al 5%.

El medio de cultivo se retira suavemente por aspiración y las células adherentes se lavan dos veces con DPBS++ a temperatura ambiente. Los portaobjetos se bloquean con DPBS++ que contiene BSA al 0,2% (bloqueante) a 0-4ºC 5 durante una hora. La solución de bloqueo se retira suavemente por aspiración y 125 µl de solución que contiene anticuerpo (una solución que contiene anticuerpo puede ser, por ejemplo, un sobrenadante de cultivo de hibridoma que se usa habitualmente sin diluir o suero/plasma que se usa habitualmente diluido, por ejemplo, una dilución de aproximadamente 1/100). Los portaobjetos se incuban durante 1 hora a 0-4ºC. Las soluciones de anticuerpos se retiran después suavemente por aspiración y las células se lavan cinco veces con 400 µl de solución de bloqueo

10 helada. A continuación, se añaden 125 µl de anticuerpo secundario marcado con rodamina 1 µg/ml (por ejemplo, anti-IgG humana) en solución de bloqueo a las células. De nuevo, las células se incuban durante 1 hora a 0-4ºC.

La solución de anticuerpo secundario se retira después suavemente por aspiración y las células se lavan tres veces con 400 µl de solución de bloqueo helada y cinco veces con DPBS++ frío. Después, las células se fijan con 125 µl de formaldehído al 3,7% en DPBS++ durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, las células se

15 lavan cinco veces con 400 µl de DPBS++ a temperatura ambiente. Por último, las células se montan en glicerol acuoso al 50% y se observan en un microscopio de fluorescencia usando filtros de rodamina.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bristol-Myers Squibb Co. Ford, Shirin K.

5 Clark, Edwin A. Huang, Xin

<120> BIOMARCADORES Y PROCEDIMIENTOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD A MODULADORES

DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO. 10

<130> 10646 PCT

<150> US 60/711.054

<151> 24-08-2005 15

<160> 260

<170> PatentIn versión 3.3

20 <210> 1

<211> 3547

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 1

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<212> ADN

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<212> ADN

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<211> 1124

<212> ADN

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<212> ADN

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<212> ADN

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<212> ADN

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<211> 10078

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<212> ADN

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<400> 79

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<400> 81 10

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<211> 2475

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<210> 244

<211> 3396

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 244

<210> 245

<211> 418

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 245

<210> 246

<211> 807

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 246

<210> 247

<211> 1806

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 247

<210> 248

<211> 323

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 248

<210> 249

<211> 729

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 249

<210> 250

<211> 259

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 250

<210> 251

<211> 510

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 251

<210> 252

<211> 303

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 252

<210> 253

<211> 394

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 253

<210> 254

<211> 388

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 254

<210> 255

<211> 460

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 255

<210> 256

<211> 499

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 256

<210> 257

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 257

taaggcctgc tgaaaatgac tg: 22

<210> 258

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 258

tggtcctgca ccagtaatat gc: 22

<210> 259

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 259

tcataatgct tgctctgata gga: 23

<210> 260

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 260

ggccaaaaat ttaatcagtg ga: 22

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento in vitro para predecir la probabilidad de que un mamífero responda terapéuticamente a un procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende administrar un modulador de EGFR que inhibe la unión de EGF a EGFR o la actividad quinasa de EGFR, en el que el procedimiento comprende medir el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina en una muestra biológica de dicho mamífero, en el que un nivel de expresión elevado de dichos biomarcadores respecto a un nivel predeterminado indica una probabilidad aumentada de que el mamífero responda terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha medición se realiza después de la exposición del mamífero al modulador de EGFR.
3.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende:

(a)

medir el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores tanto epirregulina como anfirregulina en una muestra biológica de dicho mamífero;

(b)

después de la exposición del mamífero al modulador de EGFR, medir en una muestra biológica de dicho mamífero el nivel de expresión de ARNm de dichos biomarcadores,

en el que un nivel de expresión elevado de dichos biomarcadores medido en la etapa (b) respecto al nivel de dichos biomarcadores medido en la etapa (a) indica una probabilidad aumentada de que el mamífero responda terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.
4.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además medir al menos un biomarcador adicional seleccionado de la Tabla 1.
5.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha muestra biológica es una muestra de tejido que comprende células de cáncer y dicho tejido está fijado, embebido en parafina, fresco o congelado.
6.

El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende además la etapa de determinar si dichas células de cáncer tienen la presencia de un K-RAS mutado, en el que la detección de un K-RAS mutado indica una probabilidad disminuida de que el mamífero responda terapéuticamente a dicho procedimiento de tratamiento del cáncer colorrectal.
7.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho mamífero es un ser humano.
8.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho mamífero se selecciona del grupo que consiste en: rata, ratón, perro, conejo, cerdo, oveja, vaca, caballo, gato, primate y mono.
9.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho modulador de EGFR es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR.
10.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho modulador de EGFR es un anticuerpo de cadena sencilla anti-EGFR.
11.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho modulador de EGFR es un anticuerpo anti-EGFR humanizado o quimérico.
12.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho modulador de EGFR es cetuximab.
13.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho modulador de EGFR es panitumumab.