JP6498600B2 - 部位特異的な非天然アミノ酸残基を含む抗体、その調製方法、及びその使用方法 - Google Patents

部位特異的な非天然アミノ酸残基を含む抗体、その調製方法、及びその使用方法 Download PDF

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Description

(分野)
本明細書に提供されるのは、部位特異的位置に非天然アミノ酸残基を含む抗体、該抗体を含む組成物、その調製方法、及びその使用方法である。
(背景)
抗体は、その標的抗原に対する顕著な親和性を有する生体分子である。生来、抗体は、異種タンパク質、細胞、及び生物体の排除又は破壊のための特定の脊椎動物における防御システムの一部として与えられている。特定の脊椎動物に、例えば、感染細胞又は感染性細菌上の異種タンパク質が提示された場合、抗体は、その標的異種タンパク質に結合して、異種実体をその排除又は破壊へと導くことができる。
抗体の選択的親和性を人間が用いて、所望されるほとんど全ての抗原を標的とすることができる。抗原は、感染細胞又は感染性微生物上のタンパク質であることができる。それは、例えば、癌細胞上のタンパク質、標的組織の細胞上のタンパク質、血流中のタンパク質、炎症細胞もしくは炎症性細胞上のタンパク質、又はその選択的結合が有用である任意の他のタンパク質であることもできる。したがって、抗体は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び移植片拒絶反応などの疾病の治療において用途を見出している。抗体は、免疫系にシグナルを伝達して、罹患細胞を破壊もしくは排除することができ、又は改変抗体は、分子ペイロードを担持して、標的を破壊することができる。ある用途においては、治療抗体を分子シールドに連結して、生物体内でのその寿命を増大させる。抗体は、診断薬としての用途も見出している。これらの抗体は、標識を担持して、細胞上又は組織内の標的抗原の存在を示すことができる。これらの標識は、通常、共有結合によって抗体に連結されている。
今日まで、分子ペイロード、分子シールド、及び標識などの、抗体分子実体を連結する技術は、その抗体への連結の程度及び位置の不均一性によって、その低収率によって、及び活性の喪失によって制限されている。典型的なコンジュゲーション部位としては、抗体鎖上のランダムな位置、例えば、アミノ酸側鎖上のランダムなアミン、及び特定の抗体鎖のN末端が挙げられる。そのような技術において、ある位置でコンジュゲートに連結することができる抗体がある一方、別の位置で同じコンジュゲートに連結される抗体もあり、また、全く連結することができない抗体もある。
例えば、治療及び診断における抗体の有望な使用を促進するために、均一性、収率、及び/又は活性について最適化された、部位特異的位置で修飾された抗体が必要とされている。
(概要)
本明細書に提供されるのは、1以上の部位特異的位置において1以上の非天然アミノ酸残基で修飾された抗体である。これらの部位特異的位置は、非天然アミノ酸残基による天然アミノ酸残基の置換に最適である。ある実施態様において、これらの部位特異的位置における置換は、置換が均一である、すなわち、選択された位置で実質的に修飾されている抗体を生じさせる。ある実施態様において、これらの部位特異的位置の1つ又は複数で置換された抗体は、有利な生産収率、有利な溶解度、有利な結合、及び/又は有利な活性を有する。これらの抗体の特性は、以下の節で詳細に記載されている。
一態様において、本明細書に提供されるのは、最適に置換可能であるポリペプチド鎖中の位置に少なくとも1つの非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む抗体である。該抗体は、当業者に抗体として認識される任意のポリペプチド又は多量体ポリペプチドであることができる。該ポリペプチド鎖は、任意の重鎖及び任意の軽鎖を含む、該抗体の任意のポリペプチド鎖であることができる。最適に置換可能であるポリペプチド鎖中の位置は、最適な収率、均一性、溶解度、結合、及び/又は活性を伴う置換を提供することができるポリペプチド鎖中の任意の位置である。以下の節に、そのようなポリペプチド鎖の最適に置換可能な位置が詳細に記載されている。また以下に記載されるのは、有用な抗体、有用な非天然アミノ酸である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、該抗体を含む組成物である。有利なことに、そのような組成物は、本明細書に提供される抗体の置換の均一性のために、高い均一性を有することができる。ある実施態様において、該組成物は、タンパク質の総重量で測定した場合、又は抗体の総重量で測定した場合、かなりの量の該抗体を含む。ある実施態様において、該組成物は、少なくとも80重量％の該抗体、少なくとも85重量％の該抗体、少なくとも90重量％の該抗体、又は少なくとも95重量％の該抗体を含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、該抗体を作製する方法である。該抗体は、非天然アミノ酸を抗体鎖の部位特異的位置に組み込むための当業者に明らかな任意の技術によって作製することができる。ある実施態様において、該抗体は、固相合成、半合成、インビボ翻訳、インビトロ翻訳、又は無細胞翻訳によって作製される。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、該抗体を治療に使用する方法である。治療標的に対する抗体は、本明細書中の記載による1以上の部位特異的非天然アミノ酸を組み込むことができる。これらの抗体は、治療標的と関連する疾患又は疾病の治療又は予防に使用することができる。有利なことに、部位特異的非天然アミノ酸を用いて、該抗体を治療的ペイロードに連結し、効力を向上させることができる。例示的な抗体、治療標的、及び疾患又は疾病は、本明細書に記載されている。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、該抗体を検出に使用する方法である。検出標的に対する抗体は、本明細書中の記載による1以上の部位特異的非天然アミノ酸を組み込むことができる。これらの抗体を標識とともに用いて、検出標的への結合を知らせることができる。有利なことに、部位特異的非天然アミノ酸を用いて、該抗体を標識に連結し、検出を容易にすることができる。例示的な抗体、検出標的、及び標識は、本明細書に記載されている。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、抗体の安定性を修飾する方法である。抗体を本明細書に記載の非天然アミノ酸で修飾して、抗体の安定性を修飾することができる分子実体への連結を容易にすることができる。例えば、部位特異的非天然アミノ酸は、分子シールド、例えば、ポリエチレングリコールへの連結を容易にして、抗体の安定性を増大させることができる。例示的な非天然アミノ酸及び連結部分は、本明細書に記載されている。
（図面の簡単な説明）
図1は、例示的な細胞毒性試薬DBCO-MMAFの構造を示す。
図2は、単一ピークの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)アッセイプロファイルを示す。
図3は、分離が良好でない(NWR)HICアッセイプロファイルを示す。
図4は、分離が良好な(WR)HICアッセイプロファイルを示す。
図5A及び5Bは、非コンジュゲート型、部分コンジュゲート型、及び完全コンジュゲート型のIgGに対応するピークを示す、2つの変異体(HC T110及びHC S112)の例示的HICトレースを示す。
図6A〜6Eは、部位特異的コンジュゲーションを示す例示的実施態様を示す。
図7A及び7Bは、様々な非天然アミノ酸を含む抗体の抑制効率及び溶解性収率(soluble yield)の比較データを示す。
図8は、例示的なブレンツキシマブ抗体-薬物コンジュゲートによるCD-30陽性細胞株の細胞殺傷を示す。
図9は、例示的なブレンツキシマブ抗体-薬物コンジュゲートがCD-30を発現しない細胞を殺傷しないことを示す実験結果を示す。
図10は、例示的なブレンツキシマブ(ADCETRIS(登録商標))抗体-薬物コンジュゲートによるCD-30陽性細胞株への結合を示す。
図11A、11B、11C、及び11Dは、それぞれ、例示的な細胞毒性試薬DBCO-MMAF 2、DBCO-DM4、DBCO-DM4 2、及びDBCO-MMAEの構造を示す。
図12は、例示的なscFv-Fc部位特異的抗体-薬物コンジュゲートの薬物動態のグラフ表示を示す。
図13A及び13Bは、動物モデルにおいて腫瘍成長を遅延させる及び/又は腫瘍サイズを退行させる例示的な部位特異的抗体-薬物コンジュゲートのインビボ有効性のグラフ表示を示す。
(例示的実施例の説明)
本明細書に提供されるのは、1以上の部位特異的位置に非天然アミノ酸を有する抗体、該抗体を含む組成物、該抗体の作製方法、及びその使用方法である。
(定義)
本明細書に提供される抗体に言及する場合、以下の用語は、別途示されない限り、以下の意味を有する。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の用語に対して複数の定義が存在する場合、別途明記されない限り、この節の定義が優先する。
本明細書で使用されるように、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈上、そうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗体」に対する言及は、1以上のそのような抗体などに対する言及である。
抗体を含む組成物に関して「実質的に純粋な」という用語は、組成物の残りの部分に対して、重量で、少なくとも80、85、90、もしくは95％、又はある実施態様において、重量で、例えば、乾燥重量で、95、98、99、もしくは100％の抗体を含む組成物を指す。重量パーセントは、組成物中のタンパク質の総重量に対するもの又は組成物中の抗体の総重量に対するものであることができる。純度は、当業者に明らかな技術、例えば、SDS-PAGEによって決定することができる。
「単離された」という用語は、その天然環境もしくはその生産環境、又はその両方で見出される抗体に通常付随するか、又は該抗体と通常相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない抗体を指す。単離された抗体調製物は、重量、例えば、乾燥重量で、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、又は約1％未満の夾雑タンパク質を有する。
「抗体」という用語は、当業者によって抗体として認識される任意の巨大分子を指す。抗体は、結合を含む共通の特性、及び当業者によって認識される免疫グロブリン遺伝子のいずれかによってコードされ得るポリペプチド鎖と実質的に同一である少なくとも1つのポリペプチド鎖を共有する。免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)、δ、ε、並びにμ定常領域遺伝子、並びに免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。該用語には、当業者によって認識される全長抗体及び抗体断片、並びにそれらの変異体が含まれる。該用語には、グリコシル化抗体及び非グリコシル化(aglycosylated)抗体がさらに含まれる。
「抗体断片」という用語は、全長形態以外の任意の形態の抗体を指す。本明細書における抗体断片には、全長抗体中に存在するより小さい構成要素である抗体、及び改変されている抗体が含まれる。抗体断片には、Fv、Fc、Fab、及び(Fab')2、単鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域などが含まれるが、これらに限定されない(Maynard及びGeorgiouの文献、2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudsonの文献、1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402)。
「免疫グロブリン(Ig)」という用語は、免疫グロブリン遺伝子のうちの1つによって実質的にコードされる1以上のポリペプチドからなるタンパク質、又はアミノ酸配列がそれと実質的に同一なタンパク質を指す。免疫グロブリンには、抗体が含まれるが、これに限定されない。免疫グロブリンは、限定されないが、全長抗体、抗体断片、並びに限定されないが、VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL、及びCLを含む、個々の免疫グロブリンドメインを含む、いくつかの構造形態を有し得る。
「免疫グロブリン(Ig)ドメイン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドからなるタンパク質ドメインを指す。Igドメインには、VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL、及びCLが含まれるが、これらに限定されない。
抗体の「可変領域」という用語は、VH免疫グロブリンドメイン、VL免疫グロブリンドメイン、又はVH及びVL免疫グロブリンドメインから構成されるポリペプチド(単数)又はポリペプチド(複数)を指す。可変領域は、単離されている、Fv断片としての、scFv断片としての、より大きな抗体断片との関連におけるこの領域としての、又は全長抗体もしくは別の非抗体スキャフォールド分子との関連におけるこの領域としての、この又はこれらのポリペプチドを指し得る。
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が、配列に関して、抗体間で広範囲に異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合特異性に関与しているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方における相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、3つ又は4つのCDRによって接続された、主にβ-シート配置を取る4つのFR領域を含み、これがループを形成して、β-シート構造に接続し、場合によっては、β-シート構造の一部を形成する。各々の鎖のCDRは、FR領域によってごく近接してまとまり、他方の鎖のCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabatらの文献、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991))。
定常ドメインは、通常は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体又は免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの5つの主要なクラス: IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4; IgA1及びIgA2にさらに分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。様々なヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、及びIgMだけが、補体を活性化することが知られている。
「変異体タンパク質配列」という用語は、別の類似のタンパク質配列とアミノ酸同一性が異なる1以上の残基を有するタンパク質配列を指す。該類似のタンパク質配列は、天然の野生型タンパク質配列、又は野生型配列の別の変異体であってもよい。変異体には、1以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するタンパク質が含まれる。変異体には、1以上の翻訳後修飾アミノ酸を有するタンパク質も含まれる。
「親抗体」という用語は、本明細書に提供される記載に従って修飾される当業者に公知の抗体を指す。該修飾は、物理的なものであり、すなわち、親抗体の1以上のアミノ酸を化学的又は生化学的に置換又は修飾して、本記載の範囲内の抗体を生じさせることができる。該修飾はまた、概念的なものであり、すなわち、親抗体の1以上のポリペプチド鎖の配列を用いて、本記載による1以上の部位特異的非天然アミノ酸を含む抗体を設計することができる。親抗体は、天然の抗体又は実験室で設計もしくは開発された抗体であることができる。親抗体は、人工又は改変抗体、例えば、キメラ又はヒト化抗体であることもできる。
「保存的修飾変異体」という用語は、アミノ酸配列中の保存的置換によって関連抗体とは異なる抗体を指す。当業者は、改変によって、あるアミノ酸と、化学的に類似したアミノ酸との置換が生じる場合、コードされた配列中の単一のアミノ酸又は少数のアミノ酸を改変し、付加し、又は欠失させる、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、又は付加が、「保存的修飾変異体」であることを認識しているであろう。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換表は、当技術分野で周知である。そのような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、及びアレルに加えられるものであって、これらを排除するものではない。
以下の8つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む:
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creightonの文献、タンパク質:構造及び分子特性(Proteins: Structures and Molecular Properties)(W H Freeman & Co.;第2版(1993年12月)を参照されたい)。
2以上のポリペプチド配列との関連における「同一」又は「同一性」という用語は、同じである2以上の配列又はサブ配列を指す。配列は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを用いて又は手作業でのアラインメント及び目視検査によって測定される比較域又は指定領域にわたる最大一致を求めて比較し、整列させたときに、一定の割合の同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチド(すなわち、特定の領域にわたる、約60％の同一性、任意に、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、又は約95％の同一性)を有する場合、「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約50アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、又は長さが75〜100アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、又は特定されない場合、配列もしくはポリペプチド全体にわたって存在することができる。抗体の場合、同一性は、可変CDRの外側で測定することができる。比較のための最適な配列アラインメントは、限定されないが、Smith及びWatermanの文献(1970)(Adv. Appl. Math. 2:482c)の局所相同性アルゴリズムによるか、Needleman及びWunschの文献(1970)(J. Mol. Biol. 48:443)の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Pearson及びLipmanの文献(1988)(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)によるか;又は手作業でのアラインメント及び目視検査(例えば、Ausubelらの文献、Current Protocols in Molecular Biology(1995年補遺)を参照のこと)によって行うことができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適であるアルゴリズムの例としては、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムが挙げられ、これらは、それぞれ、Altschulらの文献(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及びAltschulらの文献(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。BLASTアルゴリズムパラメータのW、T、及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M＝5、N＝−4、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用に、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値(E)、及び50のBLOSUM62採点マトリックス(Henikoff及びHenikoffの文献(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)アラインメント(B)、10の期待値(E)、M＝5、N＝−4、及び両鎖の比較を使用する。BLASTアルゴリズムは、通常、「低複雑性」フィルターをオフにして実施される。
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin及びAltschulの文献(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小合計確率(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、被験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
「アミノ酸」という用語は、天然及び非天然アミノ酸、並びにプロリンなどのイミノ酸、アミノ酸類似体、及び天然アミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸模倣体を指す。
天然コードアミノ酸とは、当業者に公知のタンパク質構成アミノ酸である。それらには、20種の一般的なアミノ酸(アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン)、並びにあまり一般的ではないピロリジン及びセレノシステインが含まれる。天然コードアミノ酸には、プレニル化アミノ酸、イソプレニル化アミノ酸、ミリソイル化アミノ酸、パルミトイル化アミノ酸、N-結合型グリコシル化アミノ酸、O-結合型グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、及びアシル化アミノ酸などの、22種の天然アミノ酸の翻訳後変異体が含まれる。
「非天然アミノ酸」という用語は、タンパク質構成アミノ酸、又はその翻訳後修飾変異体ではないアミノ酸を指す。特に、該用語は、20種の一般的なアミノ酸又はピロリジンもしくはセレノシステインのうちの1つ、或いはその翻訳後修飾変異体ではないアミノ酸を指す。
「機能的終結因子1(RF1)タンパク質」は、野生型又は未修飾RF1タンパク質と同等又は実質的に同様の活性を保持するRF1を指す。機能的RF1活性は、例えば、修飾RF1タンパク質を発現する細菌の成長速度を測定し、該成長速度を野生型又は未修飾RF1を発現する細菌と比較することによって試験することができる。機能的RF1活性は、例えば、標的タンパク質をコードするmRNAの特定の位置での直交tRNAによるnnAAの組み込みを低下させ、それにより、早期の鎖停止の量を増加させる(すなわち、切断されたタンパク質の量を増加させる)修飾RF1タンパク質の能力によって試験することもできる。
「減弱化終結因子1(RF1)タンパク質」は、野生型又は未修飾RF1タンパク質と比べて低下した活性を保持する修飾RF1を指す。RF1活性は、例えば、修飾RF1タンパク質を発現する細菌の成長速度を測定し、該成長速度を野生型又は未修飾RF1を発現する細菌と比較することによって試験することができる。RF1活性は、例えば、標的タンパク質をコードするmRNAの特定の位置での直交tRNAによるnnAAの組み込みを低下させ、それにより、早期の鎖停止の量を増加させる(すなわち、切断されたタンパク質の量を増加させる)修飾RF1タンパク質の能力によって試験することもできる。いくつかの実施態様において、減弱化RF1タンパク質は、転写修飾を含み;例えば、RF1タンパク質(野生型又は修飾型)の発現レベルを低下させて、減弱を達成することができる。該低下は、RNAi技術を使用することによって達成することもできる。いくつかの実施態様において、減弱化RF1タンパク質は、翻訳修飾を含み;タンパク質がプロテアーゼによって消化される割合を、例えば、RF1配列へのプロテアーゼ特異的配列の挿入を介して増加させることによって、例えば、合成されるRF1タンパク質(野生型又は修飾型)の量を低下させて、減弱を達成することができる。
(抗体)
本明細書に提供されるのは、少なくとも1つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列中の部位特異的位置に1以上の非天然アミノ酸残基を含む抗体である。
抗体は、当業者によって認識される任意の抗体、すなわち、親抗体との高い配列同一性を共有することができる。ある実施態様において、抗体のアミノ酸配列は、部位特異的位置の非天然アミノ酸以外は、親抗体のアミノ酸配列と同一である。さらなる実施態様において、本明細書に提供される抗体は、部位特異的位置の1以上の非天然アミノ酸の他に、親抗体と比べて1以上の挿入、欠失、又は突然変異を有することができる。ある実施態様において、本明細書に提供される抗体は、それが、当業者によって抗体と認識される限り、独特の一次配列を有することができる。
抗体は、一般に、多数のポリペプチド鎖を含むタンパク質である。ある実施態様において、抗体は、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖を含むヘテロ四量体である。各々の軽鎖は、1つの共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖に連結することができる。各々の重鎖は、1以上の共有結合的ジスルフィド結合によって他方の重鎖に連結することができる。各々の重鎖及び各々の軽鎖は、1以上の鎖内ジスルフィド結合を有することもできる。当業者に知られているように、各々の重鎖は、通常、可変ドメイン(VH)と、それに続く、いくつかの定常ドメインを含む。各々の軽鎖は、通常、一方の末端にある可変ドメイン(VL)と、定常ドメインとを含む。当業者に知られているように、抗体は、通常、その標的分子、すなわち、抗原に対する選択的親和性を有する。
本明細書に提供される抗体は、当業者に公知の任意の抗体形態を有することができる。それらは、全長、又は断片であることができる。例示的な全長抗体には、IgA、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgMなどが含まれる。例示的な断片には、Fv、Fab、Fc、sFvなどが含まれる。
本明細書に提供される抗体は、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含む。非天然アミノ酸は、当業者に公知の任意の非天然アミノ酸であることができる。例示的な非天然アミノ酸は、下の節に記載されている。
非天然アミノ酸は、抗体のポリペプチド鎖中の選択された場所に配置される。これらの場所は、非天然アミノ酸との置換のための最適な部位を提供するものとして同定された。各々の部位は、抗体を産生するための最適な構造、機能、及び/又は方法を有する非天然アミノ酸を担持することができる。
ある実施態様において、置換のための部位特異的位置は、安定である抗体を提供する。安定性は、当業者に明らかな任意の技術によって測定することができる。
ある実施態様において、置換のための部位特異的位置は、最適な機能特性を有する抗体を提供する。例えば、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、その標的抗原に対する結合親和性の損失をほとんど又は全く示すことができない。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、結合の増強を示すことができる。
ある実施態様において、置換のための部位特異的位置は、有利に作製することができる抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、該抗体は、以下で論じられるその合成方法において、有利な特性を示す。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、生産収率の損失をほとんど又は全く示すことができない。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、生産収率の増強を示すことができる。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、以下に記載されるtRNA抑制の損失をほとんど又は全く示すことができない。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、生産の点で、以下に記載されるtRNA抑制の増強を示すことができる。
ある実施態様において、置換のための部位特異的位置は、有利な溶解度を有する抗体を提供する。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、溶解度の損失をほとんど又は全く示すことができない。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、溶解度の増強を示すことができる。
ある実施態様において、置換のための部位特異的位置は、有利な発現を有する抗体を提供する。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、発現の損失をほとんど又は全く示すことができない。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、発現の増強を示すことができる。
ある実施態様において、置換のための部位特異的位置は、有利なフォールディングを有する抗体を提供する。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、適切なフォールディングの損失をほとんど又は全く示すことができない。ある実施態様において、該抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、フォールディングの増強を示すことができる。
ある実施態様において、置換のための部位特異的位置は、有利なコンジュゲーションが可能な抗体を提供する。以下に記載されるように、いくつかの非天然アミノ酸は、直接又はリンカーを介して、抗体と第二の薬剤とのコンジュゲーションを容易にする側鎖又は官能基を有する。ある実施態様において、該抗体は、他の位置に同じ又は他の非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、コンジュゲーション効率の増強を示すことができる。ある実施態様において、該抗体は、他の位置に同じ又は他の非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、コンジュゲーション収率の増強を示すことができる。ある実施態様において、該抗体は、他の位置に同じ又は他の非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、コンジュゲーション特異性の増強を示すことができる。
1以上の非天然アミノ酸は、抗体の少なくとも1つのポリペプチド鎖中の選択された部位特異的位置に位置する。該ポリペプチド鎖は、限定するものではないが、どちらかの軽鎖又はどちらかの重鎖を含む、抗体の任意のポリペプチド鎖であることができる。部位特異的位置は、任意の可変ドメイン及び任意の定常ドメインを含む、抗体の任意のドメインにあることができる。
ある実施態様において、本明細書に提供される抗体は、部位特異的位置に1つの非天然アミノ酸を含む。ある実施態様において、本明細書に提供される抗体は、部位特異的位置に2つの非天然アミノ酸を含む。ある実施態様において、本明細書に提供される抗体は、部位特異的位置に3つの非天然アミノ酸を含む。ある実施態様において、本明細書に提供される抗体は、部位特異的位置に4以上の非天然アミノ酸を含む。
置換のための部位特異的位置は、当業者に公知の任意の抗体命名法を用いて記載することができる。Kabat付番体系において、これらの位置は、重鎖残基
Figure 0006498600
 にある。言い換えると、本明細書に提供されるのは、Kabat残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat残基H005、及びH084；並びにEU残基H118、H132、H136、H239、H293、H334、H355、H359、及びH389から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat残基H042、及びH065；並びにEU残基H138、H155、H174、H176、H177、H219、H238、H243、H262、H264、H265、H278、H342、H356、H358、H360、H383、H384 H404、及びH436から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、H292〜H301、H303、及びH305に対応するEU残基から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
Chothia付番体系において、これらの位置は、重鎖残基
Figure 0006498600
 にある。言い換えると、本明細書に提供されるのは、Chothia残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Chothia残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Chothia残基H005、及びH084；並びにEU残基H118、H132、H136、H239、H293、H334、H342、H355、H359、H389、及びH404から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、H292〜H301、H303、及びH305に対応するEU残基から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Chothia残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Chothia残基H042、及びH065；並びにEU残基H138、H155、H174、H176、H177、H219、H238、H243、H262、H264、H265、H278、H342、H356、H358、H360、H383、H384、H404、及びH436から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基L043、L049、L056、L057、L060、L067、及びL068；並びにEU付番スキームによる、残基L109、L112、L114、L144、L153、L156、L157、L168、L184、L202、L203、及びL206から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基L043、L049、L056、L057、L060、L067、及びL068；並びにEU付番スキームによる、残基L109、L112、L114、L144、L153、L156、L168、L184、L202、及びL203から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基L043、L049、L056、L057、L060、L067、及びL068；並びにEU付番スキームによる、残基L109、L144、L153、L156、L184、L202、及びL203から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基L049、L056、L057、L060、及びL067；並びにEU付番スキームによる、残基L109、L153、L202、及びL203から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基H023、及びH084；並びにEU付番スキームによる、残基H118、H119、H135、H136、H160、H162、H195、H219、H282、H296、H267、H293、H297、H298、H303、H305、H334、H340、H341、H392、及びH438、H442から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基H042、H003、H007、H014、H016、H019、H025、H040、H043、H052、H053、H056、H070、H082A、H100、H110、及びH112；並びにEU付番スキームによる、残基H121、H180、H190、H192、H214、H216、H221、H222、H225、H227、H230、H231、H232、及びH236から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基H042、H003、H007、H014、H016、H019、H025、H040、H043、H052、H070、H082A、H100、H110、及びH112；並びにEU付番スキームによる、残基H121、H180、H190、H192、H214、H216、H221、H222、H225、H227、H230、H231、H232、及びH236から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基H007、H014、H019、H025、H040、H043、H052、H070、H100、H110、及びH112；並びにEU付番スキームによる、残基H121、H180、H214、H216、H222、H227、H230、H231、H232、及びH236から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基
Figure 0006498600
 から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基マイナス1、L003、L005、L007、L008、L009、L010、L016、L017、L018、L020、L022、L026、L027、L045、L058、L063、L065、L066、L070、L077、L079、及びL107；並びにEU付番スキームによる、残基L142、L143、L152、L171、L182、L188、L199、及びL201から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基(-)L001、L003、L005、L007、L008、L009、L016、L017、L018、L020、L022、L026、L027、L045、L058、L063、L065、L066、L070、L077、L079、及びL107；並びにEU付番スキームによる、残基L142、L152、L171、L182、L188、及びL199から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基マイナス1、L005、L007、L008、L016、L017、L018、L020、L022、L027、L045、L058、L063、L077、L079、及びL107；並びにEU付番スキームによる、残基L142、L152、L182、L188、及びL199から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基(-)L001、L016、及びL063；並びにEU付番スキームによる、残基L199から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基H019、H025、H051、H070、H098、H110、及びH112；並びにEU付番スキームによる、残基H121、H136、H180、H187、H190、H214、H216、H221、及びH222から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基(-)L001、L007、L008、L016、L022、L063、L014、及びL070；並びにEU付番スキームによる、残基L138、L142、L143、及びL152から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基H019、H025、H051、H070、H077、H079、H098、H110、及びH112；並びにEU付番スキームによる、残基H121、H136、H180、H187、H190、H214、H216、H221、及びH222から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、Kabat又はChothia付番スキームによる、残基(-)L001、L007、L008、L016、L022、L063、及びL070；並びにEU付番スキームによる、残基L138、L142、L143、L152、及びL201から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
部位特異的位置は、参照抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列と比べて同定することもできる。例えば、参照重鎖のアミノ酸配列を配列番号1に示す。参照重鎖において、部位特異的位置は、残基
Figure 0006498600
 にある。言い換えると、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの
Figure 0006498600
 に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの
Figure 0006498600
 に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの
Figure 0006498600
 に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの5、88、121、135、139、242、296、337、358、362、及び392に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの
Figure 0006498600
 に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの42、66、141、158、177、179、180、222、241、246、265、267、268、281、359、361、363、386、387、407、及び439に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの292〜301、303、及び305に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの
Figure 0006498600
 に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの
Figure 0006498600
 に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの23、88、121、122、138、139、140、163、164、165、167、198、200、222、285、299、364、425、443、270、275、296、300、301、306、308、337、343、344、345、358、365、395、407、427、441、445、及び446に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの23、88、121、122、138、139、140、163、164、165、198、200、222、285、299、425、443、270、275、296、300、301、306、308、337、343、344、345、358、395、407、427、441、445、及び446に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの23、88、121、122、138、139、163、165、198、222、285、299、270、296、300、301、306、308、337、343、344、395、407、及び441に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの42、3、7、14、16、19、25、40、43、51、52、54、57、71、84、102、104、114、119、124、183、187、193、195、217、219、224、225、228、230、233、234、235、及び239に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの42、3、7、14、16、19、25、40、43、52、54、57、71、84、104、114、119、124、183、193、195、217、219、224、225、228、230、233、234、235、及び239に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの7、14、19、25、40、43、52、71、104、114、119、124、183、195、217、219、230、233、234、235、及び239に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドのマイナス1、3、5、7、8、9、10、16、17、18、20、22、26、27、45、58、63、65、66、70、77、79、107、138、142、143、152、171、182、188、199、及び201に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドのマイナス1、3、5、7、8、9、16、17、18、20、22、26、27、45、58、63、65、66、70、77、79、107、142、143、152、171、182、188、199、及び201に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドのマイナス1、3、5、7、8、9、16、17、18、20、22、26、27、45、58、63、65、66、70、77、79、107、142、152、171、182、188、及び199に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドのマイナス1、5、7、8、16、17、18、20、22、27、45、58、63、77、79、107、142、152、182、188、及び199に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドのマイナス1、16、63、及び199に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの19、25、51、71、102、114、119、124、139、183、187、193、217、219、224、及び225に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドのマイナス1、7、8、16、22、63、14、70、138、142、143、及び152に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの19、25、51、71、78、80、102、114、119、124、139、183、187、193、217、219、224、及び225に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドのマイナス1、7、8、16、22、63、70、138、142、143、152、及び201に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドの43、49、56、57、60、67、68、109、112、114、144、153、156、157、168、184、202、203、及び206に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドの43、49、56、57、60、67、68、109、112、144、153、156、168、184、202、及び203に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドの43、49、56、57、60、67、68、109、144、153、156、184、202、及び203に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドの49、56、57、60、67、109、153、202、及び203に対応するものから選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体である。
ある実施態様において、抗体は、次式(I):
Xaa1-…-(Naap(i))n-…-Xaaq(I)
によって記載することができるポリペプチド鎖を含む。式(I)において、各々のXaaは、任意の同一性のポリペプチド鎖中のアミノ酸を表す。言い換えると、各々のXaaは、任意のアミノ酸、典型的には、任意の天然アミノ酸、又はその変異体であることができる。各々のXaaの右側の上付き文字は、ポリペプチド鎖の一次配列中のアミノ酸の位置を表す。Xaa1は、ポリペプチド鎖中の最初の、すなわち、N末端のアミノ酸を表し、Xaaqは、ポリペプチド鎖中の最後の、すなわち、C末端の、アミノ酸を表す。変数qは、ポリペプチド鎖中のアミノ酸の総数と等しい整数である。各々のNaaは、ポリペプチド鎖中の非天然アミノ酸を表す。有用な非天然アミノ酸は、下の節に記載されている。整数nは、ポリペプチド鎖中の非天然アミノ酸の数を表す。典型的な実施態様において、nは、1よりも大きい整数である。各々の整数p(i)は1よりも大きく、qよりも小さく、変数iは、1〜nまで変化する整数である。各々の整数p(i)は、対応するNaaに対するアミノ酸配列中の部位特異的位置を表す。各々の部位特異的位置p(i)は、本明細書に記載の技術よる、天然アミノ酸と非天然アミノ酸、例えば、Naap(i)との置換に最適である。
実施例に示されるTAGスクリーニングからのデータの解析により、細胞殺傷、発現レベル、薬物と抗体の比、溶媒露出度、及び(入手可能な場合)熱安定性に基づいてADCを作製するための理想的な候補となる部位の選択が可能になった。最も好ましい部位は、他の被験変異体よりも低い溶媒露出度、及び高い熱安定性を有する。好ましいnnAA組み込み部位を下の表Iに記載する。
Figure 0006498600
したがって、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、重鎖もしくは軽鎖残基EU HC-F404、EU HC-K121、EU HC-Y180、EU HC-F241、KabatもしくはChothia LC-T22、KabatもしくはChothia LC-S7、EU LC-N152、EU HC-S136、KabatもしくはChothia HC-S25、KabatもしくはChothia HC-A40、EU HC-S119、EU HC-S190、EU HC-K222、KabatもしくはChothia HC-R19、KabatもしくはChothia HC-Y52、もしくはKabatもしくはChothia HC-S70からなる群から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体、又はその翻訳後修飾変異体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、重鎖又は軽鎖残基EU HC-F404、EU HC-K121、EU HC-Y180、EU HC-F241、KabatもしくはChothia LC-T22、KabatもしくはChothia LC-S7、EU LC-N152、EU HC-S136、KabatもしくはChothia HC-S25、KabatもしくはChothia HC-A40、EU HC-S119、EU HC-S190、及びEU HC-K222からなる群から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体、又はその翻訳後修飾変異体である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、重鎖又は軽鎖残基EU HC-F404、EU HC-K121、EU HC-Y180、EU HC-F241、KabatもしくはChothia LC-T22、KabatもしくはChothia LC-S7、EU LC-N152、及びEU HC-S136からなる群から選択される1以上の位置に1以上の非天然アミノ酸を含む抗体、又はその翻訳後修飾変異体である。
ある実施態様において、本明細書にさらに提供されるのは、上記の抗体の保存的修飾変異体である。抗体の保存的修飾変異体は、当業者によって評価されたときに該抗体の構造及び/又は機能を破壊しない1以上の挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、20以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、15以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、10以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、9以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、8以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、7以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、6以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、5以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、4以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、3以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、2以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、保存的修飾変異体は、1つのアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。特定の実施態様において、置換は、アミノ酸を、上記のような、同じクラス内のものに置換する、保存的なものである。
ある実施態様において、抗体を修飾して、構造、安定性、及び/又は活性を調節することができる。そのような実施態様において、修飾は、保存的なものであっても、保存的なもの以外のものであってもよい。修飾は、本方法を実施し、本明細書に記載の組成物を使用する実施者にとって好適であれば十分である。ある実施態様において、修飾は、抗原結合親和性を減少させるが、消失させない。ある実施態様において、修飾は、抗原結合親和性を増大させる。ある実施態様において、修飾は、抗体の構造又は安定性を増強させる。ある実施態様において、修飾は、抗体の構造又は安定性を低下させるが、消失させない。ある実施態様において、修飾変異体は、20以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、15以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、10以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、9以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、8以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、7以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、6以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、5以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、4以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、3以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、2以下のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。ある実施態様において、修飾変異体は、1つのアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含む。
また本範囲に含まれるのは、翻訳後修飾変異体である。本明細書に提供される抗体はいずれも、当業者によって認識される任意の方法で翻訳後修飾することができる。抗体の典型的な翻訳後修飾としては、鎖間ジスルフィド結合、鎖内ジスルフィド結合、N-結合型グリコシル化、及びタンパク質分解が挙げられる。また本明細書に提供されるのは、リン酸化、O-結合型グリコシル化、メチル化、アセチル化、脂質化、GPIアンカリング、ミリストイル化、及びプレニル化などの修飾を有する他の翻訳後修飾抗体である。翻訳後修飾は、産生中、インビボで、インビトロで、又は別の形で行うことができる。ある実施態様において、翻訳後修飾は、例えば、本明細書に提供される方法を用いた、実施者による意図的な修飾であることができる。
本範囲にさらに含まれるのは、さらなるペプチド又はポリペプチドに融合された抗体である。例示的な融合体としては、例えば、メチオニンが、組換え発現の結果として生じる抗体のN末端に連結されているメチオニル抗体、精製のための(限定されないが、ポリ-ヒスチジン又は親和性エピトープとの)融合体、他の生体活性分子との連結のための融合体、血清アルブミン結合ペプチドとの融合体、及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン(限定されないが、FLAGもしくはポリ-Hisを含む)、又は他の親和性に基づく配列(限定されないが、FLAG、ポリ-His、GSTなどを含む)を含み得る。抗体は、抗体の検出(限定されないが、GFPを含む)、精製、又は他の特徴を改善する連結分子(限定されないが、ビオチンを含む)も含み得る。ある実施態様において、抗体は、全長抗体の精製を容易にするC末端親和性配列を含む。ある実施態様において、そのようなC末端親和性配列は、ポリ-His配列、例えば、6-His配列である。
抗体は、当業者によって認識される任意の抗体形態を有することができる。抗体は、単一のポリペプチド鎖-単一の重鎖又は単一の軽鎖を含むことができる。抗体は、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、及びヘテロ多量体を含む、当業者によって認識される多量体を形成することもできる。これらの多量体は、連結されていても、連結されていなくてもよい。有用な連結には、抗体分子に特有の鎖間ジスルフィド結合が含まれる。多量体は、本記載に従って導入される非天然アミノ酸を含む、他のアミノ酸によって連結されていてもよい。抗体は、例えば、IgA、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、及びIgMを含む、任意のクラス又はサブクラスの免疫グロブリンであることができる。抗体は、Fv、Fc、Fab、及び(Fab')2、並びにscFvを含む、任意の抗体断片の形態であることができる。
抗体はさらに、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。したがって、ある実施態様において、抗体は、グリコシル化されている。ある実施態様において、抗体は、グリコシル化されていない。非天然アミノ酸を含む非グリコシル化抗体は、例えば、本明細書に提供される実施例に記載されている通りに、又は当業者に公知の細菌発現系によって作製することができる。非天然アミノ酸を含むグリコシル化抗体は、例えば、Axupらの文献、2012, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 109(40):16101-16106によって記載されている通りに作製することができる。
また本明細書に提供されるのは、1以上のコンジュゲーション部分にコンジュゲートされている抗体である。コンジュゲーション部分は、当業者に有用であるとみなされる任意のコンジュゲーション部分であることができる。例えば、コンジュゲーション部分は、インビトロ又はインビボで抗体の安定性を改善することができるポリマー、例えば、ポリエチレングリコールであることができる。コンジュゲーション部分は、治療活性を有し、それにより、抗体-薬物コンジュゲートを生じさせることができる。コンジュゲーション部分は、標的細胞にとって有害である分子ペイロードであることができる。コンジュゲーション部分は、検出又は診断に有用な標識であることができる。ある実施態様において、コンジュゲーション部分は、直接的な共有結合を介して抗体に連結される。ある実施態様において、コンジュゲーション部分は、リンカーを介して抗体に連結される。有利な実施態様において、コンジュゲーション部分又はリンカーは、抗体の非天然アミノ酸のうちの1つを介して接続される。例示的なコンジュゲーション部分及びリンカーは、下の節で論じられている。
(非天然アミノ酸)
非天然アミノ酸は、当業者に公知の任意の非天然アミノ酸であることができる。いくつかの実施態様において、非天然コードアミノ酸は、官能基を含む。官能基は、当業者に公知の任意の官能基であることができる。ある実施態様において、官能基は、標識、極性基、非極性基、又は反応基である。
反応基は、さらなる官能基を抗体鎖の部位特異的位置で抗体に連結するのに特に有利である。ある実施態様において、反応基は、アミノ、カルボキシ、アセチル、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジド、スルファニル、アジド、及びアルキニルからなる群から選択される。
ある実施態様において、アミノ酸残基は、次式のいずれかによるものである:
Figure 0006498600
 。当業者は、抗体が通常L-アミノ酸から構成されることを認識しているであろう。しかしながら、非天然アミノ酸があれば、本方法及び組成物によって、部位特異的位置でL体、D体、又はラセミ体の非天然アミノ酸を使用する能力が実施者に提供される。ある実施態様において、本明細書に記載の非天然アミノ酸には、D型の天然アミノ酸及びラセミ型の天然アミノ酸が含まれる。
上記の式において、波状の線は、抗体のポリペプチド鎖の残りの部分に接続する結合を示す。これらの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸が同じポリペプチド鎖に組み込まれるのと全く同じように、ポリペプチド鎖に組み込まれることができる。ある実施態様において、非天然アミノ酸は、該式に示されているようなアミド結合を介してポリペプチド鎖に組み込まれる。
上記の式において、Rは、アミノ酸残基が天然アミノ酸残基と同一でない限り、無制限に、任意の官能基を表す。ある実施態様において、Rは、疎水性基、親水性基、極性基、酸性基、塩基性基、キレート基、反応基、治療的部分、又は標識部分であることができる。ある実施態様において、Rは、R1NR2R3、R1C(=O)R2、R1C(=O)OR2、R1N3、R1C(≡CH)からなる群から選択される。これらの実施態様において、R1は、結合、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレンからなる群から選択される。R2及びR3は、各々独立に、水素、アルキル、及びヘテロアルクリル(heteroalklyl)からなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、非天然コードアミノ酸は、20種の一般的なアミノ酸には見られない官能基(限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒド、及びアミノオキシ基を含む)と効率的かつ選択的に反応して、安定なコンジュゲートを形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する非天然コードアミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、ポリマー(限定されないが、ポリ(エチレングリコール)を含む)、或いはアルキン部分を含有する第二のポリペプチドと反応させて、アジドとアルキン官能基の選択的反応から生じる安定なコンジュゲートを形成させ、ヒュスゲン[3+2]付加環化産物を形成させることができる。
本発明での使用に好適であり得る及び水溶性ポリマーとの反応に有用である例示的な非天然コードアミノ酸としては、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド、及びアルキン反応基を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、非天然コードアミノ酸は、サッカリド部分を含む。そのようなアミノ酸の例としては、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-セリン、N-アセチル-L-ガラクトサミニル-L-セリン、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-トレオニン、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-アスパラギン、及びO-マンノサミニル-L-セリンが挙げられる。そのようなアミノ酸の例としては、アミノ酸とサッカリドの間の天然に存在するN-又はO-結合が、天然ではあまり見られない−アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含むが、これらに限定されない、共有結合によって置き換えられている例も挙げられる。そのようなアミノ酸の例としては、天然に存在するタンパク質ではあまり見られないサッカリド、例えば、2-デオキシ-グルコース、2-デオキシガラクトースなども挙げられる。
本明細書に提供される非天然コードアミノ酸の多くは、例えば、Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo., USA)、Novabiochem(EMD Biosciencesの部門, Darmstadt, Germany)、又はPeptech(Burlington, Mass., USA)から市販されている。市販されていないものは、本明細書に提供されるように、又は当業者に公知の標準的な方法を用いて、任意に合成される。有機合成技術については、例えば、Fessendon及びFessendon著、有機化学(Organic Chemistry)(1982、第2版、Willard Grant Press, Boston Mass.); March著、先端有機化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版、1985, Wiley and Sons, New York);及びCarey及びSundberg著、先端有機化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版、パートA及びB、1990, Plenum Press, New York)を参照されたい。また、引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2003/0082575号及び第2003/0108885号も参照されたい。新規の側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に好適であり得る非天然アミノ酸もまた、修飾骨格構造を任意に含み、これには、限定されないが、式II及びIIIの構造によって示されるものを含む:
Figure 0006498600
 (式中、Zは、通常、OH、NH2、SH、NH-R'、又はS-R'を含み; X及びYは、同じもの又は異なるものであることができ、通常、S又はOを含み、R及びR'は、任意に同じもの又は異なるものであり、通常、式Iを有する非天然アミノ酸について上で記載されているR基の構成成分の同じリスト、及び水素から選択される)。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、式II及びIIIによって示されるような、アミノ又はカルボキシル基中の置換を任意に含む。このタイプの非天然アミノ酸としては、限定されないが、一般的な20種の天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然の側鎖を有するものを含む、α-ヒドロキシ酸、α-チオ酸、α-アミノチオカルボキシレートが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、α-炭素での置換としては、任意に、L、D、又はα-α-二置換アミノ酸、例えば、D-グルタメート、D-アラニン、D-メチル-O-チロシン、アミノ酪酸などが挙げられるが、これらに限定されない。他の構造的代替物としては、プロリン類似体並びに3、4、6、7、8、及び9員環プロリン類似体などの環状アミノ酸、置換β-アラニン及びγ-アミノ酪酸などのP及びyアミノ酸が挙げられる。
多くの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸、例えば、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどに基づいており、本発明での使用に好適である。チロシン類似体としては、限定されないが、パラ-置換チロシン、オルト-置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、ここで、該置換チロシンは、限定されないが、ケト基(限定されないが、アセチル基を含む)、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、C6-C20直鎖又は分岐状炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、O-メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などを含む。さらに、多置換アリール環も想定される。本発明での使用に好適であり得るグルタミン類似体としては、α-ヒドロキシ誘導体、γ-置換誘導体、環状誘導体、及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に好適であり得るフェニルアラニン類似体の例としては、限定されないが、パラ-置換フェニルアラニン、オルト-置換フェニアラニン(phenyalanines)、及びメタ-置換フェニルアラニンが挙げられ、ここで、該置換基は、限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基(限定されないが、アセチル基を含む)、ベンゾイル、アルキニル基などを含む。本発明での使用に好適であり得る非天然アミノ酸の具体的な例としては、p-アセチル-L-フェニルアラニン、O-メチル-L-チロシン、L-3-(2-ナフチル)アラニン、3-メチル-フェニルアラニン、O-4-アリル-L-チロシン、4-プロピル-L-チロシン、トリ-O-アセチル-GlcNAcβ-セリン、L-ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル-L-フェニルアラニン、p-アジド-L-フェニルアラニン、p-アシル-L-フェニルアラニン、p-ベンゾイル-L-フェニルアラニン、L-ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p-ヨード-フェニルアラニン、p-ブロモフェニルアラニン、p-アミノ-L-フェニルアラニン、イソプロピル-L-フェニルアラニン、及びp-プロパルギルオキシ-フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に好適であり得る種々の非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「非天然アミノ酸のインビボ組み込み(In vivo incorporation of unnatural amino acids)」というタイトルのWO 2002/085923号に提供されている。さらなるメチオニン類似体については、Kiickらの文献(2002)、シュタウディンガーライゲーションによる化学選択的修飾のための組換えタンパク質へのアジドの組み込み(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation)、PNAS 99:19-24も参照されたい。
本発明での使用に好適な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Sigma(USA)又はAldrich(Milwaukee, Wis., USA)から市販されている。市販されていないものは、本明細書に提供されているように、又は様々な刊行物に提供されているように、又は当業者に公知の標準的な方法を用いて任意に合成される。有機合成技術については、例えば、Fessendon及びFessendon著、有機化学(Organic Chemistry)(1982、第2版、Willard Grant Press, Boston Mass.); March著、先端有機化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版、1985, Wiley and Sons, New York);及びCarey及びSundberg著、先端有機化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版、パートA及びB、1990, Plenum Press, New York)を参照されたい。非天然アミノ酸の合成を記載しているさらなる刊行物としては、例えば、「非天然アミノ酸のインビボ組み込み(In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids)」というタイトルのWO 2002/085923号; Matsoukasらの文献(1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F. E.及びKidd, D. A. A.の文献(1949)、フチル化(Phthylated)中間体からのグルタミン及びグルタミン酸のγ-ジペプチドの新規合成(A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates)、J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O. M.及びChatterrji, R.の文献(1959)、抗腫瘍剤のモデル基質としてのグルタミンの誘導体の合成(Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents)、J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J. C.らの文献(1988)、7-クロロ-4[[4-(ジエチルアミノ)-1-メチルブチル]アミノ]キノリン(クロロキン)のエナンチオマーの絶対配置(Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine))、J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M.、Vilmont, M.、及びFrappier, F.の文献(1991)、潜在的抗マラリア薬としてのグルタミン類似体(Glutamine analogues as Potential Antimalarials)、Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A. M. P.及びRapoport, H.の文献(1989)、立体構造拘束性アミノ酸類似体としての4-置換プロリンの合成(Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues）、J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B. D.及びRapoport, H.の文献(1985)、L-アスパラギンからの光学的に純粋なピペコレートの合成。アミノ酸脱カルボニル化及びイミニウムイオン環化による(+)-アポビンカミンの全合成への応用(Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization)、J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Bartonらの文献(1987)、ラジカル化学を用いた新規a-アミノ酸及び誘導体の合成: L-及びD-a-アミノ-アジピン酸、L-a-アミノピメリン酸、及び適切な不飽和誘導体の合成(Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives)、Tetrahedron Lett. 43:4297-4308;及びSubasingheらの文献(1992)、キスカル酸類似体:β-複素環式2-アミノプロパン酸誘導体の合成及び新規キスカル酸感受性部位におけるその活性(Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site)、J. Med. Chem. 35:4602-7が挙げられる。2003年12月22日に出願された「タンパク質アレイ(Protein Arrays)」というタイトルの特許出願、2002年12月22日に出願された第10/744,899号及び第60/435,821号も参照されたい。
カルボニル反応基を有するアミノ酸により、分子(限定されないが、PEG又は他の水溶性分子を含む)を、とりわけ、求核付加又はアルドール縮合反応を介して連結するための種々の反応が可能になる。
例示的なカルボニル含有アミノ酸は、次のように表すことができる:
Figure 0006498600
 (ここで、nは、0〜10であり; R1は、アルキル、アリール、置換アルキル、又は置換アリールであり; R2は、H、アルキル、アリール、置換アルキル、及び置換アリールであり; R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はアミノ末端修飾基であり、R4は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はカルボキシ末端修飾基である)。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、R2は、単純アルキル(すなわち、メチル、エチル、又はプロピル)であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、R2は、単純アルキル(すなわち、メチル、エチル、又はプロピル)であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
本発明において、隣接するヒドロキシル基とアミノ基を有する非天然コードアミノ酸を「マスクされた」アルデヒド官能基としてポリペプチドに組み込むことができる。例えば、5-ヒドロキシリジンは、εアミンに隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成させるための反応条件は、通常、ポリペプチド内の他の部位での酸化を避けるために穏やかな条件下でモル濃度過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加することを含む。酸化反応のpHは、通常、約7.0である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液に約1.5モル濃度過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、次いで、暗所で約10分間インキュベートすることを含む。例えば、引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第6,423,685号を参照されたい。
カルボニル官能基を、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、又はセミカルバジド含有試薬と、穏やかな条件下、水溶液中で選択的に反応させて、生理的条件下で安定である、対応するヒドラゾン、オキシム、又はセミカルバゾン結合をそれぞれ形成させることができる。例えば、Jencks, W. P.の文献、J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481(1959); Shao, J.及びTam, J. P.の文献、J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899(1995)を参照されたい。さらに、カルボニル基の独特の反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的な修飾が可能となる。例えば、Cornish, V. W.らの文献、J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151(1996); Geoghegan, K. F.及びStroh, J. G.の文献、Bioconjug. Chem. 3:138-146(1992); Mahal, L. K.らの文献、Science 276:1125-1128(1997)を参照されたい。
ヒドラジン、ヒドラジド、又はセミカルバジドなどの求核基を含有する非天然コードアミノ酸により、コンジュゲート(限定されないが、PEG又は他の水溶性ポリマーとのものを含む)を形成させるための種々の求電子基との反応が可能となる。
例示的なヒドラジン、ヒドラジド、又はセミカルバジド含有アミノ酸は、次のように表すことができる:
Figure 0006498600
 (ここで、nは、0〜10であり; R1は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、又は存在せず; Xは、O、N、もしくはSであるか、又は存在せず; R2は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はアミノ末端修飾基であり、R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はカルボキシ末端修飾基である)。
いくつかの実施態様において、nは4であり、R1は存在せず、XはNである。いくつかの実施態様において、nは2であり、R1は存在せず、Xは存在しない。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、XはOであり、酸素原子は、アリール環上の脂肪族(alphatic)基に対してパラ位ある。
ヒドラジド、ヒドラジン、及びセミカルバジド含有アミノ酸は、市販供給源から入手可能である。例えば、L-グルタメート-γ-ヒドラジドは、Sigma Chemical(St. Louis, Mo.)から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製されることができる。例えば、引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第6,281,211号を参照されたい。
ヒドラジド、ヒドラジン、又はセミカルバジド官能基を有する非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドは、アルデヒド又は類似の化学反応性を有する他の官能基を含有する種々の分子と効率的かつ選択的に反応させることができる。例えば、Shao, J.及びTam, J.の文献、J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899(1995)を参照されたい。ヒドラジド、ヒドラジン、及びセミカルバジド官能基の独特の反応性により、該官能基は、20種の一般的なアミノ酸上の求核基(限定されないが、セリンもしくはトレオニンのヒドロキシル基又はリジン及びN末端のアミノ基を含む)と比較して、アルデヒド、ケトン、及び他の求電子基に対する反応性が顕著により高くなる。
アミノオキシ(ヒドロキシルアミンとも呼ばれる)基を含有する非天然コードアミノ酸により、コンジュゲート(限定されないが、PEG又は他の水溶性ポリマーとのものを含む)を形成させるための種々の求電子基との反応が可能になる。ヒドラジン、ヒドラジド、及びセミカルバジドと同様、アミノオキシ基の求核性の増大により、該基は、アルデヒド又は類似の化学反応性を有する他の官能基を含有する種々の分子と効率的かつ選択的に反応することが可能になる。例えば、Shao, J.及びTam, J.の文献、J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899(1995); H. Hang及びC. Bertozziの文献、Acc. Chem. Res. 34: 727-736(2001)を参照されたい。しかしながら、ヒドラジン基との反応によって生じるものが対応するヒドラゾンであるのに対し、オキシムは、通常、アミノオキシ基と、ケトンなどのカルボニル含有基との反応によって生じるものである。
アミノオキシ基を含有する例示的なアミノ酸は、次のように表すことができる:
Figure 0006498600
 (ここで、nは、0〜10であり; R1は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、又は存在せず; Xは、O、N、Sであるか、又は存在せず; mは、0〜10であり; Yは、=C(O)であるか、又は存在せず; R2は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はアミノ末端修飾基であり、R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はカルボキシ末端修飾基である)。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、XはOであり、mは1であり、Yは存在する。いくつかの実施態様において、nは2であり、R1及びXは存在せず、mは0であり、Yは存在しない。
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手可能なアミノ酸前駆体(ホモセリン、セリン、及びトレオニン)から調製することができる。例えば、M. Carrasco及びR. Brownの文献、J. Org. Chem. 68: 8853-8858(2003)を参照されたい。L-2-アミノ-4-(アミノオキシ)酪酸)などの、特定のアミノオキシ含有アミノ酸は、天然源から単離されている(Rosenthal, G.らの文献、Life Sci. 60: 1635-1641(1997)。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって調製されることができる。
アジド及びアルキン官能基の独特の反応性により、該官能基は、ポリペプチド及び他の生体分子の選択的修飾に極めて有用となる。有機アジド、特に、脂肪族アジド、及びアルキンは、通常、一般的な反応性化学条件に対して安定である。特に、アジド官能基とアルキン官能基は両方とも、天然ポリペプチドに見られる20種の一般的なアミノ酸の側鎖(すなわち、R基)に対して不活性である。しかしながら、近接近させた場合、アジド及びアルキン基の「バネ仕掛け」の性質が現れ、それらは、ヒュスゲン[3+2]付加環化反応を介して選択的かつ効率的に反応し、対応するトリアゾールを生成させる。例えば、Chin J.らの文献、Science 301:964-7(2003); Wang, Q.らの文献、J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193(2003); Chin, J. W.らの文献、J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027(2002)を参照されたい。
ヒュスゲン付加環化反応は、求核置換ではなく、選択的付加環化反応を含むので(例えば、包括的有機合成(COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS)、第4巻(Trost, B. M.編、1991)、1069〜1109頁のPadwa, A.の文献; 1,3-双極性付加環化化学反応(1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY)(Padwa, A.編、1984)、1〜176頁のHuisgen, Rの文献)、アジド及びアルキン含有側鎖を有する非天然コードアミノ酸の組み込みにより、生じるポリペプチドを非天然コードアミノ酸の位置で選択的に修飾することが可能になる。アジド又はアルキン含有抗体が関与する付加環化反応は、Cu(II)をCu(I)に還元するための還元剤の存在下、インサイチュで、触媒量で、Cu(II)(限定されないが、触媒量のCuSO4の形態を含む)を添加することにより、水性条件下、室温で実施することができる。例えば、Wang, Q.らの文献、J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193(2003); Tornoe, C. W.らの文献、J. Org. Chem. 67:3057-3064(2002); Rostovtsevらの文献、Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599(2002)を参照されたい。例示的な還元剤としては、アスコルビン酸塩、金属銅、キニン、ヒドロキノン、ビタミンK、グルタチオン、システイン、Fe2+、Co2+、及び加電圧が挙げられるが、これらに限定されない。
アジドとアルキンとのヒュスゲン[3+2]付加環化反応が望ましい場合、抗原結合ポリペプチドは、アルキン部分を含む非天然コードアミノ酸を含み、該アミノ酸に接続されるべき水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。或いは、逆の(すなわち、アミノ酸上のアジド部分及び水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分との)反応を実施することもできる。
アジド官能基を、アリールエステルを含有し、かつアリールホスフィン部分で適切に官能化されている水溶性ポリマーと選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インサイチュでアジドを還元し、生じるアミンは、その後、近位のエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成させる。例えば、E. Saxon及びC. Bertozziの文献、Science 287, 2007-2010(2000)を参照されたい。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド(限定されないが、2-アミノ-6-アジド-1-ヘキサン酸を含む)又はアリールアジド(p-アジド-フェニルアラニン)のいずれかであることができる。
アリールエステル及びホスフィン部分を含有する例示的な水溶性ポリマーは、次のように表すことができる:
Figure 0006498600
 (ここで、Xは、O、N、Sであっても、存在しなくてもよく、Phはフェニルであり、Wは水溶性ポリマーであり、Rは、H、アルキル、アリール、置換アルキル、及び置換アリール基であることができる)。例示的なR基としては、-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-C(O)R'、-CONR'R''、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-CN、及び-NO2が挙げられるが、これらに限定されない。R'、R''、R'''、及びR''''は、各々独立に、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、限定されないが、1〜3個のハロゲンで置換されたアリールを含む、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が複数のR基を含む場合、例えば、該R基の各々は、複数のR'、R''、R'''、及びR''''基が存在する場合の各々のこれらの基として、独立に選択される。R'及びR''が同じ窒素原子に結合している場合、それらは、窒素原子と組み合わさって、5、6、又は7員環を形成することができる。例えば、-NR'R''は、限定されないが、1-ピロリジニル及び4-モルホリニルを含むことが意図される。置換基に関する上記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、ハロアルキル(限定されないが、-CF3及び-CH2CF3を含む)及びアシル(限定されないが、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3などを含む)などの、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意図するものであることを理解するであろう。
アジド官能基を、チオエステルを含有し、かつアリールホスフィン部分で適切に官能化されている水溶性ポリマーと選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インサイチュでアジドを還元し、生じるアミンは、その後、チオエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成させる。チオエステル及びホスフィン部分を含有する例示的な水溶性ポリマーは、次のように表すことができる:
Figure 0006498600
 (ここで、nは1〜10であり; Xは、O、N、Sであっても、存在しなくてもよく、Phはフェニルであり、Wは水溶性ポリマーである)。
例示的なアルキン含有アミノ酸は、次のように表すことができる:
Figure 0006498600
 (ここで、nは、0〜10であり; R1は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、又は存在せず; Xは、O、N、Sであるか、又は存在せず; mは、0〜10であり、R2は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はアミノ末端修飾基であり、R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はカルボキシ末端修飾基である)。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、Xは存在せず、mは0であり、アセチレン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、XはOであり、mは1であり、プロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する(すなわち、O-プロパルギル-チロシン)。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1及びXは存在せず、mは0である(すなわち、プロパリルグリシン(proparylglycine))。
アルキン含有アミノ酸は市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Peptech(Burlington, Mass.)から市販されている。或いは、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法に従って調製することができる。例えば、p-プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えば、Deiters, A.らの文献、J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783(2003)に記載されている通りに合成することができ、また、4-アルキニル-L-フェニルアラニンは、Kayser, B.らの文献、Tetrahedron 53(7): 2475-2484(1997)に記載されている通りに合成することができる。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって調製されることができる。
例示的なアジド含有アミノ酸は、次のように表すことができる:
Figure 0006498600
 (ここで、nは、0〜10であり; R1は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、又は存在せず; Xは、O、N、Sであるか、又は存在せず; mは、0〜10であり; R2は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はアミノ末端修飾基であり、R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド、又はカルボキシ末端修飾基である)。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、Xは存在せず、mは0であり、アジド部分は、アルキル側鎖に対してパラ位にある。いくつかの実施態様において、nは、0〜4であり、R1及びXは存在せず、m＝0である。いくつかの実施態様において、nは1であり、R1はフェニルであり、XはOであり、mは2であり、P-アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
アジド含有アミノ酸は、市販供給源から入手可能である。例えば、4-アジドフェニルアラニンは、Chem-Impex International社(Wood Dale, Ill.)から入手することができる。市販されていないアジド含有アミノ酸については、アジド基を、限定されないが、好適な脱離基(限定されないが、ハライド、メシレート、トシレートを含む)の置換によるもの、又は好適に保護されたラクトンの開環によるものを含む、当業者に公知の標準的な方法を用いて、比較的容易に調製することができる。例えば、March著、先端有機化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版、1985, Wiley and Sons, New York)を参照されたい。
β-置換アミノチオール官能基の独特の反応性により、該官能基は、チアゾリジンの形成を介した、ポリペプチド及びアルデヒド基を含有する他の生体分子の選択的修飾に極めて有用となる。例えば、J. Shao及びJ. Tamの文献、J. Am. Chem. Soc. 1995, 117(14) 3893-3899を参照されたい。いくつかの実施態様において、β-置換アミノチオールアミノ酸を抗体に組み込み、その後、アルデヒド官能基を含む水溶性ポリマーと反応させることができる。いくつかの実施態様において、水溶性ポリマー、薬物コンジュゲート、又は他のペイロードを、チアゾリジンの形成を介して、β-置換アミノチオールアミノ酸を含む抗体ポリペプチドにカップリングさせることができる。
有用な非天然アミノ酸の特定の例としては、p-アセチル-L-フェニルアラニン、O-メチル-L-チロシン、L-3-(2-ナフチル)アラニン、3-メチル-フェニルアラニン、O-4-アリル-L-チロシン、4-プロピル-L-チロシン、トリ-O-アセチル-GlcNAc b-セリン、L-ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル-L-フェニルアラニン、p-アジド-L-フェニルアラニン、p-アシル-L-フェニルアラニン、p-ベンゾイル-L-フェニルアラニン、L-ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p-ヨード-フェニルアラニン、p-ブロモフェニルアラニン、p-アミノ-L-フェニルアラニン、イソプロピル-L-フェニルアラニン、及びp-プロパルギルオキシ-フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる有用な例としては、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-セリン、N-アセチル-L-ガラクトサミニル-L-セリン、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-トレオニン、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-アスパラギン、及びO-マンノサミニル-L-セリンが挙げられる。
特定の実施態様において、非天然アミノ酸は、p-アセチル-フェニルアラニン、p-エチニル-フェニルアラニン、p-プロパルギルオキシフェニルアラニン、及びp-アジド-フェニルアラニンから選択される。1つの特に有用な非天然アミノ酸は、p-アジドフェニルアラニンである。このアミノ酸残基は、例えば、アルキニル基を有する化合物とのヒュスゲン[3+2]付加環化反応(いわゆる、「クリック」化学反応)をしやすくすることが当業者に知られている。この反応により、当業者は、容易にかつ迅速に、非天然アミノ酸の部位特異的位置で抗体にコンジュゲートすることができる。
ある実施態様において、第一の反応基は、アルキニル部分(限定されないが、非天然アミノ酸のp-プロパルギルオキシフェニルアラニン中にあるものを含み、この場合、プロパルギル基は、アセチレン部分と呼ばれることもある)であり、第二の反応基は、アジド部分であり、[3+2]付加環化化学反応を使用することができる。ある実施態様において、第一の反応基は、アジド部分(限定されないが、非天然アミノ酸のp-アジド-L-フェニルアラニン中にあるものを含む)であり、第二の反応基は、アルキニル部分である。
上記の式において、各々のLは、二価のリンカーを表す。二価のリンカーは、当業者に公知の任意の二価のリンカーであることができる。一般に、二価のリンカーは、非天然アミノ酸の官能性部分R及びα炭素との共有結合を形成することができる。有用な二価のリンカーは、結合、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、及び置換ヘテロアリーレンである。ある実施態様において、Lは、C1-10アルキレン又はC1-10ヘテロアルキレンである。
本明細書に記載の方法及び組成物で使用される非天然アミノ酸は、以下の4つの性質のうちの少なくとも1つを有する:(1)非天然アミノ酸の側鎖上の少なくとも1つの官能基は、20種の一般的な、遺伝子にコードされているアミノ酸(すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン)の化学反応性とは異なるか、又は非天然アミノ酸を含むポリペプチド中に存在する天然アミノ酸の化学反応性とは少なくとも異なる少なくとも1つの特徴及び/又は活性及び/又は反応性を有する;(2)導入される非天然アミノ酸は、20種の一般的な、遺伝子にコードされているアミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である;(3)非天然アミノ酸は、好ましくは、天然アミノ酸と同じ安定性で、又は典型的な生理的条件下で、ポリペプチドに安定に組み込むことができ、さらに好ましくは、そのような組み込みはインビボの系で行うことができる;並びに(4)非天然アミノ酸は、オキシム官能基、又は好ましくは、非天然アミノ酸を含むポリペプチドの生物学的性質を破壊しない条件(当然、生物学的性質のそのような破壊が修飾/変換の目的である場合を除く)、もしくは変換が、pH約4〜約8の水性条件下で起こり得る条件、もしくは非天然アミノ酸上の反応性部位が求電子性部位である条件下で、試薬と反応させることによりオキシム基に変換することができる官能基を含む。本明細書に記載の組成物及び方法とともに使用することができる非天然アミノ酸についてのこれら4つの性質を満たす、例示的で、非限定的なアミノ酸の例は、図2、3、35、及び40〜43に提示されている。任意の数の非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することができる。非天然アミノ酸は、保護もしくはマスクされたオキシム、又は保護基の脱保護もしくはマスクされた基の脱マスキングの後にオキシム基に変換することができる保護もしくはマスクされた基も含み得る。非天然アミノ酸は、保護基の脱保護又はマスクされた基の脱マスキングの後にカルボニル又はジカルボニル基に変換することができ、それにより、ヒドロキシルアミン又はオキシムと反応して、オキシム基を形成することが可能になる、保護もしくはマスクされたカルボニル又はジカルボニル基も含み得る。
さらなる実施態様において、本明細書に記載の方法及び組成物で使用し得る非天然アミノ酸としては、光活性化可能なクロスリンカーを含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光ケージ化された及び/又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含むアミノ酸、糖置換セリンなどのグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、アルデヒド含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又は他のポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能な及び/又は光切断可能なアミノ酸、限定されないが、ポリエーテル又は長鎖炭化水素(限定されないが、約5個又は約10個よりも多くの炭素を含む)を含む、天然アミノ酸と比較して伸長した側鎖を有するアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに1以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、非天然アミノ酸は、サッカリド部分を含む。そのようなアミノ酸の例としては、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-セリン、N-アセチル-L-ガラクトサミニル-L-セリン、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-トレオニン、N-アセチル-L-グルコサミニル-L-アスパラギン、及びO-マンノサミニル-L-セリンが挙げられる。そのようなアミノ酸の例としては、アミノ酸とサッカリドの間の天然に存在するN-又はO-結合が、天然ではあまり見られない−アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含むが、これらに限定されない、共有結合によって置き換えられている例も挙げられる。そのようなアミノ酸の例としては、天然に存在するタンパク質ではあまり見られないサッカリド、例えば、2-デオキシ-グルコース、2-デオキシガラクトースなども挙げられる。
非天然アミノ酸の組み込みによって抗体に組み込まれる化学部分により、ポリペプチドの種々の利点及び操作が提供される。例えば、カルボニル又はジカルボニル官能基(ケト又はアルデヒド官能基を含む)の独特の反応性により、いくつかのヒドラジン又はヒドロキシルアミン含有試薬のいずれかによるインビボ及びインビトロでの抗体の選択的修飾が可能になる。例えば、重原子非天然アミノ酸は、x線構造データを同期させるのに有用となり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的な導入により、重原子の位置を選択する際の選択性及び柔軟性も提供される。光反応性非天然アミノ酸(限定されないが、ベンゾフェノン及びアリールアジド(限定されないが、フェニルアジドを含む)側鎖を有するアミノ酸を含む)により、例えば、ポリペプチドの効率的なインビボ及びインビトロでの光架橋が可能になる。光反応性非天然アミノ酸の例としては、p-アジド-フェニルアラニン及びp-ベンゾイル-フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、光反応性非天然アミノ酸を含む抗体を、光反応基の励起がもたらす時間的制御によって自由自在に架橋することができる。非限定的な例において、非天然アミノのメチル基を、限定されないが、核磁気共鳴及び振動分光法を使用するものを含む、局所的構造及び動力学のプローブとして、限定されないが、メチル基を有するものを含む、同位体標識物と置換することができる。
求電子性反応基を有するアミノ酸により、限定されないが、求核付加反応を含む、様々な化学反応によって分子を連結する種々の反応が可能になる。そのような求電子性反応基としては、カルボニルもしくはジカルボニル基(ケトもしくはアルデヒド基を含む)、カルボニル様もしくはジカルボニル様基(これらは、カルボニルもしくはジカルボニル基と類似の反応性を有し、カルボニルもしくはジカルボニル基と構造的に類似している)、マスクされたカルボニルもしくはマスクされたジカルボニル基(これらは、カルボニルもしくはジカルボニル基に容易に変換することができる)、又は保護カルボニルもしくは保護ジカルボニル基(これらは、脱保護したときにカルボニル又はジカルボニル基と類似の反応性を有する)が挙げられる。そのようなアミノ酸は、式(I)の構造を有するアミノ酸を含む:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Jは、
Figure 0006498600
 であり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; 各々のR''は、独立に、H、アルキル、置換アルキル、もしくは保護基であるか、又は複数のR''基が存在するとき、2つのR''は、任意に、ヘテロシクロアルキルを形成し; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R3及びR4の各々は、独立に、H、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し;或いは-A-B-J-R基は一緒に、ジカルボニル基を含むカルボニル基、保護ジカルボニル基を含む保護カルボニル基、又はマスクされたジカルボニル基を含むマスクされたカルボニル基を少なくとも1つ含む二環式又は三環式シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを形成し;或いは-J-R基は一緒に、ジカルボニル基を含むカルボニル基、保護ジカルボニル基を含む保護カルボニル基、又はマスクされたジカルボニル基を含むマスクされたカルボニル基を少なくとも1つ含む単環式又は二環式シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを形成し;但し、Aがフェニレンであり、各々のR3がHであるとき、Bは存在し;及びAが-(CH2)4-であり、各々のR3がHであるとき、Bは-NHC(O)(CH2CH2)-ではなく;及びAもBも存在せず、各々のR3がHであるとき、Rはメチルではない)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
ある実施態様において、式(I)の化合物は、弱酸性条件下、水溶液中で、少なくとも1カ月間安定である。ある実施態様において、式(I)の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも2週間安定である。ある実施態様において、式(I)の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも5日間安定である。ある実施態様において、そのような酸性条件は、pH 2〜8である。
式(I)の化合物のある実施態様において、Bは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、-O-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、-C(R')=N-N(R')-、-N(R')CO-、-C(O)-、-C(R')=N-、-C(O)-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、-CON(R')-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、-S(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、-S(O)(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、又は-S(O)2(アルキレンもしくは置換アルキレン)-である。式(I)の化合物のある実施態様において、Bは、-O(CH2)-、-CH=N-、-CH=N-NH-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(=O)CH2-、又は-S(O)2CH2-である。式(I)の化合物のある実施態様において、Rは、C1-6アルキル又はシクロアルキルである。式(I)の化合物のある実施態様において、Rは、-CH3、-CH(CH3)2、又はシクロプロピルである。式(I)の化合物のある実施態様において、R1は、H、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、N-アセチル、テトラフルオロアセチル(TFA)、又はベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。式(I)の化合物のある実施態様において、R1は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである。式(I)の化合物のある実施態様において、R2は、OH、O-メチル、O-エチル、又はO-t-ブチルである。式(I)の化合物のある実施態様において、R2は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである。式(I)の化合物のある実施態様において、R2は、ポリヌクレオチドである。式(I)の化合物のある実施態様において、R2は、リボ核酸(RNA)である。式(I)の化合物のある実施態様において、R2は、tRNAである。式(I)の化合物のある実施態様において、該tRNAは、セレクターコドンを特異的に認識する。式(I)の化合物のある実施態様において、該セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、5塩基コドン、及び4塩基コドンからなる群から選択される。式(I)の化合物のある実施態様において、R2は、サプレッサーtRNAである。
式(I)の化合物のある実施態様において、
Figure 0006498600
 は:(i) Aは、置換低級アルキレン、C4-アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-からなる群から選択される二価のリンカーである;(ii) Aは任意であり、存在するときは、置換低級アルキレン、C4-アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-からなる群から選択される二価のリンカーである;(iii) Aは低級アルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CSN(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-からなる群から選択される二価のリンカーである;及び(iv) Aはフェニレンであり; Bは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-N(R')-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(S)-、-S(O)N(R')、-S(O)2N(R')、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、-N(R')S(O)2N(R')-、-N(R')-N=、-C(R')'N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-からなる群から選択される二価のリンカーである、からなる群から選択され; Jは、
Figure 0006498600
 であり;各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルであり; R1は任意であり、存在するときは、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は任意であり、存在するときは、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;各々のR3及びR4は、独立に、H、ハロゲン、低級アルキル、又は置換低級アルキルであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである。
さらに、式(II)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである)。ある実施態様において、Aがフェニレンであるとき、Bは存在し;及びAが-(CH2)4-であるとき、Bは-NHC(O)(CH2CH2)-ではなく;及びAもBも存在しないとき、Rはメチルではない。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(III)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Bは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)k R'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)kR'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択される)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 。そのような非天然アミノ酸は、任意に、アミノ保護基、カルボキシル保護されたもの、及び/もしくは塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(IV)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Bは、-NS(O)2-、-OS(O)2-、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)kR'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)kR'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択され; nは、0〜8である)。ある実施態様において、Aが-(CH2)4-であるとき、Bは、-NHC(O)(CH2CH2)-ではない。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されたもの、任意にカルボキシル保護されたもの、任意にアミノ保護及びカルボキシル保護されたもの、もしくはそれらの塩であるか、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい)。
さらに、式(VIII)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(IX)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;ここで、各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)kR'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)k R'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択される)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されたもの、任意にカルボキシル保護されたもの、任意にアミノ保護及びカルボキシル保護されたもの、もしくはそれらの塩であるか、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい)。
さらに、式(X)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)kR'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)kR'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択され; nは、0〜8である)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されたもの、任意にカルボキシル保護されたもの、任意にアミノ保護及びカルボキシル保護されたもの、もしくはそれらの塩であるか、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい)。
モノカルボニル構造に加えて、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、ジカルボニル基、ジカルボニル様基、マスクされたジカルボニル基、及び保護ジカルボニル基などの基を含んでいてもよい。例えば、式(V)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(VI)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;ここで、各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)kR'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)kR'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択される)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護及びカルボキシル保護されたもの、又はその塩である)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(VII)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)kR'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)kR'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択され; nは、0〜8である)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護及びカルボキシル保護されたもの、もしくはその塩であるか、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい)。
さらに、式(XXX)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; X1は、C、S、又はS(O)であり; Lは、アルキレン、置換アルキレン、N(R')(アルキレン)、又はN(R')(置換アルキレン)であり、ここで、R'は、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXX-A)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; Lは、アルキレン、置換アルキレン、N(R')(アルキレン)、又はN(R')(置換アルキレン)であり、ここで、R'は、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXX-B)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; Lは、アルキレン、置換アルキレン、N(R')(アルキレン)、又はN(R')(置換アルキレン)であり、ここで、R'は、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXI)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; X1は、C、S、又はS(O)であり; nは、0、1、2、3、4、又は5であり;各々のCR8R9基上の各々のR8及びR9は、独立に、H、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、又は任意のR8及びR9は一緒に、=Oもしくはシクロアルキルを形成することができるか、又は任意の2つの隣接するR8基は一緒に、シクロアルキルを形成することができる)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXI-A)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; nは、0、1、2、3、4、又は5であり;各々のCR8R9基上の各々のR8及びR9は、独立に、H、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、又は任意のR8及びR9は一緒に、=Oもしくはシクロアルキルを形成することができるか、又は任意の2つの隣接するR8基は一緒に、シクロアルキルを形成することができる)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXI-B)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; nは、0、1、2、3、4、又は5であり;各々のCR8R9基上の各々のR8及びR9は、独立に、H、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、又は任意のR8及びR9は一緒に、=Oもしくはシクロアルキルを形成することができるか、又は任意の2つの隣接するR8基は一緒に、シクロアルキルを形成することができる)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXII)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; X1は、C、S、又はS(O)であり; Lは、アルキレン、置換アルキレン、N(R')(アルキレン)、又はN(R')(置換アルキレン)であり、ここで、R'は、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXII-A)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; Lは、アルキレン、置換アルキレン、N(R')(アルキレン)、又はN(R')(置換アルキレン)であり、ここで、R'は、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXII-B)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; Lは、アルキレン、置換アルキレン、N(R')(アルキレン)、又はN(R')(置換アルキレン)であり、ここで、R'は、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXX)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり;
Figure 0006498600
 (a)がA基との結合を示し、(b)がそれぞれのカルボニル基との結合を示す場合、R3及びR4は、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3基もしくは2つのR4基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し; Rは、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; T3は、結合、C(R)(R)、O、又はSであり、Rは、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキル; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXXI)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中:
Figure 0006498600
 (a)がA基との結合を示し、(b)がそれぞれのカルボニル基との結合を示す場合、R3及びR4は、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3基もしくは2つのR4基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し; Rは、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; T3は、結合、C(R)(R)、O、又はSであり、Rは、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキル; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり;各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)kR'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)kR'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択される)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXXII)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Rは、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; T3は、O、又はSである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、式(XXXXIII)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Rは、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルである)。
さらに、式(XXXXIII)の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
ヒドロキシルアミン(アミノオキシとも呼ばれる)基を含有する非天然アミノ酸により、コンジュゲート(限定されないが、PEG又は他の水溶性ポリマーとのものを含む)を形成させるための種々の求電子基との反応が可能になる。ヒドラジン、ヒドラジド、及びセミカルバジドと同様、アミノオキシ基の求核性の増大により、該基は、限定されないが、ケトン、アルデヒド、又は類似の化学反応性を有する他の官能基を含む、カルボニル基又はジカルボニル基を含有する種々の分子と効率的かつ選択的に反応することが可能になる。例えば、Shao, J.及びTam, J.の文献、J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899(1995); H. Hang及びC. Bertozziの文献、Acc. Chem. Res. 34: 727-736(2001)を参照されたい。しかしながら、ヒドラジン基との反応によって生じるものが対応するヒドラゾンであるのに対し、オキシムは、通常、アミノオキシ基と、例えば、ケトン、アルデヒド、又は類似の化学反応性を有する他の官能基などのカルボニル又はジカルボニル含有基との反応によって生じるものである。
したがって、ある実施態様において、本明細書に記載されるのは、ヒドロキシルアミン基、ヒドロキシルアミン様基(これは、ヒドロキシルアミン基と類似の反応性を有し、かつヒドロキシルアミン基と構造的に類似している)、マスクされたヒドロキシルアミン基(これは、ヒドロキシルアミン基に容易に変換することができる)、又は保護ヒドロキシルアミン基(これは、脱保護したときにヒドロキシルアミン基と類似の反応性を有する)を含む側鎖を有する非天然アミノ酸である。そのようなアミノ酸には、式(XIV)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Kは、-NR6R7又は-N=CR6R7であり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R3及びR4の各々は、独立に、H、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し;R6及びR7の各々は、独立に、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、及び置換アラルキル、-C(O)R''、-C(O)2R''、-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)からなる群から選択されるか;又はR6もしくはR7は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
式(XIV)の化合物のある実施態様において、Aは、フェニレン又は置換フェニレンである。式(XIV)の化合物のある実施態様において、Bは、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、-O-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、-S-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-、又は-C(O)-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-である。式(XIV)の化合物のある実施態様において、Bは、-O(CH2)2-、-S(CH2)2-、-NH(CH2)2-、-CO(CH2)2-、又は-(CH2)n-(ここで、nは、1〜4である)である。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R1は、H、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、N-アセチル、テトラフルオロアセチル(TFA)、又はベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R1は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである。式(XIV)の化合物のある実施態様において、式中、R2は、OH、O-メチル、O-エチル、又はO-t-ブチルである。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R2 は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R2は、ポリヌクレオチドである。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R2は、リボ核酸(RNA)である。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R2は、tRNAである。式(XIV)の化合物のある実施態様において、該tRNAは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、5塩基コドン、及び4塩基コドンからなる群から選択されるコドンを特異的に認識する。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R2は、サプレッサーtRNAである。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R6及びR7の各々は、独立に、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、及び置換アラルキルからなる群から選択される。式(XIV)の化合物のある実施態様において、R6及びR7の各々は、独立に、H、メチル、フェニル、及び-[(アルキレン又は置換アルキレン)-O-(水素、アルキル、又は置換アルキル)]x(ここで、xは、1〜50である)からなる群から選択される。式(XIV)の化合物のある実施態様において、Kは、-NR6R7である。
式(XIV)の化合物のある実施態様において、Xは、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、及びミセルからなる群から選択される生体活性物質である。式(XIV)の化合物のある実施態様において、Xは、抗生物質、防黴剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安剤、ホルモン剤、成長因子、及びステロイド剤からなる群から選択される薬物である。式(XIV)の化合物のある実施態様において、Xは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される酵素である。式(XIV)の化合物のある実施態様において、Xは、蛍光部分、リン光部分、化学発光部分、キレート化部分、高電子密度部分、磁気部分、挿入部分、放射性部分、発色部分、及びエネルギー伝達部分からなる群から選択される検出可能標識である。
ある実施態様において、式(XIV)の化合物は、弱酸性条件下、水溶液中で、少なくとも1カ月間安定である。ある実施態様において、式(XIV)の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも2週間安定である。ある実施態様において、式(XIV)の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも5日間安定である。ある実施態様において、そのような酸性条件は、pH 2〜8である。
そのようなアミノ酸には、式(XV)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R3及びR4の各々は、独立に、H、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
非限定的な、代表的アミノ酸は、以下の構造を有する:
Figure 0006498600
 。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
オキシム基を含有する非天然アミノ酸により、新しいオキシム基を含む新しい非天然アミノ酸を形成させるための特定の反応性カルボニル又はジカルボニル基(限定されないが、ケトン、アルデヒド、又は類似の反応性を有する他の基を含む)を含有する種々の試薬との反応が可能になる。そのようなオキシム交換反応により、非天然アミノ酸ポリペプチドのさらなる官能化が可能になる。さらに、オキシム基を含有するもとの非天然アミノ酸は、オキシム結合が、該アミノ酸をポリペプチドに組み込むのに必要な条件(例えば、本明細書に記載のインビボ、インビトロ、及び化学合成方法)下で安定である限り、それ自体有用で有り得る。
したがって、ある実施態様において、本明細書に記載されるのは、オキシム基、オキシム様基(これは、オキシム基と類似の反応性を有し、かつオキシム基と構造的に類似している)、マスクされたオキシム基(これは、オキシム基に容易に変換することができる)、又は保護オキシム基(これは、脱保護したときに、オキシム基と類似の反応性を有する)を含む側鎖を有する非天然アミノ酸である。そのようなアミノ酸には、式(XI)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R3及びR4の各々は、独立に、H、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し; R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-ON(R'')2、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-C(O)SR''、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-S-S-(アリールもしくは置換アリール)、-C(O)R''、-C(O)2R''、もしくは-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)であるか;又はR5は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-O-N-CR'-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-C(O)NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-S(O)k-(アルキレン又は置換アルキレン)-S-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり;但し、AもBも存在しないとき、Rはメチルではない)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
式(XI)の化合物のある実施態様において、Bは、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-である。式(XI)の化合物のある実施態様において、Bは、-O(CH2)-である。式(XI)の化合物のある実施態様において、Rは、C1-4アルキルである。式(XI)の化合物のある実施態様において、Rは、-CH3である。式(XI)の化合物のある実施態様において、R1は、H、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、N-アセチル、テトラフルオロアセチル(TFA)、又はベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。式(XI)の化合物のある実施態様において、R1は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである。式(XI)の化合物のある実施態様において、R2は、OH、O-メチル、O-エチル、又はO-t-ブチルである。式(XI)の化合物のある実施態様において、R2は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドである。式(XI)の化合物のある実施態様において、R2は、ポリヌクレオチドである。式(XI)の化合物のある実施態様において、R2は、リボ核酸(RNA)である。式(XI)の化合物のある実施態様において、R2は、tRNAである。式(XI)の化合物のある実施態様において、該tRNAは、セレクターコドンを特異的に認識する。式(XI)の化合物のある実施態様において、該セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、5塩基コドン、及び4塩基コドンからなる群から選択される。式(XI)の化合物のある実施態様において、R2は、サプレッサーtRNAである。式(XI)の化合物のある実施態様において、R5は、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、又は-C(O)2R''である。式(XI)の化合物のある実施態様において、R5は、-[(アルキレン又は置換アルキレン)-O-(水素、アルキル、又は置換アルキル)]x(ここで、xは、1〜50である)である。式(XI)の化合物のある実施態様において、R5は、-(CH2CH2)-O-CH3又は-COOHである。
ある実施態様において、式(XI)の化合物は、弱酸性条件下、水溶液中で、少なくとも1カ月間安定である。ある実施態様において、式(XI)の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも2週間安定である。ある実施態様において、式(XI)の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも5日間安定である。ある実施態様において、そのような酸性条件は、pH 2〜8である。
式(XI)のアミノ酸には、式(XII)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-ON(R'')2、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-C(O)SR''、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-S-S-(アリールもしくは置換アリール)、-C(O)R''、-C(O)2R''、もしくは-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)であるか;又はR5は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-O-N-CR'-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-C(O)NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-S(O)k-(アルキレン又は置換アルキレン)-S-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
そのようなアミノ酸には、式(XIII)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中、Rは、H、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、又は置換シクロアルキルであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R5は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-ON(R'')2、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-C(O)SR''、-(アルキレンもしくは置換アルキレン)-S-S-(アリールもしくは置換アリール)、-C(O)R''、-C(O)2R''、もしくは-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)であるか;又はR5は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-O-N-CR'-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-C(O)NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-S(O)k-(アルキレン又は置換アルキレン)-S-、-(アルキレン又は置換アルキレン)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
そのようなアミノ酸のさらなる非限定的な例には、以下の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、そのようなアミノ酸には、式(XIV)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; Kは、-NR6R7又は-N=CR6R7であり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R3及びR4の各々は、独立に、H、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し;R6及びR7の各々は、独立に、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、及び置換アラルキル、-C(O)R''、-C(O)2R''、-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)からなる群から選択されるか;又はR6もしくはR7は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
そのようなアミノ酸には、式(XVI)の構造を有するアミノ酸がさらに含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Aは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、又は置換アラルキレンであり; Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R3及びR4の各々は、独立に、H、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、又はR3及びR4もしくは2つのR3は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し;R6及びR7の各々は、独立に、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、及び置換アラルキル、-C(O)R''、-C(O)2R''、-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)からなる群から選択されるか;又はR6もしくはR7は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーである)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、そのようなアミノ酸には、式(XVII)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R6及びR7の各々は、独立に、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、及び置換アラルキル、-C(O)R''、-C(O)2R''、-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)からなる群から選択されるか;又はR6もしくはR7は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーである)。
そのようなアミノ酸の非限定的な例には、以下の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
さらに、そのようなアミノ酸には、式(XVIII)の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 (式中: Bは任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり; R1は、H、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R2は、OH、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドであり; R6及びR7の各々は、独立に、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、及び置換アラルキル、-C(O)R''、-C(O)2R''、-C(O)N(R'')2(ここで、各々のR''は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルである)からなる群から選択されるか;又はR6もしくはR7は、L-X(ここで、Xは、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋剤;細胞毒性化合物;薬物;親和性標識;光親和性標識;反応性化合物;樹脂;第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体;抗体又は抗体断片;金属キレーター;補因子;脂肪酸;炭水化物;ポリヌクレオチド;DNA;RNA;アンチセンスポリヌクレオチド;サッカリド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、バイオマテリアル;ナノ粒子;スピン標識;蛍光団、金属含有部分;放射性部分;新規官能基;他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基;光ケージ化部分;光異性化可能部分;ビオチン;ビオチン類似体;重原子包含部分;化学切断可能基;光切断可能基;伸長側鎖;炭素結合糖;レドックス活性剤;アミノチオ酸;毒性部分;同位体標識部分;生物物理学的プローブ;リン光基;化学発光基;高電子密度基;磁性基;挿入基;発色団;エネルギー伝達剤;生体活性物質;検出可能標識;及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される)であり; Lは任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、-O-、-O-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S-、-S-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-S(O)k-(ここで、kは、1、2、又は3である)、-S(O)k(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)-、-C(O)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(S)-、-C(S)-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')-、-NR'-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')CO-(アルキレン又は置換アルキレン)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-、及び-C(R')2-N(R')-N(R')-(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択されるリンカーであり;各々のRaは、独立に、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、-N(R')2、-C(O)kR'(ここで、kは、1、2、又は3である)、-C(O)N(R')2、-OR'、及び-S(O)kR'(ここで、各々のR'は、独立に、H、アルキル、又は置換アルキルである)からなる群から選択され; nは、0〜8である)。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
そのようなアミノ酸の非限定的な例には、以下の構造を有するアミノ酸が含まれる:
Figure 0006498600
 。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
ある実施態様において、非天然アミノ酸は、式XIXによるもの、又はその塩であることができる:
Figure 0006498600
 (式中: Dは、-Ar-W3-又は-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-であり; Arは、
Figure 0006498600
 であり; W1、W2、及びW3の各々は、独立に、単結合又は低級アルキレンであり; 各々のX1は、独立に、-NH-、-O-、又は-S-であり;各々のY1は、独立に、単結合、-NH-、又は-O-であり;各々のY2は、独立に、単結合、-NH-、-O-、又はN-結合もしくはC-結合ピロリジニレンであり; Z1、Z2、及びZ3のうちの1つは、-N-であり、Z1、Z2、及びZ3のうちの他のものは、独立に、-CH-である)。ある実施態様において、非天然アミノ酸は、式XIXaによるものである:
Figure 0006498600
 (式中、Dは、式XIXとの関連で定義されている通りである)。ある実施態様において、非天然アミノ酸は、式XIXbによるもの、又はその塩である:
Figure 0006498600
 (式中、W4は、C1-C10アルキレンである)。さらなる実施態様において、W4は、C1-C5アルキレンである。一実施態様において、W4は、C1-C3アルキレンである。一実施態様において、W4は、C1アルキレンである。特定の実施態様において、非天然アミノ酸は、下記のもの:
Figure 0006498600
Figure 0006498600
Figure 0006498600
;又はそれらの塩からなる群から選択される。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に翻訳後修飾されていてもよい。
(リンカー及びペイロード)
ある実施態様において、抗体は、上記のような反応基を有する非天然アミノ酸を含む。当業者は、反応基を用いて、抗体を、直接的に又はリンカーを介して間接的に非天然アミノ酸との共有結合を形成することができる任意の分子実体に連結することができる。
有用なリンカーとしては、上の節に記載されているものが挙げられる。ある実施態様において、リンカーは、当業者に公知の任意の二価又は多価リンカーである。通常、リンカーは、非天然アミノ酸の官能性部分R及びα炭素との共有結合を形成することができる。有用な二価のリンカーは、結合、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、及び置換ヘテロアリーレンである。ある実施態様において、リンカーは、C1-10アルキレン又はC1-10ヘテロアルキレンである。
分子ペイロードは、当業者が抗体にコンジュゲートすることを望み得る任意の分子実体であることができる。ある実施態様において、該ペイロードは、治療的部分である。そのような実施態様において、抗体コンジュゲートを用いて、治療的部分をその分子標的にターゲッティングすることができる。ある実施態様において、該ペイロードは、標識部分である。そのような実施態様において、抗体コンジュゲートを用いて、その標的に対する抗体の結合を検出することができる。ある実施態様において、該ペイロードは、細胞毒性部分である。そのような実施態様において、コンジュゲートを用いて、細胞毒性部分を、罹患細胞、例えば、癌細胞にターゲッティングし、細胞の破壊又は除去を開始させることができる。当業者に明らかな他の分子ペイロードを含むコンジュゲートは、本明細書に記載のコンジュゲートの範囲内にある。
ある実施態様において、コンジュゲートは、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第二のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体、抗体又は抗体断片、金属キレーター、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、アンチセンスポリヌクレオチド、ペプチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、バイオマテリアル、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学切断可能基、光切断可能基、伸長側鎖、炭素結合糖、レドックス活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生体活性物質、検出可能標識、小分子、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択されるペイロードを有することができる。
有用な薬物ペイロードとしては、任意の細胞毒性薬、細胞増殖抑制薬、又は免疫調節薬が挙げられる。有用なクラスの細胞毒性剤又は免疫調節剤としては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、DNAマイナーグルーブ結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、白金錯体、例えば、シス-プラチン、モノ(白金)、ビス(白金)、及びトリ-核白金錯体、並びにカルボプラチン)、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、カルモジュリン阻害剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、メイタンシノイド、ニトロソウレア、プラチノール、孔形成化合物、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン、放射線増感剤、ラパマイシン、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。
個別の細胞毒性剤又は免疫調節剤としては、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5-アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシイミン、カリケアマイシン、カリケアマイシン誘導体、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン(BSNU)、CC-1065、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ダウノルビシン、デカルバジン(decarbazine)、DM1、DM4、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エストロゲン、5-フルオルデオキシウリジン(5-fluordeoxyuridine)、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン(CCNU)、メイタンシン、メクロレタミン、メルファラン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、パリトキシン、プリカマイシン、プロカルビジン(procarbizine)、リゾキシン、ストレプトゾトシン、テノポシド、6-チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16、及びVM-26が挙げられる。
いくつかの実施態様において、好適な細胞毒性剤としては、例えば、DNAマイナーグルーブ結合剤(例えば、エンジイン及びレキシトロプシン、CBI化合物;米国特許第6,130,237号も参照のこと)、デュオカルマイシン、タキサン(例えば、パクリタキセル及びドセタキセル)、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、CC-1065、SN-38、トポテカン、モルホリノ-ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、エイノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンA及びB、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモライド、エレウテロビン、並びにミトキサントロンが挙げられる。
いくつかの実施態様において、該ペイロードは、抗チューブリン剤である。抗チューブリン剤の例としては、タキサン(例えば、Taxol(登録商標)(パクリタキセル)、Taxotere(登録商標)(ドセタキセル))、T67(Tularik)、並びにビンカアルキロイド(vinca alkyloids)(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン)が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体、エポチロン(例えば、エポチロンA及びB)、ノコダゾール、コルヒチン及びコルシミド(colcimid)、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモライド、並びにエレウテロビンが挙げられる。
ある実施態様において、該細胞毒性剤は、別グループの抗チューブリン剤である、メイタンシノイドである。例えば、具体的な実施態様において、メイタンシノイドは、メイタンシン又はDM-1(ImmunoGen, Inc.; Chariらの文献、1992, Cancer Res. 52:127-131も参照のこと)であることができる。
いくつかの実施態様において、該ペイロードは、オーリスタチン、例えば、オーリスタチンE又はその誘導体である。例えば、オーリスタチンE誘導体は、オーリスタチンEとケト酸との間で形成されたエステルであることができる。例えば、オーリスタチンEをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれ、AEB及びAEVBを生成させることができる。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、AFP、MMAF、及びMMAEが挙げられる。オーリスタチン誘導体の合成及び構造は、米国特許出願公開第2003-0083263号、第2005-0238649号、及び第2005-0009751号;国際特許公報WO 04/010957号、国際特許公報WO 02/088172号、及び米国特許第6,323,315号;第6,239,104号;第6,034,065号;第5,780,588号;第5,665,860号;第5,663,149号;第5,635,483号;第5,599,902号;第5,554,725号;第5,530,097号;第5,521,284号;第5,504,191号;第5,410,024号;第5,138,036号;第5,076,973号;第4,986,988号;第4,978,744号;第4,879,278号;第4,816,444号;並びに第4,486,414号に記載されている。
いくつかの実施態様において、該ペイロードは、放射性同位体ではない。いくつかの実施態様において、該ペイロードは、放射性ではない。
いくつかの実施態様において、該ペイロードは、代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、例えば、プリンアンタゴニスト(例えば、アゾチオプリン(azothioprine)もしくはミコフェノール酸モフェチル)、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤(例えば、メトトレキセート)、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット(poscarnet)、又はトリフルリジンであることができる。
他の実施態様において、該ペイロードは、タクロリムス、シクロスポリン、FU506、又はラパマイシンである。さらなる実施態様において、該薬物は、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、亜ヒ酸、ベキサロテン、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、クラドリビン、ダルベポエチンα、デニロイキンディフチトクス、デクスラゾキサン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピルビシン、エポエチンα、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン(MYLOTARG)、ゴセレリン、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンα-2a、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、メクロレタミン(meclorethamine)もしくはナイトロジェンマスタード、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、マイトマイシンC、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオネート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ(HERCEPTIN)、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、又はゾレドロネートである。
いくつかの実施態様において、該ペイロードは、免疫調節剤である。該免疫調節剤は、例えば、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、又はメトトレキセートであることができる。或いは、該免疫調節剤は、例えば、グルココルチコイド(例えば、コルチゾールもしくはアルドステロン)、又はグルココルチコイド類似体(例えば、プレドニソンもしくはデキサメタゾン)であることができる。
いくつかの実施態様において、該免疫調節剤は、抗炎症剤、例えば、アリールカルボン酸誘導体、ピラゾール含有誘導体、オキシカム誘導体、及びニコチン酸誘導体である。抗炎症剤のクラスとしては、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、5-リポキシゲナーゼ阻害剤、及びロイコトリエン受容体アンタゴニストが挙げられる。
好適なシクロオキシゲナーゼ阻害剤としては、メクロフェナム酸、メフェナム酸、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、フェンブフェン、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、スリンダク、テノキシカム、及びトルメチンが挙げられる。
好適なリポキシゲナーゼ阻害剤としては、レドックス阻害剤(例えば、カテコールブタン誘導体、ノルジヒドログアヤレト酸(NDGA)、マソプロコール、フェニドン、イアノパレン、インダゾリノン、ナファザトロム、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシルアミン)、並びに非レドックス阻害剤(例えば、ヒドロキチアゾール、メトキシアルキルチアゾール、ベンゾピラン及びその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウェリン酸及びボスウェリン酸のアセチル化誘導体、並びにシクロアルキル基で置換されたキノリンメトキシフェニル酢酸)、並びにレドックス阻害剤の前駆体が挙げられる。
他の好適なリポキシゲナーゼ阻害剤としては、抗酸化剤(例えば、フェノール、没食子酸プロピル、フラボノイド及び/又はフラボノイドを含有する天然の基質、フラボンのヒドロキシル化誘導体、フラボノール、ジヒドロケルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボール、カルコンの誘導体、4,2',4'-トリヒドロキシカルコン、オルト-アミノフェノール、N-ヒドロキシウレア、ベンゾフラノール、エブセレン、並びに還元セレノ酵素の活性を増大させる種)、鉄キレート化剤(例えば、ヒドロキサム酸及びその誘導体、N-ヒドロキシウレア、2-ベンジル-1-ナフトール、カテコール、ヒドロキシルアミン、カルノソールトロロックスC、カテコール、ナフトール、スルファサラジン、ジロイトン、5-ヒドロキシアントラニル酸、並びに4-(ω-アリールアルキル)フェニルアルカン酸)、イミダゾール含有化合物(例えば、ケトコナゾール及びイトラコナゾール)、フェノチアジン、並びにベンゾピラン誘導体が挙げられる。
さらに他の好適なリポキシゲナーゼ阻害剤としては、エイコサノイド(例えば、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸、及びドコサヘキサエン酸、並びにそれらのエステル、PGE1(プロスタグランジンE1)、PGA2(プロスタグランジンA2)、ビプロストール、15-モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、15-モノヒドロキシ-エイコサトリエン酸、及び15-モノヒドロキシエイコサペンタエン酸、並びにロイコトリエンB5、C5、及びD5)の阻害剤、カルシウム流を妨げる化合物、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン、ベラパミル、フスコシド、クルクミン、クロロゲン酸、コーヒー酸、5,8,11,14-エイコサテトラエン酸(ETYA)、ヒドロキシフェニルレチナミド、イオナパレン、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントロリン、バイカレイン、プロキシクロミル、チオエーテル、ジアリルスルフィド、並びにジ-(1-プロペニル)スルフィドが挙げられる。
ロイコトリエン受容体アンタゴニストとしては、カルシトリオール、オンタゾラスト、Bayer Bay-x-1005、Ciba-Geigy CGS-25019C、エブセレン、Leo Denmark ETH-615、Lilly LY-293111、Ono ONO-4057、Terumo TMK-688、Boehringer Ingleheim BI-RM-270、Lilly LY 213024、Lilly LY 264086、Lilly LY 292728、Ono ONO LB457、Pfizer 105696、Perdue Frederick PF 10042、Rhone-Poulenc Rorer RP 66153、SmithKline Beecham SB-201146、SmithKline Beecham SB-201993、SmithKline Beecham SB-209247、Searle SC-53228、Sumitamo SM 15178、American Home Products WAY 121006、Bayer Bay-o-8276、Warner-Lambert CI-987、Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982、Lilly LY 233569、Lilly LY-255283、MacroNex MNX-160、Merck and Co. MK-591、Merck and Co. MK-886、Ono ONO-LB-448、Purdue Frederick PF-5901、Rhone-Poulenc Rorer RG14893、Rhone-Poulenc Rorer RP 66364、Rhone-Poulenc Rorer RP 69698、Shionoogi S-2474、Searle SC-41930、Searle SC-50505、Searle SC-51146、Searle SC-52798、SmithKline Beecham SK&F-104493、Leo Denmark SR-2566、Tanabe T-757、及びTeijin TEI-1338が挙げられる。
他の有用な薬物ペイロードには、癌の治療において有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例としては、エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)、Genentech/OSI Pharm.)、ボルテゾミブ(VELCADE(登録商標)、Millennium Pharm.)、フルベストラント(FASLODEX(登録商標)、AstraZeneca)、ステント(SU11248、Pfizer)、レトロゾール(FEMARA(登録商標)、Novartis)、メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標)、Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、オキサリプラチン(Eloxatin(登録商標)、Sanofi)、5-FU(5-フルオロウラシル)、ロイコボリン、ラパマイシン(シロリムス、RAPAMUNE(登録商標)、Wyeth)、ラパチニブ(TYKERB(登録商標)、GSK572016、Glaxo Smith Kline)、ロナファルニブ(SCH 66336)、ソラフェニブ(BAY43-9006、Bayer Labs)、及びゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)、AstraZeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271; Sugen)、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミド;アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン(methylamelamines);アセトゲニン(特に、ブラタシン及びブラタシノン);カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン; CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む);クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体、KW-2189及びCB1-TM1を含む);エレウテロビン; パンクラチスタチン;サルコジクチイン;スポンギスタチン;ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロスウレア(nitrosureas)、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン;抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンγll(calicheamicin gammall)及びカリケアマイシンωll(calicheamicin omegall)(Angew Chem. Intl. Ed. Engl.(1994)33:183-186);ダインマイシンAを含むダインマイシン;ビスホスホネート、例えば、クロドロネート;エスペラマイシン;並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン(caminomycin)、カルジノフィリン、クロモマイシニス(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)(ドキソルビシン)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセート及び5-フルオロウラシル(5-FU); 葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート; プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアムニプリン(thiamniprine)、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補給剤、例えば、フロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド; アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デホファミン;デメコルシン;ジアジコン;エルホルミチン(elformithine);酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダイニン;メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン; PSK(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフラン(sizofuran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン; 2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA、及びアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、TAXOL(登録商標)(パクリタキセル; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE(登録商標)(Cremophor非含有)、パクリタキセルのアルブミン処理ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.)、及びTAXOTERE(登録商標)(ドキセタキセル; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);クロランムブシル(chloranmbucil); GEMZAR(登録商標)(ゲムシタビン); 6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン;ビンブラスチン;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン; NAVELBINE(登録商標)(ビノレルビン);ノバントロン;テニポシド;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;カペシタビン(XELODA(登録商標));イバンドロネート; CPT-11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えば、レチノイン酸;並びに上記のいずれかの医薬として許容し得る塩、酸、及び誘導体が挙げられる。
他の有用なペイロードとしては:(i)腫瘍に対するホルモン作用を調節もしくは阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン薬及び選択的エストロゲン受容体調節物質(SERM)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標);タモキシフェンクエン酸塩を含む)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケトキシフェン、LY117018、オナプリストン、及びFARESTON(登録商標)(トレミフィン(toremifine)クエン酸塩)など;(ii)副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、4(5)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)(メゲストロール酢酸塩)、AROMASIN(登録商標)(エキセメスタン; Pfizer)、ホルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)(ボロゾール)、FEMARA(登録商標)(レトロゾール; Novartis)、及びARIMIDEX(登録商標)(アナストロゾール; AstraZeneca)など;(iii)抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン;並びにトロキサシタビン(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体);(iv)タンパク質キナーゼ阻害剤;(v)脂質キナーゼ阻害剤;(vi)アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常細胞増殖に関係があるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、PKC-α、Ralf、及びH-Rasなど;(vii)リボザイム、例えば、VEGF発現阻害剤(例えば、ANGIOZYME(登録商標))及びHER2発現阻害剤;(viii)ワクチン、例えば、遺伝子療法ワクチン、例えば、ALLOVECTIN(登録商標)、LEUVECTIN(登録商標)、及びVAXID(登録商標); PROLEUKIN(登録商標)rIL-2;トポイソメラーゼ1阻害剤、例えば、LURTOTECAN(登録商標); ABARELIX(登録商標)rmRH;(ix)抗血管新生剤、例えば、ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標)、Genentech);並びに(x)上記のいずれかの医薬として許容し得る塩、酸、及び誘導体が挙げられる。他の抗血管新生剤としては、MMP-2(マトリックスメタロプロテイナーゼ2)阻害剤、MMP-9(マトリックスメタロプロテイナーゼ9)阻害剤、COX-II(シクロオキシゲナーゼII)阻害剤、及びVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。本化合物/組成物と組み合わせて使用することができるそのような有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、その全てが引用により完全に本明細書中に組み込まれている、WO 96/33172号、WO 96/27583号、EP 818442号、EP 1004578号、WO 98/07697号、WO 98/03516号、WO 98/34918号、WO 98/34915号、WO 98/33768号、WO 98/30566号、EP 606,046号、EP 931,788号、WO 90/05719号、WO 99/52910号、WO 99/52889号、WO 99/29667号、WO 99/07675号、EP 945864号、米国特許第5,863,949号、米国特許第5,861,510号、及びEP 780,386号に記載されている。VEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤の例としては、4-(4-ブロモ-2-フルオロアニリノ)-6-メトキシ-7-(1-メチルピペリジン-4-イルメトキシ)キナゾリン(ZD6474; WO 01/32651号の実施例2)、4-(4-フルオロ-2-メチルインドール-5-イルオキシ)-6-メトキシ-7-(3-ピロリジン-1-イルプロポキシ)-キナゾリン(AZD2171; WO 00/47212号の実施例240)、バタラニブ(PTK787; WO 98/35985号)、及びSU11248(スニチニブ; WO 01/60814号)、並びにPCT公開番号WO 97/22596号、WO 97/30035号、WO 97/32856号、及びWO 98/13354号に開示されているものなどの化合物)が挙げられる。
ある実施態様において、該ペイロードは、抗体又は抗体断片である。ある実施態様において、ペイロード抗体又は断片は、当業者によって認識される免疫グロブリン遺伝子のいずれかによってコードされていてもよい。免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)、δ、ε、並びにμ定常領域遺伝子、並びに免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。該用語には、当業者によって認識される全長抗体及び抗体断片、並びにそれらの変異体が含まれる。例示的な断片としては、Fv、Fc、Fab、及び(Fab')2、単鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域などが挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施態様において、該ペイロードは、1以上の水溶性ポリマーである。多種多様な巨大分子ポリマー及び他の分子を本発明の抗原結合ポリペプチドに連結して、抗体の生物学的特性を調節し、及び/又は抗体に新しい生物学的特性を与えることができる。これらの巨大分子ポリマーは、天然コードアミノ酸を介して、非天然コードアミノ酸を介して、又は天然もしくは非天然アミノ酸の任意の官能性置換基を介して、又は天然もしくは非天然アミノ酸に付加された任意の置換基もしくは官能基を介して、抗体に連結することができる。該ポリマーの分子量は、限定されないが、約100Da〜約100,000Da、又はそれ以上を含む、広範囲にわたるものであってもよい。
選択されるポリマーは、それを結合させるタンパク質が生理的環境などの水性環境で沈殿しないように水溶性であってもよい。該ポリマーは、分岐状であっても、非分岐状であってもよい。好ましくは、最終製品調製物の治療的使用のために、該ポリマーは、医薬として許容し得るものである。
抗体分子に対するポリエチレングリコール分子の割合は、反応混合物中のその濃度と同様、様々に異なる。一般に、最適比(最小限の余分な未反応タンパク質又はポリマーが存在するという点で反応の効率に関する)は、選択されるポリエチレングリコールの分子量によって、及び利用可能な反応基の数に基づいて決定することができる。分子量に関しては、一般に、ポリマーの分子量が大きければ大きいほど、タンパク質に結合させることができるポリマー分子の数は少ない。同様に、これらのパラメータを最適化する場合には、ポリマーの分岐を考慮に入れるべきである。一般に、分子量が大きければ大きいほど(又は分岐が多ければ多いほど)、ポリマー:タンパク質比は大きい。
水溶性ポリマーは、限定されないが、線状、フォーク状、又は分岐状を含む、任意の構造形態であってもよい。通常、水溶性ポリマーは、ポリ(アルキレングリコール)、例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG)であるが、他の水溶性ポリマーを利用することもできる。例として、PEGを用いて、本発明の特定の実施態様を説明する。
PEGは、市販されているか、又は当技術分野で周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合により調製することができる、周知の水溶性ポリマーである(Sandler及びKaroの文献、ポリマー合成(Polymer Synthesis)、Academic Press, New York, 第3巻、138〜161頁)。「PEG」という用語は、サイズ又はPEGの末端での修飾を問わず、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、抗体に連結される場合、式: XO-(CH2CH2O)=n-CH2CH2-Y(式中、nは、2〜10,000であり、Xは、H又は限定されないが、C1-4アルキルを含む末端修飾である)により表すことができる。
場合により、本発明で使用されるPEGは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わる、すなわち、Xが、H又はCH3(「メトキシPEG」)である。或いは、PEGは、反応基で終わり、それにより、二官能性ポリマーを形成することができる。典型的な反応基としては、20種の一般的なアミノ酸に見られる官能基と反応させるために一般に使用される反応基(限定されないが、マレイミド基、活性化カルボネート(限定されないが、p-ニトロフェニルエステルを含む)、活性化エステル(限定されないが、N-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェニルエステルを含む)、及びアルデヒドを含む)、並びに20種の一般的なアミノ酸に対して不活性であるが、非天然コードアミノ酸中に存在する補足的官能基(限定されないが、アジド基、アルキン基を含む)と特異的に反応する官能基を挙げることができる。上式でYにより示されるPEGのもう一方の末端は、天然又は非天然コードアミノ酸を介して抗原結合ポリペプチドに直接的又は間接的に結合することに留意されたい。例えば、Yは、ポリペプチドのアミン基(限定されないが、リジン又はN末端のεアミンを含む)へのアミド、カルバメート、又はウレア結合であってもよい。或いは、Yは、チオール基(限定されないが、システインのチオール基を含む)へのマレイミド結合であってもよい。或いは、Yは、20種の一般的なアミノ酸を介して通常は接近可能ではない残基への結合であってもよい。例えば、PEG上のアジド基を抗体上のアルキン基と反応させて、ヒュスゲン[3+2]付加環化生成物を形成させることができる。或いは、PEG上のアルキン基を非天然コードアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、類似の生成物を形成させることができる。いくつかの実施態様において、強い求核剤(限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含む)を、非天然コードアミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応させて、適宜、ヒドラゾン、オキシム、又はセミカルバゾンを形成させることができ、これらは、場合によっては、適当な還元剤による処理により、さらに還元することができる。或いは、強い求核剤を、非天然コードアミノ酸を介して抗体に組み込み、それを用いて、水溶性ポリマー中に存在するケトン又はアルデヒド基と優先的に反応させることができる。
PEGの任意の分子質量をほぼ望み通りに使用することができ、これには、限定されないが、約100ダルトン(Da)〜100,000Da、又はそれを上回る望み通りの質量が含まれる(限定されないが、0.1〜50kDa又は10〜40kDaを含む場合もある)。限定されないが、1〜100kDa(限定されないが、1〜50kDa又は5〜20kDaを含む)の範囲のMWを有する各々の鎖を有するPEG分子を含む分岐鎖PEGを使用することもできる。幅広いPEG分子は、限定されないが、引用により本明細書中に組み込まれている、Shearwater Polymers, Inc.カタログ、Nektar Therapeuticsカタログに記載されている。
通常、PEG分子の少なくとも1つの末端は、非天然コードアミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキン及びアジド部分を担持するPEG誘導体を用いて、PEGを本明細書に記載の非天然コードアミノ酸に結合させることができる。非天然コードアミノ酸がアジドを含む場合、PEGは、通常、[3+2]付加環化生成物の形成をもたらすアルキン部分か、又はアミド結合の形成をもたらすホスフィン基を含有する活性化PEG種(すなわち、エステル、カルボネート)かのいずれかを含有する。或いは、非天然コードアミノ酸がアルキンを含む場合、PEGは、通常、[3+2]ヒュスゲン付加環化生成物の形成をもたらすアジド部分を含有する。非天然コードアミノ酸がカルボニル基を含む場合、PEGは、通常、対応するヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾン結合の形成をそれぞれもたらすために、強力な求核剤(限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、又はセミカルバジド官能基を含む)を含む。他の代替例において、上記の反応基の方向が逆であるものを使用することができる、すなわち、非天然コードアミノ酸中のアジド部分を、アルキンを含有するPEG誘導体と反応させることができる。
いくつかの実施態様において、PEG誘導体を有する抗体変異体は、非天然コードアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応する化学官能基を含有する。
ある実施態様において、該ペイロードは、約800Da〜約100,000Daの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含むアジド又はアセチレン含有ポリマーである。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ(エチレングリコール)であることができる。しかしながら、限定されないが、ポリ(エチレン)グリコール並びにポリ(デキストラン)及びポリ(プロピレングリコール)を含む他の関連ポリマーを含む、多種多様な水溶性ポリマーもまた、本発明の実施における使用に好適であること、並びにPEG又はポリ(エチレングリコール)という用語の使用が、全てのそのような分子を包含し、及びそれらを含むことを意図するものであることが理解されるべきである。PEGという用語には、限定されないが、その全ての形態のポリ(エチレングリコール)が含まれ、これには、二官能性PEG、マルチアーム型PEG、誘導体化PEG、フォーク状PEG、分岐状PEG、懸垂PEG(すなわち、ポリマー骨格に懸垂している1以上の官能基を有するPEGもしくは関連ポリマー)、又はその中に分解可能な結合を有するPEGが含まれる。
ポリマー骨格は、線状又は分岐状であることができる。分岐状ポリマー骨格は、一般に、当技術分野で公知である。通常、分岐状ポリマーは、中央の分岐コア部分及び該中央の分岐コア部分に連結された複数の線状ポリマー鎖を有する。PEGは、一般に、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール、及びソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの付加により調製することができる分岐形態で使用される。中央の分岐部分は、リジンなどの数種のアミノ酸に由来することもできる。分岐状ポリ(エチレングリコール)は、R(-PEG-OH)mのような一般形態で表すことができ、ここで、Rは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、又はペンタエリスリトールなどのコア部分に由来し、mは、アームの数を表す。その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれている、米国特許第5,932,462号、第5,643,575号;第5,229,490号;第4,289,872号;米国特許出願第2003/0143596号; WO 96/21469号;及びWO 93/21259号に記載されているものなどのマルチアーム型PEG分子を、ポリマー骨格として使用することもできる。
分岐状PEGは、PEG(-YCHZ2)nによって表される、フォーク状PEGの形態であることもでき、ここで、Yは連結基であり、Zは、規定の長さの原子の鎖によってCHに連結された活性化末端基である。
また別の分岐形態である懸垂PEGは、PEG鎖の末端にではなく、PEG骨格に沿って、カルボキシルなどの反応基を有する。
これらの形態のPEGに加えて、ポリマーは、骨格中の弱い又は分解可能な結合を伴って調製することもできる。例えば、PEGは、加水分解を受けやすいポリマー骨格中のエステル結合を伴って調製することができる。以下に示すように、この加水分解によって、ポリマーからより低い分子量の断片への切断: -PEG-CO2-PEG-＋H2O→PEG-CO2H＋HO-PEG-が生じる。ポリ(エチレングリコール)又はPEGという用語が、限定されないが、本明細書に開示されているものを含む、当技術分野で公知の全ての形態を表し、又はそれを含むことが当業者によって理解される。
多くの他のポリマーもまた、本発明での使用に好適である。いくつかの実施態様において、2〜約300の末端を有する水溶性のポリマー骨格は、本発明において特に有用である。好適なポリマーの例としては、他のポリ(アルキレングリコール)、例えば、ポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)、そのコポリマー(限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーを含む)、そのターポリマー、その混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各々の鎖の分子量は様々に異なり得るが、それは、通常、約800Da〜約100,000Da、時に、約6,000Da〜約80,000Daの範囲である。
当業者は、実質的に水溶性の骨格についての前述のリストが決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであるということ、及び上記の性質を有する全てのポリマー材料が本発明での使用に好適なものと想定されるということを認識しているであろう。
本発明のいくつかの実施態様において、ポリマー誘導体は「多官能性」であり、これは、ポリマー骨格が、官能基で官能化又は活性化された、少なくとも2つの末端、場合によっては、約300もの末端を有することを意味する。多官能性ポリマー誘導体には、限定されないが、各々の末端が官能基に結合している、2つの末端を有する線状ポリマーが含まれ、該官能基は、同じものであっても、異なるものであってもよい。
一実施態様において、ポリマー誘導体は、構造: X-A-POLY-B-N=N=Nを有し、ここで: N=N=Nは、アジド部分であり; Bは、連結部分であり、これは、存在していても、存在していなくてもよく; POLYは、水溶性の非抗原性ポリマーであり; Aは、連結部分であり、これは、存在していても、存在していなくてもよく、また、Bと同じものであっても、異なるものであってもよく; Xは、第二の官能基である。A及びBの連結部分の例としては、最大18個、より好ましくは、1〜10個の炭素原子を含有する多重官能化アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。窒素、酸素、又は硫黄などのヘテロ原子をアルキル鎖とともに含めることができる。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分岐していてもよい。A及びBの連結部分の他の例としては、最大10個、より好ましくは、5〜6個の炭素原子を含有する多重官能化アリール基が挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、もう1つの炭素原子、窒素、酸素、又は硫黄原子で置換されていてもよい。好適な連結基の他の例としては、その各々が引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第5,932,462号;第5,643,575号;及び米国特許出願公開第2003/0143596号に記載されている連結基が挙げられる。当業者は、連結部分についての前述のリストが決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであるということ、及び上記の性質を有する全ての連結部分が本発明での使用に好適であることが想定されるということを認識しているであろう。
Xとして使用するための好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えば、N-ヒドロキシスクシニミジルエステル及び1-ベンゾトリアゾリルエステル、活性カルボネート、例えば、N-ヒドロキシスクシニミジルカルボネート及び1-ベンゾトリアゾリルカルボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサル、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート(tresylate)、アルケン、ケトン、及びアジドが挙げられるが、これらに限定されない。当業者によって理解されるように、選択されたX部分は、アジド基との反応が起こらないように、アジド基と適合性であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、第二の官能基(すなわち、X)もアジド部分であるということを意味するホモ二官能性であってもよく、又は第二の官能基が異なる官能基であるということを意味するヘテロ二官能性であってもよい。
「保護された」という用語は、特定の反応条件下で化学反応性官能基の反応を防止する保護基又は部分の存在を指す。保護基は、保護されている化学反応性基の種類によって異なる。例えば、化学反応性基がアミン又はヒドラジドである場合、保護基は、tert-ブチルオキシカルボニル(t-Boc)及び9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)の群から選択されることができる。化学反応性基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであることができる。化学反応性基が、ブタン酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸、又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル、又はメチル、エチル、もしくはtert-ブチルなどのアルキル基であることができる。当技術分野で公知の他の保護基を、本発明で使用することもできる。
文献中の末端官能基の具体的な例としては、N-スクシニミジルカルボネート(例えば、米国特許第5,281,698号、第5,468,478号を参照のこと)、アミン(例えば、Buckmannらの文献、Makromol. Chem. 182:1379(1981)、Zaplipskyらの文献、Eur. Polym. J. 19:1177(1983)を参照のこと)、ヒドラジド(例えば、Andreszらの文献、Makromol. Chem. 179:301(1978)を参照のこと)、スクシニミジルプロピオネート及びスクシニミジルブタノエート(例えば、Olsonらの文献、ポリエチレン(グリコール)の化学及び生物学的応用(Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications)、170〜181頁、Harris & Zaplipsky編、ACS, Washington, D.C., 1997を参照のこと;米国特許第5,672,662号も参照のこと)、スクシニミジルスクシネート(例えば、Abuchowskiらの文献、Cancer Biochem. Biophys. 7:175(1984)及びJoppichらの文献、Macrolol. Chem. 180:1381(1979)を参照のこと)、スクシニミジルエステル(例えば、米国特許第4,670,417号を参照のこと)、ベンゾトリアゾールカルボネート(例えば、米国特許第5,650,234号を参照のこと)、グリシジルエーテル(例えば、Pithaらの文献、Eur. J Biochem. 94:11(1979)、Ellingらの文献、Biotech. Appl. Biochem. 13:354(1991)を参照のこと)、オキシカルボニルイミダゾール(例えば、Beauchampらの文献、Anal. Biochem. 131:25(1983)、Tondelliらの文献、J. Controlled Release 1:251(1985)を参照のこと)、p-ニトロフェニルカルボネート(例えば、Veroneseらの文献、Appl. Biochem. Biotech., 11: 141(1985);及びSartoreらの文献、Appl. Biochem. Biotech., 27:45(1991)を参照のこと)、アルデヒド(例えば、Harrisらの文献、J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341(1984)、米国特許第5,824,784号、米国特許第5,252,714号を参照のこと)、マレイミド(例えば、Goodsonらの文献、Bio/Technology 8:343(1990)、Romaniらの文献、Chemistry of Peptides and Proteins 2:29(1984)、並びにKoganの文献、Synthetic Comm. 22:2417(1992)を参照のこと)、オルトピリジル-ジスルフィド(例えば、Woghirenらの文献、Bioconj. Chem. 4:314(1993)を参照のこと)、アクリロール(acrylol)(例えば、Sawhneyらの文献、Macromolecules, 26:581(1993)を参照のこと)、ビニルスルホン(例えば、米国特許第5,900,461号を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献及び特許は全て、引用により本明細書中に組み込まれる。
本発明のある実施態様において、本発明のポリマー誘導体は、構造: X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N=N=Nを有するポリマー骨格を含み、ここで: Xは、上記の官能基であり; nは、約20〜約4000である。別の実施態様において、本発明のポリマー誘導体は、構造: X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH-2)m-W-N=N=Nを有するポリマー骨格を含み、ここで: Wは、1〜10個の炭素原子を含む脂肪族又は芳香族リンカー部分であり; nは、約20〜約4000であり; Xは、上記の官能基であり; mは、1〜10である。
本発明のアジド含有PEG誘導体は、当技術分野で公知の及び/又は本明細書に開示される種々の方法によって調製することができる。以下に示すある方法において、約800Da〜約100,000Daの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、第一の官能基に結合した第一の末端及び好適な脱離基に結合した第二の末端を有するポリマー骨格を、アジドアニオン(これは、ナトリウム、カリウム、tert-ブチルアンモニウムなどを含む、いくつかの好適な対イオンのいずれかと対合し得る)と反応させる。該脱離基が、求核置換を受け、アジド部分と置き換えられると、次に示すように、所望のアジド含有PEGポリマーが得られる: X-PEG-L＋N3 -→X-PEG-N3。
示したように、本発明での使用に好適なポリマー骨格は、式X-PEG-Lを有し、式中、PEGは、ポリ(エチレングリコール)であり、Xは、アジド基と反応しない官能基であり、Lは、好適な脱離基である。好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護アミン、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン、及びビニルピリジン、並びにケトンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な脱離基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、及びトシレートが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の別の調製方法において、アジド官能基を担持する連結剤を、約800Da〜約100,000Daの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格と接触させ、その場合、該連結剤は、PEGポリマー上の化学官能基と選択的に反応する化学官能基を担持して、アジド含有ポリマー誘導体生成物を形成し、ここで、該アジドは、連結基によってポリマー骨格から分離されている。
例示的な反応スキームを以下に示す: X-PEG-M＋N-リンカー-N=N=N→PG-X-PEG-リンカー-N=N=N(ここで: PEGは、ポリ(エチレングリコール)であり、Xは、アルコキシなどのキャッピング基又は上記の官能基であり; Mは、アジド官能基と反応しないが、N官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である)。
好適な官能基の例としては、Nがアミンである場合、カルボン酸、カルボネート、又は活性エステルであるM; Nが、ヒドラジド又はアミノオキシ部分である場合、ケトンであるM; Nが求核剤である場合、脱離基であるMが挙げられるが、これらに限定されない。
粗生成物の精製は、既知の方法によって達成することができ、該方法には、生成物の沈殿と、必要であれば、それに続くクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
より具体的な例をPEGジアミンについて以下に示す。該例では、アミンのうちの1つをtert-ブチル-Bocなどの保護基部分により保護し、生じるモノ-保護PEGジアミンを、アジド官能基を担持する連結部分と反応させる: BocHN-PEG-NH2＋HO2C-(CH2)3-N=N=N。
この場合、アミン基を、塩化チオニル又はカルボジイミド試薬及びN-ヒドロキシスクシンイミド又はN-ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの種々の活性化剤を用いて、カルボン酸基にカップリングさせて、モノアミンPEG誘導体とアジド担持リンカー部分との間にアミド結合を作り出すことができる。アミド結合の形成に成功した後、得られるN-tert-ブチル-Boc-保護アジド含有誘導体を直接的に用いて、生体活性分子を修飾することができるか、又はそれをさらに精巧化して、他の有用な官能基を導入することができる。例えば、N-t-Boc基を強酸による処理によって加水分解して、ω-アミノ-PEG-アジドを生成させることができる。得られるアミンを合成ハンドルとして用いて、有益なヘテロ二官能性試薬の作出のための他の有用な官能基、例えば、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなどを導入することができる。
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各々の末端に異なる分子を結合させることが望ましい場合、特に有用である。例えば、ω-N-アミノ-N-アジドPEGは、例えば、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カルボネートなどの活性化求電子基を有する分子のPEGの一方の末端への結合、及びアセチレン基を有する分子のPEGのもう一方の末端への結合を可能にするであろう。
本発明の別の実施態様において、ポリマー誘導体は、構造: X-A-POLY-B-C=C-Rを有し、ここで: Rは、H、或いはアルキル、アルケン、アルキオキシ(alkyoxy)、又はアリールもしくは置換アリール基のいずれかであることができ; Bは、連結部分であり、これは、存在していても、存在していなくてもよく; POLYは、水溶性の非抗原性ポリマーであり; Aは、連結部分であり、これは、存在していても、存在していなくてもよく、また、Bと同じものであっても、異なるものであってもよく; Xは、第二の官能基である。
A及びBの連結部分の例としては、最大18個、より好ましくは、1〜10個の炭素原子を含有する多重官能化アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。窒素、酸素、又は硫黄などのヘテロ原子をアルキル鎖とともに含めることができる。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分岐していてもよい。A及びBの連結部分の他の例としては、最大10個、より好ましくは、5〜6個の炭素原子を含有する多重官能化アリール基が挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、もう1つの炭素原子、窒素、酸素、又は硫黄原子で置換されていてもよい。好適な連結基の他の例としては、その各々が引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第5,932,462号及び第5,643,575号並びに米国特許出願公開第2003/0143596号に記載されている連結基が挙げられる。当業者は、連結部分についての前述のリストが決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであることが意図されるということ、及び上記の性質を有する多種多様な連結部分が本発明において有用であることが想定されるということを認識しているであろう。
Xとして使用するための好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えば、N-ヒドロキシスクシニミジルエステル及び1-ベンゾトリアゾリルエステル、活性カルボネート、例えば、N-ヒドロキシスクシニミジルカルボネート及び1-ベンゾトリアゾリルカルボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサル、ジオン、メシレート、トシレート、及びトレシレート、アルケン、ケトン、並びにアセチレンが挙げられるが、これらに限定されない。理解されるように、選択されたX部分は、アセチレン基との反応が起こらないように、アセチレン基と適合性であるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、第二の官能基(すなわち、X)もアセチレン部分であるということを意味するホモ二官能性であってもよく、又は第二の官能基が異なる官能基であるということを意味するヘテロ二官能性であってもよい。
本発明の別の実施態様において、ポリマー誘導体は、構造: X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C=CHを有するポリマー骨格を含み、ここで: Xは、上記の官能基であり; nは、約20〜約4000であり; mは、1〜10である。ヘテロ二官能性PEGポリマー各々の具体的な例は、以下に示されている。
本発明のアセチレン含有PEG誘導体は、当業者に公知の及び/又は本明細書に開示される方法を用いて調製することができる。ある方法において、約800Da〜約100,000Daの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、第一の官能基に結合した第一の末端及び好適な求核基に結合した第二の末端を有するポリマー骨格を、アセチレン官能基と、PEG上の求核基との反応に好適な脱離基の両方を担持する化合物と反応させる。求核部分を担持するPEGポリマーと脱離基を担持する分子を組み合わせたとき、該脱離基が、求核置換を受け、求核部分と置き換えられると、所望のアセチレン含有ポリマーが得られる: X-PEG-Nu＋L-A-C→X-PEG-Nu-A-C=CR'。
示したように、該反応において使用するための好ましいポリマー骨格は、式X-PEG-Nuを有し、式中、PEGは、ポリ(エチレングリコール)であり、Nuは、求核部分であり、Xは、Nu、L、又はアセチレン官能基と反応しない官能基である。
Nuの例としては、主にSN2型機構を介して反応する、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジド、アミノオキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。Nu基の追加の例としては、主に求核付加反応を介して反応する官能基が挙げられる。L基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、及びトシレート、並びに求核置換を受けると考えられる他の基、並びにケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、α-β不飽和カルボニル基、カルボネート、及び求核剤による付加を受けると考えられる他の求電子基が挙げられる。
本発明の別の実施態様において、Aは、1〜10個の炭素原子の脂肪族リンカー又は6〜14個の炭素原子の置換アリール環である。Xは、アジド基と反応しない官能基であり、Lは、好適な脱離基である。
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の別の調製方法において、約800Da〜約100,000Daの平均分子量を有し、保護官能基又はキャッピング剤のいずれかを一方の末端に、及び好適な脱離基をもう一方の末端に担持するPEG ポリマーを、アセチレンアニオンにより接触させる。
水溶性ポリマーを本発明の抗体に連結することができる。水溶性ポリマーを、抗体に組み込まれた非天然コードアミノ酸、又は非天然コードもしくは天然コードアミノ酸の任意の官能基もしくは置換基、又は非天然コードもしくは天然コードアミノ酸に付加された任意の官能基もしくは置換基を介して連結してもよい。或いは、水溶性ポリマーを、天然アミノ酸(限定されないが、システイン、リジン、又はN末端残基のアミン基を含む)を介して非天然コードアミノ酸を組み込んでいる抗原結合ポリペプチドに連結する。場合により、本発明の抗体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の非天然アミノ酸を含み、その場合、1以上の非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマー(複数可)(限定されないが、PEG及び/又は多糖を含む)に連結されている。場合により、本発明の抗体は、水溶性ポリマーに連結された、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれより多くの天然コードアミノ酸をさらに含む。場合により、本発明の抗体は、水溶性ポリマーに連結された1以上の非天然コードアミノ酸及び水溶性ポリマーに連結された1以上の天然アミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、本発明で使用される水溶性ポリマーは、非コンジュゲート型形態と比べて抗体の血清半減期を向上させる。
本発明の抗原結合ポリペプチドに連結される水溶性ポリマーの数(すなわち、PEG化又はグリコシル化の程度)は、インビボ半減期などの、薬理学的、薬物動態学的、又は薬力学的特性の変化(限定されないが、増加又は減少を含む)をもたらすように調整することができる。いくつかの実施態様において、抗体の半減期は、未修飾のポリペプチドと比べて、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90パーセント、2倍、5倍、10倍、50倍、又は少なくとも約100倍増加している。
本発明の一実施態様において、カルボニル含有非天然コードアミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドは、PEG骨格に直接連結されている末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、又はセミカルバジド部分を含有するPEG誘導体で修飾される。
いくつかの実施態様において、ヒドロキシルアミン末端PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である(すなわち、平均分子量は、5〜40kDaである)。
いくつかの実施態様において、ヒドラジン又はヒドラジド含有PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000であり、Xは、任意に、存在しても存在しなくてもよいカルボニル基(C=O)である。
いくつかの実施態様において、セミカルバジド含有PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である。
本発明の別の実施態様において、カルボニル含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドは、アミド結合によってPEG骨格に連結されている末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン、又はセミカルバジド部分を含有するPEG誘導体で修飾される。
いくつかの実施態様において、ヒドロキシルアミン末端PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である(すなわち、平均分子量は、5〜40kDaである)。
いくつかの実施態様において、ヒドラジン又はヒドラジド含有PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000であり、Xは、任意に、存在しても存在しなくてもよいカルボニル基(C=O)である。
いくつかの実施態様において、セミカルバジド含有PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である。
本発明の別の実施態様において、カルボニル含有アミノ酸を含む抗体は、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、又はセミカルバジド部分を含有する分岐状PEG誘導体で修飾され、該分岐状PEGの各々の鎖は、10〜40kDa、より好ましくは、5〜20kDaの範囲のMWを有する。
本発明の別の実施態様において、非天然コードアミノ酸を含む抗体は、分岐した構造を有するPEG誘導体で修飾される。例えば、いくつかの実施態様において、ヒドラジン又はヒドラジド末端PEG誘導体は、以下の構造: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH- 2)m-X-NH-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000であり、Xは、任意に、存在しても存在しなくてもよいカルボニル基(C=O)である。
いくつかの実施態様において、セミカルバジド基を含有するPEG誘導体は、構造: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、Xは、任意に、NH、O、S、C(O)であるか、又は存在せず、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である。
いくつかの実施態様において、ヒドロキシルアミン基を含有するPEG誘導体は、構造: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、Xは、任意に、NH、O、S、C(O)であるか、又は存在せず、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である。
水溶性ポリマー(複数可)が抗体に連結される程度及び部位は、抗体の抗原又は受容体への結合を調節することができる。
ポリマーの活性化のための及びペプチドのコンジュゲーションのための方法及び化学は、文献に記載されており、当技術分野で公知である。ポリマーの活性化のための一般に使用される方法としては、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド(biepoxide)、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基の活性化が挙げられるが、これらに限定されない(R. F. Taylorの文献(1991)、タンパク質固定化。基礎及び応用(PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS)、Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wongの文献(1992)、タンパク質コンジュゲーション及び架橋の化学(CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING)、CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermansonらの文献(1993)、固定化親和性リガンド技術(IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES)、Academic Press, N.Y.; Dunn, R. L.ら編、高分子薬物及び薬物送達系(POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS)、ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991を参照されたい)。
PEGの官能化及びコンジュゲーションに関するいくつかの総説及び研究論文が入手可能である。例えば、Harrisの文献、Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373(1985); Scoutenの文献、Methods in Enzymology 135: 30-65(1987); Wongらの文献、Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874(1992); Delgadoらの文献、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304(1992); Zalipskyの文献、Bioconjugate Chem. 6: 150-165(1995)を参照されたい。
ポリマーの活性化のための方法は、WO 94/17039号、米国特許第5,324,844号、WO 94/18247号、WO 94/04193号、米国特許第5,219,564号、米国特許第5,122,614号、WO 90/13540号、米国特許第5,281,698号、及びWO 93/15189号にも見出すことができ、また、活性化ポリマーと、限定されないが、凝固因子VIII(WO 94/15625号)、ヘモグロビン(WO 94/09027号)、酸素運搬分子(米国特許第4,412,989号)、リボヌクレアーゼ、及びスーパーオキシドジスムターゼ(Veroneseらの文献、App. Biochem. Biotech. 11: 141-45(1985))を含む酵素とのコンジュゲーションのための方法も見出される。引用された参考文献及び特許は全て、引用により本明細書中に組み込まれる。
p-アジド-L-フェニルアラニンなどの非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドのPEG化(すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加)は、任意の好都合な方法によって実施される。例えば、抗体は、アルキン末端を有するmPEG誘導体でPEG化される。簡潔に述べると、過剰の固体mPEG(5000)-O-CH2-C=CHを、撹拌しながら、p-アジド-L-Phe含有抗体の水溶液に室温で添加する。通常、該水溶液を、反応が実施されることになるpH(通常、約pH 4〜10)付近のpKaを有するバッファーで緩衝化する。例えば、pH 7.5でのPEG化のための好適なバッファーの例としては、HEPES、リン酸塩、ホウ酸塩、TRIS-HCl、EPPS、及びTESが挙げられるが、これらに限定されない。pHを絶えずモニタリングし、必要であれば、調整する。反応は、通常、約1〜48時間持続させておく。
その後、反応生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけて、PEG化抗体変異体を遊離mPEG(5000)-O-CH2-C=CH及びペグ化抗体の任意の高分子量複合体から分離する。該高分子量複合体は、ブロックされていないPEGが分子の両端で活性化され、それにより、抗体変異体分子を架橋するときに形成され得る。疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける条件は、遊離mPEG(5000)-O-CH2-C=CHがカラムを通過し、その一方で、架橋されたPEG化抗体変異体複合体は、1以上のPEG基にコンジュゲートされた1つの抗体変異体分子を含有する所望の形態の後に溶出するようなものである。好適な条件は、所望のコンジュゲートに対する架橋された複合体の相対的なサイズによって異なり、当業者によって容易に決定される。所望のコンジュゲートを含有する溶出液は、限外濾過によって濃縮され、透析濾過によって脱塩される。
必要であれば、疎水性クロマトグラフィーから得られたPEG化抗体を、限定されないが、親和性クロマトグラフィー;陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー(限定されないが、DEAE SEPHAROSEなどを使用するものを含む);シリカゲル上でのクロマトグラフィー;逆相HPLC;ゲル濾過(限定されないが、SEPHADEX G-75などを使用するものを含む);疎水性相互作用クロマトグラフィー;サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー;限外濾過/透析濾過;エタノール沈殿;硫酸アンモニウム沈殿;クロマト分画法;置換クロマトグラフィー;電気泳動法(限定されないが、分取等電点分画法を含む)、示差溶解性(限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む)、又は抽出を含む、当業者に公知の1以上の手順によってさらに精製することができる。見掛けの分子量は、球状タンパク質標準との比較により、GPCによって推定することができる(タンパク質精製法、実践的アプローチ(PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH)(Harris & Angal編) IRL Press 1989, 293-306)。抗体-PEGコンジュゲートの純度は、タンパク質分解(限定されないが、トリプシン分解を含む)と、それに続く、質量分光分析法によって評価することができる。Pepinsky B.らの文献、J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66(2001)。
本発明の抗体のアミノ酸に連結された水溶性ポリマーを、無制限に、さらに誘導体化又は置換することができる。
本発明の別の実施態様において、抗原結合ポリペプチドは、非天然コードアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するPEG誘導体で修飾される。一般に、PEG誘導体は、1〜100kDa、及びいくつかの実施態様において、10〜40kDaの範囲の平均分子量を有する。
いくつかの実施態様において、アジド末端PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である(すなわち、平均分子量は、5〜40kDaである)。
別の実施態様において、アジド末端PEG誘導体は、構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、pは、2〜10であり、nは、100〜1,000である(すなわち、平均分子量は、5〜40kDaである)。
本発明の別の実施態様において、アルキン含有アミノ酸を含む抗体は、末端アジド部分を含有する分岐状PEG誘導体で修飾され、該分岐状PEGの各々の鎖は、10〜40kDa、より好ましくは、5〜20kDaの範囲のMWを有する。例えば、いくつかの実施態様において、アジド末端PEG誘導体は、以下の構造: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH- 2)m-X-(CH2)p-N3を有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、pは、2〜10であり、nは、100〜1,000であり、Xは、任意に、O、N、S、又はカルボニル基(C=O)であり、いずれの場合にも、これらは存在しても存在しなくてもよい。
本発明の別の実施態様において、抗原結合ポリペプチドは、非天然コードアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有するPEG誘導体で修飾される。
いくつかの実施態様において、アルキン末端PEG誘導体は、以下の構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C=CHを有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、nは、100〜1,000である(すなわち、平均分子量は、5〜40kDaである)。
本発明の別の実施態様において、アルキン含有非天然コードアミノ酸を含む抗体は、アミド結合によってPEG骨格に連結されている末端アジド又は末端アルキン部分を含有するPEG誘導体で修飾される。
いくつかの実施態様において、アルキン末端PEG誘導体は、以下の構造: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C=CHを有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、pは、2〜10であり、nは、100〜1,000である。
本発明の別の実施態様において、アジド含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドは、末端アルキン部分を含有する分岐状PEG誘導体で修飾され、該分岐状PEGの各々の鎖は、10〜40kDa、より好ましくは、5〜20kDaの範囲のMWを有する。例えば、いくつかの実施態様において、アルキン末端PEG誘導体は、以下の構造: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH- 2)m-X-(CH2)pC=CHを有し、ここで、Rは、単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど)であり、mは、2〜10であり、pは、2〜10であり、nは、100〜1,000であり、Xは、任意に、O、N、S、もしくはカルボニル基(C=O)であるか、又は存在しない。
本発明の別の実施態様において、抗体は、非天然コードアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む、活性化官能基(限定されないが、エステル、カルボネートを含む)を含有するPEG誘導体で修飾される。一般に、該PEG誘導体は、1〜100kDa、及びいくつかの実施態様において、10〜40kDaの範囲の平均分子量を有する。
抗体に連結し得る他の例示的なPEG分子、及びPEG化方法としては、例えば、引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2004/0001838号;第2002/0052009号;第2003/0162949号;第2004/0013637号;第2003/0228274号;第2003/0220447号;第2003/0158333号;第2003/0143596号;第2003/0114647号;第2003/0105275号;第2003/0105224号;第2003/0023023号;第2002/0156047号;第2002/0099133号;第2002/0086939号;第2002/0082345号;第2002/0072573号;第2002/0052430号;第2002/0040076号;第2002/0037949号;第2002/0002250号;第2001/0056171号;第2001/0044526号;第2001/0027217号;第2001/0021763号;米国特許第6,646,110号;第5,824,778号;第5,476,653号;第5,219,564号;第5,629,384号;第5,736,625号;第4,902,502号;第5,281,698号;第5,122,614号;第5,473,034号;第5,516,673号;第5,382,657号;第6,552,167号;第6,610,281号;第6,515,100号;第6,461,603号;第6,436,386号;第6,214,966号;第5,990,237号;第5,900,461号;第5,739,208号;第5,672,662号;第5,446,090号;第5,808,096号;第5,612,460号;第5,324,844号;第5,252,714号;第6,420,339号;第6,201,072号;第6,451,346号;第6,306,821号;第5,559,213号;第5,612,460号;第5,747,646号;第5,834,594号;第5,849,860号;第5,980,948号;第6,004,573号;第6,129,912号; WO 97/32607号、EP 229,108号、EP 402,378号、WO 92/16555号、WO 94/04193号、WO 94/14758号、WO 94/17039号、WO 94/18247号、WO 94/28024号、WO 95/00162号、WO 95/11924号、W095/13090号、WO 95/33490号、WO 96/00080号、WO 97/18832号、WO 98/41562号、WO 98/48837号、WO 99/32134号、WO 99/32139号、WO 99/32140号、WO 96/40791号、WO 98/32466号、WO 95/06058号、EP 439 508号、WO 97/03106号、WO 96/21469号、WO 95/13312号、EP 921 131号、号、WO 98/05363号、EP 809 996号、WO 96/41813号、WO 96/07670号、EP 605 963号、EP 510 356号、EP 400 472号、EP 183 503号、及びEP 154 316号に記載されているものが挙げられる。本明細書に記載のPEG分子はいずれかも、限定されないが、単鎖、分岐鎖、多腕鎖、単官能性、二官能性、多官能性、又はそれらの任意の組合せを含む、任意の形態で使用することができる。
ある実施態様において、抗体は、非天然アミノ酸と反応することができる1以上のリンカーとともにペイロードに連結することができる。該1以上のリンカーは、当業者に明らかな任意のリンカーであることができる。「リンカー」という用語は、通常は化学反応の結果として形成され、典型的には共有結合である基又は結合を指すために本明細書で使用される。加水分解的に安定な結合とは、該結合が、水中で実質的に安定であり、限定されないが、生理的条件下を含む、有用なpH値で、長期間、もしかすると無制限とさえ言える期間、水と反応しないことを意味する。加水分解的に不安定な又は加水分解的に分解可能な結合とは、該結合が、水中で、又は例えば、血液を含む水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定な又は酵素的に分解可能な結合とは、該結合が1以上の酵素によって分解され得ることを意味する。当技術分野で理解されているように、PEG及び関連ポリマーは、ポリマー骨格中に、又はポリマー分子のポリマー骨格と末端官能基の1つもしくは複数との間のリンカー基中に分解可能な結合を含み得る。例えば、PEGカルボン酸又は活性化PEGカルボン酸と生体活性物質上のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、通常、生理的条件下で加水分解して、該薬剤を放出する。他の加水分解的に分解可能な結合としては、カルボネート結合;アミンとアルデヒドの反応によって生じるイミン結合;アルコールとリン酸基とを反応させることによって形成されるリン酸エステル結合;ヒドラジドとアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾン結合;アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール結合;ギ酸エステルとアルコールの反応生成物であるオルトエステル結合;限定されないが、PEGなどのポリマーの末端にあるものを含む、アミン基と、ペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド結合;及び限定されないが、ポリマーの末端にあるものを含む、ホスホロアミダイト基と、オリゴヌクレオチドの5'ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられるが、これらに限定されない。分岐状リンカーを本発明の抗体で使用してもよい。いくつかの異なる切断可能リンカーが当業者に公知である。米国特許第4,618,492号;第4,542,225号、及び第4,625,014号を参照されたい。これらのリンカー基からの薬剤の放出のメカニズムとしては、例えば、光解離性結合の照射及び酸触媒加水分解が挙げられる。例えば、米国特許第4,671,958号には、インビボの標的部位で患者の補体系のタンパク質分解酵素によって切断されるリンカーを含む免疫コンジュゲートの説明が含まれている。リンカーの長さは、抗体とそれに連結される分子との所望の空間関係によって予め決定され、又は選択され得る。種々の放射線診断化合物、放射線治療化合物、薬物、毒素、及び他の薬剤を抗体に結合させるための報告されている多数の方法を考慮して、当業者は、所与の薬剤を抗体に結合させるための好適な方法を決定することができるであろう。
任意のヘテロ又はホモ二官能性リンカーを用いて、コンジュゲートを連結することができる。該リンカーは、幅広い分子量又は分子長を有することができる。より高分子量の又はより低分子量のリンカーを用いて、抗体と連結される実体との間の所望の空間関係又は立体構造を提供することができる。より長い又はより短い分子長を有するリンカーを用いて、抗体と連結される実体との間の所望の空間又は柔軟性を提供することもできる。同様に、特定の形状又は立体構造を有するリンカーを利用して、抗体がその標的に到達する前後のどちらかに、抗体又は連結される実体に特定の形状又は立体構造を与えることができる。リンカーの各々の末端に存在する官能基を、所望の条件下での抗体又はペイロードの放出を調節するように選択することができる。抗体と連結される実体との間の空間関係のこのような最適化は、新しい、調節された、又は所望の特性を分子に与えることができる。
いくつかの実施態様において、本発明は: a)ポリマー骨格の少なくとも第一の末端上のアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、又はカルボニル含有部分;及びb)ポリマー骨格の第二の末端上の少なくとも第二の官能基を含む亜鈴構造を有する水溶性の二官能性リンカーを提供する。第二の官能基は、第一の官能基と同じものであっても、異なるものであってもよい。第二の官能基は、いくつかの実施態様において、第一の官能基と反応しない。本発明は、いくつかの実施態様において、分岐状分子構造の少なくとも1つのアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、分岐状分子構造は、樹状であることができる。
(親抗体)
親抗体は、限定するものではないが、当業者に公知の又は後に発見される任意の抗体であることができる。親抗体は、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、サル、特に哺乳動物、特にヒト並びに特にマウス及びラットを含む、任意の生物体由来の抗体遺伝子(単数)又は抗体遺伝子(複数)によって実質的にコードされていてもよい。一実施態様において、親抗体は、例えば、患者もしくは対象から、トランスジェニックマウスもしくは他の動物を用いることによって(Bruggemann及びTaussigの文献、1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458)、又は選択方法と併用されるヒト抗体ライブラリーを用いることによって(Griffiths及びDuncanの文献、1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:102-108)得られる、完全にヒトのものであり得る。親抗体は、人工又は天然を含む、任意の源に由来するものであってもよい。例えば、親抗体は、限定されないが、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む、改変抗体であるか(Clarkの文献、2000, Immunol. Today 21:397-402)、又はコンビナトリアルライブラリーに由来するものであることができる。さらに、親抗体は、1以上の天然抗体遺伝子によって実質的にコードされる抗体の改変変異体であってもよい。例えば、一実施態様において、親抗体は、親和性成熟によって同定された抗体である。
親抗体は、当業者に公知の又は後に発見される任意の抗原に対する親和性を有することができる。ほとんど全ての物質が、親抗体、又は本記載の抗体の抗原となり得る。有用な抗原の例としては、α-1アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、C-X-Cケモカイン(例えば、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、カルシトニン、CCケモカイン(例えば、単球走化性タンパク質-1、単球走化性タンパク質-2、単球走化性タンパク質-3、単球炎症性タンパク質-1α、単球炎症性タンパク質-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40リガンド、C-kitリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子(CSF)、補体因子5a、補体阻害因子、補体受容体1、サイトカイン(例えば、上皮好中球活性化ペプチド-78、GRO/MGSA、GRO、GRO、MIP-1、MIP-1、MCP-1)、上皮成長因子(EGF)、エリスロポエチン(「EPO」)、剥脱性毒素A及びB、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第X因子、線維芽細胞成長因子(FGF)、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、G-CSF、GM-CSF、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、ヘッジホッグタンパク質(例えば、ソニック、インディアン、デザート)、ヘモグロビン、肝細胞成長因子(HGF)、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子(IGF)、インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-、IFN-γ)、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12など)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子(NIF)、オンコスタチンM、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、PD-ECSF、PDGF、ペプチドホルモン(例えば、ヒト成長ホルモン)、プレイオトロピン、プロテインA、プロテインG、発熱性外毒素A、B、及びC、リラキシン、レニン、SCF、可溶性補体受容体I、可溶性I-CAM 1、可溶性インターロイキン受容体(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、すなわち、ブドウ球菌エンテロトキシン(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE)、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素(TSST-1)、チモシンα1、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子(TNFβ)、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、腫瘍壊死因子-α(TNFα)、血管内皮成長因子(VEGF)、ウロキナーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗原は、当業者に公知の方法によって、例えば、市販供給源から、又は公開されているポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列(例えば、Genbank)から得ることができる。
さらなる抗原としては、転写及び発現アクチベーターが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な転写及び発現アクチベーターとしては、細胞の成長、分化、調節などを調節する遺伝子及びタンパク質が挙げられる。発現及び転写アクチベーターは、原核生物、ウイルス、並びに真菌、植物、及び哺乳動物を含む動物を含む、真核生物に見られ、広範囲の治療標的を提供している。発現及び転写アクチベーターは、多くの機構によって、例えば、受容体に結合すること、シグナル伝達カスケードを刺激すること、転写因子の発現を調節すること、プロモーター及びエンハンサーに結合すること、プロモーター及びエンハンサーに結合するタンパク質に結合すること、DNAを巻き戻すこと、プレ-mRNAをスプライシングすること、RNAをポリアデニル化すること、並びにRNAを分解することによって、転写を調節することが理解されるであろう。抗原としては、発現アクチベーター、例えば、サイトカイン、炎症性分子、成長因子、それらの受容体、及びオンコジーン産物、例えば、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-8など)、インターフェロン、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、及びヒアルリン/CD44;シグナル伝達分子及び対応するオンコジーン産物、例えば、Mos、Ras、Raf、及びMet;並びに転写アクチベーター及びサプレッサー、例えば、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、及びステロイドホルモン受容体、例えば、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロンの受容体、LDL受容体リガンド、並びにコルチコステロンが挙げられるが、これらに限定されない。
ワクチンタンパク質は、限定されないが、感染性真菌、例えば、アスペルギルス、カンジダ種;細菌、特に、病原性細菌のモデルとしての役割を果たす大腸菌(E. coli)、及び医学的に重要な細菌、例えば、ブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌)、又は連鎖球菌(例えば、肺炎連鎖球菌);原虫、例えば、胞子虫(例えば、プラスモジウム)、根足虫(例えば、エントアメーバ)、及び鞭毛虫(トリパノソーマ、リューシマニア、トリコモナス、ジアルジアなど);ウイルス、例えば、(+)RNAウイルス(例としては、ポックスウイルス、例えば、ワクシニア;ピコルナウイルス、例えば、ポリオ;トガウイルス、例えば、風疹;フラビウイルス、例えば、HCV;及びコロナウイルスが挙げられる)、(-)RNAウイルス(例えば、ラブドウイルス、例えば、VSV;パラミクソウイルス、例えば、RSV;オルトミクソウイルス、例えば、インフルエンザ;ブニヤウイルス;及びアレナウイルス)、dsDNAウイルス(例えば、レオウイルス)、RNAからDNAへのウイルス、すなわち、レトロウイルス、例えば、HIV及びHTLV、並びにDNAからRNAへの特定のウイルス、例えば、B型肝炎由来のタンパク質を含む抗原であってもよい。
抗原は、限定されないが、アミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ(例えば、p450)、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ、及びヌクレアーゼを含む、酵素であってもよい。
虫害耐性タンパク質(例えば、Cryタンパク質)、デンプン及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性タンパク質、マイコトキシン解毒タンパク質、植物成長酵素(例えば、リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ、「ルビスコ」)、リポキシゲナーゼ(LOX)、及びホスホエノールピルビン酸(PEP)カルボキシラーゼなどの農業関連のタンパク質も抗原となり得る。
例えば、抗原は、腫瘍表面抗原、例えば、B細胞イディオタイプ、悪性B細胞上のCD20、白血病性芽球上のCD33、及び乳癌上のHER2/neuなどの、疾患関連分子であってもよい。或いは、抗原は、成長因子受容体であってもよい。成長因子の例としては、上皮成長因子(EGF)、トランスフェリン、インスリン様成長因子、形質転換成長因子(TGF)、インターロイキン-1、及びインターロイキン-2が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、EGF受容体の高発現は、多種多様なヒト上皮原発腫瘍に見出されている。TGF-αは、癌細胞の自己分泌刺激経路を媒介することが分かっている。いくつかのマウスモノクローナル抗体は、EGF受容体に結合し、リガンドのEGF受容体への結合を遮断し、並びに培養下で及び異種移植モデルで種々のヒト癌細胞株の増殖を阻害することができることが示されている。Mendelsohn及びBaselgaの文献(1995)、癌の生物療法における成長因子及び受容体に対する抗体(Antibodies to growth factors and receptors, in Biologic Therapy of Cancer)、第2版、J B Lippincott, Philadelphia, pp 607-623。したがって、本発明の抗体を用いて、種々の癌を治療することができる。
抗原はまた、血小板糖タンパク質IIb/IIIa受容体などの冠動脈疾患と関連する細胞表面タンパク質又は受容体、CD4、CAMPATH-1、及びグラム陰性細菌のリポ多糖の脂質A領域などの自己免疫疾患と関連する細胞表面タンパク質又は受容体であってもよい。CD4に対するヒト化抗体は、菌状息肉腫、汎発性膿疱性乾癬、重度乾癬、及び関節リウマチの患者の治療において臨床試験で試験されている。グラム陰性細菌のリポ多糖の脂質A領域に対する抗体は、敗血症性ショックの治療において臨床的に試験されている。CAMPATH-1に対する抗体もまた、難治性関節リウマチの治療において臨床的に試験されている。したがって、本明細書に提供される抗体を用いて、種々の自己免疫疾患を治療することができる。
有用な抗原としては、ヒトアレルギー性疾患と関連するタンパク質又はペプチド、例えば、炎症性メディエータータンパク質、例えば、インターロイキン-1(IL-1)、腫瘍壊死因子(TNF)、ロイコトリエン受容体、及び5-リポキシゲナーゼ、並びに接着分子、例えば、V-CAM/VLA-4も挙げられる。さらに、IgEは、喘息などのI型の即時型過敏性アレルギー反応において極めて重要な役割を果たすので、IgEも抗原としての役割を果たし得る。研究により、全血清IgEのレベルが、特に喘息において、疾患の重症度と相関する傾向があることが示されている。Burrowsらの文献(1989)、「喘息と血清IgEレベル及びアレルゲンに対する皮膚試験反応性との関連(Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens)」、New Engl. L. Med. 320:271-277。したがって、IgEに対して選択された抗体を用いて、IgEのレベルを低下させ、又はアレルギー性疾患の治療において、正常な免疫機能に大きな影響を及ぼすことなく、肥満細胞及び好塩基球へのIgEの結合を遮断することができる。
抗原はまた、宿主の免疫応答を誘発する抗原としての役割を果たし得るウイルス表面又はコアタンパク質であってもよい。これらのウイルスタンパク質の例としては、糖タンパク質(又は表面抗原、例えば、GP120及びGP41)並びにカプシドタンパク質(又は構造タンパク質、例えば、P24タンパク質); A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、又はE型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタンパク質(例えば、B型肝炎ウイルスの小さなB型肝炎表面抗原(SHBsAg)並びにC型肝炎ウイルスのコアタンパク質、NS3、NS4、及びNS5抗原);糖タンパク質(G-タンパク質)又は呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質(F-タンパク質);単純ヘルペスウイルスHSV-1及びHSV-2の表面及びコアタンパク質(例えば、HSV-2由来の糖タンパク質D)が挙げられるが、これらに限定されない。
抗原はまた、その腫瘍抑制機能を喪失し、細胞を癌により罹りやすくし得る突然変異した腫瘍抑制遺伝子産物であってもよい。腫瘍抑制遺伝子は、細胞成長及び分裂周期を阻害するように機能し、それにより、新生物の発生を妨げる遺伝子である。腫瘍抑制遺伝子の突然変異は、細胞に、阻害シグナルのネットワークの構成要素の1つ又は複数を無視させ、細胞周期チェックポイントを乗り越え、より速い速度の制御された細胞成長−癌をもたらす。腫瘍抑制遺伝子の例としては、DPC-4、NF-1、NF-2、RB、p53、WT1、BRCA1、及びBRCA2が挙げられるが、これらに限定されない。DPC-4は、膵癌に関与し、細胞分裂を阻害する細胞質経路に関与する。NF-1は、細胞質阻害タンパク質のRasを阻害するタンパク質をコードする。NF-1は、神経系の神経線維腫及び褐色細胞腫並びに骨髄性白血病に関与する。NF-2は、神経系の髄膜腫、神経鞘腫、及び上衣腫に関与する核タンパク質をコードする。RBは、細胞周期の主な阻害因子となる核タンパク質である、pRBタンパク質をコードする。RBは、網膜芽腫、並びに骨癌、膀胱癌、小細胞肺癌、及び乳癌に関与する。p53は、細胞分裂を調節し、アポトーシスを誘導し得るp53タンパク質をコードする。p53の突然変異及び/又は不活動は、広範囲の癌で見られる。WT1は、腎臓のウィルムス腫瘍に関与する。BRCA1は、乳癌及び卵巣癌に関与し、BRCA2は、乳癌に関与する。したがって、抗体を用いて、腫瘍発生及び発症の経路における遺伝子産物と他のタンパク質又は生化学物質との相互作用を遮断することができる。
抗原は、CD分子であってもよく、これには、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD110-113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw124、CD125、CD126、CDw127、CDw128a、CDw128b、CD129、CDw130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、及びTCRζが含まれるが、これらに限定されない。抗原は、VEGF、VEGF受容体、EGFR、Her2、TNFa、TNFRI受容体、GPIIb/IIIa、IL-2Rα鎖、IL-2Rβ鎖、RSV Fタンパク質、α4インテグリン、IgE、IgE受容体、ジゴキシン、カーペットバイパーの毒、補体C5、OPGL、CA-125腫瘍抗原、ブドウ球菌タンパク質、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)タンパク質、ブドウ球菌感染(限定されないが、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌を含む)に関与するタンパク質、IL-6受容体、CTLA-4、RSV、IL-2受容体のTacサブユニット、IL-5、並びにEpCamであってもよい。ある実施態様において、抗原はCD74である。抗原は、分子の断片であってもよい。
親抗体は、限定するものではないが、当技術分野で公知の任意の抗体又は当業者によって開発された任意の抗体であることができる。例としては、抗TNF抗体(米国特許第6,258,562号)、抗IL-12、及び/又は抗IL-12p40抗体(米国特許第6,914,128号);抗IL-18抗体(米国特許公開第2005/0147610号)、抗05、抗CBL、抗CD147、抗gp120、抗VLA-4、抗CD11a、抗CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗CD-40(例えば、PCT公開WO 2007/124299号を参照のこと)、抗Id、抗ICAM-1、抗CXCL13、抗CD2、抗EGFR、抗TGF-β2、抗HGF、抗cMet、抗DLL-4、抗NPR1、抗PLGF、抗ErbB3、抗E-セレクチン、抗Fact VII、抗Her2/neu、抗F gp、抗CD11/18、抗CD14、抗ICAM-3、抗RON、抗SOST、抗CD-19、抗CD80(例えば、PCT公開WO 2003/039486号を参照のこと)、抗CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2-インテグリン、抗α4β7、抗CD52、抗HLA DR、抗CD22(例えば、米国特許第5,789,554号を参照のこと)、抗CD20、抗MIF、抗CD64(FcR)、抗TCR αβ、抗CD2、抗Hep B、抗CA 125、抗EpCAM、抗gp120、抗CMV、抗gpIIbIIIa、抗IgE、抗CD25、抗CD33、抗HLA、抗IGF1,2、抗IGFR、抗VNRインテグリン、抗IL-1α、抗IL-1β、抗IL-1受容体、抗IL-2受容体、抗IL-4、抗IL-4受容体、抗IL5、抗IL-5受容体、抗IL-6、抗IL-8、抗IL-9、抗IL-13、抗IL-13受容体、抗IL-17、抗IL-6R、抗RANKL、抗NGF、抗DKK、抗αVβ3、抗IL-17A、抗IL23p19、並びに抗IL-23(Presta, L. G.の文献(2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731-6、及びwww<dot>path<dot>cam<dot>ac<dot>uk</><dot>about<dot>mrc<7></>humanisation</>antibodies<dot>htmlを参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。
親抗体はまた、臨床試験での、又は臨床使用のための開発での使用が承認されている様々な治療的抗体から選択されてもよい。そのような治療的抗体としては、リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、IDEC/Genentech/Roche)(例えば、米国特許第5,736,137号を参照のこと)、非ホジキンリンパ腫の治療のために承認されたキメラ抗CD20抗体; Genmabによって現在開発されている抗CD20であるHuMax-CD20、米国特許第5,500,362号に記載されている抗CD20抗体、AME-133(Applied Molecular Evolution)、hA20(Immunomedics, Inc.)、HumaLYM(Intracel)、及びPRO70769(PCT出願PCT/US2003/040426号)、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標)、Genentech)(例えば、米国特許第5,677,171号を参照のこと)、乳癌の治療のために承認されたヒト化抗Her2/neu抗体; Genentechによって現在開発されているペルツズマブ(rhuMab-2C4、Omnitarg(登録商標));抗Her2抗体(米国特許第4,753,894号;種々の癌について臨床試験中のキメラ抗EGFR抗体である、セツキシマブ(Erbitux(登録商標)、Imclone)(米国特許第4,943,533号; PCT公開WO 96/40210号); Abgenix-Immunex-Amgenによって現在開発されているABX-EGF(米国特許第6,235,883号); Genmabによって現在開発されているHuMax-EGFr(米国特許第7,247,301号); 425、EMD55900、EMD62000、及びEMD72000(Merck KGaA)(米国特許第5,558,864号; Murthyらの文献(1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2): 549-60; Rodeckらの文献(1987) J. Cell. Biochem. 35(4): 315-20; Kettleboroughらの文献(1991) Protein Eng. 4(7): 773-83); ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT公開WO 95/20045号; Modjtahediらの文献(1993) J. Cell. Biophys. 22(I-3): 129-46; Modjtahediらの文献(1993) Br. J. Cancer 67(2): 247-53; Modjtahediらの文献(1996) Br. J. Cancer 73(2): 228-35; Modjtahediらの文献(2003) Int. J. Cancer 105(2): 273-80); TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba(米国特許第5,891,996号;米国特許第6,506,883号; Mateoらの文献(1997) Immunotechnol. 3(1): 71-81); mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluthらの文献(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-44); KSB-102(KS Biomedix); MR1-1(IVAX, National Cancer Institute)(PCT公開WO 01/62931A2号);及びSC100(Scancell)(PCT公開WO 01/88138号); B細胞慢性リンパ性白血病の治療に現在承認されているヒト化mAbであるアレムツズマブ(Campath(登録商標)、Millenium); Ortho Biotech/Johnson & Johnsonによって開発された抗CD3抗体であるムロモナブ-CD3(Orthoclone OKT3(登録商標))、IDEC/Schering AGによって開発された抗CD20抗体であるイブリツモマブチウキセタン(Zevalin(登録商標))、Celltech/Wyethによって開発された抗CD33(p67タンパク質)抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン(Mylotarg(登録商標))、Biogenによって開発された抗LFA-3 Fc融合体であるアレファセプト(Amevive(登録商標)))、Centocor/Lillyによって開発されたアブシキシマブ(ReoPro(登録商標))、Novartisによって開発されたバシリキシマブ(Simulect(登録商標))、Medimmuneによって開発されたパリビズマブ(Synagis(登録商標))、Centocorによって開発された抗TNFα抗体であるインフリキシマブ(Remicade(登録商標))、Abbottによって開発された抗TNFα抗体であるアダリブマブ(Humira(登録商標))、Celltechによって開発された抗TNFα抗体であるHumicade(登録商標)、Centocorによって開発された完全ヒトTNF抗体であるゴリムマブ(CNTO-148)、Immunex/Amgenによって開発されたp75 TNF受容体Fc融合体である、エタネルセプト(Enbrel(登録商標))、Rocheによって以前に開発されたp55TNF受容体Fc融合体であるイエネルセプト(Ienercept)、Abgenixによって開発されている抗CD147抗体であるABX-CBL、Abgenixによって開発されている抗IL8抗体であるABX-IL8、Abgenixによって開発されている抗MUC18抗体であるABX-MA1、Antisomaによって開発されている抗MUC1であるペムツモマブ(R1549、90Y-muHMFG1)、Antisomaによって開発されている抗MUC1抗体であるTherex(R1550)、Antisomaによって開発されているAngioMab(AS1405)、Antisomaによって開発されているHuBC-1、Antisomaによって開発されているチオプラチン(AS1407)、Biogenによって開発されている抗α-4-β-1(VLA-4)及びα-4-β-7抗体であるAntegren(登録商標)(ナタリズマブ)、Biogenによって開発されている抗VLA-1インテグリン抗体であるVLA-1 mAb、Biogenによって開発されている抗リンホトキシンβ受容体(LTBR)抗体であるLTBR mAb、Cambridge Antibody Technologyによって開発されている抗TGF-β抗体であるCAT-152、Abbottによって開発されている抗IL-12 p40抗体であるABT 874(J695)、Cambridge Antibody Technology及びGenzymeによって開発されている抗TGFβ1抗体であるCAT-192、Cambridge Antibody Technologyによって開発されている抗エオタキシン1抗体であるCAT-213、Cambridge Antibody Technology及びHuman Genome Sciences Inc.によって開発されている抗Blys抗体であるLymphoStat-B(登録商標)、Cambridge Antibody Technology及びHuman Genome Sciences, Inc. によって開発されている抗TRAIL-R1抗体であるTRAIL-R1 mAb、Genentechによって開発されている抗VEGF抗体であるAvastin(登録商標)(ベバシズマブ、rhuMAb-VEGF)、Genentechによって開発されている抗HER受容体ファミリー抗体、Genentechによって開発されている抗組織因子抗体である抗組織因子(ATF)、Genentechによって開発されている抗IgE抗体であるXolair(登録商標)(オマリズマブ)、Genentech及びXomaによって開発されている抗CD11a抗体であるRaptiva(登録商標)(エファリズマブ)、Genentech及びMillenium Pharmaceuticalsによって開発されているMLN-02抗体(旧LDP-02)、Genmabによって開発されている抗CD4抗体であるHuMax CD4、Genmab及びAmgenによって開発されている抗IL15抗体であるHuMax-IL15、Genmab及びMedarexによって開発されているHuMax-Inflam、Genmab及びMedarex及びOxford GcoSciencesによって開発されている抗ヘパラナーゼI抗体であるHuMax-Cancer、Genmab及びAmgenによって開発されているHuMax-Lymphoma、Genmabによって開発されているHuMax-TAC、IDEC Pharmaceuticalsによって開発されている抗CD40L抗体であるIDEC-131、IDEC Pharmaceuticals によって開発されている抗CD4抗体であるIDEC-151(クレノリキシマブ)、IDEC Pharmaceuticalsによって開発されている抗CD80抗体であるIDEC-114、IDEC Pharmaceuticalsによって開発されている抗CD23であるIDEC-152、IDEC Pharmaceuticalsによって開発されている抗マクロファージ遊走因子(MIF)抗体、Imcloneによって開発されている抗イディオタイプ抗体であるBEC2、Imcloneによって開発されている抗KDR抗体であるIMC-1C11、Imcloneによって開発されている抗flk-1抗体であるDC101、Imcloneによって開発されている抗VEカドヘリン抗体、Immunomedicsによって開発されている抗癌胎児性抗原(CEA)抗体であるCEA-Cide(登録商標)(イアベツズマブ(Iabetuzumab))、Immunomedicsによって開発されている抗CD22抗体であるLymphoCide(登録商標)(エプラツズマブ)、Immunomedicsによって開発されているAFP-Cide、Immunomedicsによって開発されているMyelomaCide、Immunomedicsによって開発されているLkoCide、Immunomedicsによって開発されているProstaCide、Medarexによって開発されている抗CTLA4抗体であるMDX-010、Medarexによって開発されている抗CD30抗体であるMDX-060、Medarexによって開発されているMDX-070、Medarexによって開発されているMDX-018、Medarex及びImmuno-Designed Moleculesによって開発されている抗Her2抗体であるOsidem(登録商標)(IDM-1)、Medarex及びGenmabによって開発されている抗CD4抗体であるHuMax(登録商標)-CD4、Medarex及びGenmabによって開発されている抗IL15抗体であるHuMax-IL15、Medarex及びCentocor/J&Jによって開発されている抗TNFα抗体であるCNTO 148、Centocor/J&Jによって開発されている抗サイトカイン抗体であるCNTO 1275、MorphoSysによって開発されている抗細胞内接着分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体であるMOR101及びMOR102、MorphoSysによって開発されている抗線維芽細胞成長因子受容体3(FGFR-3)抗体であるMOR201、Protein Design Labsによって開発されている抗CD3抗体であるNuvion(登録商標)(ビシリズマブ)、Protein Design Labsによって開発されている抗γインターフェロン抗体であるHuZAF(登録商標)、Protein Design Labsによって開発されている抗α5β1インテグリン、Protein Design Labsによって開発されている抗IL-12、Xomaによって開発されている抗Ep-CAM抗体であるING-1、Genentech及びNovartisによって開発されているヒト化抗IgE抗体であるXolair(登録商標)(オマリズマブ)、並びにXomaによって開発されている抗β2インテグリン抗体であるMLN01が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様において、治療薬としては、KRN330(Kirin); huA33抗体(A33、Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95(αVインテグリン、Centocor); MEDI-522(αVβ3インテグリン、Medimmune);ボロシキシマブ(αVβ1インテグリン、Biogen/PDL);ヒトmAb 216(B細胞グリコシル化エピトープ、NCl); BiTE MT103(二重特異性CD19×CD3、Medimmune); 4G7×H22(二重特異性B細胞×FcガンマR1、Medarex/Merck KGa); rM28(二重特異性CD28×MAPG、欧州特許第EP1444268号); MDX447(EMD 82633)(二重特異性CD64×EGFR、Medarex);カツマキソマブ(removab)(二重特異性EpCAM×抗CD3、Trion/Fres);エルツマキソマブ(二重特異性HER2/CD3、Fresenius Biotech);オレゴボマブ(OvaRex)(CA-125、ViRexx); Rencarex(登録商標)(WX G250)(カルボニックアンヒドラーゼIX、Wilex); CNTO 888(CCL2、Centocor); TRC105(CD105(エンドグリン)、Tracon); BMS-663513(CD137アゴニスト、Brystol Myers Squibb); MDX-1342(CD19、Medarex);シプリズマブ(MEDI-507)(CD2、Medimmune);オファツムマブ(Humax-CD20)(CD20、Genmab);リツキシマブ(Rituxan)(CD20、Genentech);ベルツズマブ(hA20)(CD20、Immunomedics);エプラツズマブ(CD22、Amgen);ルミリキシマブ(IDEC 152)(CD23、Biogen);ムロモナブ-CD3(CD3、Ortho); HuM291(CD3 fc受容体、PDL Biopharma); HeFi-1、CD30、NCl); MDX-060(CD30、Medarex); MDX-1401(CD30、Medarex); SGN-30(CD30、Seattle Genentics); SGN-33(リンツズマブ)(CD33、Seattle Genentics);ザノリムマブ(HuMax-CD4)(CD4、Genmab); HCD122(CD40、Novartis); SGN-40(CD40、Seattle Genentics); Campath1h(アレムツズマブ)(CD52、Genzyme); MDX-1411(CD70、Medarex); hLL1(EPB-1)(CD74.38、Immunomedics);ガリキシマブ(IDEC-144)(CD80、Biogen); MT293(TRC093/D93)(切断されたコラーゲン、Tracon); HuLuc63(CS1、PDL Pharma);イピリムマブ(MDX-010)(CTLA4、Brystol Myers Squibb);トレメリムマブ(チシリムマブ、CP-675,2)(CTLA4、Pfizer); HGS-ETR1(マパツムマブ)(DR4TRAIL-R1アゴニスト、Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655(DR5、Amgen);アポマブ(DR5、Genentech); CS-1008(DR5、Daiichi Sankyo); HGS-ETR2(レキサツムマブ)(DR5TRAIL-R2アゴニスト、HGS);セツキシマブ(Erbitux)(EGFR、Imclone); IMC-11F8,(EGFR、Imclone);ニモツズマブ(EGFR、YM Bio);パニツズマブ(Vectabix)(EGFR、Amgen);ザルツムマブ(HuMaxEGFr)(EGFR、Genmab); CDX-110(EGFRvIII、AVANT Immunotherapeutics);アデカツムマブ(MT201)(Epcam、Merck);エドレコロマブ(Panorex、17-1A)(Epcam、Glaxo/Centocor); MORAb-003(葉酸受容体a、Morphotech); KW-2871(ガングリオシドGD3、Kyowa); MORAb-009(GP-9、Morphotech); CDX-1307(MDX-1307)(hCGb、Celldex);トラスツズマブ(Herceptin)(HER2、Celldex);
ペルツズマブ(rhuMAb 2C4)(HER2(DI)、Genentech);アポリズマブ(HLA-DRβ鎖、PDL Pharma); AMG-479(IGF-1R、Amgen); 抗IGF-1R R1507(IGF1-R、Roche); CP 751871(IGF1-R、Pfizer); IMC-A12(IGF1-R、Imclone); BIIB022(IGF-1R、Biogen); Mik-β-1(IL-2Rb(CD122)、Hoffman LaRoche); CNTO 328(IL6、Centocor);抗KIR(1-7F9)(キラー細胞Ig様受容体(KIR)、Novo); Hu3S193(ルイス(y)、Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11(LTβR、Biogen); HuHMFG1(MUC1、Antisoma/NCl); RAV12(N結合型炭水化物エピトープ、Raven); CAL(副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTH-rP)、University of California); CT-011(PD1、CureTech); MDX-1106(ono-4538)(PD1、Medarex/Ono); MAb CT-011(PD1、Curetech); IMC-3G3(PDGFRa、Imclone);バビツキシマブ(ホスファチジルセリン、Peregrine); huJ591(PSMA、Cornell Research Foundation); muJ591(PSMA、Cornell Research Foundation); GC1008(TGFb(汎)阻害剤(IgG4)、Genzyme);インフリキシマブ(Remicade)(TNFa、Centocor); A27.15(トランスフェリン受容体、Salk Institute、INSERN WO 2005/111082号); E2.3(トランスフェリン受容体、Salk Institute);ベバシズマブ(Avastin)(VEGF、Genentech); HuMV833(VEGF、Tsukuba Research Lab、PCT公開WO/2000/034337号、University of Texas); IMC-18F1(VEGFR1、Imclone); IMC-1121(VEGFR2、Imclone)が挙げられる。
有用な二重特異性親抗体の例としては、腫瘍細胞抗原に対する1つの抗体と細胞毒性誘導分子に対するもう1つの抗体を有する抗体、例えば、抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗悪性B細胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結腸癌)、抗CD3/抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗EGF受容体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神経細胞接着分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結合タンパク質(FBP)/抗CD3、抗汎癌腫関連抗原(AMOC-31)/抗CD3;腫瘍抗原に特異的に結合する1つの抗体と毒素に結合する別の抗体を有する二重特異性抗体、例えば、抗サポリン/抗Id-1、抗CD22/抗サポリン、抗CD7/抗サポリン、抗CD38/抗サポリン、抗CEA/抗リシンA鎖、抗インターフェロン-α(IFN-α)/抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗CEA/抗ビンカアルカロイド;酵素活性化プロドラッグを変換するための二重特異性抗体、例えば、抗CD30/抗アルカリホスファターゼ(これは、マイトマイシンホスフェートプロドラッグからマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する);線維素溶解剤として使用することができる二重特異性抗体、例えば、抗フィブリン/抗組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、抗フィブリン/抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA);免疫複合体を細胞表面受容体にターゲッティングするための二重特異性抗体、例えば、抗低密度リポタンパク質(LDL)/抗Fc受容体(例えば、FcγRI、FcγRII、又はFcγRIII);感染性疾患の治療で使用するための二重特異性抗体、例えば、抗CD3/抗単純ヘルペスウイルス(HSV)、抗T細胞受容体:CD3複合体/抗インフルエンザ、抗FcγR/抗HIV;インビトロ又はインビボでの腫瘍検出のための二重特異性抗体、例えば、抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗抗p185HER2/抗ハプテン;ワクチンアジュバントとしての二重特異性抗体(引用により本明細書中に組み込まれているFanger, M Wらの文献、Crit Rev Immunol. 1992; 12(34):101-24を参照のこと);並びに診断ツールとしての二重特異性抗体、例えば、抗ウサギIgG/抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)/抗ホルモン、抗ソマトスタチン/抗サブスタンスP、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-ガラクトシダーゼ(引用により本明細書中に組み込まれているNolan, O及びR. O'Kennedyの文献、Biochim Biophys Acta. 1990 Aug. 1; 1040(1):1-11を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。三重特異性抗体の例としては、抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37、及び抗CD3/抗CD8/抗CD37が挙げられる。
ある実施態様において、部位特異的位置に1以上の非天然アミノ酸残基を含む抗体は、本明細書に記載の任意の親抗体と高い配列同一性を有する。ある実施態様において、該抗体は、本明細書に記載の親抗体と実質的に同一である。ある実施態様において、該抗体は、本明細書に記載の親抗体と約60％の同一性、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、又は約95％の同一性を有する。ある実施態様において、該抗体は、本明細書に記載の親抗体と約65％超、約70％超、約75％超、約80％超、約85％超、約90％超、又は約95％超の同一性を有する。ある抗体の少なくとも1つのポリペプチド鎖が、別の抗体の対応するポリペプチド鎖との配列同一性を有する場合、抗体は実質的に同一である。ある実施態様において、部位特異的位置に1以上の非天然アミノ酸残基を含む抗体は、少なくとも1つのドメイン、少なくとも2つのドメイン、又は少なくとも3つのドメインにわたって、配列番号1〜6のいずれかと約65％超、約70％超、約75％超、約80％超、約85％超、約90％超、又は約95％超の同一性を有する少なくとも1つのポリペプチド鎖を有する。
(抗体組成物)
本明細書に記載の抗体は、当技術分野で利用可能な方法及び本明細書に開示される方法を用いて組成物に製剤化することができる。本明細書に開示される化合物はいずれも、適当な医薬組成物中に提供し、好適な投与経路で投与することができる。
ある実施態様において、本明細書に提供される抗体組成物は、医薬として許容し得る担体をさらに含む。担体は、それとともに医薬組成物が投与される、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルであることができる。そのような医薬担体は、水及び油などの滅菌液であることができ、該油には、石油、動物、植物、又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。生理食塩水溶液並びにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液を、特に注射用溶液のための液体担体として利用することもできる。
好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、望ましい場合、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、又はpH緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態を取ることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。好適な医薬担体の例は、E.W. Martinの文献、1990、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、Mack Publishing Coに記載されている。
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、ヒト対象への投与に好適な形態で提供される。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、予防的又は治療的有効量の抗体を、患者への適切な投与のための形態を提供するための好適な量の担体とともに含有する。製剤は、投与様式に適するべきである。
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、静脈内投与に好適な形態で提供される。通常、静脈内投与に好適な組成物は、滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤及び注射部位での痛みを和らげるリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。しかしながら、そのような組成物は、静脈内投与以外の経路で投与してもよい。
特定の実施態様において、医薬組成物は、皮下投与に好適である。特定の実施態様において、医薬組成物は、筋肉内投与に好適である。
医薬組成物の成分は、別々に、又は混合して一緒に、単位剤形で、例えば、乾燥凍結乾燥粉末又は非含水濃縮物として供給することができる。該組成物を注入によって投与すべき場合、それを、滅菌医薬等級水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルで分配することができる。該組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、滅菌注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、対象への投与のための適当な濃度まで再構成することができる乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。いくつかの実施態様において、抗体は、非含水濃縮物として供給される。いくつかの実施態様において、抗体は、少なくとも0.5mg、少なくとも1mg、少なくとも2mg、少なくとも3mg、少なくとも5mg、少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも30mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも60mg、又は少なくとも75mgの単位投薬量の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
別の実施態様において、医薬組成物は、液体形態で供給される。いくつかの実施態様において、医薬組成物は液体形態で提供され、界面活性剤及び/又は無機塩を実質的に含まない。いくつかの実施態様において、抗体は、少なくとも0.1mg/ml、少なくとも0.5mg/ml、少なくとも1mg/ml、少なくとも2.5mg/ml、少なくとも3mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/ml、少なくとも25mg/ml、少なくとも30mg/ml、又は少なくとも60mg/mlの単位投薬量の液体形態で供給される。
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、塩形態として製剤化される。医薬として許容し得る塩としては、陰イオン、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する陰イオンとともに形成される塩、及び陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する陽イオンとともに形成される塩が挙げられる。
治療的使用において、医師は、予防的又は治癒的処置に従って、並びに年齢、体重、感染段階、及び治療すべき対象に特異的な他の因子に従って、最適な薬量を決定する。ある実施態様において、用量は、成人で1日当たり約1〜約1000mg、又は成人で1日当たり約5〜約250mgもしくは1日当たり約10〜50mgである。ある実施態様において、用量は、成人で1日当たり約5〜約400mg又は1日当たり25〜200mgである。ある実施態様において、1日当たり約50〜約500mgの用量率も想定される。
(治療又は予防のための使用方法)
本明細書に提供される特定の抗体は、当業者に好適とみなされる任意の疾患又は疾病の治療又は予防に使用することができる。通常、治療又は予防方法は、該疾患又は疾病を治療又は予防するための、それを必要とする対象への治療的又は予防的有効量の抗体又は抗体組成物の投与を包含する。
抗体又は組成物の治療的有効量とは、特定の疾患又は疾病の重症度、持続期間、及び/又は症状を低下させるのに有効である量である。特定の疾患の予防、管理、治療、及び/又は改善において治療的に有効である抗体又は組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。投与すべき抗体又は組成物の正確な量は、一つには、投与経路、特定の疾患又は疾病の重症度によって決まり、医師の判断及び各々の対象の状況によって決定されるべきである。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体の有効量は、ヒト対象の体重1kgあたり約0.025mg〜約1000mgである。ある実施態様において、抗体は、ヒト対象に、約1000mg/kg体重以下、約950mg/kg体重以下、約900mg/kg体重以下、約850mg/kg体重以下、約800mg/kg体重以下、約750mg/kg体重以下、約700mg/kg体重以下、約650mg/kg体重以下、約600mg/kg体重以下、約550mg/kg体重以下、約500mg/kg体重以下、約450mg/kg体重以下、約400mg/kg体重以下、約350mg/kg体重以下、約300mg/kg体重以下、約250mg/kg体重以下、約200mg/kg体重以下、約150mg/kg体重以下、約100mg/kg体重以下、約95mg/kg体重以下、約90mg/kg体重以下、約85mg/kg体重以下、約80mg/kg体重以下、約75mg/kg体重以下、約70mg/kg体重以下、又は約65mg/kg体重以下の量で投与される。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体の有効量は、ヒト対象の体重1kgあたり0.025mg〜約60mgである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物の抗体の有効量は、約0.025mg/kg以下、約0.05mg/kg以下、約0.10mg/kg以下、約0.20mg/kg以下、約0.40mg/kg以下、約0.80mg/kg以下、約1.0mg/kg以下、約1.5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約5mg/kg以下、約10mg/kg以下、約15mg/kg以下、約20mg/kg以下、約25mg/kg以下、約30mg/kg以下、約35mg/kg以下、約40mg/kg以下、約45mg/kg以下、約50mg/kg、又は約60mg/kg以下である。
本方法の医薬組成物は、当業者に公知の任意の方法を用いて投与することができる。例えば、医薬組成物は、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、皮下投与、又はそれらの任意の組合せで投与することができる。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、皮下投与される。いくつかの実施態様において、該組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施態様において、該組成物は、筋肉内投与される。
(検出又は診断のための使用方法)
本明細書に提供される抗体は、任意の標的の検出のために、又は当業者に好適と見なされる任意の疾患もしくは疾病の診断のために使用することができる。本方法は、適切な場所、例えば、適切な体、組織、又は細胞内の標的抗原に対する抗体の結合を検出することを包含する。本方法において、抗体と抗原の複合体の形成は、当業者に公知の任意の方法によって検出することができる。例としては、検出用の第二の試薬を使用するアッセイ、ELISA並びに免疫沈降及び凝集アッセイが挙げられる。これらのアッセイの詳細な説明は、例えば、Harlow及びLaneの文献、抗体:実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612)、Maertens及びStuyverのWO96/13590号、Zreinらの文献(1998)、及びWO96/29605号に示されている。
インサイチュ診断については、本発明による抗体とアミロイドタンパク質上のエピトープ領域との間の特異的結合が生じ得るように、抗体を、当技術分野で公知の方法、例えば、静脈内、鼻腔内、腹腔内、脳内、動脈内注射によって対象に投与することができる。抗体/抗原複合体は、抗体に結合している標識又は任意の他の当技術分野で公知の検出方法によって好都合に検出することができる。
本明細書にさらに提供されるのは、検出又は診断用のキットである。例示的なキットは、1以上の本明細書に提供される抗体を、該1以上の抗体とその標的抗原との複合体を検出するのに有用な1以上の試薬とともに含む。
(抗体の調製)
本明細書に記載の抗体は、限定するものではないが、当業者に明らかな任意の技術によって調製することができる。調製のための有用な技術としては、例えば、修飾されたtRNAとtRNAシンセターゼを用いるインビボ合成、例えば、修飾されたtRNAとtRNAシンセターゼを用いる無細胞合成、固相ポリペプチド合成、及び液相ポリペプチド合成が挙げられる。例示的な技術は、本節及び下記の実施例に記載されている。
ある方法において、抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする1以上のポリヌクレオチドから翻訳及び/又は転写される。したがって、本明細書に提供されるのは、1以上のポリペプチド鎖中の部位特異的位置に1以上の非天然アミノ酸を有する抗体をコードすることができるポリヌクレオチドである。ある実施態様において、該ポリヌクレオチドは、非天然アミノ酸のための部位特異的ポリペプチド位置に対応するポリヌクレオチド位置に、通常はアミノ酸と関連しないコドンを含む。そのようなコドンの例としては、停止コドン、4bpコドン、5bpコドンなどが挙げられる。反応混合物は、通常、該コドンを相補(抑制)するtRNAを作ることができるtRNAシンセターゼを含む。これらのサプレッサーtRNAを非天然アミノ酸に連結して、サプレッサーコドンの部位でのポリペプチドへのその取込みを容易にする。
抗体は、そのようなポリヌクレオチドを発現させて、非天然アミノ酸をポリペプチド鎖の部位特異的な位置に組み込むための当業者に公知の技術によって調製することができる。そのような技術は、例えば、米国特許第7,045,337号及び第7,083,970号、米国公開特許出願US 2008/0317670号、US 2009/0093405号、US 2010/0093082号、US 2010/0098630号、US 2008/0085277号、及び国際特許公報WO 2004/016778 A1号及びWO 2008/066583 A2号に記載されており、これらの内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
ある実施態様において、抗体は、非天然アミノ酸でアミノアシル化された少なくとも1つの直交tRNAを含む無細胞反応混合物中で調製することができ、その場合、該直交tRNAは、通常はアミノ酸と関連しないコドン、例えば、停止コドン; 4bpコドンなどと塩基対を形成する。該反応混合物は、直交tRNAを非天然アミノ酸でアミノアシル化することができるtRNAシンセターゼも含む。通常、細菌細胞抽出物中に存在するプロテアーゼによって分解されやすい直交tRNAシンセターゼを外部で合成し、ポリペプチド合成の開始前に反応混合物に添加する。直交tRNAは、細胞抽出物が得られる細菌細胞内で合成してもよく、ポリペプチド合成反応中にデノボで合成してもよく、又は反応混合物に外から添加してもよい。
ある実施態様において、非天然アミノ酸挿入及びタンパク質挿入又はフォールディングに影響を及ぼす成分を反応混合物に任意に添加する。そのような成分としては、終結因子1及び2の効果を最小化するための、及び直交成分濃度をさらに最適化するための高濃度の翻訳因子が挙げられる。タンパク質シャペロン(オキシドレダクターゼ及びイソメラーゼのDsb系、GroES、GroEL、DNAJ、DNAK、Skpなど)を、反応混合物に外から添加してもよく、又は細胞抽出物を調製するために使用される起源細胞で過剰発現させてもよい。反応は、大規模リアクター、小規模を利用してもよく、又は複数の同時合成を実施するために多重化してもよい。連続反応は、フィード機構を用いて試薬の流れを導入し、プロセスの一部として最終生成物を単離してもよい。バッチ系も関心対象であり、この場合、活性合成の期間を延長するために追加の試薬を導入してもよい。リアクターは、バッチ、拡大バッチ、半バッチ、半連続、フェドバッチ、及び連続などの、並びに適用目的に従って選択される、任意の様式で動作させることができる。反応は、一般的には少なくとも約1μlかつ約15μl以下の小規模、又は反応容量が、少なくとも約15μl、一般的には少なくとも約50μl、より一般的には少なくとも約100μlであり、500μl、1000μl、もしくはそれを上回る量であり得る、スケールアップされた反応のいずれかの、任意の容量であり得る。原則として、反応は、必要なときに十分な酸素(又は他の電子受容体)が供給される限り、任意の規模で実施することができる。
伸長中に少なくとも1つの非天然アミノ酸をポリペプチド鎖に導入する有用な合成法には、以下が含まれるが、これらに限定されない:(I)外因性の精製された直交シンセターゼ、非天然アミノ酸、及び直交tRNAの無細胞反応物に添加する、(II)外因性の精製された直交シンセターゼ及び非天然アミノ酸を反応混合物に添加するが、直交tRNAは無細胞反応中に転写される、(III)外因性の精製された直交シンセターゼ及び非天然アミノ酸を反応混合物に添加するが、直交tRNAは、細胞抽出物の起源生物によって合成される。ある実施態様において、直交成分は、合成レベルを制御することができるように、調節可能なプロモーターによって駆動されるが、関連するDNA鋳型のレベルを付加又は特異的消化によって制御することなどの、他の手段を使用してもよい。
いくつかの実施態様において、無細菌細胞発現系を用いて、非天然アミノ酸(nnAA)を有するタンパク質又はペプチド変異体を産生する。インビトロタンパク質合成への無細菌細胞抽出物の使用は、従来のインビボタンパク質発現法に優るいくつかの利点を提供する。無細胞系は、細胞の代謝資源のうちの全てではないにしても大部分を、1つのタンパク質の独占的産生に向けることができる。さらに、インビトロでの細胞壁及び細胞膜成分の欠如は、それにより合成環境の制御が可能になるため、有利である。しかしながら、無細胞抽出物の効率は、直接的又は間接的にタンパク質合成を阻害する細菌タンパク質によって減少することがある。したがって、タンパク質合成の効率を減少させる望ましくないタンパク質の不活化は、無細胞抽出物中の望ましいタンパク質の収量を増大させるはずである。例えば、タンパク質合成の効率を減少させるタンパク質の不活化は、非天然アミノ酸が規定のアミノ酸残基に組み込まれているポリペプチドの収量を増大させるはずである。ポリペプチドへのnnAAの導入は、タンパク質の生物学的多様性及び機能を増大させるのに有用である。nnAAが規定のアミノ酸残基に組み込まれているポリペプチドを産生するための1つの手法は、タンパク質翻訳時にnnAAをアンバー(停止)コドンで新生ポリペプチドに導入するために、nnAAのアミノアシル化直交CUAを含有するtRNAを使用することである。しかしながら、アンバーコドンでのnnAAの組み込みは、通常、停止コドンを認識し、翻訳を終結させる天然の細菌終結複合体によって阻害され得る。終結因子1(RF1)は、mRNA配列中のアンバーコドンを認識することによって翻訳の終結を促進する終結複合体タンパク質である。RF1によるアンバー停止コドンの認識は、非天然アミノ酸組み込みの部位での切断産物の早成を促進し、それにより、タンパク質収量の減少を促進することができる。したがって、RF1の活性を減弱させると、組換えタンパク質へのnnAA組み込みが増大し得る。
nnAA組み込みは: 1)中和抗体によるRF1の不活化、2)(RF2強化系統における)RF1のゲノムノックアウト、及び3)親和性クロマトグラフィーによる除去のためのタンパク質タグ(キチン結合ドメイン及びHisタグ)を含有するRF1を発現するように改変された系統を用いる部位特異的RF1除去という3通りの方法でRF1活性を減弱させることによって増大させることができることが以前に示されている。RF1を不活化するための別の方法は、タンパク質分解的切断部位をRF1アミノ酸配列に導入することを含む。該切断部位は、細菌細胞成長時には、プロテアーゼに利用されないが、細菌細胞を溶解させて、無細胞抽出物を産生したときには、プロテアーゼによって切断される。したがって、nnAAがアンバーコドンで組み込まれている全長ポリペプチドの収量は、そのような修飾されたRF1変異体を発現する細菌細胞抽出物中で増加している。
いくつかの実施態様において、非天然アミノ酸を含む抗体を産生するために、核酸鋳型が必要とされる。無細胞タンパク質合成用の鋳型は、mRNA又はDNAのどちらであってもよい。該鋳型は、関心対象の任意の特定の抗体の配列を含むことができ、全長抗体又は任意の長さのその断片をコードし得る。タンパク質合成鋳型としての役割を果たす核酸は、任意に、天然源に由来するものであるか、又はそれらは、合成されたものもしくは組換え体であることができる。例えば、DNAは、組換えDNA、例えば、プラスミド、ウイルスなどであることができる。
いくつかの実施態様において、抗体の核酸鋳型を産生したら、該鋳型を用いて、無細胞翻訳系で抗体を産生する。例えば、鋳型を、該鋳型をタンパク質に翻訳するのに十分な条件下で細胞溶解物に添加することができる。細胞溶解物は、細菌細胞又は真核細胞由来のものであることができる。次いで、発現されたタンパク質を、下記のように、当技術分野で公知の方法を用いて精製することができる。
いくつかの実施態様において、翻訳系(例えば、インビトロタンパク質合成系)を用いて、1以上のnnAAがその中に組み込まれている抗体を産生する。例示的な翻訳系は、無細胞抽出物、細胞溶解物、又は再構成された翻訳系を、予め選択された(規定の)位置に非天然アミノ酸を有する所望のポリペプチド又はタンパク質の合成のための核酸鋳型とともに含む。反応混合物は、合成されることになる巨大分子、例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなどのモノマー、並びに合成に必要であるような補因子、酵素、及び他の試薬、例えば、リボソーム、tRNA、ポリメラーゼ、転写因子などをさらに含む。無細胞抽出物、核酸鋳型、及びアミノ酸などの上記の成分に加えて、タンパク質合成に特に必要とされる材料を反応液に添加してもよい。該材料としては、塩、フォリン酸、環状AMP、タンパク質又は核酸分解酵素の阻害剤、タンパク質合成の阻害剤又は調節物質、酸化/還元電位の調整剤、非変性界面活性剤、緩衝剤成分、スペルミン、スペルミジン、プトレシンなどが挙げられる。様々な無細胞合成反応系が当技術分野で周知である。例えば、Kim, D.M.及びSwartz, J.R.の文献、Biotechnol. Bioeng. 66:180-8(1999); Kim, D.M.及びSwartz, J.R.の文献、Biotechnol. Prog. 16:385-90(2000); Kim, D.M.及びSwartz, J.R.の文献、Biotechnol. Bioeng. 74:309-16(2001); Swartzらの文献、Methods MoL Biol. 267:169-82(2004); Kim, D.M.及びSwartz, J.R.の文献、Biotechnol. Bioeng. 85:122-29(2004); Jewett, M.C.及びSwartzの文献、J.R., Biotechnol. Bioeng. 86:19-26(2004); Yin, G.及びSwartzの文献、J.R., Biotechnol. Bioeng. 86:188-95(2004); Jewett, M.C.及びSwartz, J.R. の文献、Biotechnol. Bioeng. 87:465-72(2004); Voloshin, A.M.及びSwartz, J.R. の文献、Biotechnol. Bioeng. 91:516-21(2005)を参照されたい。所望のポリペプチドの無細胞合成のためのさらなる条件は、その内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれているWO2010/081110号に記載されている。
いくつかの実施態様において、DNA鋳型を用いて、インビトロタンパク質合成を推進し、RNAポリメラーゼを反応混合物に添加して、DNA鋳型の転写の増強をもたらす。本明細書での使用に好適なRNAポリメラーゼには、細菌抽出物が得られる細菌内で機能する任意のRNAポリメラーゼが含まれる。他の実施態様において、RNA鋳型を用いて、インビトロタンパク質合成を推進し、反応混合物の成分を任意の好都合な順序で1つに混合することができるが、RNA鋳型が最後に添加される順序で混合し、それにより、ヌクレアーゼによるRNA鋳型の分解の可能性を最小化することが好ましい。
いくつかの実施態様において、無細胞翻訳系を用いて、1以上のnnAAがその中に組み込まれている抗体を産生する。無細胞タンパク質合成は、細胞機構の触媒能力を利用する。インビトロで最大限のタンパク質収量を得るには、十分な基質供給、例えば、ヌクレオシド三リン酸及びアミノ酸、ホメオスタシス環境、触媒安定性、並びに阻害的副生成物の除去又は回避が必要となる。インビトロ合成反応の最適化は、急速に成長する生物体のインビボ状態を再現することによって効果が上がる。本発明のいくつかの実施態様において、無細胞合成は、それゆえ、酸化的リン酸化が活性化される反応で実施される。さらなる詳細は、その内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,338,789号に記載されている。
インビトロタンパク質合成、又は無細胞タンパク質合成は、従来のインビボタンパク質発現法に優るいくつかの利点を提供する。無細胞系は、細胞の代謝資源のうちの全てではないにしても大部分を、1つのタンパク質の独占的産生に向けることができる。さらに、インビトロでの細胞壁及び細胞膜成分の欠如は、それにより合成環境の制御が可能になるため、有利である。例えば、tRNAレベルを、発現されている遺伝子のコドン使用を反映するように変化させることができる。細胞の成長又は生存の懸念が存在しないので、レドックス電位、pH、又はイオン強度を、インビボタンパク質合成の場合よりも大きく融通を利かせて変化させることもできる。さらに、精製された、適切にフォールディングされたタンパク質産物の直接的な回収を容易に達成することができる。いくつかの実施態様において、無細胞系の生産性は、ここ数年で2桁を超えて、約5μg/ml-hrから約500μg/ml-hrにまで向上した。
ある実施態様において、tRNAシンセターゼを外部で合成し、無細胞反応混合物に添加する。ある実施態様において、該反応混合物を、ompTが不活化されているか、又はもともと不活性である細菌細胞から調製する。OmpTは、tRNAシンセターゼを含む、反応混合物の成分を分解すると考えられている。
無細胞抽出物、遺伝子鋳型、及びアミノ酸などの上記の成分に加えて、タンパク質合成に特に必要とされる材料を反応液に添加してもよい。これらの材料としては、塩、フォリン酸、環状AMP、タンパク質又は核酸分解酵素の阻害剤、タンパク質合成の阻害剤又は調節物質、酸化/還元電位の調整剤、非変性界面活性剤、緩衝剤成分、スペルミン、スペルミジン、プトレシンなどが挙げられる。
塩としては、好ましくは、(例えば、酢酸又はグルタミン酸の)カリウム、マグネシウム、及びアンモニウム塩が挙げられる。そのような塩の1つ又は複数は、代替アミノ酸を対陰イオンとして有し得る。イオン種間に最適濃度についての相互依存関係が存在する。これらのイオン種は、通常、タンパク質産生に関して最適化される。反応媒体の特定の成分の濃度を変化させる場合、別の成分の濃度を相応に変化させてもよい。例えば、ヌクレオチド及びエネルギー源化合物などのいくつかの成分の濃度を、他の成分の濃度の変化に合わせて同時に調整してもよい。また、リアクター内の成分の濃度レベルを経時的に変えてもよい。酸化/還元電位の調整剤は、ジチオスレイトール、アスコルビン酸、グルタチオン、及び/又はそれらの酸化形態であってもよい。
ある実施態様において、反応は、透析様式、透析濾過バッチ様式、フェドバッチ様式、又は半連続操作様式で進行することができる。ある実施態様において、フィード溶液を、膜を通すか、又は注入ユニットを通してリアクターに供給することができる。合成された抗体は、リアクター内に蓄積し、次いで、システム操作の終了後に単離又は精製することができる。抗体を含む小胞を、反応流体がポンプで汲み上げられて、吸着マトリックスを通過するときに、例えば、インサイチュ又は循環ループ中のいずれかでの、反応混合物からの親和性吸着によって連続的に単離することもできる。
リアクター内でのタンパク質合成の間、所望のタンパク質を選択的に単離するためのタンパク質単離手段は、抗体分子、又は合成された所望のタンパク質を吸着させるための他の分子をコーティングした粒子が充填されたユニットを含んでいてもよい。好ましくは、タンパク質単離手段は、交互に使用される2つのカラムを含む。
得られた抗体は、標準的な技術によって精製又は単離することができる。例示的な技術は、下記の実施例に提供されている。
(アッセイ方法)
抗体を、その予想される活性について、又は新しい活性について、当業者に明らかな任意のアッセイに従ってアッセイすることができる。得られた抗体を、機能アッセイで活性について、又は非機能アッセイ、例えば、免疫染色、ELISA、クマシー染色もしくは銀染色されたゲル上での定量などで存在するタンパク質の量を定量し、全タンパク質に対する生体活性タンパク質の割合を決定することによって、アッセイすることができる。
翻訳反応で産生されるタンパク質の量は、様々な方法で測定することができる。ある方法は、翻訳されている特定のタンパク質の活性を測定するアッセイの利用可能性に依存する。タンパク質活性を測定するためのアッセイの例は、ルシフェラーゼアッセイ系、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイ系である。これらのアッセイにより、翻訳反応から産生される機能的に活性のあるタンパク質の量が測定される。活性アッセイでは、不適切なタンパク質フォールディング又はタンパク質活性に必要な他の翻訳後修飾の欠如が原因で不活性となる全長タンパク質は測定されない。
共役したインビトロ転写及び翻訳反応で産生されるタンパク質の量を測定する別の方法は、既知の分量の放射性標識アミノ酸、例えば、35S-メチオニン、3H-ロイシン、又は14C-ロイシンを使用する反応を実施し、その後、新たに翻訳されたタンパク質に取り込まれた放射性標識アミノ酸の量を測定することである。取り込みアッセイでは、切断されたタンパク質産物を含むインビトロ翻訳反応で産生された全タンパク質中の放射性標識アミノ酸の量が測定される。放射性標識タンパク質をタンパク質ゲル上でさらに分離し、オートラジオグラフィーによって、産物が適切なサイズであること、及び二次的なタンパク質産物が産生されていないことを確認してもよい。
(実施例)
本明細書で使用されるように、これらのプロセス、スキーム、及び実施例で使用される記号及び慣例は、特定の略語が具体的に定義されているかどうかにかかわらず、現在の科学文献、例えば、Journal of Biological Chemistryで使用されているものと一致する。
以下の実施例の全てについて、当業者に公知の標準的な後処理及び精製方法を利用することができる。別途示されない限り、温度は全て、℃(摂氏度)で表す。別途注記されない限り、方法は全て室温で実施する。
(実施例1)
(非天然アミノ酸を含有する例示的な抗体の合成及び例示的な細胞毒性剤へのコンジュゲーション)
以下の実施例は、規定の位置に非天然アミノ酸を含有する例示的な抗体を、その構築方法及び発現方法とともに記載している。該抗体を、発現、抑制効率、細胞殺傷剤とのコンジュゲーション効率、細胞結合、及び細胞殺傷について、下記のように評価した。この実施例では、例示的な抗体は、親抗体トラスツズマブをベースにしている(米国特許第6,165,464号及び2006/0018899 A1号; Carterらの文献、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10:4285-4289)。
まず、トラスツズマブの重鎖の規定の位置にTAGアンバーコドンを組み込んでいるコンストラクトを作製した。DNA鋳型としてのC末端-(His)6タグ(SD02005)付きトラスツズマブのコード領域を含むpYDプラスミド、及びセンスとアンチセンスの両方向に関心対象の突然変異を含む合成オリゴヌクレオチド(Eurofins MWS Operon; Huntsville, AL)を用いて、部位特異的突然変異生成を実施した。各々の突然変異のオリゴヌクレオチドを、DNA鋳型及びPHUSION(登録商標)ポリメラーゼ(New England Biolabs; Ipswich, MA)に、20μLの最終容量まで添加した。各々の成分の最終濃度は、1.5mM MgCl2及び200μM dNTPを含むHFバッファー中、0.16μMの各々のオリゴヌクレオチド、0.5ng/μLの鋳型DNA、0.02U/μLのPHUSION(登録商標)ポリメラーゼであった。混合物を、98℃で5分間、18回のPCRサイクル(98℃で30秒、55℃で1分、72℃で4分)、72℃で10分間インキュベートし、4℃で保存した。DpnI(New England Biolabs; Ipswich, MA)を該混合物に0.6U/μLの最終濃度まで添加し、37℃で1時間インキュベートして、もとのDNAを消化した。
その後、5μLの各々の混合物を、製造元の手順(Invitrogen; Carlsbad, CA)に従って、MultiShot(商標) 96-Well Plate TOP10を用いて50μLのケミカルコンピテント大腸菌に形質転換した。形質転換された細胞を、200μLのSOC(Invitrogen; Carlsbad, CA)中、37℃で1時間回復させ、50μg/mLのカナマイシン(Teknova; Hollister, CA)を補充したルリア-ベルターニ(LB)寒天にプレーティングした。37℃で24時間後、コロニーを選んで、7.5％グリセロール及び50μg/mLのカナマイシンを含む200μLのLBに入れ、37℃で24時間成長させた。20μLの培養物をローリングサイクル増幅(RCA)に使用し、T7(5'TAATACGACTCACTATAGG(配列番号7)3')及びT7 term(5'GCTAGTTATTGCTCAGCG(配列番号8)3')プライマーを用いるプライマー伸長によってシークエンシングした。SEQUENCHER(登録商標)ソフトウェア(Gene Codes Corp; Ann Arbor, MI)を用いて配列を解析し、突然変異を含むクローンを選び、96ウェルプレート中に配置した。選択された変異体の終夜培養物を成長させ、製造元(Qiagen; Germantown, MD)による標準的な96ウェルミニプレッププロトコルを用いたプラスミドDNAの調製に使用した。ミニプレップDNAの濃度は、260nm(及び280nm)での吸光度を用いて測定した。
その後、変異体を、下記の変更を加えて、Zawadaらの文献、2011, Biotechnol. Bioeng.108(7) 1570-1578に記載されている通りに、次のように、無細胞タンパク質合成反応で発現させた。非置換トラスツズマブも対照として作製した。無細胞抽出物を、RT(20℃)で30分間、50μMのヨードアセトアミドで処理し、関心対象の変異体由来の重鎖DNAを除く全ての他の成分を含むプレミックスに添加した。無細胞反応を重鎖DNA変異体のプラスミドDNAの添加により開始させ、96ディープウェルプレート中、450rpmで、シェーカー上で、30℃で12時間インキュベートした。反応液を4℃で5時間さらにインキュベートした。タンパク質合成反応液中の最終濃度は、30％細胞抽出物、1mMのパラ-アジドフェニルアラニン(pAzF)(RSP Amino Acids)、0.125mg/mLのメタノカルドコックス・ヤンナスキイ(M jannaschii)アンバーサプレッサーtRNA、0.37mg/mLのメタノカルドコックス・ヤンナスキイpAzF特異的アミノ-アシルtRNAシンセターゼ(FRS)、2mMのGSSG、0.29mg/mLのPDI(Mclab)、100μg/mLの大腸菌DsbC、8mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸アンモニウム、130mMのグルタミン酸カリウム、35mMのピルビン酸ナトリウム、1.2mMのAMP、各々0.86mMのGMP、UMP、及びCMP、2mMのアミノ酸(チロシン及びフェニルアラニンの場合の0.5mMを除く)、4mMのシュウ酸ナトリウム、1mMのプトレシン、1.5mMのスペルミジン、15mMのリン酸カリウム、100nMのT7 RNAP、2μg/mLのトラスツズマブ軽鎖DNA、8μg/mLのトラスツズマブ-(His)6重鎖DNAであった。各々のトラスツズマブ(trastuzamab)変異体を、1mLスケールで、96ディープウェルプレート中、2連で産生した。合計3枚のプレートを用いて変異体を発現させ、各々を非置換トラスツズマブの発現と比較して、プレート全体での発現について正規化した。このようにして産生されたトラスツズマブ変異体は全て、グリコシル化されていなかったことに留意すべきである。
タンパク質合成をモニタリングするために、各々の無細胞タンパク質合成反応液の一部を取り除き、3.33％(v/v)のl-[U-14C]-ロイシン(300mCi/mmole; GE Life Sciences, Piscataway, NJ)を添加した。重鎖の様々な部位でのアンバーコドンの抑制を、還元SDS-PAGEゲルの[14C]-オートラジオグラフィーにより決定した。全長トラスツズマブ重鎖及び抑制されたトラスツズマブ(tastuzumab)重鎖変異体は、SDS-PAGEで50kDに泳動する。抑制されていない(切断された)トラスツズマブ変異体は、より低い分子量に泳動する。重鎖におけるアンバー抑制は、次式により決定される:
Figure 0006498600
 。
バンド強度をImageQuant(Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ)により決定した。切断された変異体を全長産物と区別することができないので、この14Cゲルアッセイを、425(EUインデックス付番)の位置からC末端までの重鎖のTAG変異体の抑制を評価するために使用することができないことに留意すべきである。
合成後、各々1mLの反応液をpH7.4の1mLのPBSで希釈した。混合物を、5000×gで、4℃で15分間遠心分離した。4.2μl/分の流速でゆっくりと上下に4回ピペッティングすることにより、上清を、40μLの樹脂(PhyNexus, Inc.; San Jose, CA)を含むIMAC Phytipで捕捉した。8.3μL/分の流速で上下に2回ピペッティングすることにより、樹脂を925μLのIMAC結合バッファー(50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、10mMイミダゾール)で洗浄した。さらに925μLのIMAC結合バッファーを用いて、このプロセスを1回繰り返した。4.2μL/分の流速で上下に4回ピペッティングすることにより、結合タンパク質を250μLのIMAC溶出バッファー(50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、500mMイミダゾール)で溶出させた。コンストラクトの(his)6タグはC末端であるので、この手順により、全長タンパク質の単離が可能になる。精製後の変異体を定量するために、IMACで精製した試料を2×ゲルローディングバッファー(Bio-Rad# 161-0737)と混合し、4〜15％Stain-Free(商標)ゲル(Bio-Rad Criterion(商標) TGX #567-8085)により分離した。試料は、ゲルのウェルに充填する前に加熱しなかった。タンパク質バンドを可視化し、Image Labソフトウェア(v3)を用いて、Bio-Rad Gel Doc EZシステムにより定量した。試料のバンド強度を、同じゲルに充填されたHERCEPTIN(登録商標)の質量標準に基づいて決定した。
次に、トラスツズマブ変異体を、制約されたシクロオクチン試薬を用いて、例示的な細胞毒性剤MMAFにコンジュゲートした。簡潔に述べると、DBCO-MMAF(構造は図1に示す; ACME Bioscience; Palo Alto, CA)を5mMの最終濃度までDMSOに溶解させた。該化合物をPBSで1mMに希釈し、その後、IMAC溶出バッファー中のトラスツズマブ-(His)6変異体に、100μMの最終薬物濃度まで添加した。混合物をRT(20℃)で17時間インキュベートした。アジ化ナトリウムを100mMの最終濃度まで添加することによって、反応を停止させ、1×PBS中で平衡化したZebaプレート(Thermo Scientific; Waltham, MA)を用いて、バッファー交換した。その後、濾液をMUSTANG(登録商標) Qプレート(Pall Corp.; Port Washington, NY)に通して、内毒素を除去した。
(実施例2)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け)
試料を定量するために、及びトラスツズマブ変異体薬物コンジュゲートの薬物-抗体比を決定するために、次のように、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を実施した。試料及び標準を、ミリQ水中に調製した3M硫酸アンモニウム(EMD Chemical)、50mMリン酸ナトリウムpH 7.0(Mallinckrodt)に1:2希釈した。Agilent 1100バイナリーポンプHPLCシステムに、Tosoh Bioscience LLC TSK-ゲルButyl-NPR(登録商標)(4.6mm×3.5cm)カラムを、30℃のカラム区画温度にして装備した。移動相Aは、1.5M硫酸アンモニウム、50mMリン酸ナトリウム、pH 7.0であった。移動相Bは、80:20の水:イソプロピルアルコール(Honeywell)中の50mMリン酸ナトリウム、pH 7.0であった。移動相は、1.0mL/分の流速で供給した。分離は、10分間に15％移動相Bから100％移動相Bの線形勾配で実施した。UVデータは、210nmと280nmの両方で取得した。ピーク面積は、Chemstationソフトウェア(Agilent)を用いて定量し、薬物抗体比(DAR)は、全ピーク面積のパーセントから算出した。
コンジュゲート型トラスツズマブ変異体の結合を評価するために、HER2を発現する細胞に対する結合アッセイを次のように実施した。1細胞当たり1,500,000を超える受容体コピーでHER2/c-erb-2遺伝子産物を過剰発現するSKBR3細胞(ATCC # HTB-30, Manassas, VA)上のHER2に対する精製されたコンジュゲート型変異体の結合を、臨床等級のHerceptin(登録商標)、無細胞タンパク質合成によって産生された非グリコシル化トラスツズマブ、又は陰性対照としてのヒト血清IgG1(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)と比較した。SKBR3細胞を、10％熱非働化胎仔ウシ血清(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)、2mM glutamax(Invitrogen; Carlsbad, CA)、及び1×ペニシリン(Pencillin)/ストレプトマイシン(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)を補充したDMEM:Ham's F-12(50:50)、高グルコース(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)中で培養した。接着細胞をカルシウム及びマグネシウム非含有ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、HYQ(登録商標)TASE(商標)(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)を用いて回収した。10μLの総容量中、試料当たり合計200,000個の細胞を、10μLのFACSバッファー(1％ウシ血清アルブミンを補充したDPBSバッファー)中に作製したコンジュゲート型トラスツズマブ変異体、臨床等級HERCEPTIN(登録商標)、又は非グリコシル化トラスツズマブのいずれかの連続希釈液とともにインキュベートした。細胞に抗体又はADCを加えたものを、氷上で60分間インキュベートした。未染色の細胞、ヒトIgG1(アイソタイプ対照)、及び二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG)を対照として使用した。細胞を氷冷FACSバッファーで2回洗浄し、5μg/mlのAlexa 647標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体抗体(Invitrogen; Carlsbad, CA)のいずれかとともに氷上で1時間インキュベートした。全ての試料を、FACSバッファーを用いて洗浄し、BD FACS Caliburシステム(BD Biosciences; San Jose, CA)を用いて解析した。
平均蛍光強度を、GraphPad Prism(GraphPad v 5.00, ソフトウェア; San Diego, CA)を用いて、一部位特異的結合方程式を用いる非線形回帰分析を用いてフィッティングさせた。データを、相対MFI対抗体又は抗体変異体の濃度としてμg/mlで表した。
次に、細胞殺傷に対するコンジュゲート型トラスツズマブの効果を細胞増殖アッセイで次のように測定した。SKBR3及びMDA-MB-468をATCCから入手し、10％熱非働化胎仔ウシ血清(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)、2mM glutamax(Invitrogen; Carlsbad, CA)、及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)を補充したDMEM:Ham's F-12(50:50)、高グルコース(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)中で維持した。接着細胞をカルシウム及びマグネシウム非含有ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、HYQ(登録商標)TASE(商標)(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)を用いて回収した。合計103個の細胞を96-ウェルのハーフエリア平底白色ポリスチレンプレートに40μlの容量で播種した。該細胞を、CO2インキュベーター中、37℃で一晩接着させておいた。ADC変異体をDMEM/F12培地中に2×濃度で準備し、MultiScreen HTS 96-ウェルフィルタープレート(Millipore; Billerica, MA)に通して濾過した。フィルター滅菌したコンジュゲート型トラスツズマブ変異体、HERCEPTIN、又は非グリコシル化トラスツズマブを処理用ウェルに添加し、プレートを、CO2インキュベーター中、37℃で120時間培養した。細胞生存率測定のために、80μlのCell Titer-Glo(登録商標)試薬(Promega Corp.; Madison, WI)を各ウェルに添加し、プレートを製品説明書の通りに処理した。相対発光をENVISION(登録商標)プレートリーダー(Perkin-Elmer; Waltham, MA)で測定した。相対発光読取値を、未処理の細胞を対照として用いて、％生存に変換した。データを、GraphPad Prism(GraphPad v 5.00, ソフトウェア; San Diego, CA)を用いて、log(阻害剤)対応答-可変勾配、4パラメータフィット方程式を用いる非線形回帰分析でフィッティングさせた。データを、ADCの用量と比べた相対細胞生存率、ATP含有量％として、μg/mlで表した。
これらの特徴付け実験の陽性結果を、表1、2、及び3(それぞれ、プレート1、2、及び3)に示す。これらの表には、変異体の以下の特性が示されている:作製されたタンパク質の順位及び濃度、野生型と比較した全長産物の発現効率(抑制効率)、HER2発現細胞に結合する能力、薬物-抗体比(抗体1つ当たりの細胞毒性剤の数として表示)、HICプロファイルに関するコメント、及び上記の細胞殺傷アッセイからの観察されるIC50。HICアッセイに関するコメントにおいて、単一ピークは、単一ピークとして良好に分離したプロファイルに対応し(そのようなプロファイルの例は、図2として示されている)、NWRは、分離が不十分なプロファイルに対応し(そのようなプロファイルの例は、図3として示されている)、WRは、分離が良好なHICプロファイルに対応する(そのようなプロファイルの例は、図4として示されている)。単一ピークプロファイルを示す変異体のいくつかは、強力な細胞殺傷も示した。これは、該変異体が、実際には、薬物とコンジュゲートされていたが、HICカラムで分離しなかったことを示している。
一般に、好ましい変異体は、約20ng/ml以下、さらにより好ましくは、約10ng/ml未満、さらにより好ましくは、約5ng/ml未満のIC50を示す。好ましくは、変異体は、発現の上位50％に入り、さらにより好ましくは発現の上位25％に入る。少なくとも約1.0のDARを有する変異体も好ましい。好ましい変異体には、位置
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 を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。さらにより好ましいのは、位置
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 を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体である。さらにより好ましいのは、位置
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 を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体である。位置V005、A084、A118、S132、S136、S239、E293、K334、R355、Q342、T359、及びN389を置換する非天然アミノ酸を有する変異体を特に好ましいものとして同定した。
発現、抑制効率、コンジュゲーション効率、細胞結合、及び細胞殺傷は、Fcの公表されている結晶構造に基づいて予想できないことにも注目した。例えば、E293及びK334は、Fc構造内のそれらの位置に基づくと、芳香族フェニルアラニン誘導体による置換を受け入れることが予測されないが、どちらも良好に発現し、それぞれ、2.7及び3.0ng/mlのIC50値を有する、強力なキラーである。逆に、S131は、重鎖表面でのその利用可能性に基づくと、コンジュゲーションのための優良な位置であることが予測されるが、この位置で置換を有する誘導体は、不良なコンジュゲーター(0.65のDAR)及び不良なキラー(27.1ng/mLのIC50)である。したがって、発現、抑制、コンジュゲーション、及び細胞殺傷のための最適部位を同定するためには、実験が必要であると結論付けられる。
トラスツズマブのN結合型グリコシル化部位N297付近の部位が、コンジュゲーションによく適していることが分かったことにも注目すべきである。特に、R292からR301、V303、及びV305に至る部位は、望ましい細胞殺傷及び/又はコンジュゲーション特性を示すことが分かった。トラスツズマブ変異体の非グリコシル化形態が上記のような無細胞タンパク質合成反応で産生されるために、これらの部位を評価することができた。
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(実施例3)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートにおける非天然アミノ酸の組み込みの忠実度)
この実施例は、例示的な抗体-薬物コンジュゲートへの非天然アミノ酸の組み込みの忠実度の評価を記載している。S136で置換されるp-アジド-フェニルアラニンで置換され、DBCO-MMAFとコンジュゲートされたトラスツズマブをトリプシンで消化し、ナノ-エレクトロスプレーChipCube源を備えたAgilent 6520 Accurate Mass Q-TOF LC-MSシステムで分析した。誤って組み込まれた可能性のあるアミノ酸及びその野生型対応物を含有するペプチドを、LC-MSデータからの抽出イオンクロマトグラムを用いて、z＝1〜4の電荷状態のペプチドについての理論m/zの±10ppm以内で検索した。実測ピークのm/zが、理論m/zの±10ppm以内、かつ正確な電荷状態である場合、それを、MS/MS検証までの潜在的一致とみなした。誤組み込みによるシグナルがない場合は、シグナルを質量スペクトル中のノイズ以下のものであると考えた。最小忠実度率をノイズ対シグナル比として算出した。シグナルを、最も豊富な電荷状態についてのペプチドの溶出プロファイルにわたる全モノアイソトピックイオンの平均として測定し、ノイズを、最小量のシグナルを示す領域に隣接する領域中の同じスペクトル中で推定した。誤組み込み事象を含む観測ペプチドが見つかった場合、その平均シグナルをノイズ測定の代わりに使用した。
試験された抗体-薬物コンジュゲートのペプチドマップにおいて、nnAA＋コンジュゲート型薬物を有するペプチドは、電荷状態2及び3で検出され、誤差は4ppm未満であった。位置136において、チロシンの組み込みは存在せず、pAzPheの組み込み効率は、98.3％であると決定された。チロシンの誤組み込みは、検出されたIgG配列にわたるPhe位置で検出されなかった。Pheの全体的な組み込み効率は、最低でも99.7％であると測定された。
(実施例4)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの熱安定性の評価)
この実施例は、非グリコシル化トラスツズマブ及びトラスツズマブ変異体の熱安定性(Tm)を測定するために設計された実験を記載している。熱シフトアッセイを、アッセイすべきタンパク質(Sutroceptin及び変異体)を環境感受性色素(SYPRO Orange, Life Technologies Cat #S-6650)と緩衝化溶液(PBS)中で混合し、該混合物の蛍光を、それが制御された熱変性を受けているときにリアルタイムでモニタリングすることによって実施した。アッセイ混合物中のタンパク質の最終濃度は100〜250μg/mLであり、色素はオリジナルストックから1:1000希釈した(ストック色素はDMSO中5000×である)。タンパク質-色素混合物の5μLアリコートを384-ウェルマイクロプレート(Bio-Rad Cat #MSP-3852)に分配した後、プレートを光学的に透明なシーリングフィルム(Bio-Rad Cat #MSB-1001)で密閉し、384-ウェルプレートリアルタイムサーマルサイクラー(Bio-Rad CFX384 Real Time System)に入れた。タンパク質-色素混合物を、各温度で3秒間平衡化させて、1サイクル当たり0.1℃ずつ(1分当たり〜1.5℃)、25℃から95℃に加熱し、その後、蛍光測定を行った。実験の最後に、Bio-Rad CFXマネージャーソフトウェアを用いて、融解温度(Tm)を決定した。複雑な熱転移プロファイルを有するタンパク質試料については、融解温度(Tm)を、温度(X-軸)に対する蛍光強度(Y-軸)の負の一階微分プロットから、又はデータをボルツマンシグモイドモデルにフィッティングさせることによって算出する。野生型タンパク質と比較したIgG変異体の融解温度の差が、アッセイされているタンパク質についての熱シフトの大きさである。
特定の変異体についてのこのアッセイの結果を表4に示す。一般に、非置換トラスツズマブを顕著に下回るTm、特にTm1の偏差は、望ましくない安定性喪失及び/又は凝集傾向を示す。したがって、非置換トラスツズマブの約5℃以内のTm1及び/又はTm2を示すトラスツズマブ変異体が好ましい。より好ましいのは、非置換トラスツズマブの約3℃以内のTm1及び/又はTm2を示す変異体である。さらにより好ましいのは、非置換トラスツズマブの約2℃以内のTm1及び/又はTm2を示す変異体である。さらにより好ましいのは、非置換トラスツズマブの約1℃以内のTm1及び/又はTm2を示す変異体である。Tm1及びTm2は、非コンジュゲート型又はコンジュゲート型形態で測定することができる。
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(実施例5)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け:軽鎖置換)
実施例9に記載の方法を用いて、軽鎖置換を有する変異体を作製し、解析した。これらの特徴付け実験の結果を表5に示す。
Figure 0006498600
好ましい変異体には、軽鎖(LC)の次の位置: A043、Y049、S056、G057、S060、S067、G068、T109、A112、S114、A144、A153、S156、G157、S168、A184、S202、S203、及びT206を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。
少なくとも約1.0のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、軽鎖の次の位置: A043、Y049、S056、G057、S060、S067、G068、T109、A112、A144、A153、S156、S168、A184、S202、及びS203を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.2のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、軽鎖の次の位置: A043、Y049、S056、G057、S060、S067、G068、T109、A144、A153、S156、A184、S202、及びS203を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.5のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、軽鎖の次の位置: Y049、S056、G057、S060、S067、T109、A153、S202、及びS203を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
(実施例6)
(RF-1減弱化抽出物におけるHC-F404の発現の評価)
非天然アミノ酸の組み込みに対するRF-1減弱化大腸菌株の使用の効果をまず評価するために、RF-1陽性株であまり発現されない12の変異体を発現させ、RF-1減弱化株でスケールアップした。そのような変異体の1つであるHC-F404は、以下で論じるような、並外れて望ましい特性を示した。
この無細胞タンパク質合成反応に使用される無細胞抽出物をOmpT感受性RF-1減弱化大腸菌株から調製した。この株は、アンバー停止コドンで非天然アミノ酸を挿入するための直交CUAをコードするtRNAを産生するようにも改変されている。HC-F404及びWT LCをコードするDNA鋳型を添加した後、無細胞反応液を、フラワープレート(m2p-labs # MTP-48-B)中、1mlスケール×6回(合計9ml)で、650rpmで、シェーカー上で、30℃で12時間インキュベートした。その後、タンパク質を、Protein Maker(Emerald Bio)を用いて、プロテインA及びCapto Adhere樹脂で精製した。
さらなる解析のための薬物(DBCO-MMAF)とのコンジュゲーション及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)の調製を先に記載されている通りに行った。
変異体のThermofluor解析を、先に記載されている通りに実施した。
TAGスキャン時と中間スケールの両方において作製されたHC変異体F404は、良好な細胞殺傷能力(TAGスキャンI: IC50＝0.018nM;中間スケールアップ: IC50＝0.023nM)を示したが、そのHICプロファイルに基づくDAR推定は、おそらくはHIC分析時に薬物が分析用カラムにアクセスできなかったことによるピークの分離の悪さのために、問題があることが分かった。しかしながら、MS分析により、それが1.74のDARを有することが示された。また、thermofluor解析により、ADC型のHC-F404が、抗体のみと比較して、改善された(より高い熱安定性の)Tm1(2.2℃の増加)を有することが示された。
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(実施例7)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け:終結因子解析)
(TAGスキャンI 方法及び選択された変異体のリスト)
無細胞タンパク質合成反応に使用される無細胞抽出物をOmpT感受性RF-1減弱化大腸菌株から調製した。この株は、アンバー停止コドンで非天然アミノ酸を挿入するための直交CUAをコードするtRNAを産生するようにも改変されている。DNA鋳型の添加後、無細胞反応液を、フラワープレート(m2p-labs # MTP-48-B)中、650rpmで、シェーカー上で、30℃で12時間インキュベートした。軽鎖変異体(軽鎖上にnnAA組み込みを有する変異体)の合成のために、4ug/mLの軽鎖DNA対8μg/mLの重鎖DNAのDNA比を用いた。各々のトラスツズマブ変異体を、1mLスケールで、48-ウェルフラワープレート中、単独で(in singlicate)産生した。合計6枚のプレートを用いて、該変異体を発現させた。
4.2ul/分の流速でゆっくりと上下に10回ピペッティングすることにより、上清を、40μLの樹脂を含むIMAC Phytipで捕捉した。結合タンパク質を125μLのIMAC溶出バッファー(50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、500mMイミダゾール)で溶出させた。精製後、同じProtein Express LabChip(Caliper LifeSciences # 760499)上で泳動させたHERCEPTIN(登録商標)の質量標準と比較することにより、IMAC精製変異体をCaliper GXIIシステムで定量した。Caliperシステムで解析する前に(試料バッファー中で混合した)試料を65℃で10分間加熱することを除き、Protein Express Reagent Kit(Caliper Life Sciences # 760328)に規定されている通りに、試料を解析用に調製した。
さらなる解析のための薬物(DBCO-MMAF)とのコンジュゲーション及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)の調製を先に記載されている通りに行った。
これらの特徴付け実験の陽性結果を表7に示す。この表には、変異体の以下の特性が示されている:作製された抗体-薬物コンジュゲートの最終濃度、HER2発現細胞に結合する能力、薬物-抗体比(DAR、抗体1つ当たりの細胞毒性剤の数として表示)、HICプロファイルに関するコメント、及び先に記載された細胞殺傷アッセイからの観察されるIC50。HICアッセイに関するコメントにおいて、SPは、単一ピークとして良好に分離したプロファイルに対応し、NWRは、分離が不十分なプロファイルに対応し、WRは、分離が良好なHICプロファイルに対応する。単一ピークプロファイルを示す変異体のいくつかは、強力な細胞殺傷も示した。これは、該変異体が、実際には、薬物とコンジュゲートされていたが、HICカラムで分離しなかったことを示している。
Figure 0006498600
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好ましい変異体には、重鎖(HC)の次の位置:
Figure 0006498600
 を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。
少なくとも約0.7のDARを有する変異体も好ましい。好ましい変異体には、重鎖(HC)の次の位置:
Figure 0006498600
 を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。
少なくとも約1.0のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、重鎖の次の位置:
Figure 0006498600
 を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.2のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、重鎖の次の位置: A023、A084、A118、S119、T135、S136、G137、S160、G161、A162、T195、T197、S219、V282、Y296、V422、S440、S267、E272、E293、N297、S298、V303、V305、K334、K340、G341、Q342、R355、K392、F404、S424、Q438、S442 及びL443を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.5のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、重鎖の次の位置: A023、A084、A118、S119、T135、S136、S160、A162、T195、S219、V282、Y296、S267、E293、N297、S298、V303、V305、K334、K340、G341、K392、F404、及びQ438を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
(実施例8)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け:さらなる終結因子解析)
(TAGスキャンII 方法及び選択された変異体のリスト)
無細胞タンパク質合成反応に使用される無細胞抽出物をOmpT感受性RF-1減弱化大腸菌株から調製した。この株は、アンバー停止コドンで非天然アミノ酸(p-アジド-フェニルアラニン)を挿入するための直交CUAをコードするtRNAを産生するようにも改変されている。DNA鋳型の添加後、無細胞反応液を、フラワープレート(m2p-labs # MTP-48-B)中、650rpmで、シェーカー上で、30℃で12時間インキュベートした。軽鎖変異体(軽鎖上にnnAA組み込みを有する変異体)の合成のために、4μg/mLの軽鎖DNA対8μg/mLの重鎖DNAのDNA比を用いた。各々のトラスツズマブ変異体を、1mLスケールで、48-ウェルフラワープレート中、単独で産生した。合計6枚のプレートを用いて、該変異体を発現させた。
4.2μL/分の流速でゆっくりと上下に10回ピペッティングすることにより、上清を、40μLの樹脂を含むIMAC Phytipで捕捉した。結合タンパク質を125μLのIMAC溶出バッファー(50mM Tris pH 8.0、300mM NaCl、500mMイミダゾール)で溶出させた。精製後、同じProtein Express LabChip(Caliper LifeSciences # 760499)上で泳動させたHERCEPTIN(登録商標)の質量標準と比較することにより、IMAC精製変異体をCaliper GXIIシステムで定量した。Caliperシステムで解析する前に(試料バッファー中で混合した)試料を65℃で10分間加熱することを除き、Protein Express Reagent Kit(Caliper Life Sciences # 760328)に規定されている通りに、試料を解析用に調製した。
さらなる解析のための薬物(DBCO-MMAF)とのコンジュゲーション及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)の調製を先に記載されている通りに行った。
これらの特徴付け実験の陽性結果を表8に示す。この表には、変異体の以下の特性が示されている:作製された抗体-薬物-コンジュゲートの最終濃度、野生型と比較した全長産物の発現効率(抑制効率)、HER2発現細胞に結合する能力、薬物-抗体比(DAR、抗体1つ当たりの細胞毒性剤の数として表示)、HICプロファイルに関するコメント、及び先に記載された細胞殺傷アッセイからの観察されるIC50。HICアッセイに関するコメントにおいて、SPは、単一ピークとして良好に分離したプロファイルに対応し、NWRは、分離が不十分なプロファイルに対応し、WRは、分離が良好なHICプロファイルに対応する。単一ピークプロファイルを示す変異体のいくつかは、強力な細胞殺傷も示した。これは、該変異体が、実際には、薬物とコンジュゲートされているが、HICカラムで分離しなかったことを示している。
全体で、記載されているような活性についてスクリーニングされた269の部位に非天然アミノ酸を有するトラスツズマブ変異体。表8は、望ましいDAR、発現プロファイル、抑制効率、及び/又はIC50値を有していた71の変異体を示している。これらの特性はいずれも、実験前には予測することができず、各々の個々の特性についての何倍もの値が、試料内で予測不可能に変動した。例えば、一般に、高いDARを有する変異体は、低いDARを有する変異体よりも低いIC50値を示すと考えられる。それにもかかわらず、例えば、0.6という比較的低いDARを示すI51変異体は、それでも、1ng/mlというIC50を示した。
Figure 0006498600
Figure 0006498600
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好ましい変異体には、重鎖(HC)の次の位置: G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、I051、Y052、T053、Y056、S070、N082A、D098、F100、T110、S112、K121、Y180、S184、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、及びG236を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。
少なくとも約0.7のDARを有する変異体も好ましい。好ましい変異体には、重鎖(HC)の次の位置: G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、Y052、T053、Y056、S070、N082A、F100、T110、S112、K121、Y180、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、及びG236を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。
少なくとも約1.0のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、重鎖の次の位置: G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、Y052、T053、Y056、S070、N082A、F100、T110、S112、K121、Y180、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、及びG236を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.2のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、重鎖の次の位置: G042、Q003、S007、P014、G016、R019、S025、A040、K043、Y052、S070、N082A、F100、T110、S112、K121、Y180、S190、S192、K214、E216、D221、K222、T225、P227、P230、A231、P232、及びG236を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.5のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、重鎖の次の位置: S007、P014、R019、S025、A040、K043、Y052、S070、F100、T110、S112、K121、Y180、K214、E216、K222、P227、P230、A231、P232、及びG236を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
好ましい変異体には、軽鎖(LC)の次の位置:マイナス1、Q003、T005、S007、P008、S009、S010、G016、D017、R018、T020、T022、S026、Q027、K045、V058、S063、S065、R066、D070、S077、Q079、K107、N138、R142、E143、N152、S171、S182、K188、Q199、及びL201を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。
少なくとも約0.7のDARを有する変異体も好ましい。好ましい変異体には、軽鎖の次の位置:マイナス1、Q003、T005、S007、P008、S009、G016、D017、R018、T020、T022、S026、Q027、K045、V058、S063、S065、R066、D070、S077、Q079、K107、R142、E143、N152、S171、S182、K188、Q199、及びL201を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれる。
少なくとも約1.0のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、軽鎖の次の位置:マイナス1、Q003、T005、S007、P008、S009、G016、D017、R018、T020、T022、S026、Q027、K045、V058、S063、S065、R066、D070、S077、Q079、K107、R142、N152、S171、S182、K188、及びQ199を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.2のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、軽鎖の次の位置:マイナス1、T005、S007、P008、G016、D017、R018、T020、T022、Q027、K045、V058、S063、S077、Q079、K107、R142、N152、S182、K188、及びQ199を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
少なくとも約1.5のDARを有する変異体も好ましい。さらにより好ましいのは、軽鎖の次の位置:マイナス1、G016、S063、及びQ199を置換する非天然アミノ酸を有するものを含む、変異体であった。
(実施例9)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け:スケールアップ解析)
(TAG IIスキャンからの選択された変異体のスケールアップ)
さらなる特徴付けのための材料を作製するために、DAR及び細胞殺傷データに基づいて、望ましい特徴を有するトラスツズマブ変異体のサブセットを小規模無細胞発現用に選んだ。小規模産生用に選択された重鎖変異体は: R019、S025、I051、S070、D098、T110、S112、K121、S136、Y180、S187、S190、K214、E216、D221、及びK222であった。小規模産生用に選択された軽鎖変異体は:(-)1、S007、P008、G016、T022、S063、R014、D070、N138、R142、E143、及びN152であった。
変異体が合成される無細胞反応混合物は、それぞれ、OmpT感受性RF-1減弱化大腸菌株から作製された無細胞抽出物と直交CUAをコードするtRNAを発現するように改変されたOmpT感受性RF-1減弱化大腸菌株の80％:20％ブレンドから構成されていた。全ての変異体をフラワープレート中で9mlにスケールアップし(1.5mL×6回の複製)、Protein Maker(Emerald Bio)を用いて精製した。
さらなる解析のための薬物(DBCO-MMAF)とのコンジュゲーション及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)の調製を先に記載されている通りに行った。
これらの特徴付け実験の陽性結果を表9に示す。この表には、変異体の以下の特性が示されている:作製された抗体-薬物-コンジュゲートの最終濃度、野生型と比較した全長産物の発現効率(抑制効率)、HER2発現細胞に結合する能力、薬物-抗体比(DAR、抗体1つ当たりの細胞毒性剤の数として表示)、HICプロファイルに関するコメント、及び先に記載された細胞殺傷アッセイからの観察されるIC50。HICアッセイに関するコメントにおいて、SPは、単一ピークとして良好に分離したプロファイルに対応し、NWRは、分離が不十分なプロファイルに対応し、WRは、分離が良好なHICプロファイルに対応する。
Figure 0006498600
(実施例10)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け: Thermofluor解析)
変異体のThermofluor解析を先に記載されている通りに実施した。Thermofluorの結果を表10に示す。
Figure 0006498600
thermofluor解析にかけた変異体には、重鎖の次の位置: R019、S025、I051、S070、T077、Y079、D098、T110、S112、K121、S136、Y180、S187、S190、K214、E216、D221、及びK222を置換する非天然アミノ酸を有するものが含まれた。
thermofluor解析にかけた変異体には、軽鎖の次の位置:マイナス1、S007、P008、G016、T022、S063、D070、N138、R142、E143、N152、及びL201を有するものも含まれた。
(実施例11)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け:動力学解析)
(選択された変異体のコンジュゲーション動力学)
コンジュゲーションの割合を、幅広い薬物対抗体コンジュゲート比を示す5つの変異体について決定した。該変異体を、薬物(DBCO-MMAF)と、PBS(pH7.4)中、20℃で、2連で、15分間、30分間、1時間、2時間、4時間、8時間、及び16時間混合することにより、反応を開始させた。混合物中の抗体の最終濃度は、0.2〜2uMの範囲である。全ての反応についての最終薬物濃度は100uMである。インキュベーション期間の最後に、アジ化Naを混合物に10mMの最終濃度まで添加した。最終混合物を、先に記載されている通りにZeba及びMustangQプレートにより精製した。IgGの濃度を、Herceptinを質量標準として用いて、Caliperにより決定した。完全コンジュゲート型変異体の割合を、先に記載されている通りに、HICにより決定した。
Figure 0006498600
図5A及び5Bは、2つの変異体(HC T110及びHC S112)のHICトレースを示している。該トレースは、それぞれ、非コンジュゲート型IgG、単一コンジュゲート型IgG、及び完全コンジュゲートIgGを含むピークに対応する、3つのピーク(P0、P1、及びP2)を示した。
図6A〜6Eは、パラ-アジドフェニルアラニン(pAzF)変異体のコンジュゲーションが部位特異的であることを示している。単一コンジュゲート型抗体と完全コンジュゲート型抗体の全ての割合をHICにより分離した。
(実施例12)
(例示的な抗体-薬物コンジュゲートの特徴付け:抑制比較解析)
(パラ-アジドフェニルアラニン(pAzF)及びパラ-アジドメチルフェニルアラニン(pAzMeF)による抑制の比較)
広範な抑制効率を有する11の変異体を、下記の変更を加えて、Zawadaらの文献、2011, Biotechnol. Bioeng.108(7): 1570-1578に記載されている通りに、次のように、無細胞タンパク質合成反応で発現させた。非置換トラスツズマブも対照として作製した。tRNA及びOmpT感受性RF1(株16/23の80/20ブレンド)を含む無細胞抽出物を、RT(20℃)で30分間、50μMのヨードアセトアミドで処理し、GSSG、非天然アミノ酸、tRNAシンセターゼ、T7 RNAP、DsbC、PDI、及び鋳型DNAを除く全ての他の成分を含むプレミックスに添加した。その後、DNAを除く全ての残りの試薬を該混合物に添加した。無細胞反応を、選択された変異体のプラスミドDNAの添加により開始させ、96ディープウェルプレート中、450rpmで、シェーカー上で、30℃で12時間インキュベートした。反応液を4℃で5時間さらにインキュベートした。タンパク質合成反応液中の最終濃度は、30％細胞抽出物、0.37mg/mLのメタノカルドコックス・ヤンナスキイpAzF特異的アミノ-アシルtRNAシンセターゼ(FRS)を伴う1mMのパラ-アジドフェニルアラニン(pAzF)(RSP Amino Acids)又は0.37mg/mLのp-シアノフェニルアラニン特異的アミノアシル-tRNAシンセターゼ(Youngらの文献、2011, Biochem. 50: 1894-1900)を伴う1mMのパラ-アジドメチルフェニルアラニン(pAzMeF)、2mMのGSSG、0.29mg/mLのPDI(Mclab)、100μg/mLの大腸菌DsbC、8mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸アンモニウム、130mMのグルタミン酸カリウム、35mMのピルビン酸ナトリウム、1.2mMのAMP、各々0.86mMのGMP、UMP、及びCMP、2mMのアミノ酸(チロシン及びフェニルアラニンの場合の0.5mMを除く)、4mMのシュウ酸ナトリウム、1mMのプトレシン、1.5mMのスペルミジン、15mMのリン酸カリウム、100nMのT7 RNAP、2μg/mLのトラスツズマブ軽鎖DNA、8μg/mLのトラスツズマブ-(His)6重鎖DNAであった。各々のトラスツズマブ変異体を、各々の変異体について14Cを用いて、100uLスケールで、96ディープウェルプレート中、2連で産生した。このようにして産生されたトラスツズマブ変異体は全て、グリコシル化されていなかったことに留意すべきである。
タンパク質合成をモニタリングするために、反応液に、3％(v/v)のl-[U-14C]-ロイシン(300mCi/mmole; GE Life Sciences, Piscataway, NJ)を添加した。重鎖及び軽鎖の様々な部位でのアンバーコドンの抑制を、還元SDS-PAGEゲルの[14C]-オートラジオグラフィーにより決定した。全長トラスツズマブ重鎖及び抑制されたトラスツズマブ重鎖変異体は、SDS-PAGEで50kDに泳動する。全長トラスツズマブ重鎖及び抑制されたトラスツズマブ軽鎖変異体は、SDS-PAGEで30kDに泳動する。抑制されない(切断された)トラスツズマブ変異体は、より低い分子量に泳動する。重鎖又は軽鎖におけるアンバー抑制は、次式により決定される:
Figure 0006498600
 。
バンド強度をImageQuant(Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ)により決定した。図7Aでは、pAzF及びpAzMeF変異体の抑制効率が比較されている。抑制効率は、野生型HCバンド強度と比べた変異体HCバンド強度又は野生型LCバンド強度と比べた変異体LCバンド強度として算出される。図7Bでは、pAzF及びpAzMeF変異体の可溶性IgG収量が比較されている。IgGの量は、式:可溶性カウント/総カウント*IgGバンド強度/全レーン強度*2*74008.02Da/47ロイシンに従って計算される。
(実施例13)
(別の抗体への非天然アミノ酸組み込み部位の移転)
非天然アミノ酸の組み込み部位を、予測可能なDARを有する2つの異なるIgG配列間で移転することができるかどうかを検討するために、代表的な部位で非天然アミノ酸を含む第二の抗体を評価した。この実験のために、ブレンツキシマブを第二の抗体(配列番号:3及び配列番号:4参照)として選んだ。いくつかの部位を、様々なDARを示すトラスツズマブ突然変異生成研究から選んだ。重鎖において、部位は、K121、Y180、K133、S157、F126、及びP127(EU付番)に対応した。軽鎖において、部位は、R142、N152、Q147、E161、K149、及びQ155(EU付番)に対応した。標準的な迅速変化に基づく部位特異的突然変異生成を用いて、TAG停止コドンをブレンツキシマブ配列中に挿入し、各々の変異体の同一性をDNAシークエンシングにより確認した。無細胞タンパク質合成反応を推進させる鋳型として使用するためのミニプレップDNAを、Qiagenキットを用いて調製した。
変異体を、OmpT感受性RF-1タンパク質及びインビボで発現させた直交CUAをコードするtRNAを含む反応混合物中で合成した。全ての変異体を、フラワープレート中、9mlまでスケールアップし(1.5mL×6回の複製)、Protein Maker(Emerald Bio)を用いて精製した。
さらなる解析のための薬物(DBCO-MMAF)とのコンジュゲーション及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)の調製を先に記載されている通りに行った。DARを、先に記載されているHICプロファイリング法により同定した。
実験の結果から、該部位を、一般に、2つの異なるIgG間で予測通りに移転することができることが示唆される。
Figure 0006498600
Figure 0006498600
ブレンツキシマブコンジュゲートをさらに特徴付けるために、重鎖位置K121もしくはF404又は軽鎖位置N152にアンバー突然変異を含む変異体をスケールアップ及びさらなる特徴付け用に選択した。対照として、F404にアンバー突然変異を含むトラスツズマブも発現させた。重鎖上の位置K121及びF404及び軽鎖上のN152に対応するヌクレオチドでの重複PCR突然変異生成によって、TAGコドンを挿入し、発現ベクターpYD317に別々にクローニングした。
ブレンツキシマブ及びトラスツズマブ変異体が合成される無細胞反応混合物は、OmpT感受性RF-1減弱化大腸菌株、及びアンバー停止コドンで非天然アミノ酸を挿入するための直交CUAをコードするtRNAを産生するようにも改変されているOmpT感受性RF-1減弱化大腸菌株から作製される無細胞抽出物のブレンドを含んでいた。該変異体を、下記の変更を加えて、Zawadaらの文献、2011, Biotechnol. Bioeng.108(7) 1570-1578に記載されている通りに、無細胞タンパク質合成反応で発現させた。無細胞抽出物を、RT(20℃)で30分間、50μMのヨードアセトアミドで処理し、関心対象の変異体をコードするDNAを除く全ての他の成分を含むプレミックスに添加した。タンパク質合成反応液中の最終濃度は、30％細胞抽出物、1mMのパラ-アジドメチルフェニルアラニン(pAzMeF)(RSP Amino Acids)、0.37mg/mLのメタノカルドコックス・ヤンナスキイpAzMeF特異的アミノ-アシルtRNAシンセターゼ(FRS)、2mMのGSSG、0.29mg/mLのPDI(Mclab)、30μg/mLの大腸菌DsbC、8mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸アンモニウム、130mMのグルタミン酸カリウム、35mMのピルビン酸ナトリウム、1.2mMのAMP、各々0.86mMのGMP、UMP、及びCMP、2mMのアミノ酸(チロシン及びフェニルアラニンの場合の0.5mMを除く)、4mMのシュウ酸ナトリウム、1mMのプトレシン、1.5mMのスペルミジン、15mMのリン酸カリウム、100nMのT7 RNAPであった。最適条件を見つけるために、HC対LCのプラスミド比: 3:1、2:1、1:1、及び1:2を検討した。総プラスミド濃度を10ug/mLで一定に保った。DNA鋳型の添加後、無細胞反応液を、ペトリ皿上で、30℃で12時間インキュベートし、その後、14Cアッセイ解析を行った。最大収量は、1:1の比で達成された。10mLの無細胞反応をこの条件下で実施した。
変異体を精製するために、各々の変異体についての10mlの粗無細胞液を平衡化バッファー(50mMリン酸ナトリウム、pH 7)で1:0.5にまず希釈し、11,000×gで30分間スピンした。その後、上清を0.45ミクロンシリンジフィルターに通した後、2分間の滞留時間で、予め平衡化された1mL MabSelect Sure HiTrap(GE Lifesciences)に充填し、IgG変異体を捕捉した。その後、カラムを、7.5CV(カラム容量)の洗浄バッファー1(100mMリン酸ナトリウム及び800mMアルギニン、pH 7)、次いで、7.5CVの洗浄バッファー2(50mMリン酸ナトリウム及び0.5％(v/v)Triton X-100、pH 7.3)で洗浄した。7.5CVの平衡化バッファーで洗浄した後、各々の変異体を4CVの溶出バッファー(100mMクエン酸ナトリウム及び300mMアルギニン、pH 3)で溶出させた。30％(v/v)の1M Tris、pH9の添加により、溶出プールをpH 7に調整した。
回収した溶出プールを、10kD Slide-A-Lyzer(Pierce)ユニットでの終夜透析により、PBSにバッファー交換した。その後、透析した材料を、Amicon Ultra-15(Millipore)遠心分離フィルターユニットを用いて、5〜10mg/mLの濃度にまで濃縮した。
精製した変異体を次のようにコンジュゲートした。DBCO-MMAF 2(ACME Bioscience; Palo Alto, CA)をDMSOに5mMの最終濃度まで溶解させた。化合物をPBSで1mMの濃度に希釈し、その後、IMAC溶出バッファー中の精製トラスツズマブ変異体に添加して、100μMの最終薬物濃度を達成した。混合物をRT(20℃)で17時間インキュベートした。アジ化ナトリウムを100mMの最終濃度まで添加することにより、反応を停止させ、1×PBS中で平衡化したZebaプレート(Thermo Scientific; Waltham, MA)を用いて、バッファー交換した。
非グリコシル化変異体のDARをLC-MSにより次のように決定した。
(LCMSによるADC)
試料を、Xevo QTOFに接続されたWaters Aquity UPLCシステムかけた。タンパク質を、Agilent PLRP-Sカラム(2.3×50mm、5μm、4000Å)で、80℃で分離した。移動相:A: 0.1％ギ酸水; b: 20:80のイソプロパノール:アセトニトリル、0.1％ギ酸。試料を、カラムで、10％Bで0.4分間、その後、30％Bから40％Bまで7分間かけて、40％Bから60％Bへ3分間かけて、ステップ勾配で脱塩した。データを、35Vのコーン電圧を用いて、全LC溶出にわたって取得した。スペクトルを、MassLynxソフトウェアを用いて分析した。DAR値を加重平均として算出した。これを表13に示す。
Figure 0006498600
 次に、変異体の細胞結合及び細胞殺傷活性を次のように測定した。Karpas 299及びL540細胞株をドイツ微生物細胞培養コレクション(DSMZ)から入手し、SKBR3及びRaji細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手した。細胞を、20％熱非働化胎仔ウシ血清(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)、2mM glutamax(Invitrogen; Carlsbad, CA)、及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)を含むRPMI 1650培地(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)中で成長させた。接着SKBR3細胞を、10％熱非働化胎仔ウシ血清、2mM glutamax、及び1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/Nutrient F-12 Ham(50:50)高グルコース培地(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)中で成長させた。全ての細胞を37℃で、5％CO2インキュベーター中で成長させ、維持した。SKBR3をカルシウム/マグネシウム非含有リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄することにより継代し、HyQTase(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)を用いて回収した。
トラスツズマブ及びブレンツキシマブ(Adcetris)変異体の細胞殺傷活性を、CellTiter-Glo(登録商標)細胞増殖アッセイを用いて測定した。簡潔に述べると、104個の懸濁細胞又は3×103個のSKBR3細胞を、96-ウェルハーフエリア白色TC処理プレート中、1ウェル当たり40μlでプレーティングし、37℃で2時間インキュベートした後、抗体を添加した。抗体をそれぞれの細胞培養培地中に準備し、0.45μmセルロースアセテートCostar Spin-X(登録商標)遠心分離管フィルター(Corning; Tewksbury, MA)でフィルター濾過した。40μlの非コンジュゲート型抗体、AB4285コンジュゲート型抗体、又はAB4285非含有薬物を細胞に添加し、懸濁細胞及びSKBR3細胞について、それぞれ、3日間又は5日間、培養した。80μlのCell Titer-Glo(登録商標)試薬(Promega Corp.; Madison, WI)を各ウェルに添加することにより、細胞生存率を測定し、製品説明書に従って処理した。発光をENVISION(登録商標)プレートリーダー(Perkin-Elmer; Waltham, MA)で測定した。相対発光読取値を、未処理の細胞を対照として用いて、％生存に変換し、抗体濃度に対してプロットした。IC50を、統計ソフトウェアのPrism(GraphPadソフトウェア; San Diego, CA)を用いて、非線形回帰方程式、log(阻害剤)対応答-可変勾配(4パラメータ)から算出した。結果を図8及び9並びに表14に示す。
Figure 0006498600
トラスツズマブ及びブレンツキシマブ変異体の細胞結合親和性を、FACSベースのアッセイを用いて測定した。簡潔に述べると、0.5％ウシ血清アルブミン(BSA)(Invitrogen; Carlsbad, CA)及び0.09％アジ化ナトリウム(Sigma; St. Louis, MO)を含むPBSからなる25μlの結合バッファー中の2×105個のKarpas 299又はL540細胞を96-ウェルU底ポリプロピレンプレート(Greiner Bio-One; Monroe, NC)中にプレーティングした。抗体を結合バッファー中に準備し、2倍連続希釈液を別の96-ウェルプレート中に調製した。等容量の希釈抗体を細胞に添加し、4℃で1時間インキュベートした。細胞を200μlの結合バッファーで2回洗浄して、未結合の抗体を除去した。二次抗体検出のために、5μg/mlのAlexa-488 コンジュゲート型ヤギ抗ヒトIgG(Invitrogen; Carlsbad, CA)を結合バッファー中に調製し、50μlを細胞に添加し、4℃で1時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、200μlの結合バッファーに再懸濁させ、96-ウェル自動マイクロサンプラー(Cytek; Fremont, CA)を備えたBD FACScan(登録商標)フローサイトメーター(Cytek; Fremont, CA)を用いて解析した。データを取得し、FlowJo(Tree Star; Ashland, OR)を用いて解析した。平均化した最大MFI値に対して正規化することにより、平均蛍光強度読取値を％結合として表し、データを抗体濃度に対してプロットした。結合親和性を、Prismソフトウェアを用いて、非線形回帰飽和結合方程式、一部位-全結合から算出した。結果を図10及び表15に示す。
Figure 0006498600
(実施例14:代替スキャフォールド:scFvフォーマットでの抗体-薬物コンジュゲート)
ADCの代替スキャフォールドとしてのscFvの使用の実現可能性を示すために、アンバーコドンを有するトラスツズマブscFv(VL_VH)をコードするDNAを発現ベクターpYD317にクローニングした。位置(-1)のアミノ酸セリンに対応するヌクレオチドでの重複PCR突然変異生成によって、TAGコドン挿入した。
scFvを発現させるために、無細胞抽出物を室温に解凍し、50uMのヨードアセトアミドとともに30分間インキュベートした。8mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸アンモニウム、130mMのグルタミン酸カリウム、35mMのピルビン酸ナトリウム、1.2mMのAMP、各々0.86mMのGMP、UMP、及びCMP、0.5mMで添加されるチロシン及びフェニルアラニンを除く全18種のアミノ酸について2mMのアミノ酸、4mMのシュウ酸ナトリウム、1mMのプトレシン、1.5mMのスペルミジン、15mMのリン酸カリウム、100nMのT7 RNAP、1.3uMの大腸菌DsbC、2mMの酸化(GSSG)グルタチオン、10ug/mLのscFvプラスミド、15uMのインビボで産生されたm.j. tRNA、5uMのm.j RNAシンセターゼ、及び1mMのpアジドフェニルアラニン(pN3F)とともに30％(v/v)のヨードアセトアミド処理抽出物を含む無細胞反応を30Cで最大10時間行った。野生型scFvを対照として発現させた。
scFv(-1)pN3F及び野生型scFvを、プロテインL、その後、SECにより精製した。5uMのscFv(-1)を、図1に示すような、50uMのDBCO-MMAF試薬とともに、室温で16時間インキュベートした。余分な遊離薬物をzeba脱塩カラムにより除去した。
その後、試料を定量するために、及び薬物-抗体比を決定するために、次のように、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。試料及び標準を、ミリQ水中に調製した3M硫酸アンモニウム(EMD Chemical)、50mMリン酸ナトリウムpH 7.0(Mallinckrodt)に1:1希釈した。Dionex HPLCシステムに、Tosoh Bioscience LLC TSK-ゲルButyl-NPR(登録商標)(4.6mm×3.5cm)カラムを、30℃のカラム区画温度にして装備した。移動相Aは、1.5M硫酸アンモニウム、50mMリン酸ナトリウム、pH 7.0であった。移動相Bは、80:20の水:イソプロピルアルコール(Honeywell)中の50mMリン酸ナトリウム、pH 7.0であった。移動相は、1.0mL/分の流速で送達した。分離は、10分間に15％移動相Bから100％移動相Bの線形勾配で実施した。UVデータは、214nmで取得した。ピーク面積を、Chromeleonソフトウェア(Thermo)を用いて定量して、薬物抗体比(DAR)を算出した。
コンジュゲート型代替スキャフォールド変異体の結合を評価するために、HER2を発現する細胞に対する結合アッセイを次のように実施した。HER2/c-erb-2遺伝子産物を、1細胞当たり1,500,000を超える受容体コピーで過剰発現するSKBR3細胞(ATCC # HTB-30, Manassas, VA)上のHER2に対する精製されたコンジュゲート型変異体の結合を、臨床等級のHerceptin(登録商標)、無細胞タンパク質合成によって産生された非グリコシル化トラスツズマブ、又は陰性対照としてのヒト血清IgG1(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)と比較した。SKBR3細胞を、10％熱非働化胎仔ウシ血清(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)、2mM glutamax(Invitrogen; Carlsbad, CA)、及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)を補充したDMEM:Ham's F-12(50:50)、高グルコース(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)中で培養した。接着細胞をカルシウム及びマグネシウム非含有ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、HYQ(登録商標)TASE(商標)(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)を用いて回収した。10μLの総容量中、試料当たり合計200,000個の細胞を、10μLのFACSバッファー(1％ウシ血清アルブミンを補充したDPBSバッファー)中に作製したコンジュゲート型代替スキャフォールド変異体、臨床等級HERCEPTIN(登録商標)、又は非グリコシル化トラスツズマブのいずれかの連続希釈液とともにインキュベートした。細胞に抗体又はADCを加えたものを、氷上で60分間インキュベートした。未染色の細胞、ヒトIgG1(アイソタイプ対照)、及び二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG)を対照として使用した。HERCEPTIN(登録商標)又は非グリコシル化トラスツズマブ結合を検出するために、細胞を氷冷FACSバッファーで2回洗浄し、5μg/mlのAlexa 647標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体抗体(Invitrogen; Carlsbad, CA)とともに氷上で1時間インキュベートした。細胞を、5μg/mlのAlexa 647標識プロテイン質L(Pierce)又はAlexa 647で標識したヤギ抗ヒト-Fc(Invitrogen; Carlsbad, CA)のいずれかとともに、氷上で1時間インキュベートすることにより、代替スキャフォールド変異体の細胞結合を検出した。全ての試料を、FACSバッファーを用いて洗浄し、BD FACS Caliburシステム(BD Biosciences; San Jose, CA)を用いて解析した。
平均蛍光強度を、GraphPad Prism(GraphPad v 5.00, ソフトウェア; San Diego, CA)を用いて、一部位特異的結合方程式を用いる非線形回帰分析を用いてフィッティングさせた。データを、相対MFI対抗体又は抗体変異体の濃度としてnMで表した。
次に、細胞殺傷に対するコンジュゲート型代替スキャフォールド変異体の効果を細胞増殖アッセイで次のように測定した。SKBR3をATCCから入手し、10％熱非働化胎仔ウシ血清(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)、2mM glutamax(Invitrogen; Carlsbad, CA)、及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)を補充したDMEM:Ham's F-12(50:50)、高グルコース(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)中で維持した。接着細胞をカルシウム及びマグネシウム非含有ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、HYQ(登録商標)TASE(商標)(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)を用いて回収した。合計103個の細胞を96-ウェルのハーフエリア平底白色ポリスチレンプレートに40μlの容量で播種した。該細胞を、CO2インキュベーター中、37℃で一晩接着させておいた。ADC変異体をDMEM/F12培地中に2×濃度で準備し、MultiScreen HTS 96-ウェルフィルタープレート(Millipore; Billerica, MA)に通して濾過した。フィルター滅菌したコンジュゲート型代替スキャフォールド変異体、HERCEPTIN(登録商標)、又は非グリコシル化トラスツズマブを処理用ウェルに添加し、プレートを、CO2インキュベーター中、37℃で120時間培養した。細胞生存率測定のために、80μlのCell Titer-Glo(登録商標)試薬(Promega Corp.; Madison, WI)を各ウェルに添加し、プレートを製品説明書の通りに処理した。相対発光をENVISION(登録商標)プレートリーダー(Perkin-Elmer; Waltham, MA)で測定した。相対発光読取値を、未処理の細胞を対照として用いて、％生存に変換した。データを、GraphPad Prism(GraphPad v 5.00, ソフトウェア; San Diego, CA)を用いて、log(阻害剤)対応答-可変勾配、4パラメータフィット方程式を用いる非線形回帰分析でフィッティングさせた。データを、ADCの用量と比べた相対細胞生存率、ATP含有量％として、nMで表した。
HIC分析、細胞結合、及び細胞殺傷実験の結果を表16に示す。
Figure 0006498600
(実施例15:代替スキャフォールド:scFv-Fcフォーマットでの抗体-薬物コンジュゲート)
ADCの代替スキャフォールドとしてのscFv Fcの使用の実現可能性を示すために、アンバーを有するトラスツズマブscFv Fc(VL_VH_Fc)をコードするDNAを発現ベクターpYD317にクローニングした。位置(-1)、Fc R355、Fc N389、及びFc F404(EUインデックス付番)のアミノ酸セリンに対応するヌクレオチドでの重複PCR突然変異生成によって、TAGコドン挿入した。
CFPS反応条件は、5uMの酵母PDIを添加することを除き、実施例14に記載されているものと同じであった。野生型scFv Fcを対照として発現させた。
非グリコシル化scFv-Fcをコンジュゲートするために、タンパク質を、プロテインA、その後、SECにより、まず精製した。scFv-Fcを含む5uMのpN3Fを50uMのDBCO-MMAFと室温で16時間インキュベートした。余分な遊離薬物をzeba脱塩カラムにより除去した。
さらに、pアジドメチルフェニルアラニンを、それぞれ、R355、N389、及びF404の部位で、scFv Fcに組み込んだ。反応条件は、m.j. FRSとpアジドPheの対を置換するために、1uMのm.j. pシアノFRS及び1mMのpアジドメチルPheを使用することを除き、実施例14に記載されているものと同じであった。その後、プロテインAで精製したタンパク質をDBCO-MMAF試薬2(DBCO-MMAF 2)とコンジュゲートした。DBCO-MMAF 2の構造を図11に示す。
次に、試料を定量するために、及び薬物-抗体比を決定するために、次のように、LC-MSを実施した。試料を、qTOF質量分析計(Agilent 6520)に接続された液体クロマトグラフィー(CHIP-Cube nanoLC, Agilent)により分析した。タンパク質を、逆相HPLC-チップ(PLRP-S、4000Å、5μ;濃縮カラム: 25mm;分離カラム: 150mm×75μm)で、水中の0.1％ギ酸(溶媒A)及びアセトニトリル＋イソプロピルアルコール中の0.1％ギ酸(80:20 v/v、溶媒B)により分離した。データを、MassHunter定量ソフトウェア(Agilent)を用いて処理した。データを表17に示す。
Figure 0006498600
薬物リンカーADCコンジュゲートのインビボ安定性を、2mg/kgのそれぞれのscFv-Fc DBCO-MMAF 2コンジュゲートをベージュヌードXidマウスに投与することにより測定した。血漿を、30分、d3、d7、d14、及びd21での末期採血(terminal bleed)により、各々の時点についてn＝2匹の動物から回収した。全循環ScFv-FC ADCをFcγ断片特異的なビオチン-(Fab)2ヤギ抗ヒトIgGにより捕捉した。複合体をストレプトアビジンMag Sepharoseでプルダウンした。捕捉された複合体を洗浄して、非特異的結合を除去し、1％ギ酸で溶出させた。中和した溶出物をインタクトLCMSにより分析した。結果は、scFv-Fc(N389)pN3CH2F DBCO-MMAF 2及びscFv-Fc(R355)pN3CH2 F DBCO-MMAF 2が28日まで安定であることを示している。
次に、ScFv-Fc ADCの薬物動態特性をベージュヌードxidマウスで解析した。動物に、約2.0mg/kgの用量レベルで、scFv-Fc R355及びscFv-Fc N389を静脈内投与した。28日までサンプリングした血漿濃度を免疫アッセイにより決定し、薬物動態パラメータを、WinNonlin ‘v' 5.2(Pharsight, CA)を用いる非コンパートメント手法を用いて算出した。結果を図12に示す。
scFc-Fc ADCのインビボ効力を評価するために、KPL-4ヒト乳房腫瘍細胞をSCIDベージュマウス(Charles River Laboratories)の乳房脂肪体に接種した。マウス1匹当たり合計300万個の細胞を、培養培地と混合した50％フェノールレッド非含有Matrigel(Becton Dickinson Bioscience)に懸濁させて、注射した。腫瘍サイズが目的に達したら、各群の平均腫瘍体積が100〜150mm3となるように、全ての動物を処置群に無作為に割り当てた。
トラスツズマブ(30mg/kg)を腹腔内(i.p.)投与し(処置0日目に1回注射)、その後、3週間、週に(15mg/kg)で投与した。非グリコシル化トラスツズマブ2nnAA変異体scFv-Fc N389 DBCO-MMAF 2 15mg/kg(872ug MMAF/m2、DAR 1.901)、非グリコシル化トラスツズマブ2nnAA変異体HC-S136(15mg/kg)(非コンジュゲート型)、ビヒクル(PBS)、及び遊離薬物(0.54mg/kg)を静脈内(i.v)投与した(処置0日目に1回注射)。この実験の結果を図13aに示す。
別の実験において、scFv-Fc F404 vL-vH DBCO-MMAF 2(15mg/kg)、scFv-Fc F404 vH-vL DBCO-MMAF 2(15mg/kg)、トラスツズマブ-CF HC F404 DBCO-MMAF 2(15mg/kg)、トラスツズマブ-CF(15mg/kg)、及びビヒクルを、0日目に、1回の静脈内注射により投与した。この実験の結果を図13bに示す。
両方の実験について、全ての処置群は、1群当たり10匹の動物からなり、腫瘍サイズは、キャリパー測定を用いて、週2回モニタリングされた。マウスを標準的な齧歯類用マイクロアイソレーターケージで飼育した。動物部屋の環境制御を、70°Fの温度、40％〜60％の相対湿度、及び約14時間/10時間の明暗周期を維持するように設定した。
この実験の結果から、位置N389及びF404でコンジュゲートされたADCが、動物で腫瘍サイズを恒久的に退行させるのに有効であったことが示されている。特に注目すべきは、F404 scFv-Fcコンジュゲートがベースラインを下回る退行を達成したことであり、これは、固形腫瘍モデルにおけるこのスキャフォールドの特別な効力を示している。
(実施例16: CD74及びHer2に特異的で、かつ追加の例示的なリンカー-ウォーヘッド組合せを有する例示的なADC)
この実施例は、CD74に特異的な抗体を用いて調製され、かつ本明細書に記載の様々な例示的なリンカー-ウォーヘッド組合せを含む例示的な抗体-薬物コンジュゲートを提供するものである。この実施例はさらに、該リンカー-ウォーヘッド組合せのうちのいくつかとコンジュゲートされたトラスツズマブから調製された例示的な抗体-薬物コンジュゲートを提供するものである。
この実施例で使用される抗CD74抗体の重鎖及び軽鎖のタンパク質配列は、それぞれ、配列番号5及び6に示されている。該重鎖配列は、精製を助けるための6-His C末端タグを含む。HC K212、HC S136、HC F241、HC F404、LCS7、又はLC N152をコードする位置のアンバーコドンを、実施例13に記載の方法を用いて導入した。p-メチルアジド-Pheを含む抗CD74抗体を、実施例13に記載の方法を用いて発現させ、精製した。位置HC S136又はHC F404にp-メチルアジド-Pheを含むトラスツズマブ変異体も、実施例13に記載されている通りに発現させ、精製した。
次に、抗CD74又はトラスツズマブ変異体を、DBCO-MMAF 2(図11A)、DBCO-DM4(図11B)、DBCO-DM4 2(図11C)、又はDBCO-MMAE(図11D)とコンジュゲートした。抗体変異体とリンカー-ウォーヘッド組合せとのコンジュゲーション反応を実施するために使用された方法は、実施例13に記載されている通りであった。
その後、ADCの薬物-抗体比(DAR)を、実施例13に記載の方法に従って、LC-MSにより決定した。抗CD74試料用のLC-MS法が、この抗体について最適化されていなかったことに留意すべきであり;解析の結果は、これらの試料のDARを人為的に低下させる、非コンジュゲート型種と重複するピークを含んでいた。それゆえ、この実施例で調製されたADC変異体のDARは、実施例1〜15で考察された対応する部位でnnAAを含むADCと良好な一致を示した。DAR解析の結果を下の表18に示す。
次に、ADC変異体を細胞殺傷実験で用いて、そのIC50値を決定した。トラスツズマブ変異体を実施例13に記載されている通りに解析した。細胞殺傷に対するコンジュゲート型抗CD74変異体の効果を細胞増殖アッセイにより測定した。SU-DHL-6及びNCI-H929細胞をATCCから入手し、20％熱非働化胎仔ウシ血清(Hyclone; Thermo Scientific; Waltham, MA)、2mM glutamax(Invitrogen; Carlsbad, CA)、及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)を補充したRPMI-1640培地(Cellgro-Mediatech; Manassas, VA)中で維持した。SU-DHL-6及びNCI-H929細胞を回収し、培養培地に0.5×106細胞/mLの最終濃度で再懸濁させた。40μlの容量中、合計20×103個の細胞を96-ウェルハーフエリア平底白色ポリスチレンプレートの各ウェルに播種した。ADC変異体をRPMI-1640完全培地中に2×濃度で準備し、MultiScreenHTS 96-ウェルフィルタープレート(Millipore; Billerica, MA)に通して濾過した。フィルター滅菌したADCを処理用ウェルに添加し、プレートを、CO2インキュベーター中、37℃で72時間培養した。細胞生存率測定のために、80μlのCell Titer-Glo(登録商標)試薬(Promega Corp. Madison, WI)を各ウェルに添加し、プレートを製品説明書の通りに処理した。相対発光をENVISION(登録商標)プレートリーダー(Perkin-Elmer; Waltham, MA)で測定した。相対発光読取値を、未処理の細胞を対照として用いて、％生存に変換した。データを、GraphPad Prism(GraphPad v 5.00, ソフトウェア; San Diego, CA)を用いて、log(阻害剤)対応答-可変勾配、4パラメータフィット方程式を用いる非線形回帰分析でフィッティングさせた。データを、ADCの用量と比べた相対細胞生存率、ATP含有量％として、nMで表した。細胞殺傷アッセイの結果を表18に示す。
Figure 0006498600
実施例17は、抗体へのnnAAの組み込み部位が、抗体間で適度に予測通りに移転し得ることをさらに示している。さらに、リンカーとウォーヘッドの中身は、得られるADCのコンジュゲーション効率又はDARにそれほど大きな影響を及ぼすようには見えず、これは、所与のウォーヘッド-リンカー組合せを、好ましい部位のうちの1つで非天然アミノ酸を含む抗体とコンジュゲートすることができるという適度な予測可能性を示している。
本明細書に引用した全ての刊行物及び特許、特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物又は特許出願が、引用により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されるかのように、引用により本明細書中に組み込まれる。特許請求された主題は、様々な実施態様に関して記載されているが、当業者は、その精神から逸脱することなく、様々な修正、置換、省略、及び変更が行われ得ることを理解するであろう。したがって、該主題の範囲は、その等価物を含む、以下の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。

(配列表)

<210> 配列番号1
<211> 長さ: 449
<212> タイプ: PRT
<213> 生物体:人工配列
<220> 特徴:
<223> 他の情報:配列は合成されたものである。
<400> 配列: 1
Figure 0006498600
 <210> 配列番号2
<211> 長さ: 214
<212> タイプ: PRT
<213> 生物体:人工配列
<220> 特徴:
<223> 他の情報:配列は合成されたものである。
<400> 配列: 2
Figure 0006498600
 配列番号3

> ブレンツキシマブ重鎖:HC-6Hisの配列
Figure 0006498600
 配列番号4

> ブレンツキシマブ軽鎖:LCの配列
Figure 0006498600
 配列番号5

> 抗CD74重鎖:HCの配列
Figure 0006498600
 配列番号6

> 抗CD74軽鎖の配列
Figure 0006498600
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
KabatもしくはChothia付番スキームによる重鎖もしくは軽鎖残基H404、H121、H180、H241、L22、L7、L152、H136、H25、H40、H119、H190、H222、H19、H52、もしくはH70からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
（構成２）
KabatもしくはChothia付番スキームによる重鎖もしくは軽鎖残基H404、H121、H180、H241、L22、L7、L152、H136、H25、H40、H119、 H190、及びH222からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、構成1記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
（構成３）
KabatもしくはChothia付番スキームによる重鎖もしくは軽鎖残基H404、H121、H180、H241、L22、L7、L152、及びH136からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、構成1記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
（構成４）
配列番号1との少なくとも70％、80％、もしくは90％の相同性を有し、かつ配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの残基404、121、180、241、136、25、40、119、190、222、19、52、もしくは70に対応する部位からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、構成1記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
（構成５）
配列番号2との少なくとも70％、80％、もしくは90％の相同性を有し、かつ配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドの残基22、7、及び152に対応する部位からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、構成1記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
（構成６）
前記ポリペプチド鎖が、α、δ、ε、及びμからなる群から選択されるタイプの重鎖である、構成1〜5のいずれか１記載の抗体。
（構成７）
前記ポリペプチド鎖が、λ及びκから選択されるタイプの軽鎖である、構成1〜6のいずれか１記載の抗体。
（構成８）
IgA、IgA、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgMからなる群から選択されるクラス又はサブクラスのものである、構成1〜7のいずれか１記載の抗体。
（構成９）
前記非天然アミノ酸残基が、アミノ、カルボキシ、アセチル、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジド、スルファニル、アジド、及びアルキニルからなる群から選択される部分を含む、構成1〜8のいずれか１記載の抗体。
（構成１０）
各々の非天然アミノ酸残基が、下記式
（化１）
Figure 0006498600
(式中、各々のLは、独立に、二価のリンカーであり;かつ
各々のRは、独立に、官能基である)
によるものである、構成1〜9のいずれか１記載の抗体。
（構成１１）
Rが、反応基、治療的部分、又は標識部分である、構成10記載の抗体。
（構成１２）
各々のRが、アミノ、カルボキシ、アセチル、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジド、スルファニル、アジド、及びアルキニルからなる群から選択される反応基である、構成10記載の抗体。
（構成１３）
各々のLが、結合、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、及び置換ヘテロアリーレンからなる群から選択される二価のリンカーである、構成10記載の抗体。
（構成１４）
1以上の治療的部分又は標識部分に連結された構成1〜13のいずれか１記載の抗体を含む、抗体コンジュゲート。
（構成１５）
1以上の薬物又はポリマーに連結された前記抗体を含む、構成14記載の抗体コンジュゲート。
（構成１６）
1以上の標識部分に連結された前記抗体を含む、構成14記載の抗体コンジュゲート。
（構成１７）
1以上の単鎖結合ドメイン(scFv)に連結された前記抗体を含む、構成14記載の抗体コンジュゲート。
（構成１８）
前記抗体が、1以上のリンカーを介して前記1以上の治療的部分又は標識部分に連結されている、構成14〜17のいずれか１記載の抗体コンジュゲート。
（構成１９）
実質的に純粋である、構成1〜18のいずれか１記載の抗体を含む組成物。
（構成２０）
構成1〜19のいずれか１記載の抗体を含む組成物であって、該抗体が、該組成物の全抗体質量の少なくとも95質量％である、前記組成物。

Claims (19)

  1. KabatもしくはChothia付番スキームによる軽鎖残基L22及びL7、重鎖残基H25、H40、H19及びH70、並びにEU付番スキームによる重鎖残基H404、H121、H180、H136及びH190からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、IgGクラスのヒト若しくはヒト化抗体、又はその翻訳後修飾変異体であって、
    該翻訳後修飾が、鎖間ジスルフィド結合、鎖内ジスルフィド結合、N-結合型グリコシル化、リン酸化、O-結合型グリコシル化、メチル化、アセチル化、脂質化、GPIアンカリング、ミリストイル化、及びプレニル化からなる群から選択される1以上である、
    前記ヒト若しくはヒト化抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
  2. KabatもしくはChothia付番スキームによる軽鎖残基L22及びL7、重鎖残基H25及びH40、並びにEU付番スキームによる重鎖残基H404、H121、H180、H136及びH190からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、請求項１記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
  3. KabatもしくはChothia付番スキームによる軽鎖残基L22及びL7、並びにEU付番スキームによる重鎖残基H404、H121、H180及びH136からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、請求項１記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
  4. 配列番号1との少なくとも90％の同一性を有し、かつ配列番号1による代表的な重鎖ポリペプチドの残基407、124、183、139、25、40、193、19、もしくは71に対応する部位からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、請求項１記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
  5. 配列番号2との少なくとも90％の同一性を有し、かつ配列番号2による代表的な軽鎖ポリペプチドの残基22、及び7に対応する部位からなる群から選択される特異的部位で1以上の非天然アミノ酸残基を有するポリペプチド鎖を含む、請求項１記載の抗体、又はその翻訳後修飾変異体。
  6. 前記ポリペプチド鎖が、λ及びκから選択されるタイプの軽鎖である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
  7. IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択されるサブクラスのものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
  8. 前記非天然アミノ酸残基が、アミノ、カルボキシ、アセチル、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジド、スルファニル、アジド、及びアルキニルからなる群から選択される部分を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体。
  9. 各々の非天然アミノ酸残基が、下記式
    Figure 0006498600
     (式中、各々のLは、独立に、二価のリンカーであり;かつ
    各々のRは、独立に、官能基である)
    によるものである、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  10. Rが、反応基、治療的部分、又は標識部分であり、該治療的部分又は標識部分が、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール若しくはその誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、光親和性標識、樹脂、第二のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチド類似体、抗体若しくは抗体断片、金属キレーター、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、アンチセンスポリヌクレオチド、ペプチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、バイオマテリアル、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、光異性化可能部分、ビオチン若しくはその誘導体若しくは類似体、重原子包含部分、化学切断可能基、光切断可能基、伸長側鎖、炭素結合糖、レドックス活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生体活性物質、検出可能標識、小分子、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項9記載の抗体。
  11. 各々のRが、アミノ、カルボキシ、アセチル、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジド、スルファニル、アジド、及びアルキニルからなる群から選択される反応基である、請求項9記載の抗体。
  12. 各々のLが、結合、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、及び置換ヘテロアリーレンからなる群から選択される二価のリンカーである、請求項9記載の抗体。
  13. 1以上の治療的部分又は標識部分に連結された請求項1〜12のいずれか一項記載の抗体を含む、抗体コンジュゲートであって、該治療的部分又は標識部分が、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール若しくはその誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、光親和性標識、樹脂、第二のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチド類似体、抗体若しくは抗体断片、金属キレーター、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、アンチセンスポリヌクレオチド、ペプチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、バイオマテリアル、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、光異性化可能部分、ビオチン若しくはその誘導体若しくは類似体、重原子包含部分、化学切断可能基、光切断可能基、伸長側鎖、炭素結合糖、レドックス活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生体活性物質、検出可能標識、小分子、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、前記抗体コンジュゲート。
  14. 1以上の薬物又はポリマーに連結された前記抗体を含む、請求項13記載の抗体コンジュゲート。
  15. 1以上の標識部分に連結された前記抗体を含む、請求項13記載の抗体コンジュゲート。
  16. 1以上の単鎖結合ドメイン(scFv)に連結された前記抗体を含む、請求項13記載の抗体コンジュゲート。
  17. 前記抗体が、1以上のリンカーを介して前記1以上の治療的部分又は標識部分に連結されている、請求項13〜16のいずれか一項記載の抗体コンジュゲート。
  18. 請求項1〜17のいずれか一項記載の抗体を含む組成物であって、該抗体が、該組成物の全抗体質量の少なくとも80質量％である、前記組成物。
  19. 請求項1〜18のいずれか一項記載の抗体を含む組成物であって、該抗体が、該組成物の全抗体質量の少なくとも95質量％である、前記組成物。
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