JPH06506217A - ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体 技術分野 本発明は生物学的に活性な巨大分子結合体に関するものであり、特に生物学的に 活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチドと水溶性ポリマーとの結合体に関 するものである。

背景技術 ポリペプチドとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような水溶性ポリマーとの 結合体は公知である。ＰＥＧや類似の水溶性ポリマーへのペプチドまたはポリペ プチドのカップリングは、Ｄａｖｉｓらの米国特許第４．１７９．３３７号に記 載されている。

Ｄａｖｉｓらは、ＰＥＧて修飾された生理学的に活性なポリペプチドか劇的な免 疫原性・抗原性の低下を示すことを開示している。

さらに、ＰＥＧ−タンパク質結合体は、生きている生物に注入したとき、対応す る天然タンパク質よりも相当長く血流中にとどまることか判明した。かくして、 タンパク質の生理学的活性の大部分を保持しつつ、免疫原性・抗原性の低下と比 較的長いクリアランス時間を示すＰＥＧ結合治療用タンパク質か数多く開発され た。

重要なＰＥＧ結合治療用タンパク質としては組織プラスミノーゲン活性化因子、 インシュリン、インターロイキン２、ヘモグロピタンパク質とＰＥＧとの共有結 合修飾かそれらのアレルゲン性を低下させるのに効果的であり得ることを開示し ている。５ｅｈｏｎ　ｅｔａｔ、、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｔｏｘｉｃｏｌ、 　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　６５．２０５−１９　（１９８７）は、アレルゲン性を 低下させた、このようなＰＥＧ結合結合アレルゲンタンパクモの後寛容性誘導物 質として利用し得ることを開示している。

たいていの場合、米国特許第４．１７９．３３７号に例示されるように、ポリマ ーの共有結合はＰＥＧ−スクシンイミド誘導体をタンパク質分子の外側にあるア ミノ基と反応させることにより行われる。

しかし、多くのタンパク質のアミノ基はポリペプチド活性に関係のある部分で、 このような修飾の結果として不活性化されやすい。

かかるタンパク質結合体は、生理学的活性の低減をもたらすので望ましくない。

その他のタンパク質は利用可能なアミノ基をわずかしかもたず、それ故にポリマ ー固定部位がきわめて少ない。その結果として、関心のある多くのタンパク質を この方法でＰＥＧに結合させることかできない。

タンパク質の外側にある他の官能基にポリマーを共有結合で結合させる方法には 重大な制限がある。米国特許第４．１７９．３３７号には、例えば、ＰＥＧ−マ レイミド誘導体を利用してタンパク質のスルフヒドリル基にポリマーを共有結合 で結合させることが開示されている。しかしながら、生理活性または酵素活性に とって必要てなく、従って化学修飾のために利用できる遊離スルフヒドリル基を もつタンパク質はごく少ないので、この方法の用途は限られている。

米国特許第４．１７９．３３７号は、アミノ−ＰＥＧ誘導体とトリプシンおよび 他のタンパク質の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジ イミド（ＥＤＣ）−活性化カルボン酸基との反応を開示している。この反応の選 択性はどちらかと言えば低い。なぜなら、アミノ−ＰＥＧの反応性がタンパク質 のリシル残基の反応性に類似し、アミノ−ＰＥＧとタンパク質アミノ基の両方か 競合して活性化カルボン酸基と反応するからである。これは分子間および分子内 架橋、並びにタンパク質活性の低下をもたらす。

Ｐｏ１ｌａｃｋ’　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＡＣ３，９８，２８９（１９７６）によ って開示された同様の反応ては、ＰＥＧのｐ−アミノベンジルエーテルかＥＤＣ 処理によってＤ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼのカルボン酸 基にカップリングされる。

タンパク質の活性化カルボン酸基についてタンパク質アミノ基が競合しないポリ マー誘導体が強く望まれるだろう。これは分子間および分子内架橋を排除し、ポ リマー結合体の酵素活性を向上させるだろう。

５ｈａｄ　Ｉ　ｅらの米国特許第４．８４７．３２５号は、グリコジル化コロニ ー刺激因子１　（Ｃ３Ｆ−１）がＰＥＧ−アミン、ＰＥＧ−ヒドラジンまたはＰ ＥＧ−ヒドラジドと、過ヨウ素酸塩で酸化して糖の隣接ジオールをアルデヒドに 変換したＣ３Ｆ−１とを反応させることにより、ＰＥＧに共有結合で結合され得 ることを示唆している。

しかし、前記結合体の製造およびそれらの反応性についてこの明細書には何の記 述もない。

アミノ基とポリマーの結合度は、通常、結合体をトリニトロベンゼンスルホン酸 （ＴＮＢＳ）でアッセイして遊離アミノ基の数を測定することにより決定される 。タンパク質アミノ基に結合したポリマーの場合は、修飾タンパク質の遊離アミ ノ基の数と天然タンパク質の遊離アミノ基の数との差がタンパク質の結合度を表 す。

タンパク質の結合度を測定する際のＴＮＢＳアッセイからの結果は、ポリマーが 別の官能基に共有結合で結合されている場合には無意味である。このような場合 、遊離アミノ基の数は結合タンパク質と非結合タンパク質問で変化しないだろう 。

結合タンパク質はまた、酵素を用いて小さいフラグメントに消化し、カラムクロ マトグラフィーで分離し、続いて非修飾タンパク質のマツプと比較するためのペ プチドマツプを作成することができる。その際、溶出時間の変化したフラグメン トがポリマー結合の位置を示している。しかし、この手法は大量の生成物を消費 し、利用能の限られたポリペプチドの場合には適していない。放射性ラベリング はもう１つの代替法を表すが、この代替法は最終治療用途（このためには結合度 の測定が最も大切である）のために製造される物質にとっては不適当である。

Ｙａｍａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、 　５２（８）、　２１２５−７（＋９８８）は、ポリマーとスクシンイミド成分 間にノルロイシン残基とリシン残基を有するＰＥＧ−スクシンイミド誘導体の製 造を開示している。これらの残基は、ノルロイシンまたはりシンの存°　在につ いてのアミノ酸分析により、タンパク質のアミノ基に共有結合で結合したＰＥＧ 量の測定を可能にする。また、５ａｒｔｏｒｅ　ｅｔたＰＥＧ−スクシンイミド 誘導体中でのノルロイシンスペーサーの使用を開示している。このような非天然 アミノ酸の使用は、単一アミノ酸の分析がタンパク質の濃度とアミノ基に結合し たポリマー鎖の数の両方を提供するので、付加物の特性決定において役に立つと 記載されている。言い換えれば、精製した結合体においては、単一のノルロイシ ン残基酸が外部アミノ基に結合したポリマー鎖を表している。

分子間架橋による活性低下なしに、ポリペプチドおよびグリコポリペプチドのア ミノ基以外の部分にポリマーを共有結合で結合させる方法、並びにアミノ基以外 の官能基でのポリペプチドへのポリマーの結合度をアッセイする方法の必要性が 依然として存在水溶性ポリマーは、当該水溶性ポリマーのアシルヒドラジン誘導 体を利用して、生物学的に活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチドに結合 させ得ることが見いだされた。水溶性ポリマーのアシルヒドラジン誘導体は、グ リコポリペプチドの酸化された炭水化物残基、あるいはポリペプチドまたはグリ コポリペプチドのペプチド部分の反応性カルボニル基もしくは活性化カルボン酸 基に共有結合で結合する。本発明はこれまで慣用方法では修飾することかできな かったポリペプチドおよびグリコポリペプチドへ水溶性ポリマー−ペプチド結合 の範囲を広げるものである。さらに、結合反応の中性または弱酸性条件下におい て、本発明のアシルヒドラジン含有ポリマーは、それらの低いｐＫａ　（約３） のために、ポリペプチドのアミノ基（ｐＫａ約１０．５）よりも高い反応性を有 し、それ故にたいていの場合これらのアミノ基の競合反応を最小限に抑えるか徘 除し、さらに結合体の生物学的活性を維持する。

本発明によれば、生物学的に活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチドと、 ヒドラジドまたはヒドラゾン官能基を含む結合によりポリペプチドまたはグリコ ポリペプチドのペプチド部分の反応性カルボニルもしくはカルボン酸基において これに共有結合で結合された１つまたはそれ以上の水溶性ポリマー分子と、の生 物学的に活性な巨大分子結合体が提供される。前記結合は、水溶性ポリマーのア シルヒドラジン誘導体と、活性化カルボン酸基または反応性カルボニル基を生成 させたポリペプチドまたはグリコポリペプチドと、の反応により形成される。

本発明はまた、生物学的に活性なグリコポリペプチドと、短いペプチド配列を介 してポリマーに結合されたヒドラジドまたはヒドラゾン官能基を含む結合により 、グリコポリペプチドの酸化炭水化物部分においてこれに共有結合で結合された １つまたはそれ以上の水溶性ポリマー分子と、の生物学的に活性な巨大分子結合 体を提供する。炭水化物成分の酸化は反応性アルデヒドを生成させる。ヒドラゾ ン結合は、ペプチド配列を含む水溶性ポリマーのアシルヒドラジン誘導体とこれ らのアルデヒド基とを反応させることにより形成される。ヒドラゾンは非常に安 定したアルキルヒドラジン誘導体への還元によりさらに安定化することかできる 。

ペプチド配列は加水分解酵素へのこの結合の不安定性に影響を与え、またそれら の加水分解物のアミノ酸分析によるポリマー結合体の簡便な特性決定を可能にす る。アミノ酸分析の最新技術を駆使することにより、ピコモル濃度の結合体につ いてペプチド配列の量およびその結果としての結合度を測定することができる。

従って、水溶性ポリマーにヒドラジドまたはヒドラゾン官能基を含む結合を結合 させるために、本発明のポリペプチド結合体においてペプチド配列を利用するこ とも本発明に従うものである。

図面の簡単な説明 図１は、ｍＰＥＧ−β−アラニン−ウシ血清アルブミン結合体と天然ウシ血清ア ルブミンとのＧＦ−ＨＰＬＣクロマトグラム比較である。

図２は、ｍＰＥＧ−β−アラニン−卵アルブミン結合体と天然卵アルブミンとの ＧＦ−ＨＰＬＣクロマトグラム比較である。

図３は、酸化された炭水化物成分を介して結合されたＰＥＧ−β−アラニン−Ｉ ｇＧと天然ＩｇＧとのＧＦ−ＨＰＬＣクロマトグラム比較である。

図４は、ｒｈＧ−Ｃ３Ｆのカルボン酸基を介して結合されたＰＥＧ−β−アラニ ン−ｒｈＧ−Ｃ３Ｆと天然ｒｈＧ−Ｃ３ＦとのＧＦ−ＨＰＬＣクロマトグラム比 較である。

発明を実施するための最良の態様 本発明の巨大分子は、生物学的に活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチド に共有結合で結合された１つまたはそれ以上の水溶性ポリマー分子である。「生 物学的に活性な」という用語は、ポリペプチドおよびグリコポリペプチドの分野 で当業者が通常理解している意味と同様に用いられ、その意味は治療上の意味で のポリペプチドまたはグリコポリペプチドの生理学的もしくは薬理学的活性に制 限されるものではない。例えば、酵素のような多くの生理学的に活性なポリペプ チド（その水溶性ポリマー結合体は治療用途を有する）は有機溶媒中ての反応を 触媒することができる。同様に、コンカナバリンＡ、免疫グロブリンのようなタ ンパク質の水溶性ポリマー結合体には治療用途が存在する一方で、これらのタン パク質のポリマー結合体は実験室用の診断道具としても有用である。

一般生物学的用途と治療用途の両方に興味がもてる酵素には、オキシドレダクタ ーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガ ーゼか含まれ、これらは米国特許第４．１７９．３３７号に記載され、その開示 内容を参照によりここに引用するものとする。特定の酵素に制限するものではな いか、興味のもてる特定酵素の例としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、 アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、キモト リプシン、リパーゼ、ウリカーゼおよびビリルビンオキシダーゼがある。炭水化 物に特異的な酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクト シダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼなども興味かもてる。

一般生物学的にまたは治療上興味のある他のタンパク質の例には、第ｖ１［１因 子およびポリペプチドホルモン、例えばインシュリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、 ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン 、ソマトメジン、エリトロポエチン、黄体形成ホルモン、視床下部放出因子、利 尿ホルモンおよびプロラクチンか含まれるが、これらに限定されない。

興味のもてるグリコポリペプチドの例には、免疫グロブリン、絨毛膜生殖腺刺激 ホルモン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵アルブミン、ウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）　、レクチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、多数の酵 素、およびグリコジル化されたインターロイキン、インターフェロンおよびコロ ニー刺激因子か含まれるが、これらに限定されない。興味のもてる免疫グロブリ ンとしてはＩｇＧＳ　ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＴｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのフラグメ ントがある。

インターロイキン、インターフェロンおよびコロニー刺激因子のような上記グリ コポリペプチドの多くは、通常、組換えタンパク質技術による製造の結果、非グ リコジル化形態で存在することがある。この種の改変体の構造は炭水化物成分を 含まない。しかし、非グリコジル化改変体は、ペプチド部分の反応性カルボニル またはカルボン酸基において、なお結合することが可能である。

水溶性ポリマーと結合したとき低減したアレルゲン性を示し、結果的に寛容性誘 導物質として使用するのに適しているアレルゲンタンパク質および糖タンパク質 の例には、上で論じたＤｒｅｂｏｒｇｅｔ　ａｌ、、Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｔ ｈｅｒａｐ、　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　５ｙｓｔ、に記載されるアレルゲン か含まれ、その教示内容を参照によりここに引用するものとする。この論文に記 載されたアレルゲンの中にはブタフサの抗原Ｅ、ミツバチの毒、ダニのアレルゲ ンなどがある。

ポリペプチドおよびグリコポリペプチドへの結合に適している水溶性ポリマーと しては、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチレン化ポリオール、ポリアク リルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン、お よび他の炭水化物をヘースにしたポリマーが含まれる。本発明での使用に適する ためには、ポリマーは室温で水に溶けなければならない。この要件を満たすポリ アルキレンオキシドホモポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそ のコポリマーである。ＰＥＧとポリプロピレングリコールまたはポリプロピレン オキシドとのブロックコポリマーも、ブロック共重合度がポリマーを室温で水に 溶けなくするほど大きくないという条件で、本発明において使用することかでき る。ポリオキシエチレン化ポリオールの例には、ポリオキシエチレン化グリセロ ール、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコースな どが含まれる。

ポリマーの分子量は決定的なものではなく、特定のポリマー結合体の最終用途に 主として左右されよう。当業者はそれらの最終用途に適した分子量範囲を決定す ることが可能である。一般的には、有用な分子量範囲は約６００−約１００．０ ００ダルトンの数平均分子量であり、約２，０００−約２０．０００ダルトンが 好ましい。

ポリマーのアシルヒドラジン誘導体を、反応性カルボニル基または活性化ペプチ ドカルボン酸基を有するポリペプチドまたはグリコポリペプチドと反応させるこ とにより、１つまたはそれ以上のポリマー単位をポリペプチドまたはグリコポリ ペプチドに共有結合で結合させることができる。本発明において、反応性カルボ ニル基はケトンまたはアルデヒド基のいずれかであると定義され、アミドのよう な他のカルボキシル含有基は除かれる。アルデヒド基はケトンよりも反応性であ るので、アルデヒド基の方が好ましい。

カルボニル基はペプチドまたは炭水化物単位の部位に生成することができる。例 えば、Ｄｉｘｏｎ、　Ｊ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ、、　３．９９（１９８ ４）は、ポリペプチド分子のＮ末端に反応性カルボニル基を生成する方法をいく つか論評している。例えば、ポリペプチドまたはグリコポリペプチドを、ホルミ ル安息香酸の反応性エステルのような適当なヘテロ三官能性試薬と反応させるこ とにより、カルボニル基をペプチド上に生成させることかでき、これはＫｉｎｇ ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５．５７７４　（１９８６） に記載されており、その教示内容を参照によりここに引用するものとする。また 、例えばグリコポリペプチドの炭水化物成分の隣接ジオールを過剰の過ヨウ素酸 塩で、あるいは酵素的に（例えばガラクトースオキシダーセを使用して）酸化し 、カルボニル基をグリコポリペプチドの炭水化物単位の部位に生成させることも てきる。

ポリマーアシルヒドラジンはポリペプチドまたはグリコポリペプチド上の反応性 カルボニル基と反応して、ポリマーとポリペプチドまたはグリコポリペプチド間 にヒドラゾン結合を形成させる。

このヒドラゾンは例えばＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４またはＮａＣＮＢＨ，を用いて比較的 安定しているアルキルヒドラジドに還元することができる。

活性化ペプチドカルボン酸基はＣ末端のカルボン酸基あるいはアスパラギン酸ま たはグルタミン酸残基のカルボン酸基から誘導される。ポリマーアシルヒドラジ ンは活性化ペプチドカルボン酸基と反応して、ポリマーとポリペプチドまたはグ リコポリペプチド間にジアシルヒドラジン結合を形成させる。

活性化カルボン酸基はポリマーアシルヒドラジンにより置換され得る適当な離脱 基で置換されたカルボン酸基である。適当な離脱基の例はＢｏｄａｎｓｚｋｙ、 　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒ ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４）に記載されてお り、その開示内容を参照によりここに引用するものとする。このような離脱基は ペプチド化学の分野て公知であり、例えばイミダゾリル、トリアゾリル、Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシノルボルネンジカルボキシイミドル 、およびフェノール系離脱基か含まれるか、これらに限定されない。ポリペプチ ドまたはグリコポリペプチドを、活性化試薬の存在下で、対応するイミダゾール 、トリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン ジカルボキシイミド、またはフェノール系化合物と反応させることにより、離脱 基がペプチドのカルボン酸基に置換される。

適当な活性化試薬も公知であって、上記のＢｏｄａｎｓｚｋｙ。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓに記載され ており、その開示内容を参照によりここに引用するものとする。このような活性 化試薬の例としては、エチルジメチルアミノ−プロビルカルボジイミド（ＥＤＣ ）や３−〔２−モルホリニル−（４）−エチル〕カルボジイミドのような水溶性 カルボジイミド類、ｐ−トルエンスルホネート、５−置換イソキサゾリウム塩、 例えばウッドワード（Ｗｏｏｄｗａ　ｒｄ）試薬になどか含まれるが、これらに 限定されない。

本発明のアシルヒドラジンポリマー誘導体は一般構造（１）：〔式中、Ｒは上記 の水溶性ポリマーの１っであり、Ｚは０、ＮＨｌＳまたは１０個までの炭素原子 を含む低級アルキル基であり、そしてＸはポリマー上の末端基である〕を有する 。Ｘはヒト口キシル基であり得、その場合ポリマーはポリマー成分あたり２個の 不安定基（ポリペプチドまたはグリコポリペプチドと共有結合で結合し得る誘導 体を形成するために反応可能な基）をもつことになる。かくして、Ｘは末端ヒド ロキシル基から変換され得る基であってもよく、米国特許第４．１７９．３３７ 号および同第４．８４７．３２５号（その開示内容を参照によりここに引用する ものとする）に記載された従来技術の反応性誘導体、並びに本発明のアシルヒド ラジン誘導体が含まれる。上記のへテロ三官能性ポリマーは当業者に知られた方 法で製造することができ、アシルヒドラジン誘導体の製造に関して本明細書中に 記載した方法、並びにＺａｌｉｐｓｋｙ　ａｎｄＢａｒａｎｙ、　Ｐｏｌｙｍ、 　Ｐｒｅｐｒ、、　２７（１）、　ｌ　（１９８６）およびＺａｌｉｐｓｋｙ　 ａｎｄＢａｒａｎｙ、　Ｊ、　Ｂｉｏａｃｔ、　Ｃｏｍｐａｔ、　Ｐｏｌｙｍ、 、　５．２２７　（１９９０）　（これらの開示内容を参照によりここに引用す るものとする）に記載された方法が含まれる。

Ｘがポリマーを第２ポリペプチドまたはグリコポリペプチドと共有結合で結合さ せるのに有用な官能基である場合、Ｘは固体支持体または薬物のような小分子、 あるいは式（ＩＩ）　・〔式中、２はアシルヒドラジン誘導体に関して上記した ものと同しである〕のアシルヒドラジン誘導体であり得る。この場合のポリマー は対称のホモ三官能性ポリマー誘導体となろう。

このような二重ポリマー置換はポリペプチドまたはグリコポリペプチドの分子間 または分子内架橋をもたらすことかあり、これはある場合には有用であろう。こ の種の架橋はポリマーの使用量および反応する物質の濃度により制御することが でき、その方法は当業者によく知られている。

また、ポリペプチドもしくはグリコポリペプチドの架橋は、不安定なヒドロキシ ル基をポリマー分子あたり１個しかもたない予めブロックしたポリマーを使うこ とによっても防ぐことができる。

このようなポリマーの場合、Ｘはブロッキング基、例えば１−４個の炭素原子の アルコキシ基を表す。好ましいブロッキング基はメトキシ基である。

どんな場合にも、ペプチドアミノ基を越える反応性カルボニルまたは活性化カル ボン酸基に対するアシルヒドラジンの選択性は、ペプチドアミノ基と反応性カル ボニルまたは活性化カルボン酸基との間の分子間架橋を妨げ、二官能性ポリマー 誘導体を用いる場合にこのような架橋が起こるのを制限する。

Ｘは当業者に知られた方法によってポリマーに共有結合で結合された抗体または 固体支持体を表すこともてきる。水溶性ポリマーに共有結合で結合される固体支 持体の例、および水溶性ポリマーを固体支持体にカップリングさせる方法は公開 された欧州特許出願第２９５．０７３号に記載されており、その開示内容を参照 によりここに引用するものとする。

アシルヒドラジン誘導体は、例えばＺａｌｉｐｓｋｙによる米国特許出願第３４ ０．９２８号（１９８９年４月１９日付け；その開示内容を参照によりここに引 用するものとする）に記載されるように、メトキシル化ＰＥＧの末端−ＯＨ基（ ｍＰＥＧ−ＯＨ）をホスゲンと反応させてｍＰＥＧ−クロロホルメートを形成さ せることにより製造される。この反応は反応物質を溶解する有機溶媒（例えば塩 化メチレン）中で行われ、室温で一夜の反応により完了するだろう。

溶媒と過剰のホスゲンを除去し、その後ポリマークロロホルメートの残留物を過 剰のヒドラジンと反応させる。

アシルヒドラジンポリマー誘導体の製造は、限定するためでなく、例示するため にｍＰＥＧに関して記載しである。本発明で使用するのに適したどんなポリマー の場合にも類似の生成物か得られ、この製法を他の適当なポリマーに如何に適合 させるかは当業者にとって自明なことであろう。

本発明のより好ましい態様は、一般式（［１１）　：〔式中、Ｒは水溶性ポリマ ーを表し、Ｚは式■に関して上述した基を表し、Ｘは上記のポリマー末端基を表 し、そしてＡＡは１個のアミノ酸またはペプチド配列を表す〕のポリマーヒドラ ジドを利用する。ＡＡは普通の任意のアミノ酸のペプチド配列、あるいは少なく とも１個のアミノ酸残基てあり得る。ＡＡか１個のアミノ酸残基である場合、そ れはタンパク質中に自然界では見られない残基であることが好ましい。このよう な普通でない残基の例としては、α−またはγ−アミノ酪酸、ノルロイシン、ホ モセリン、β−アラニン、ε−カプロン酸などか含まれるが、これらに限定され ない。

Ｚか酸素である場合、その結合はウレタン結合であり、これは眉ＵＭ温度におい て種々の緩衝液中で、極端なｐＨてさえも、非常に安定しているが、タンパク質 加水分解に通常用いられる条件下では簡単に切断され、かくしてアミノ酸分析に よるＡＡのアミノ酸成分の測定か可能となる。

ペプチド配列は２つの役割を果たすことがてきる。第一に、それはアミノ酸分析 で当該配列を定量することによって修飾タンパク質の簡便な特性決定を提供し得 る。この場合、ペプチド配列はてきるだけ短いことか好ましく、普通でないアミ ノ酸残基を含むことが有利である。修飾タンパク質の特性決定においては、ペプ チド配列が１個だけのアミノ酸を含むことが最も好ましい。

さらに、ＡＡは標識されたアミノ酸残基（発色団、蛍光団、またはラジオアイソ トープを含む）、あるいは簡単に標識できるアミノ酸（例えば、チロシンはヨウ 素化され得る）を含んていてもよい。かかる標識の存在は生成するポリマー−ポ リペプチド結合体の実験的評価を容易にするだろう。

第二に、ペプチド配列は水溶性ポリマーとポリペプチド間の共有結合のタンパク 質加水分解酵素に対する不安定性を最適化するようなものであり得る。この第二 の場合に、ペプチド配列はできるたけ長いことが好ましく、天然のアミノ酸残基 を含むことが有利である。このようにして酵素に対する不安定性をコントロール することにより、当該ポリマー結合体を使って、ある種のタンパク質加水分解酵 素（ペプチド配列はこの酵素に不安定である）を高濃度で含むがん細胞のような 、特定の部位に生理学的に活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチドを運搬 することができる。

この第二の事例のペプチドの長さおよび配列は、使用システムおよび標的酵素の 特異性に応じて微調整することか可能である。

通常、３−７個のアミノ酸残基が必要とされよう。ペプチド化学の最新技術を用 いると、このような短いペプチド配列は簡単に組み立てることかできる。

対称的なホモニ宜能性ポリマー誘導体において、Ｘは第２ベブチ１〜配列残基を 含むことができる。例えば、Ｘがアシルヒドラジン誘導体であるとき、Ｘは一般 式（ＩＶ）　・〔式中、ＺおよびＡＡは上記の通りである〕を有するだろう。

ペプチド配列を含むアシルヒドラジンポリマー誘導体は、最初に上記のようなポ リマーのクロロホルメートを製造することにより合成し得る。その後、ポリマー クロロホルメートを溶解する溶媒（例えば塩化メチレン）中でポリマークロロホ ルメートとペプチドまたはアミノ酸誘導体を反応させる。ペプチドまたはアミノ 酸はＣ末端酸基のエステルの形であることが好ましく、メチルまたはエチルエス テルがより好ましい。

この反応も温和な条件下で実施可能であり、一般には室温で完全に進行し、得ら れた生成物はヒドラジン分解によりヒドラジドに簡明に変換される。次いて、ポ リマー生成物の反復沈殿のような慣用方法によりペプチド配列を含むアシルヒド ラジンポリマー誘導体を回収し、精製する。

別法として、ペプチド配列またはアミノ酸を含むアシルヒドラジンポリマー誘導 体は、上記のＺａｌｉｐｓｋｙによる米国特許出願第３４０、９２８号に記載さ れるように、ポリマーのスクシンイミジルカルボホー１−活性エステルどペプチ ド配列とを反応させるか、あるいはＺａｌｉｐｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｎｔ、 　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　３０゜７４０　（１９ ８７）に記載されるように、ポリマーの末端ヒドロキシル基とアミノ酸のイソシ アネート誘導体とを直接反応させることにより製造し得る（上記両文献の開示内 容を参照によりここに引用するものとする）。この場合も、再反応は本質的に慣 例的であって、温和な条件下で実施可能であり、ポリマーを溶解する塩化メチレ ンのような有機溶媒中室温で完全に進行する。アミノ酸エステルのイソシアネー ト誘導体とポリマーの末端ヒドロキシル基との反でおり、これらの教示内容を参 照によりここに引用する。ポリマーのスクシンイミジルカルボネート誘導体は、 上記のＺａｌ　１ｐｓｋｙによる米国特許出願第３４０．９２８号（その開示内 容を参照によりここに引用する）に記載されるように、上記のポリマークロロホ ルメートとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応させる既知の方法により形成 される。

上記のポリマー−ポリペプチド誘導体のどちらも、アシルヒドラジン誘導体を生 成する上記のヒドラジン分解法によってヒドラジドに簡単に変換される。ペプチ ド配列の製造は本質的に慣例的ポリマーアシルヒドラジン誘導体とカルボニル含 有ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとを反応させてヒドラゾン結合を形成 させる反応は図式ｌの反応順序により示され、ここでＲは上記の水溶性ポリマー を表し、Ｚは式１−ＩＶに関して上述した通りであり、そしてＲ１およびＲ２の いずれか一方または両方は独立してグリコポリペプチドの酸化炭水化物成分およ び反応性カルボニル基を形成させたポリペプチドまたはグリコポリペプチドのペ プチド単位から選ばれる。

ヒドラジド ヒドラゾンは、これを例えばＮ　ａ　Ｂ　ＨａまたはＮ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈｘと 反応させて、より安定したアルキルヒドラジドに還元することかできる。

ペプチド配列を含むポリマーアシルヒドラジン誘導体とカルボニル含有ポリペプ チドまたはグリコポリペプチドとの反応は図式ＩＡに示され、ここてＲ，Ｒ，、 Ｒ，およびＺは図式ｌに関して上述した通りであり、ＡＡは上記のペプチド配列 を表す：図式ＩＡ ポリマーアシルヒドラジン誘導体とポリペプチドまたはグリコポリペプチドの活 性化ペプチドカルボン酸基とを反応させてジアシルヒドラジドを形成する反応は 図式２の反応順序によって示さＲはこの場合も上記の水溶性ポリマーを表し、Ｚ は式Ｉ−［Ｖに関して上述した通りである。Ｒ２はアスパラギン酸、グルタミン 酸またはＣ末端カルボン酸基を含むポリペプチドを表す。Ｒ４はカルボン酸基が 上記のように活性化されるときにペプチドカルボン酸上に置換された上記の離脱 基の１つを表す。

ペプチド配列を含むポリマーアシルヒドラジン誘導体と、ポリペプチドまたはグ リコポリペプチドの活性化ペプチドカルボン酸基との反応は図式２Ａに示され、 ここでＲ，Ｒｓ　、Ｒ４およびＺは図式２に関して上述した通りであり、そして ＡＡは上記のペプチド配列を表す・ 一般に、ポリペプチドまたはグリコポリペプチドと水溶性ポリマーとの結合は、 最初にグリコポリペプチドの炭水化物部分を酸化するか、あるいはポリペプチド またはグリコポリペプチドのペプチド部分のカルボン酸基を活性化することを伴 う。炭水化物部分は、水溶液中のグリコポリペプチドを過ヨウ素酸ナトリウムと 反応させることにより、またはＳｏｌｏｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈＹ、　５１０．３２１−９　（１９９０）に記載さ れるようにガラクトースオキシダーゼあるいはノイラミニダーゼとガラクトース オキシダーゼの組合せを用いて酵素的に、酸化することができる。

この反応は室温で迅速かつ完全に進行する。反応媒体はポリペプチドまたはグリ コポリペプチドの要件に応じて緩衝化することが好ましい。酸化したグリコポリ ペプチドはその後回収し、カラムクロマトグラフィーによって過剰の過ヨウ素酸 塩から分離する。

ペプチド部分のカルボン酸基は、ポリペプチドまたはグリコポリペプチドを活性 化試薬（例えば、ＥＤＣのような水溶性カルボジイミド）と反応させることによ り活性化し得る。反応物質を水性反応媒体中約３．　０−８．　０のｐＨで接触 させるが、このｐＨを維持するように媒体を緩衝化してもよい。この反応は大部 分のタンパク質によって十分に許容される温和な条件（一般には４−３７°Ｃ） て行われる。

反応性カルボニル基を生成させたペプチド単位を有するポリペプチドまたはグリ コポリペプチドは、水性反応媒体中でアシルヒドラジンポリマー誘導体と直接反 応させることができる。この反応媒体はポリペプチドまたはグリコポリペプチド のｐＨ要件およびこの反応の最適ｐＨに応じて緩衝化されてもよく、そのｐＨは 一般に約５．　０−７．　０てあり、約６．０が好ましい。

すべての場合において、特定のポリペプチドまたはグリコポリペプチドの安定性 および反応効率に最適な反応媒体のｐＨ１並びに最適ｐＨとするための緩衝液は 、過度の実験を行うことなく当業者によって上記範囲内で簡単に決定される。本 出願において、温和な条件下での反応とは、好ましい温度範囲か約４−３７°Ｃ であるという意味に定義される。より高い温度ではより速く反応が完了すること が当業者には理解されよう。ただし、反応媒体の温度はポリペプチドまたはグリ コポリペプチドが変性し始める温度を越えてはならない。さらに、ある種のポリ ペプチドまたはグリコポリペプチドは、活性低下を最小限に抑えモして／また変 性を防ぐために、ポリマーアシルヒドラジン誘導体との反応を低温で行う必要の あることが当業者には理解されよう。特定のポリペプチドまたはグリコポリペプ チドにとって必要な低温は４°Ｃより低くないことか好ましく、どんな場合にも この温度は０℃より低くない方かよい。より長い反応時間が必要であるか、この 反応はなお進行するだろう。

通常、ポリペプチドまたはグリコポリペプチドは水溶液中で希望する結合度より 過剰の量のアシルヒドラジンポリマー誘導体と反応させる。この反応も温和な条 件、一般には４−３７°Ｃて進行する。場合により、ポリペプチドまたはグリコ ポリペプチドの要件および反応を実施する最適ｐＨに応じて反応媒体を緩衝化す る。

反応後、結合生成物を回収し、透析、カラムクロマトグラフィーなどて精製する 。アシルヒドラジンポリマー誘導体がアミノ酸またはペプチド配列を含む場合は 、アミノ酸分析によってポリペプチドまたはグリコポリペプチドのポリマー結合 度をその後測定することかてきる。

前述のことから、本発明のアシルヒドラジンポリマー誘導体は反応性と選択性の 最適バランスを保ち、その結果アシルヒドラジンとペプチドアミノ基の事実上の 競合なしに、ポリマー結合体がポリペプチドまたはグリコポリペプチドの非アミ ノ官能基により形成され得ることが容易に理解されよう。かくして、架橋が妨げ られ、しかもポリペプチドまたはグリコポリペプチドの活性が保持される。

以下に記載する非限定的実施例は本発明のある面を例示するものである。すべて の部およびパーセントは特に指定しない限り重量基準であり、すべての温度は° Ｃで表される。

メトキシ−ＰＥＧ　（ｍＰＥＧ）はＵｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ社から入手でき る。使用した溶媒、β−アラニンエチルエステルＨＣＩ、ヒドラジン、ＰｚＯｓ 　、ＥＤＣ，Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド （ＨＯＮｂ）　、ＮａＣＮＢＨ２およびＮａ１Ｏ４はライスコンシン州ミルウォ ーキーのＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手できる。キモトリプシン はＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＣｈｅｍｉｃａ１社から得られた。ＢＳＡ、卵アルブ ミンおよびヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はミズーリ州セントルイスのＳ　ｉ 　ｇｍａＣｈｅｍｉｃａ１社から入手できる。Ｇ−Ｃ３Ｆはカリフォルニア州す サンオークスのＡｍｇｅｎ社から得られた。

ｍＰＥＧ　（ＭＷｎ　５．０００．１００ｇ、２０ミリモル）をトルエン（２５ ０ｍＬ）に溶かし、共沸により還流下で２時間乾燥した。この溶液を２５°Ｃと なし、塩化メチレン（５０ｍＬ）で希釈し、その後ホスゲン（２０％トルエン溶 液　３０ｍＬ、５６ミリモル）で−夜処理した。溶媒と過剰のホスゲンを減圧下 で回転蒸発により除去した。ポリマークロロホルメートの固体残留物を塩化メチ レン（９０ｍＬ）に溶かし、塩化メチレンに予め溶解しておいたβ−アラニンエ チルエステル塩酸塩（６，１ｇ、４０ミリモル）（全量３ｏｍＬ）で処理し、次 いでトリエチルアミン（８，４ｍＬ、６０ミリモル）で処理した。およそ３０分 後、この溶液をトルエン（５０ｍＬ）で希釈し、濾過し、蒸発乾固させた。粗生 成物は加温した（５０°Ｃ）酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶かし、セライトを通 して濾過した。濾液をイソプロパツールで希釈して全量１，０００ｍＬとし、２ ５°Ｃに一夜放置して生成物の沈殿を促進させた。イソプロパツールからの生成 物の再結晶を行った。乾燥させたｍＰＥＧ−β−アラニンエチルエステルの収量 は９８ｇ（９５％）であった。その後、以下のＩＲおよびＮＭＲスペクトルを得 た： ＩＲ（無溶媒）：　３３４１（Ｎ−Ｈ）、　１７２３（Ｃ＝Ｏ，ウレタン）　Ｃ Ｍ−’、　ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：　δ１．１７（ｔ、　ＣシＣＨ２０） 、　２．４４　（ｔ、β−アラニンのＣＩ（、ＣＩ（、）、　３．６４　（ＰＥ Ｇ）、　３．９　（ｔ、　ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＯＣＨ２）、　４．１１　（２゜ＣＨ ，ＣＨ，０）、　５．２５　（幅広、　Ｎ）ｆ）　ｐｐｍ。

ｍＰＥＧ−β−アラニンエチルエステル（６２ｇ、１２ミリモル）をピリジン（ １２０ｍＬ）に溶かし、還流下にヒドラジン（１２ｍＬ、０．３７５モル）て６ 時間処理した。この溶液を回転蒸発により乾燥し、残留物をイソプロパツールか ら２回結晶化させ、Ｐ２Ｏ，て減圧乾燥した。収量は６０ｇ（９７％）であった 。

生成物中の遊離ヒドラジンの非存在は、水／メタノール（３：ｌ）での逆相（Ｃ −１８）薄層クロマトグラフィーにかけ、検出用のＴＮＢＳスプレー溶液を用い て確かめた。

ＴＮＢＳを用いるヒドラジド基の比色検定は０．２ミリモル／ｇ（理論量の１０ ３％）をもたらした。ポリマーのβ−アラニン含有量は、この生成物の完全加水 分解（６Ｎ　ＨＣＩ、１１０°Ｃ１２４時間）アリコートのアミノ酸分析により 測定して、０．２０５ミリモル／ｇ（理論量の１０５％）であった。

”Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：δＩ７１．２　（Ｃ＝０．　ｌ＝ドラシト）；　 １５６．４　（Ｃ＝０．　’７　ｔ。

（ＮＨＣＨｔＣＨｔ）　ｐｐｍ、ＩＲＣ無溶媒”）：　３３２８（ＮＨ）；　１ ７１９（Ｃ＝Ｏ，ウレタン）；１６７１　（Ｃ＝０．　ヒドラジド）　ｃｍ−’ 。

（本頁以下余白） 実施例２ キモトリプシンのＥＤＣ活性化カルボキシル基へのβ−アラニンを含むｍＰＥＧ −ヒドラジド誘導体のカップリング：キモトリプシン（２０ｍｇ、８．０ＸＩＯ −７モル、１．２８ＸｌＯ−５当量のカルボキシル）と実施例１のｍＰＥＧ−β −アラニン−ヒドラジド誘導体（８００ｍｇ、０．１６ミリモル）を８ｍ１の１ ｍＭＨＣｌに溶かし、この溶液のｐＨを５．０にしてＥＤＣ（１５ｍｇ、０．０ ７８ミリモル）て処理した。１．０ＮＨＣＩを加えてｐＨ５，０に保ちながら、 この反応混合物を２５°Ｃて一夜静かに攪拌した。１ｍＭＨＣｌに対して反応混 合物を４°Ｃて十分に透析し、過剰の試薬類を除いた。カップリング反応の程度 を調べるために、ＰＥＧ−キモトリプシン結合体のアリコートを完全に加水分解 しく６Ｎ　ＨＣＩ、１１０℃、２４時間）、アミノ酸分析を行った。β−アラニ ンの量はキモトリプシン１分子あたり２．４分子のｍＰＥＧに相当した。

実綿例３ キモトリプシンのＨＯＮｂ活性化カルボキシル基へのβ−アラニンを含むｍＰＥ Ｇ−ヒドラジド誘導体のカップリング−ＨｏＮｂ　（２８，７ｍｇ、０，１６ミ リモル）の存在下で、実施例２と同じ結合プロトフールを採用した。得られたＰ ＥＧ−キモトリプシンは、アミノ酸分析によるβ−アラニンの定量に基づいて、 タンパク質１分子あたり平均２．７分子のｍＰＥＧを含んでいた。これはＨＯＮ ｂの存在によって結合プロセスかわずかだけ高められることを実証している。

ＢＳＡのＥＤＣ活性化カルボキシル基へのβ−アラニンを含むｍＰＥＧ−ヒドラ ジド誘導体のカップリング：５０ｍＭ　ＮａＣｌ　（１０ｍＬ）中のＢＳＡ　（ ２０ｍｇ）およびｍＰＥＧ−β−アラニン−ヒドラジド誘導体（８００ｍｇ、　 ０゜１６ミリモル）の溶液を、実施例２のようにｐＨ５，０，２５°Ｃて一夜Ｅ ＤＣ（１５ｍｇ、０．０７８ミリモル）により処理した。

リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７，７）に対して反応混合物を４°Ｃて十分に透 析し、過剰の試薬類を除いた。結合体中のβ−アラニンの含有量はＢ５Ａｌ分子 あたり８．１残基のｍＰＥＧに相当した。ＰＥＧ結合体と天然ＢＳＡのＧＦ−Ｈ ＰＬＣ比較をＢＩＯ３ＥＰ　ＳＥＣ４０００カラムを使って行い、その結果を図 １に示す。溶出条件は１０％（Ｖ　／　Ｖ　）メタノール／４０ｍＭリン酸緩衝 液であった。図１は、天然Ｂ５Ａ２と比較して分子量か実質的に増大した、ＰＥ Ｇ結合結合体長好な均質性を示す。

リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ｐＨ６，０（１，８ｍＬ）に溶解した卵アルブミン（ ２０ｍｇ、４．４ｘｌＯ−’モル）をＮａ　１０゜（２００ｍＭ水溶液、０．２ ｍＬ）で処理した。この反応は暗室にて４°Ｃて進行させた。１時間後、反応溶 液を、酢酸緩衝液でｐＨ５，０に平衡化した１　２ｍＬのセファデックスＧ−２ ５カラムにかけて、酸化した糖タンパク質を過剰の過ヨウ素酸塩から分離した。

追加の試料を調製し、ｐＨ６，０のＰＢＳ緩衝液またはｐＨ７，０のリン酸緩衝 液てカラムを平衡化し、この手順を繰り返した。これにより、異なる緩衝系を有 する３つの別個の反応混合物か得られた。それぞれの混合物に実施例１のｍＰＥ Ｇ−β−アラニン−ヒドラジド誘導体（１５０ｍｇ、２．９Ｘ１０−’モル）を 加えた。３つの反応混合物のそれぞれを２等分し、それぞれの一方にＮ　ａ　Ｃ Ｎ　Ｂ　Ｈｓ　（６、６ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌ溶液　０．３ｍＬ、３゜＋５ＸｌＯ −’モル）を加えた。この反応は４°Ｃて一夜進行させた。

各溶液は未反応試薬がなくなるまでリン酸緩衝液ｐＨ７，７を用いて透析した。

Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈｓを加えた溶液中の結合体はアシルヒドラジン結合を形成 した。ｍＰＥＧ−卵アルブミン結合体の分析を下記の表Ｉに要約する。

ネ卵アルブミン分子に結合したｍＰＥＧ鎖の平均数は、結合体のアミノ酸分析の 結果から計算した。

ＴＳＫ　Ｇ　４０．００ＳＷカラムおよび１０％（ｖ／、ｖ）メタノール／４０ ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５移動相を用いたＣＦ−ＨＰＬＣ分析を図２に示すが 、これからｍＰＥＧ−卵アルブミン結合体３の良好な均質性と、天然卵アルブミ ン４に比べて実質的に増加した分子量が明らかである。

ＰＢＳ　（０，８ｍＬ、５０ｍＭ５ｐＨ６，０）中のヒト免疫グロブリンＧ　（ ＩｇＧ）（５ｍｇ、３．１２Ｘ１０−’ミリモル）を、新たに調製したＰＢＳ中 の過ヨウ素酸ナトリウムの溶液（０，２ｍＬ、２００ｍＭ）て処理した。得られ た溶液を４°Ｃでインキュベートした。１時間後、反応溶液を１２ｍＬのセファ デックスＧ−２５カラムにかけて、酸化した糖タンパク質を過剰の過ヨウ素酸塩 から分離した。酸化したＩｇＧを回収し、実施例１のｍＰＥＧ−β−アラニン− ヒドラジド誘導体（２００ｍｇＳ　１．２５ｘｌｏ−’ミリモル）と共に４°Ｃ で一夜処理した。各溶液は未反応試薬かなくなるまでリン酸緩衝液ｐＨ７，７を 用いて透析した。結合体と天然１ｇＧとのＧＦ−ＨＰＬＣ比較をＺＯＲＢＡＸ　 ＧＦ−４５０カラムを使って行い、その結果を図３に示す。移動相として０．２ Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５を用いた。図３は、天然ＩｇＧ６に比へて実質的に増 加した分子量を有するＰＥＧ−結合体５の良好な均質性を示している。ＰＥＧ− ＩｇＧ結合体の加水分解アリコート（６Ｎ　ＨＣＩ、１１０″Ｃ１２４時間）の アミノ酸分析によりβ−アラニンの量を測定し、その結果それはタンパク質１分 子あたり６残基のｍＰＥＧに相当した。

ＩｇＧ　（５，４ｍｇ、３．３７ＸＩＯ−’ミリモル）とＰＢＳ（５０ｍＭ、０ ．９１ｍＬ）を、暗室中４°Ｃにて新たに調製した過ヨウ素酸ナトリウム溶液（ １１０ｍＭ、０．０９ｍＬ）て処理した。１時間後、この反応混合物にｍＰＥＧ −β−アラニン−ヒドラジド（１００ｍｇ、６．３Ｘ１０−’ミリモル）を加え 、その後４°Ｃて一夜インキユベートした。この溶液は未反応試薬がな（なるま でリン酸緩衝液ｐＨ７，７に対して透析した。純粋なＰＥＧ−１ｇｃを回収し、 この結合体の加水分解アリコート（６ＮＨＣＩ、１１０°Ｃ１２４時間）のアミ ノ酸分析によりβ−アラニン含有量を測定し、その結果１ｇＧ１分子あたり８． ６残基のｍＰＥＧを含んていた。

このワン−ボット結合法は、より少ない操作に加えて、実施例６に記載した方法 よりも効率的であるようだ。

ＩｍＭ　ＨＣｌ　（８６ｍＬ）中のＧ−Ｃ３Ｆ　（８６ｍｇ、４゜７８Ｘ１０１ モル）の溶液に実施例１のｍＰＥＧ−β−アラニン−ヒドラジド（１５，０ｇ、 ２．９ミリモル）を加え、続いてＥＤＣ（１２８ｍｇ、０．６６７ミリモル）を 加えた。この反応混合物を約ｐＨ４，７−５，０に保ちなから２５°Ｃで９０分 間静かに攪拌した。４°Ｃて１ｍＭ　ＨＣＩに対して反応溶液を十分に透析し、 過剰の試薬を除いた。ＰＥＧ結合体と天然Ｇ−Ｃ３ＦとのＧＦ−ＨＰＬＣ比較を ＺＯＲＢＡＸ　ＧＦ−４５０カラムを使って行い、その結果を図４に示す。移動 相は０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５であった。図４は、天然Ｇ−Ｃ３Ｆ８に比 べて実質的に増加した分子量を有するＰＥＧ結合体７を示している。

ＰＥＧ−Ｇ−Ｃ３Ｆ中のｍＰＥＧ残基の平均数は、この結合体の加水分解アリコ ート（６Ｎ　ＨＣＩ、１１０℃、２４時間）中のβ−アラニン量を測定して、５ ．８であった。ＴＮＢＳ検定により、天然およびＰＥＧ修飾Ｇ−Ｃ３Ｆ−１が同 数のアミノ基をもつことを確認し、このタンパク質のＥＤＣ活性化カルボン酸基 はタンパク質のアミノ基と反応しないことがわかった。ｍＰＥＧ−〇−Ｃ３Ｆの 調製は、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　（ＰｈａｓｔＧｅｌ−１Ｈｏｍｏｇｅ ｎｏｕｓ　１２．５　、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上に２９，０００−６７．００ ０ダルトンの範囲で４本の別個のバンドをもたらした。ｍＰＥＧ−Ｇ−Ｃ３Ｆ− １の等電点電気泳動（ＰｈａｓｔＧｅｌ　、［ＥＦ　３−９、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ社）は、天然タンパク質（ｐ１５．２；５．９）よりも著しく高い６．　８− ９．　０の範囲にｐＴを有する６本のバンドの分離をもたらした。このことは、 活性化カルボン酸基とペプチドアミノ基との架橋を起こすことなくペプチドカル ボン酸基と結合した結果として、タンパク質がより塩基性になったことを明らか に示すものである。

容易に理解てきるように、上で説明した特徴の多くの変更および組合せが、請求 の範囲に記載した本発明から逸脱することなく利用し得るだろう。このような変 更は本発明の精神および範囲からの逸脱とは見なされず、かかる修飾はすべて次 の請求の範囲に含まれるものである。

産業上の利用可能性 本発明は、新規な薬剤運搬形態を表す、生物学的に活性なまたは薬学的に活性な 化合物と結合させたポリマーの製造に適用される。

国際調゛査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　７／３４ １３１００　８３１８−４Ｈ １５／１４　８３１８−４Ｈ １５／２６　８３１８−４Ｈ １５／２８　８３１８−４Ｈ １７１０８８３１８−４Ｈ １７／１０　８３１８−４Ｈ ＣＯ８Ｆ　８／３０　ＭＨＡ　７３０８−４ＪＣＯ８Ｇ　６５／３２　ＮＱＪ　 ９１６７−４Ｊ６９／１０　ＮＲＮ　９２８６−４Ｊ ８１１００　ＮＵＳ　８４１６−４Ｊ ＣＯ８Ｌ１０１１００　ＬＴＢ　７２４２−４ＪＣ１２Ｎ　９１０２　９３５９ −４Ｂ ９／７６　９３５９−４Ｂ ／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００ ９９：２６　８３１８−４Ｈ ９９：３４ ９９　：５８ Ｉ （７２）発明者　メノンールドルフ、スニーサアメリカ合衆国　０８９０４　ニ ュージャージ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的に活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチドと、ヒドラジドま たはヒドラゾン官能基を含む結合により、当該ポリペプチドまたはグリコポリペ プチドのペプチド部分の反応性カルボニルもしくはカルボン酸基においてこれに 共有結合で結合された１つまたはそれ以上の水溶性ポリマーと、からなる生物学 的に活性な巨大分子待合体。
2. ２．前記の生物学的に活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチドがポリペプ チドからなる、請求項１記載の巨大分子結合体。
3. ３．前記ポリペプチドが酵素である、請求項２記載の巨大分子結合体。
4. ４．前記酵素がアスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ス ーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカ ーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガ ラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼおよびグルクロニダーゼより成る群か ら選ばれる、請求項３記載の巨大分子結合体。
5. ５．前記ポリペプチドが第ＶＩＩＩ因子、インシュリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン 、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモ ン、ソマトメジン、エリトロポエチン、黄体形成ホルモン、視床下部放出因子、 制尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロンおよびコロ ニー刺激因子より成る群から選ばれる、請求項２記載の巨大分子結合体。
6. ６．前記の生物学的に活性なポリペプチドまたはグリコポリペプチドが免疫グロ ブリン、卵アルブミン、リパーゼ、グリコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プ ラスミノーゲン活性化因子、およびグリコシル化されたインターロイキン、イン ターフェロンおよびコロニー刺激因子から選ばれたグリコポリペプチドからなる 、請求項１記載の巨大分子結合体。
7. ７．前記結合が前記ヒドラジドまたはヒドラゾン官能基を前記ポリマーへ結合さ せるペプチド配列をさらに含む、請求項１記載の巨大分子結合体。
8. ８．前記反応性カルボニル基が前記ペプチド部分に形成されたケトンまたはアル デヒド基である、請求項１記載の巨大分子結合体。
9. ９．生物学的に活性なグリコポリペプチドと、ペプチド配列を介して下記ポリマ ーに結合されたヒドラジドまたはヒドラゾン官能基を含む結合により、当該グリ コポリペプチドの酸化炭水化物部分においてこれに共有結合で結合された１つま たはそれ以上の水溶性ポリマーと、からなる生物学的に活性な巨大分子結合体。
10. １０．前記水溶性ポリマーがポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチレン化ポ リオール、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン およびデキストランより成る群から選ばれる、請求項１または９記載の巨大分子 結合体。
11. １１．前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールホモポリマーであ る、請求項１０記載の巨大分子結合体。
12. １２．前記ポリエチレングリコールホモポリマーがメトキシル化ポリエチレング リコールホモポリマーである、請求項１１記載の巨大分子結合体。
13. １３．前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールとポリプロピレン グリコールまたはポリプロピレンオキシドとのブロックコポリマーである、請求 項１０記載の巨大分子結合体。
14. １４．前記ポリオキシエチレン化ポリオールがポリオキシエチレン化グリセロー ル、ポリオキシエチレン化ソルビトールおよびポリオキシエチレン化グルコース より成る群から選ばれる、請求項１０記載の巨大分子結合体。
15. １５．前記水溶性ポリマーが約６００−１００，０００ダルトンの数平均分子量 をもつ、請求項１または９記載の巨大分子結合体。
16. １６．前記水溶性ポリマーが約２，０００−２０，０００ダルトンの数平均分子 量をもつ、請求項１５記載の巨大分子結合体。
17. １７．前記グリコポリペプチドが免疫グロブリン、卵アルブミン、リパーゼ、グ リコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびグ リコシル化されたインターロイキン、インターフェロンおよびコロニー刺激因子 より成る群から選ばれる、請求項９記載の巨大分子結合体。
18. １８．前記免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこ れらのフラグメントより成る群から選ばれる、請求項６または７記載の巨大分子 結合体。
19. １９．前記ペプチド配列が本質的に１個のアミノ酸からなる、請求項７または９ 記載の巨大分子結合体。
20. ２０．前記ペプチド配列が自然界ではタンパク質中に存在しないアミノ酸を１個 またはそれ以上含む、請求項７または９記載の巨大分子結合体。
21. ２１．前記アミノ酸がα−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、ノルロイシン、ホモセ リン、β−アラニンおよびε−カプロン酸より成る群がら独立に選ばれる、請求 項２０記載の巨大分子結合体。
22. ２２．前記ペプチド配列が６個までのアミノ酸を含む、請求項７または９記載の 巨大分子結合体。
23. ２３．前記アミノ酸が自然界でタンパク質中に存在する、請求項７または９記載 の巨大分子結合体。
24. ２４．前記ペプチド配列が前記ポリマーとウレタン基を形成する、請求項７また は９記載の巨大分子結合体。