JP5876208B2 - 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体 - Google Patents

Description

この出願は、２００６年１２月１５日に出願された、米国仮出願第６０／８７５，２１７号に対する優先権を主張する。

発明の分野
本発明は、１〜４のシアル酸ユニットの鎖を含む炭水化物部分に結合される凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）を含むタンパク質性コンストラクトに関する。本発明は、さらに、血液凝固タンパク質（特に、少なくともＦＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、および第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の機能上の欠損または欠乏に関連する出血性障害を有する哺乳類において血中のＦＶＩＩａ）のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延ばす方法に関する。

発明の背景
血液凝固カスケードは、内因性経路、外因性経路、および共通経路の３つの異なるセグメントに分けられる。（非特許文献１）。血液凝固カスケードは、一連のセリンプロテアーゼ酵素（チモーゲン）およびタンパク質補助因子に関わる。必要な場合、不活性チモーゲン前駆体は活性型に転換され、それは、結果的に血液凝固カスケードで次の酵素に転換する。

内因性経路は凝固第ＶＩＩＩ因子、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩを必要とする。内因性経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、および第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が負の電荷をもつ表面に曝される場合、起こる。血小板から分泌されるカルシウムイオンおよびリン脂質も必要とされる。

外因性経路は、血管の血管腔が損傷を受けた場合、開始される。膜糖タンパク質組織因子が曝され、循環する第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に、次いで既存する少量のその活性化型ＦＶＩＩａに結合する。この結合は、ＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの完全転換を促進し、続いてカルシウムおよびリン脂質の存在下で第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）への転換および第Ｘ因子（ＦＸ）の第Ｘａ因子（ＦＸａ）への転換を促進する。ＦＶＩＩａの組織因子との会合は、基質（ＦＸおよびＦＩＸ）に対するＦＶＩＩの結合部位を近接近させることによって、および立体構造変化を誘発することによってタンパク質分解活性を増進させ、それによってＦＶＩＩａの酵素活性が増進する。外因性経路によるＦＸ活性化の速度は、ＦＩＸａ、ＦＶｌＩＩａ、リン脂質、およびカルシウムイオンの（内因性）経路によって達成される速度の約５０分の一の速さである。

ＦＸの活性化は、これら２つの経路の共通点である。リン脂質およびカルシウムとともに、第Ｖａ因子（ＦＶａ）および第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンに転換させる（プロトロンビナーゼ複合体）。次いでそれはフィブリノーゲンを切断してフィブリンモノマーを形成する。フィブリンモノマーは、重合してフィブリン鎖を形成する。第ＸＩＩＩａ因子（ＦＸＩＩＩａ）は、これらのフィブリン鎖を互いに共有結合させて、剛性のメッシュを形成する。

ＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの転換も、トロンビン、ＦＩＸａ、ＦＸａ、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、および第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）を含むいくつかのプロテアーゼによって触媒される。血液凝固カスケードの初期相を抑制するために、組織因子経路インヒビターはＦＶＩＩａ／組織因子／ＦＸａ産物複合体を標的にする。

ＦＶＩＩ（安定因子またはプロコンバーチンとしても公知である）は、止血および凝固で中心的役割を有する、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である（非特許文献２）。

ＦＶＩＩは肝臓で合成されて、４８ｋＤの１本鎖糖タンパク質として分泌される。ＦＶＩＩａは、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質のすべてと、類似するタンパク質ドメイン構造を共有する。前記タンパク質ドメイン構造は、タンパク質の脂質膜との相互作用に関与する９〜１２の残基を有するアミノ末端γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン、カルボキシ末端セリンプロテアーゼドメイン（触媒ドメイン）、および組織因子との相互作用を調整するカルシウムイオン結合部位を含有する２つの上皮増殖因子様ドメインからなる。

γ−グルタミルカルボキシラーゼは、分子のアミノ末端部分でＧｌａ残基のカルボキシル化を触媒する。カルボキシラーゼは、その作用のために還元型ビタミンＫに依存し、それはエポキシド型に酸化される。ビタミンＫエポキシド還元酵素は、ビタミンＫのエポキシド型を還元型に再変換するために必要である。

ＦＶＩＩの主要部分は、チモーゲン型で血漿中で循環し、この型の活性化は、アルギニン１５２とイソロイシン１５３との間のペプチド結合の切断をもたらす。結果として生じる活性化ＦＶＩＩａは、ＮＨ_２由来軽鎖（２０ｋＤ）および単一のジスルフィド結合（Ｃｙｓ１３５〜Ｃｙｓ２６２）を介して連結されるＣＯＯＨ末端由来重鎖（３０ｋＤ）からなる。軽鎖は膜結合Ｇｌａドメインを含有し、重鎖は触媒ドメインを含有する。

遺伝因子および環境因子によって決定されるＦＶＩＩの血漿中濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである（非特許文献３）。ＦＶＩＩの異なる遺伝子型は、ＦＶＩＩの平均レベルで数倍の相違をもたらすことができる。血漿中ＦＶＩＩレベルは、健常な女性では妊娠中に上昇し、また年齢とともに上昇し、女性および高トリグリセリド血症の人においてはより高い。ＦＶＩＩは、すべての凝血原因子のなかでその半減期が最も短い（３〜６時間）。ＦＶＩＩａの血漿中の平均濃度は、健常な個体で３．６ｎｇ／ｍＬであり、かつＦＶＩＩａの循環半減期は、他の凝固因子と比較すると相対的に長い（２．５時間）。

遺伝性ＦＶＩＩ欠乏は、稀な常染色体劣性遺伝出血性障害であり、その有病率は一般人口５０万人あたり１症例と推定される（非特許文献４）。インヒビターからの後天性ＦＶＩＩ欠乏も非常に稀である。症例は、また、薬物（例えばセファロスポリン、ペニシリン、および経口抗凝固剤）に関連して発症するＦＶＩＩ欠乏が報告されている。さらにまた、後天性ＦＶＩｌ欠乏は、自然発症的に、または他の状態（例えば骨髄腫、敗血症、再生不良性貧血）とともに、インターロイキン−２および抗胸腺細胞グロブリン療法で発症することが報告されている。

補充療法は、ＦＶＩＩ欠乏症の患者に対する処置の中心である（非特許文献５）。これは、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、プロトロンビン複合体濃度物（ＰＣＣ）、または血漿由来ＦＶＩＩ濃縮物を用いて、従来から成し遂げられてきた。しかし、組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）は、今や、これらの患者での療法のために広く使用されている。

ｒＦＶＩＩａは、また、インヒビターを有する血友病ＡおよびＢの患者の出血を処置するために開発され、大手術（例えば整形外科手術）中でさえも止血を誘導することが分っている（非特許文献６）。ｒＦＶＩＩａは、ＢＨＫ細胞培養物で生成され、かつ血漿由来ＦＶＩＩａに極めて類似することが示されている。血友病処置でのｒＦＶＩＩａの使用は、トロンビン活性化血小板の表面へのＦＶＩＩａの低親和性結合に基づく。外来性ｒＦＶＩＩａの薬理量を投与することによって、損傷部位の血小板表面上のトロンビン生成がＦＶＩＩＩ／ＦＩＸの存在とは独立して増強される。急速なトロンビン形成が増大する結果、密接なフィブリン止血血栓が形成される。

ＦＶＩＩ欠乏およびインヒビター合併血友病ＡおよびＢの処置のために本来は開発されたのだが、ｒＦＶＩＩａの新規適応（症例報告および小規模の臨床試験に基づく）としては、肝疾患、血小板減少症、または質的な血小板機能異常症の患者での使用、および非凝固障害を有する患者が大手術または大外傷に起因する出血の場合の使用が挙げられる。

ポリペプチド治療薬（例えばＦＶＩＩａを含む血液凝固タンパク質）は、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、抗体によって中和される。これは、ポリペプチド治療薬の半減期および循環時間を減少させ、それによってポリペプチド治療薬の治療有効性を限定する。所望のＦＶＩＩａの治療効果または予防効果を達成して維持するには、相対的に高い投与量および頻繁な投与が必要である。結果として、適切な投与量の調節を得るのは困難であり、頻繁な静脈内投与を必要とするために、患者の生活様式を制限する。従って、長い循環半減期によって改善されたＦＶＩＩａ分子は、必要な投与回数を減少させる。

原則として、血液循環におけるタンパク質の半減期を延ばすには４つの一般的な選択肢がある。すなわち、
・化学修飾または酵素修飾の導入
・血液循環中のタンパク質を保護する担体分子の使用
・半減期を延ばす突然変異体の構築
・分解経路の修飾
本発明は、血液凝固タンパク質の改善（特に化学修飾によるＦＶＩＩａ分子）を教示する。治療用ポリペプチドの化学修飾に関しては、これまでいくつかのアプローチが用いられている。

ポリペプチド薬のＰＥＧ化はポリペプチド薬を保護し、それらの薬力学的プロファイルおよび薬物動態プロファイルを改善する（非特許文献７）。ＰＥＧ化プロセスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の繰り返し単位をポリペプチド薬に付着させる。ＰＥＧ分子は、大きな流体力学的容積（球状タンパク質の大きさの５〜１０倍）を有し、水溶性で高度に水和し、流動性が高く、無毒、非免疫原性であり、および身体から迅速に除去される。分子のＰＥＧ化は、酵素分解に対する薬物耐用の増加、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加、投薬頻度の減少、免疫原性の低下、物理的安定性および熱安定性の増加、溶解性の増加、液体安定性の増加、ならびに凝集の減少をもたらすことが可能である。最初のＰＥＧ化薬物は、１９９０年代の初めにＦＤＡによって承認された。今のところ、ＦＤＡは、経口用、注射用、および局所投与用のいくつかのＰＥＧ化薬物を承認している。

ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）技術は、インタクトなグリコシル結合基を介してペプチドに共有結合したＰＥＧによる、ＰＥＧポリマーとペプチドとの間にペプチド結合体を提供する方法が含まれる。

リポソームを用いて、種々の分子（例えばＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、抗生物質、抗癌剤および抗真菌剤、抑制剤／活性剤、抗体（免疫リポソーム）、ならびに抗原（ワクチン用）がカプセル化されている。

リン脂質も、ＰＥＧ（ＰＥＧ−リポソーム）（例えばアミド結合を介して）、カルボキシ−ＰＥＧおよび精製ダイズ・ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、エステルおよびカルバミン酸誘導体に結合体化されることが可能であり、今日最も広く使用されているのはカルバミン酸誘導体である（特許文献１）。最も一般的に用いられているＰＥＧの分子量は、２，０００および５，０００であるが、６００から１２，０００の範囲のＰＥＧも用いられている。

酸性単糖置換タンパク質は、最初に、特許文献２に開示された。この特許では酸性単糖（すなわちｎ−アセチルノイラミン酸およびグルコン酸）は、インスリン、ヒト成長ホルモン、またはアルブミンのα−アミノ基またはε−アミノ基の上に置換され、ポリペプチドの抗原性を減少させる。

コロミン酸（ＣＡ）とも称されるポリシアル酸（ＰＳＡ）も、天然の多糖である。ポリシアル酸は、α（２→８）ケトシド結合によるＮ−アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端に隣接ジオール基を含有する。ポリシアル酸は、負の電荷をもち、人体の天然の成分である。ポリシアル酸は、大量に細菌から容易に生成されることが可能であり、所定の物理的特性を有する（特許文献３）。人体においてポリシアル酸と化学的および免疫学的に同一である細菌性ポリシアル酸は、タンパク質に結合する場合でさえ、非免疫原性である。他のポリマー（例えばＰＥＧ）と異なり、ポリシアル酸は生分解性である。カタラーゼおよびアスパラギナーゼに共有結合するコロミン酸は、タンパク質分解酵素または血漿の存在下で酵素安定性の増加をもたらした。ポリシアル酸化および修飾されていないアスパラギナーゼによるｉｎ ｖｉｖｏ比較研究は、ポリシアル酸化が酵素の半減期を増加させることを明らかにした（非特許文献８）。

しかし、特許文献２に記載されるように、酸性単糖に結合体化したポリペプチドからなる治療化合物は、現在までに市販されていない。対照的に、特許文献３は、治療化合物の多糖部分がポリマー鎖に少なくとも５個（他の実施形態では少なくとも２０または５０個）のシアル酸残基を有するはずであることを教示する。多糖は通常、同時精製する内毒素の固有のリスクを保有する細菌で生成されるので、シアル酸ポリマー長鎖の精製は、内毒素含有物が増加する可能性を高め得る。１〜４のシアル酸ユニットを有するＰＳＡ短分子も、合成的に調製され得（非特許文献９；非特許文献１０）、従って高レベルの内毒素のリスクを最小化する。

特許文献４は、他の多くのタンパク質の中でＦＶＩＩがＰＥＧ化され得ることを示唆しているが、その開示を支持する任意の実施例を含有していない。

特許文献５が教示する結合体は、ポリペプチドに共有結合する少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含む結合体を教示する。ここで、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記非ポリペプチド部分のための結合基を含む少なくとも１つのアミノ酸残基が導入または除去されている点で野生型ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａのそれと異なる。非ポリペプチド部分に対しては、特にＰＥＧが示唆された。

特許文献６は、ＦＶＩＩポリペプチドまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを開示する。ここで、ポリペプチドは、アスパラギン結合型および／またはセリン結合型の１つ以上のオリゴ炭水化物部分を含み、および前記オリゴ糖基のうちの少なくとも１つが少なくとも１つのポリマー基（ＰＥＧ、「グリコＰＥＧ化」）に共有結合される。

米国特許第６，５９３，２９４号明細書 米国特許第３，８４７，８９０号明細書 米国特許第５，８４６，９５１号明細書 国際公開第９８／３２４６６号パンフレット 国際公開第０１／５８９３５号パンフレット 米国特許出願公開第２００５／０１１３５６５号明細書

Ｓｃｈｅｎｏｎｅら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００４）１１：２７２−７ Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ， Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．（２００２）３：２８７−９９ Ｐｉｎｏｔｔｉら、Ｂｌｏｏｄ．（２０００）９５：３４２３−８ Ａｃｈａｒｙａら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（２００４）２２４８−５６ Ｍａｒｉａｎｉら、Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００６）４３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４２−７ Ｈｅｄｎｅｒ， Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）１２４：７４７−５７ ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．（２００３）２：２１４−２１ Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．（２００１）２１７：２１５−２４ Ｋａｎｇら、Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２２７−８ ＲｅｓｓおよびＬｉｎｈａｒｄｔ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（２００４）１：３１−４６

従って、当該技術分野において、改善した血漿由来もしくはｒＦＶＩＩ、修飾型ＦＶＩＩ、またはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを含む凝固タンパク質製剤を提供する組成物および方法の必要性が残っている。

本発明は、血漿または組換え第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）またはその生物学的に活性な誘導体、１〜４のシアル酸ユニットからなる鎖に結合される前記ＦＶＩＩａまたはその前記生物学的に活性な誘導体を含むタンパク質性コンストラクトを提供する。ここで、タンパク質性コンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、１〜４のシアル酸ユニットからなる鎖が欠けているＦＶＩＩａまたはその誘導体と比較すると、哺乳類（特にヒト）の血中で実質的に延びている。さらに、前記タンパク質性コンストラクトを含有する医薬組成物ならびに前記タンパク質性コンストラクトを用いてＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＩＸのうちの少なくとも１つの機能上の欠損または欠乏に関連する出血性障害を有する哺乳類の血中ＦＶＩＩａのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延ばす方法が本発明によって提供される。本発明のタンパク質性コンストラクトは、正常なレベルの凝固因子を有する哺乳類における外傷または手術の場合に出血を制御するために投与されることもできる。

本発明の一実施形態において、タンパク質性コンストラクトは、（ａ）血漿ＦＶＩＩａ、組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）、およびＦＶＩＩａの生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）分子と、（ｂ）前記ＦＶＩＩａ分子に結合する１〜４のシアル酸ユニットを含む、生理的に許容される少なくとも１つの炭水化物部分とを含み、
ここで前記タンパク質性コンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、前記炭水化物部分に結合されていないＦＶＩＩａ部分のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、哺乳類の血液中で延びている。

本発明の別の実施形態において、上述のタンパク質性コンストラクトが提供され、ここで該コントラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が前記炭水化物部分に結合されていないＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、少なくとも約２倍増加される。別の実施形態において、そのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が前記炭水化物部分に結合されていないＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、少なくとも約３倍増加される、上述のタンパク質性コンストラクトが提供される。さらに別の実施形態において、生理的に許容される炭水化物部分が前記ＦＶＩＩａ分子の少なくとも１つのアミノ酸残基に直接的に共有結合する、上述のタンパク質性コンストラクトが提供される。

本発明のさらに別の実施形態において、上述のタンパク質性コンストラクトが提供され、ここで生理的に許容される炭水化物部分は、前記ＦＶＩＩａ分子の少なくとも１つのアミノ酸残基に非共有結合される。さらに別の実施形態において、上述のタンパク質性コンストラクトが提供され、ここで生理的に許容される炭水化物部分がポリシアル酸またはその誘導体である。

本発明の一実施形態において、医薬組成物は有効量の上述のタンパク質性コンストラクトと、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤、および賦形剤からなる群から選択される１つ１つ以上の化合物とを含み提供される。

本発明の別の実施形態において、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＩＸのうちの少なくとも１つの機能上の欠損または欠乏に関連する出血性障害を有する哺乳類において出血を制御する方法は、上述のタンパク質性コンストラクトを投与することを含み、提供される。さらに別の実施形態において、哺乳類において手術または外傷の間に出血を制御する方法は、上述のタンパク質性コンストラクトを投与することを含み、提供される。

本発明のさらに別の実施形態において、容器にパッケージされた上述のタンパク質性コンストラクトの有効量を含み、場合により第２の治療薬を含有し、前記容器に添付されたまたは前記容器とともにパッケージされたラベルをさらに含むキットを提供する。前記ラベルは、容器の内容物を説明し、哺乳類での出血を制御するための前記容器の内容物の使用に関する適応および／または使用説明書を提供する。さらに別の実施形態において、上述のキットを提供し、ここで前記容器がバイアルまたは瓶または予め充填されたシリンジである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
タンパク質性コンストラクトであって、
（ａ）血漿ＦＶＩＩａ、組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）、およびＦＶＩＩａの生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）分子と、（ｂ）該ＦＶＩＩａ分子に結合される１〜４のシアル酸ユニットを含む少なくとも１つの生理的に許容される炭水化物部分とを含み、
該炭水化物部分に結合されていないＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、該コンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が哺乳類の血中において延長している、タンパク質性コンストラクト。
（項目２）
前記コンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、前記炭水化物部分に結合されていないＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、少なくとも約２倍増加する、項目１に記載のタンパク質性コンストラクト。
（項目３）
前記コンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、前記炭水化物部分に結合されていないＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、少なくとも約３倍増加する、項目１に記載のタンパク質性コンストラクト。
（項目４）
前記生理的に許容される炭水化物部分が前記ＦＶＩＩａ分子の少なくとも１つのアミノ酸残基に直接的に共有結合する、項目１に記載のタンパク質性コンストラクト。
（項目５）
前記生理的に許容される炭水化物部分が前記ＦＶＩＩａ分子の少なくとも１つのアミノ酸残基に非共有結合する、項目１に記載のタンパク質性コンストラクト。
（項目６）
前記生理的に許容される炭水化物部分がポリシアル酸またはその誘導体である、項目１に記載のタンパク質性コンストラクト。
（項目７）
項目１に記載のタンパク質性コンストラクトの有効量と、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤、および賦形剤からなる群から選択される１つ以上の化合物とを含む、医薬組成物。
（項目８）
ＦＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、および第ＩＸ因子（ＦＩＸ）のうちの少なくとも１つの機能上の欠損または欠乏に関連する出血性障害を有する哺乳類において出血を制御する方法であって、該方法は、項目１に記載のタンパク質性コンストラクトを投与することを含む、方法。
（項目９）
哺乳類において手術または外傷の間に出血を制御する方法であって、該方法は、項目１に記載のタンパク質性コンストラクトを投与することを含む、方法。
（項目１０）
容器にパッケージされた、項目１に記載のタンパク質性コンストラクトの有効量を含むキットであって、該キットが場合により第２の治療薬を含有し、該容器に添付されたまたは該容器とともにパッケージされたラベルをさらに含み、該ラベルが該容器の内容物を説明し、哺乳類における出血を制御するための該容器の該内容物の使用に関する適応および／または使用説明書を提供する、キット。
（項目１１）
前記容器がバイアルまたは瓶または予め充填されたシリンジである、項目１０に記載のキット。

発明の詳細な説明
本発明を、以下の実施例でさらに例示するが、それらに何ら限定されない。

本発明は、本明細書に記載のＦＶＩＩ部分に限定されないことを理解すべきである。本発明の一態様は、血液凝固カスケードの１つのメンバー、血漿の（すなわち血漿由来）および／または組換えのＦＶＩＩａまたはその生物学的に活性な誘導体（以下「ＰＳＡ−ＦＶＩＩａ結合体」と表す）、１〜４のシアル酸部分と結合される前記ＦＶＩＩまたはその前記生物学的に活性な誘導体を含むタンパク質性コンストラクトに関する。ここで、前記ＦＶＩＩまたはその前記生物学的に活性な誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、哺乳類の血中で延びる。本明細書に用いるように、「タンパク質性コンストラクト」という用語は、（ａ）血漿ＦＶＩＩａ、組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）、およびＦＶＩＩａの生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）分子、および（ｂ）前記ＦＶＩＩａ分子に結合した１〜４のシアル酸ユニットを含む少なくとも１つの生理的に許容される炭水化物部分をいう。本明細書に用いるように、「血漿の」という用語は、「血漿由来の」を言及する。

ＦＶＩＩａポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明に有用なＦＶＩＩａ分子としては、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質の生物活性サブユニットまたは機能的サブユニットまたは断片、およびその機能的誘導体が挙げられる。ＦＶＩＩａへの言及は、かかるタンパク質のすべての潜在的な形を含むことを意図される。

本発明によれば、「組換え第ＶＩＩａ因子」（ｒＦＶＩＩａ）という用語は、特定の制限の根底にあるのではなく、かつ組換えＤＮＡ技術を介して取得する任意のｒＦＶＩＩａ、非相同的もしくは天然の、またはそれらの生物学的に活性な誘導体も含み得る。ある実施形態において、この用語は、タンパク質および核酸（例えば遺伝子、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡおよびポリペプチド）、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、ならびに種間相同体を包含する。種間相同体は、（１）参照核酸または本明細書に記載するアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドと、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、またはそれ以上のアミノ酸（成熟タンパク質の場合、完全長配列の４０６アミノ酸まで）からなる領域にわたり、約６０％を超えるアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；（２）本明細書に記載の参照アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原断片、および保存的に修飾されたその変異体に対して産生される抗体（例えばポリクローナル抗体）に特異的に結合する；（３）本明細書に記載の参照アミノ酸配列をコードする核酸およびその保存的に修飾された変異体に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする；（４）本明細書に記載の参照核酸配列と、少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチド（成熟タンパク質の完全長配列の１２１８ヌクレオチドまで）からなる領域にわたり、約９５％を超える核酸配列同一性、約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える核酸配列同一性を有する核酸配列を有する。

本明細書に用いるように、「内因性ＦＶＩＩａ」は、前記哺乳類から生ずるＦＶＩＩａを含む。内因性ＦＶＩＩａは、前記哺乳類に存在するトランスジーンまたは他の任意の外来ＤＮＡから転写されるＦＶＩＩａも含む。本明細書で用いるように、「外因性ＦＶＩＩａ」は、前記哺乳類から生じないＦＶＩＩａを含む。

変異体（または類似体）ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基がＦＶＩＩａアミノ酸配列を補充する、挿入変異体を含む。挿入は、タンパク質のいずれかの末端または両末端に位置していることもあり、またはＦＶＩＩａアミノ酸配列の内部領域内に位置することもある。いずれかの末端または両末端に残基をさらに有する挿入変異体は、例えば融合タンパク質およびアミノ酸タグまたはアミノ酸標識を含むタンパク質を含むことができる。例えば、ＦＶＩＩａ分子は、特に、ＦＶＩＩａ分子が細菌細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））内で、組換えで発現される場合、場合によりＮ末端メチオニンを含有することもある。

欠失体では、ＦＶＩＩａポリペプチドで１つ以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、ＦＶＩＩａポリペプチドの一方または両末端で、またはＦＶＩＩａアミノ酸配列内の１つ以上の残基を取り除くことで引き起こされ得る。従って、欠失体はＦＶＩＩａポリペプチド配列のすべての断片を含む。

置換変異体では、ＦＶＩＩａポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去されて、代替残基と置換する。一態様において、置換は、天然において保存的であり、このタイプの保存的置換は当該技術分野では公知である。あるいは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。代表的な保守的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５）， ｐｐ．７１−７７）に記載されており、以下に記載する。

あるいは、代表的な保存的置換は、以下に記載する。

ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、一般的に、霊長類（例えばヒト）齧歯類（例えばラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳類にも限定されないが哺乳類に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子（例えば非相同的および野生型配列もしくはその変異体をコードする、または非天然の）であり得る。参照ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列としては、例えば、ゲノム配列のためのＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０２９３３、ｃＤＮＡのためのＭ１３２３２（Ｈａｇｅｎら、ＰＮＡＳ １９８６；８３：２４１２−６）、およびポリペプチド配列のためのＰ０８７０９（それら開示内容全体を参考として本明細書で援用される）が挙げられる。ＦＶＩＩの種々の多型性は、例えばＳａｂａｔｅｒ−Ｌｌｅａｌら、（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００６；１１８：７４１−５１）（それら開示内容全体を参考として本明細書で援用される）に記載されている。

本明細書で用いるように、「生物学的に活性な誘導体」または「生物活変異体」としては、前記分子と同一の機能的特性および／または生物学的特性（例えば結合特性）、ならびに／または同一の構造基盤（例えばペプチド主鎖または塩基性ポリマーユニット）を実質的に有する、任意の誘導体または種々の分子が挙げられる。

本明細書で用いるように、「血漿誘導型ＦＶＩＩａ」または「血漿」は、凝固経路を活性化する特性を有する哺乳類から採血した血液中で見出されたタンパク質のすべての形状を含む。

本明細書で用いるように、「組換えＦＶＩＩａ」は、組換えＤＮＡ技術を介して得たｒＦＶＩＩａを含む。組換えＦＶＩＩａは、当該技術分野で公知の任意の方法によって生成され得る。１つの特定の例は、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されている。かかるｒＦＶＩＩａの例は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋによって製造、販売されるＮｏｖｏＳｅｖｅｎである。

ＦＶＩＩａ生成および発現
ｒＦＶＩＩａの生成は、以下に関して当該技術分野で公知の任意の方法を含み得る。（ｉ）遺伝子工学（例えばＲＮＡ逆転写および／またはＤＮＡの増幅）による組換えＤＮＡの生成、（ｉｉ）組換えＤＮＡを、トランスフェクション（例えば電気穿孔またはマイクロインジェクションを介して）によって原核細胞または真核細胞に導入すること、（ｉｉｉ）前記形質転換させた細胞を、例えば連続的方法またはバッチ式方法で培養すること、（ｉｖ）例えば恒常的にまたは誘導により、ｒＦＶＩＩａを発現させる、（ｖ）例えば培地から前記ＦＶＩＩａを分離すること、または形質転換した細胞を収集すること、（ｖｉ）続いて、例えばアニオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを介して、精製したｒＦＶＩＩａを得ること。

ｒＦＶＩＩａは、薬理学的に許容されるｒＦＶＩＩａ分子を生成することよって特徴づけられる、適切な原核または真核宿主系で発現させることで生成することができる。真核細胞の例としては、哺乳類細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２）がある。本発明によってｒＦＶＩＩａの生成または分離のために用いられる試薬もしくは条件は、特に限定されず、当該技術分野で公知の任意の系または市販されているものを利用することができる。

多種多様なベクターを用いて、ｒＦＶＩＩａを調製することができ、真核および原核発現ベクターから選択されることができる。原核発現のためのベクターの例としては、様々のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなど）が挙げられ、原核発現ベクターで用いられるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核発現のためのベクターの例としては、以下が挙げられる。すなわち、
（ｉ）酵母での発現のため、プロモーター（例えばＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１など）を用いるベクター（例えばｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴ）、
（ｉｉ）昆虫細胞での発現のため、プロモーター（例えばＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏ１ｈなど）を用いるベクター（例えばｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ）、ならびに（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現のため、プロモーター（例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチン）を用いるベクター（例えばｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなど）、およびウイルス系由来のベクター（例えばワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなど）。

シアル酸
本明細書で用いるように、「シアル酸部分」は、シアル酸のモノマーまたはポリマーが含まれる。これらは、水溶液中または懸濁液中で可溶性であり、何ら否定的な影響（例えばＰＳＡ−ＦＶＩＩａ結合体を医薬的有効量で哺乳類に投与した後の副作用）がない。本発明によって用いられるシアル酸ユニットには特に限定されない。一態様において、シアル酸ポリマーは、１〜４ユニットを有するとして特徴づけられる。また異なるシアル酸ユニットが鎖状に組み合わせられ得る。

シアル酸部分は、例えば米国特許第４，３５６，１７０号に記載の方法（参考として本明細書で援用される）によって、ＦＶＩＩａに結合され得る。本発明の一実施形態において、多糖化合物は、天然の多糖、天然の多糖の誘導体、または天然多糖誘導体であり得る。通常、化合物中の糖類残基のすべては、シアル酸残基である。

ＰＳＡをポリペプチドに結合させる他の技法も公知である。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８２０９６号は、タンパク質への例えばＰＳＡのアミンまたはヒドラジン誘導体の結合体化を記載している。さらに、米国特許出願公開第２００７／０１９１５９７は、還元終端で基質（例えばタンパク質）との反応のためのアルデヒド基を含有するＰＳＡ誘導体を記載している。

本発明の一実施形態において、多糖化合物のポリシアル酸部分は高度に親水性である。別の実施形態において、化合物全体が高度に親水性である。親水性は、主に、シアル酸ユニットのペンダントカルボキシル基ならびにヒドロキシル基によって与えられる。糖類ユニットは、他の官能基（例えばアミン基、ヒドロキシル基、もしくは硫酸基、またはそれらの組み合わせ）を含有し得る。これらの基は、天然の糖類化合物上に存在し得、または誘導体多糖化合物に導入され得る。

本発明の特定の用途の多糖化合物は、細菌によって産生されるものである。これらの天然の多糖の一部は、糖脂質として知られている。多糖化合物に、肝細胞およびクッパー細胞のガラクトース受容体によって認識される傾向がある末端ガラクトースユニットが実質的にない場合、特に有利である。

結合
ＦＶＩＩａは、当業者にとって公知の種々の技術のいずれかによって多糖化合物に共有結合され得る。種々の例は、米国特許第５，８４６，９５１号の第７欄１５行目から第８欄５行目に確認される。

例としては、ＦＶＩＩａまたは多糖のいずれか一方のカルボキシル基と、他方のアミン基との間のペプチド結合を介する結合、または一方のカルボキシル基と、他方のヒドロキシル基との間のエステル結合が挙げられる。活性成分（例えばＦＶＩＩａ）が多糖化合物に共有結合し得ることによる別の結合は、反応される活性成分上の遊離アミノ基と、過ヨウ素酸酸化によってポリマーの非還元末端で形成されたアルデヒド基との間のシッフ塩基を介する（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ａｎｄ Ｌｕｇｏｗｓｋｉ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；１２７：１０１１−８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７；１３４１；２６−３４）。生成されたシップ塩基は、ＮａＣＮＢＨ_３による特異的還元によって安定化され、二級アミンを形成することができる。別のアプローチは、事前の酸化の後にＮＨ_４Ｃｌを用いる還元的アミノ化によってポリシアル酸（ＰＳＡ）内に末端遊離アミノ基を生成することである。二価性試薬を用いて、２つのアミノ基または２つのヒドロキシル基を結合するため使用できる。例えば、アミノ基を含有するＰＳＡはＢＳ^３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート／Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）等の試薬を用いてタンパク質のアミノ基に結合させることができる。さらに、ヘテロ二価架橋試薬（例えばスルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、例えばアミン基およびチオール基を結合することができる。

別のアプローチでは、事前の酸化およびアルデヒド官能基の生成の後、ＰＳＡヒドラジドを調製して、タンパク質の炭水化物部分に結合させることができる。

治療用タンパク質の遊離アミン基は、シアル酸残基の１−カルボキシル基と反応させることも可能であり、ペプチジル結合を形成し、またはエステル結合が活性成分上で１−カルボン酸基およびヒドロキシルまたは他の適切な活性基の間に形成されることが可能である。あるいは、カルボキシル基は、脱アセチル化５−アミノ基によってペプチド結合を形成することもある。医薬的活性化合物の分子のアルデヒド基は、シアル酸残基のＮ−脱アセチル化５−アミノ基とシッフ塩基を形成し得る。

あるいは、多糖化合物は、非共有の方法で医薬的活性化合物（例えばＦＶＩＩａ）と結合し得る。例えば、多糖化合物および医薬的活性化合物は、疎水性相互作用を介して（例えば多糖化合物の脂質成分を介して）疎水性医薬的活性化合物と結合され得る。他の非共有結合は、逆帯電したイオンが互いに引きつけることによる静電相互作用を介することも可能である。

医薬的活性化合物は、化学量論量（例えば１：１）で多糖化合物に直接的に共有結合され得る。あるいは、多糖化合物の２つ以上の分子は結合されて活性成分の１つの分子になり得る。

用途
本発明は、少なくとも１つの生理的に許容されるシアル酸部分に結合されていないＦＶＩＩａのｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較して、血液凝固タンパク質（特に、ＦＶＩＩａの機能上の欠損または欠乏に関連する出血性障害を有する、ＦＶＩＩａまたはその生物学的に活性な誘導体）のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させることに関する。本発明のＰＳＡ−ＦＶＩＩａ結合体は、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸのうちの少なくとも１つの機能上の欠損または先天性欠乏または後天性欠乏に関連する出血性障害の処置のためにさらに用いられることができる。

療法における最先端技術により、さらに国際ガイドラインおよび規定により、注入されるＦＶＩＩａの薬物動態は、有効性の有効な代理マーカーとして認識され、容認されている（Ｂｊｏｒｋｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｍｔｒｏｐ， Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００１；４０：８１５−３２）。

これは、機能活性に関する標準化試験によって特徴づけられた、注入されたＦＶＩＩａ産物が血流中で見出され、凝固血液カスケードの成分として予想通りにそこで作用するという確認された仮定に基づく。従って、動物モデルにおける任意の薬物動態分析でも、ＦＶＩＩａ産物で処置される患者において予想される有効性を予測する。

半減期
本発明の一実施形態において、タンパク質性コンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、延ばされる。関連する実施形態において、シアル酸に結合されないＦＶＩＩａと比較すると、タンパク質性コンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、少なくとも２倍延び、別の実施形態において、そのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は少なくとも３倍延びる。ＦＶＩＩａ半減期の延長は、以下の実施例で説明するようにラットでの薬物動態を測定することによって評価され得る。

投与
投与経路は、特定の限定を示さない。一実施形態において、本発明のタンパク質性コンストラクトは、注射（例えば静脈注射、筋肉内注射、または腹腔内注射）によって投与され得る。

本発明のタンパク質性コンストラクトを含む組成物をヒトまたは試験動物に投与するため、一態様において、その組成物は１つ以上の薬学的に許容される担体を含む。「医薬的に」または「薬理学的に許容される」という用語は、以下の記載のように、安定しており、タンパク質分解（例えば凝集および切断産物）を抑制し、さらに、当該技術分野で周知の経路を用いて投与される場合、アレルギー反応または他の副作用を出現させない分子化合物および組成物をいう。「薬学的に許容される担体」としては、上記に開示した薬剤を含む、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。

本明細書で用いるように、「有効量」は、上記に概要を述べるように、出血性障害を有する哺乳類を処置するのに適している用量が含まれる。

組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入スプレーによって、経膣的に、直腸に、または頭蓋内注射によって投与されてもよい。本明細書で用いるように、「非経口的に」という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射、または注入法が挙げられる。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、眼球後、肺内の注射、および／または特定部位での外科的移植による投与もまた考えられる。通常、組成物は、発熱物質ならびにレシピエントに有害になり得る他の不純物が本質的に取り除かれる。

組成物の単回投与または複数回投与は、処置を行う医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行われ得る。疾患の予防または処置に関して、適切な投与量は、上述のように処置すべき疾患の種類、疾患の重症度、および疾患の経過、薬物が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、治療歴、患者の臨床歴および薬物応答、ならびに主治医の裁量に依存する。

医薬組成物
本発明は、また、上記に明示したように、有効量のタンパク質性コンストラクトを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤、または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物を用いて、上記に明示した出血性障害を処置することができる。本発明の医薬組成物は、溶液または凍結乾燥生成物であり得る。タンパク質の安定な溶液、および特にＦＶＩＩａを形成する公知の方法が数多くある。１つの例は、米国特許第５，８７４，４０８号に開示されている。医薬組成物の溶液を、任意の適切な凍結乾燥プロセスにかけることが可能である。

キット
追加の態様として、本発明は、被験者への投与のためにその用途を促進する方法でパッケージされた本発明の組成物を含むキットが挙げられる。一実施形態において、かかるキットには、本明細書に記載の化合物または組成物（例えばタンパク質性コンストラクトを含む組成物）が含まれる。前記化合物または組成物は、密封された瓶またはベスル等の容器にパッケージされ、前記方法を実践する際の化合物または組成物の用途を説明するラベルが容器に添付されるか、またはパッケージに含まれる。一実施形態において、キットは、タンパク質性コンストラクトを含む組成物を有する第１の容器と、第１の容器内の組成物のための生理的に許容される再構成溶液を有する第２の容器とを含有する。一態様において、化合物または組成物は、単位用量形態でパッケージされる。キットは、投与の特定の経路によって、組成物を投与するのに適した装置をさらに含み得る。好ましくは、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の用途を説明するラベルを含有する。

ＰＳＡとの結合体化後のｒＦＶＩＩａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体および修飾されていないｒＦＶＩＩａのラットにおける薬物動態を示す。 ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体および修飾されていないｒＦＶＩＩａ（抗原レベル）のラットにおける薬物動態を示す。 ＰＳＡとのＮ末端結合体化後のｒＦＶＩＩａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 モノＳＡ−ｒＦＶＩＩａおよびトリＳＡ−ｒＦＶＩＩａのキャピラリー電気泳動を示す。 ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体および修飾されていないｒＦＶＩＩａのラットにおける薬物動態を示す。Ａ：モノＳＡ−ｒＦＶＩＩａ。 ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体および修飾されていないｒＦＶＩＩａのラットにおける薬物動態を示す。Ｂ：トリＳＡ−ｒＦＶＩＩａ。 Ｎ−アセチルノイラミン酸三量体のキャピラリー電気泳動を示す。

（実施例１）：ｒＦＶＩＩａ内のリジン残基のコロミン酸による修飾
シアル酸（コロミン酸、ＣＡ）によるリジン残基の修飾を、ＪｅｎｎｉｎｇｓおよびＬｕｇｏｗｓｋｉ（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９８１；１２７；１０１１−８）によって記載されるように行った。この処置のために、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｉｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ；ＭＯ）製のＣＡを使用した。０．１Ｍ ＮａＩＯ_４を含有するＣＡの水溶液（濃度２０ｍｇ／ｍＬ）を暗所で、室温で１５分間攪拌し、ＣＡを酸化させた。活性化ＣＡ溶液／ｍＬに２ｍＬのエチレングリコールを加えて暗所で、室温でさらに３０分間攪拌した。この溶液を、暗所で、２〜８℃の温度で、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に対して一晩透析した。

続いて、この溶液のアリコートを、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中のｒＦＶＩＩａ溶液（３０μｇ／ｍＬ）に加えて、ｒＦＶＩＩａのｍｇあたり１００ｍｇの活性化ＣＡの最終濃度にした。この混合物を暗所で、室温で１８０分間攪拌した。ＮａＣＮＢＨ_３を加えて（最終濃度１０ｍｇ／ｍｇ ｒＦＶＩＩａ）、この混合物を静かに振盪させながら暗所で、室温で１８時間、インキュベートした。次いで、２．５ｍＬの水性１Ｍ ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ７．２）をこの混合物／ｍＬに加えて、６０分間攪拌して、反応を終了させた。

イオン交換クロマトグラフィーで、ＱＨｙｐｅｒＤ Ｆ ５０μｍ樹脂（Ｐａｌｌ ＢｉｏＳｅｐｒａ， Ｃｅｒｇｙ， Ｆｒａｎｃｅ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ １０；高さ＝１５ｃｍ）を用いて、ｒＦＶＩＩａ−ＣＡ酸結合体から遊離試薬を分離した。ＣＡ結合体化タンパク質を、溶出緩衝剤（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ８．０）で溶出した。最終段階で、３０ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によって、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５％ショ糖を含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して濃縮させた。

（実施例２）：ポリシアル酸化ｒＦＶＩＩａの生化学的性質
ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡの酵素活性を、凝固アッセイによって決定した。ＦＶＩＩａをヒトＦＶＩＩ欠乏血漿に加えて、凝固を、ＦＶＩＩａと反応するが、ＦＶＩＩと反応しないトランケート型組織因子（Ｓｔａｃｌｏｔ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ， Ａｓｎｉｅｒｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）によって誘発した。

ｒＦＶＩＩ−ＰＳＡのＦＶＩＩＩのバイパス活性をトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）によって測定した。ＦＶＩＩａを、トロンビン−特異的蛍光ペプチド−基質の存在下で高力価の抗ＦＶＩＩＩインヒビターを含有する重度の血友病Ａの血漿に加えた。凝固を、組織因子−リン脂質複合体で誘発し、トロンビン生成を、基質のフルオロフォアの切断速度によって連続的に測定した。トロンビン生成活性を、ピークのトロンビン（すなわち、アッセイ中に観察された最大量トロンビンの濃度）から算出した。両ケースでは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ組換えＦＶＩＩａ製剤（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，デンマーク コペンハーゲン）を参考として使用した。
表１に示すように、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａの比活性は、修飾後減少した。

修飾を、非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。免疫染色を、ポリクローナル抗ＦＶＩＩ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ａｎｃａｓｔｅｒ， Ｃａｎａｄａ）およびモノクローナル抗ＰＳＡ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて行った。修飾は、ＰＳＡ含有タンパク質と相関するスメア領域によって示されたＦＶＩＩａのＭＷの増加をもたらした（図１）。

（実施例３）：ラットにおけるｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体の薬物動態
４匹のラット（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）に麻酔して、緩衝液（１．３ｇ／Ｌ グリシルグリシン、３ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、３０ｇ／Ｌ マンニトール、１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２ ｘ ２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ５．５）中のｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体（１６．５００Ｕ ＦＶＩＩａ／ｋｇ）を、用量（２０ｍＬ／ｋｇ）を尾静脈に静脈内注射によって投与した。対照として６匹の正常なラットに、修飾されていないｒＦＶＩＩａを１８．０００Ｕ ＦＶＩＩａ／ｋｇの用量で用いた。物質を投与してから５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、および２４時間後に血液試料を、眼窩静脈叢から採取し、クエン酸血漿を調製してさらなる分析のために凍結させた。

次いで、血漿中のＦＶＩＩａ活性（Ｓｔａｃｌｏｔ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ， Ａｓｎｉｅｒｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を測定した。修飾されていないｒＦＶＩＩａの半減期は１．１時間であったが、ｒＦＶＩＩａ−結合体により２．３時間に増加した（図２）。

ＦＶＩＩａ抗原レベルの薬物動態を、さらなる実験で測定した。６匹のラットに麻酔して、緩衝液（１．３ｇ／Ｌ グリシルグリシン、３ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、３０ｇ／Ｌ マンニトール、１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ５．５）中のｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体（４５０μｇ／ｋｇ）を、容積用量（１０Ｌ／ｋｇ）で尾静脈に静脈内注射によって投与した。対照として６匹のラットに、修飾されていないｒＦＶＩＩａを３９０μｇ／ｋｇの用量で用いた。物質を投与してから５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、および２４時間後に血液試料を、眼窩静脈叢から採取した。そしてクエン酸血漿を調製してさらなる分析のために凍結させた。血漿中のＦＶＩＩ抗原レベルを、ＥＬＩＳＡ（ポリクローナル抗−ヒトＦＶＩＩ抗体）で測定した。ＭＳ Ｅｘｃｅｌで決定したように、直線回帰による半減期算出は、天然ｒＦＶＩＩａに対しては１．１時間およびｒＦＶＩＩａ結合体に対しては３．１時間であった。ＦＶＩＩ抗原に関するデータを、投与から５分後に得た平均血漿レベルに規準化する（図３）。

（実施例４）：ＦＶＩＩａのＮ末端ポリシアル化
ＦＶＩＩａのＮ末端でのＣＡの結合体化をｐＨ６．０で行った。この処置のために、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からのＣＡを使用し、それをさらにＱ−セファロース ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上で陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。０．０４Ｍ ＮａＩＯ_４を含有する精製ＣＡの水溶液（濃度２３ｍｇ／ｍＬ）を暗所で、室温で１５分間攪拌して、ＣＡを酸化させた。続いて、この溶液のアリコートを０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中のｒＦＶＩＩａ溶液（７４０μｇ／ｍＬ）に加えて、ｒＦＶＩＩａのｍｇあたり６０ｍｇの活性化ＣＡの最終濃度にした（約１５０モル過剰）。この混合物を暗所で、室温で１８０分間攪拌した。ＮａＣＮＢＨ_３を加えて（２５ｍｇ／ｍｇ ｒＦＶＩＩａ）この混合物を静かに振盪させながら暗所で、２４時間、インキュベートした。次いで、２．５ｍＬの水性１Ｍ ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ７．２）をこの混合物／ｍＬに加えて、４℃で６０分間攪拌して、反応を終了させた。

イオン交換クロマトグラフィーで、ＱＨｙｐｅｒＤ Ｆ ５０μｍ樹脂（Ｐａｌｌ ＢｉｏＳｅｐｒａ， Ｃｅｒｇｙ， Ｆｒａｎｃｅ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−１６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ １６；高さ＝１４ｃｍ）を用いて、ｒＦＶＩＩａ−ＣＡ酸結合体から遊離試薬を分離した。次いで、ＣＡ結合体化タンパク質を、溶出緩衝剤（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出した。最終段階で、１０ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＵＦ／ＤＦによって、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して濃縮させた。イオン交換クロマトグラフ法およびＵＦ／ＤＦステップを４℃で行った。

Ｎ末端修飾ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡの酵素活性を、実施例２に記載するように、凝固アッセイおよびトロンビン生成アッセイによって決定した。その結果を表２に要約する。

Ｎ末端結合体化型ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａの比活性は、ＳＴＦアッセイで測定したように約５０％まで、およびＴＧＡでは２５％まで低下した。

実施例２に記載するように、修飾は、ポリクローナル抗ＦＶＩＩ抗体およびポリクローナル抗ＰＳＡ抗体を用いる免疫染色によって展開させた非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。修飾は、抗ＰＳＡで染色した免疫ブロットで示されるバンドと相関して、ＦＶＩＩａのＭＷの軽微な増加をもたらした（図４）。

（実施例５）：ＣＮＢｒ活性化型合成Ｎ−アセチルノイラミン酸によるＦＶＩＩａの結合体化
ｒＦＶＩＩａを、米国特許第３，４８７，８９０号に記載されるように、Ｎ−アセチルノイラミン酸によって結合体化させた。３５０ｍｇの合成Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０ｍＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解させた。次いで、４３０ｍｇのＣＮＢｒ（Ｆｌｕｋａ， Ｓｔｅｉｎｈａｍｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）をこの溶液に加え、活性化の処置の間０．５Ｍ ＮａＯＨでｐＨを９．５に調整した。３０分後、ｐＨ値は９．５であった。次いで、ｐＨ値を、０．１Ｍ ＨＣｌを加えることによって８．４に調整した。活性化の全処置の間、温度を氷浴を用いることで制御し、２０〜２５℃で維持した。ｒＦＶＩＩａによる活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸の結合体化のために、ｒＦＶＩＩａ溶液５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の（５０ｍＬ／０．４４ｍｇ ｒＦＶＩＩａ／ｍＬ）を加えて室温で、緩やかな攪拌下で３０分間インキュベートした。次いで、２０ｍＬの０．２Ｍトリス緩衝液を加えて、反応を終了させ、遊離シアン酸エステルをブロックし、混合物を緩やかな攪拌下で１５分間インンキュベートした。最終的にこの溶液を、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して１０ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いるＵＦ／ＤＦによって濃縮させた。

（実施例６）：ＣＮＢｒ活性化合成Ｎ−アセチルノイラミン酸三量体によるＦＶＩＩａの結合体化
ｒＦＶＩＩａを、Ｎ−アセチルノイラミン酸に関する米国特許第３，４８７，８９０号に記載されるように、ＴｉｍＴｅｃ、ＬＬＣ（Ｎｅｗａｒｋ， ＵＳＡ）から得た合成Ｎ−アセチルノイラミン酸三量体に結合体化させた。３５０ｍｇのＮ−アセチルノイラミン酸三量体を、１０ｍＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解させた。次いで、４３０ｍｇのＣＮＢｒ（Ｆｌｕｋａ）をこの溶液に加え、活性化の処置の間０．５Ｍ ＮａＯＨでｐＨを９．５に調整した。３０分後、ｐＨ値は９．５であった。ｐＨ値を、０．１Ｍ ＨＣｌを加えることによって８．４に調整した。活性化の全処置の間、温度を、氷浴を用いることによって制御し、２０〜２５℃で維持した。次いで、ＦＶＩＩａにおる活性化の結合体化を、実施例５に記載するように行った。

（実施例７）：モノＳＡ−ＦＶＩＩａおよびトリＳＡ−ＦＶＩＩａの生化学的性質
実施例５に記載するＮ−アセチルノイラミン酸（モノＳＡ）に結合体化した修飾ｒＦＶＩＩａ、または実施例６に記載するＮ−アセチルノイラミン酸三量体（トリＳＡ）に結合体化した修飾ｒＦＶＩＩａの酵素活性を、実施例２に記載するように凝固アッセイおよびトロンビン生成アッセイによって決定した。それらの結果を、表３に要約する。

オリゴ−ＰＳＡ結合体化型ｒＦＶＩＩａの比活性は、ＳＴＦアッセイによって測定されたように低下したが、ＴＧＡによって測定されたモノＳＡ−ｒＦＶＩＩａは、そのＦＶＩＩＩバイパス活性の約５０％を保持した。

さらに、モノＳＡ−ｒＦＶＩＩａおよびトリＳＡ−ｒＦＶＩＩａを、ＫｌａｕｓｅｎおよびＫｏｒｎｆｅｌｔ（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ． １９９５；７１８：１９５−２０２）によって記載されるように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって調べた。それらの結果を図５に示す。天然のｒＦＶＩＩａと比較して、付加的な負の電荷のためにモノＳＡ−ｒＦＶＩＩａおよびトリＳＡ−ｒＦＶＩＩａのより高い保持時間への明らかな変化を示す。

（実施例８）：ラットにおけるｒＦＶＩＩａ−モノＳＡおよびｒＦＶＩＩａ−トリＳＡ結合体の薬物動態
１２匹のラットに麻酔して、緩衝液（１．３ｇ／Ｌ グリシルグリシン、３ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、３０ｇ／Ｌ マンニトール、１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ５．５）中のｒＦＶＩＩａ−モノＳＡ結合体（４００μｇ タンパク質／ｋｇ）を、容積用量（１０ｍＬ／ｋｇ）を尾静脈に静脈内注射によって投与した。４匹のラットに、ｒＦＶＩＩａ−トリＳＡ結合体（４００μｇ タンパク質／ｋｇ）で処置した。対照として８匹の正常なラットにおいて４００μｇ タンパク質／ｋｇの用量で修飾されていないｒＦＶＩＩａを用いた。物質を投与してから５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、７時間後、１０時間後、および２２時間後に血液試料を、眼窩静脈叢から採取し、クエン酸血漿を調製してさらなる分析のために凍結させた。血漿中のＦＶＩＩ抗原レベルをＥＬＩＳＡ（ポリクローナル抗−ヒトＦＶＩＩ抗体）によって測定した。データを、投与から５分後に血漿で見出された濃度に対して規準化した。投与から７時間後、ｒＦＶＩＩａ−モノＳＡおよびトリＳＡ−ｒＦＶＩＩａの血漿レベルは対照の天然ｒＦＶＩＩａのそれよりも高かった。それらの結果を図６Ａ（ｒＦＶＩＩａ−モノＳＡ）および図６Ｂ（ｒＦＶＩＩａ−トリＳＡ）に示す。

（実施例９）：還元的アミノ化によるＮ−アセチルノイラミン酸三量体のｒＦＶＩＩａへの結合
還元的アミノ化によるｒＦＶＩＩａのＮ−アセチルノイラミン酸三量体との結合体化を、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｌ ａｌ． （Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９４；２９９：２９１−６）に記載されるように行った。３５０ｍｇのＮ−アセチルノイラミン酸三量体（ＴｉｍＴｅｃ）を１０ｍＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、７０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（０．３ｍｇ／ｍＬ）中の組換えＦＶＩＩａの溶液３２ｍＬに加えた。次いで、ＮａＣＮＢＨ_３を加えて、５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にし、０．１Ｍ ＨＣｌを加えることによってｐＨ７．０にｐＨ調整した。混合物を３７℃で、穏やかな攪拌下で４８時間インキュベートした。この溶液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に対して１０ｋＤ膜（再生セルロース／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いるＵＦ／ＤＦによって濃縮させた。

Ｎ−アセチルノイラミン酸三量体のｒＦＶＩＩａとの結合体化を、ＫｌａｕｓｅｎおよびＫｏｒｎｆｅｌｔ（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ． １９９５， ７１８：１９５−２０２）によって行われたＣＥによって示した。それらの結果を図７に示す。天然のｒＦＶＩＩａと比較して、誘導体のより高い保持時間への明らかな変化を示す。

（実施例１０）：コロミン酸の精製および誘導体化
国際公開第ＷＯ０６０１６１６Ａ１号に記載されるように、ＣＡをＱ−セファロース ＦＦ上で陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。５ｇのＣＡを、２５ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＬの１０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．４）（＝開始緩衝液）で溶解した。この溶液を、Ｑ−セファロース ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填し、開始緩衝液と平衡に達したＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ５０カラム上に適用した。次いで、このカラムを８カラム容積（ＣＶ）の開始緩衝液で洗浄し、結合したＣＡを開始緩衝液中で、３ＣＶで段階的に（２００ｍＭ ＮａＣｌ、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５００ｍＭ ＮａＣｌ）溶出させた。３５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した画分は、ＳＤＳゲル電気泳動によって示されるように２０ｋＤａの分子量を示した。この画分を、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製の５ｋＤ膜を用いて限外濾過によって濃縮し、続いて５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対してダイアフィルトレーションした。次いで、ＣＡを、実施例１に記載のＮａＩＯ_４で酸化させ、末端の一次アミノ基を、国際公開第ＷＯ０５０１６９７３Ａ１号に記載されるように、還元的アミノ化によって導入した。還元的アミノ化のために、１１ｍＬの２Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ−溶液を、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に５８ｍｇの酸化ＰＳＡ／ｍＬを含有する２０ｍＬの溶液に加えた。次いで、１Ｍ ＮａＯＨ中の５Ｍ ＮａＣＮＢＨ_３の溶液を加えて、７５ｍＭの最終濃度にした。反応を室温、ｐＨ８．０で５日間、行った。次いで、この混合物を、１０ｍＭ ＮａＣｌを含有する（ＮＨ_４）_２ＣＯ_３溶液（５０ｍｇ／Ｌ）に対して透析し、続いて５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。次いで、スルフヒドリル基を、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬／Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる末端の一次アミノ基の反応によって導入した。反応を室温で、試薬の２０倍のモル過剰を有する５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、１時間行った。最終的に、末端遊離ＳＨ基を含有するＰＳＡ溶液を、再生セルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製の５ｋＤのカットオフ膜を使用する限外濾過／ダイアフィルトレーションにかけた。

（実施例１１）：ヘテロ二価性架橋剤の使用によるＰＳＡのｒＦＶＩＩａへの結合
ＰＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＱ−セファロース ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、実施例１０に記載の末端スルフヒドリル基を化学修飾によって導入し、ＰＳＡ−ＳＨを形成した。ＰＳＡ−ＳＨのｒＦＶＩＩａへの結合のために、２つの反応基、すなわちＳＨ基への結合体化のためのマレイミド基および遊離アミノ基への結合体化のためのスルホ−ＮＨＳ−エステル基を含有するヘテロ二価性水溶性架橋剤であるスルホ−ＥＭＣＳ（（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の２ｍＬのｒＦＶＩＩａ溶液（１．６ｍｇ／ｍＬ）に、スルホ−ＥＭＣＳを加えて最終濃度の０．０７ｍｇの架橋剤／ｍｇタンパク質にした。反応を室温で、３０分間行った。続いて、実施例１０によって調製した１３０ｍｇのＰＳＡ−ＳＨ（１００倍の過剰）を加えて、中間体リンカー／ｒＦＶＩＩａ複合体の反応のＰＳＡ−ＳＨへの結合を室温で、さらに２時間行った。次いで、この混合物を、ブチル−セファロース（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＩＣクロマトグラフィーによって精製した。５Ｍ ＮａＣｌ溶液をこの混合物に加えて、３Ｍ ＮａＣｌの最終濃度にした。次いで、この混合物をブチル−セファロース（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で充填したカラムに適用し、ｒＦＶＩＩａ−ＰＳＡ結合体の溶出を、６．７ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で行った。結合体の溶出後、ｐＨをｐＨ６，９に調整した。

（実施例１２）：ＰＳＡ−ヒドラジドの、ｒＦＶＩＩａの炭水化物部分への結合体化
ＰＳＡの、ｒＦＶＩＩａの炭水化物部分への結合体化のために、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）（１．６ｍｇ／ｍＬ）中のｒＦＶＩＩａの溶液を調製した。この溶液の９容積に対して、５ｍＭ ＮａＩＯ_４−溶液の１容積を加えて穏やかに混合した。酸化反応を４℃で、暗所で１時間行い、遊離アルデヒド基を生成した。次いで。亜硫酸水素ナトリウム（最終濃度５ｍＭ）を加えて、酸化反応を止めた。続いてＰＳＡ−ヒドラジド（国際公開第ＷＯ０６０６１６８Ａ２）を加え（最終濃度１０ｍＭ）、アルデヒド基への結合反応を室温で１時間行った。次いで、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａ結合体を、実施例１に記載のＱＨｙｐｅｒ Ｄ（Ｐａｌｌ ＢｉｏＳｅｐｒａ）上で陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。

Claims (7)

1. 以下：
   （ａ）血漿ＦＶＩＩａ、および、組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）からなる群から選択される活性化型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）分子、ならびに、
   （ｂ）該ＦＶＩＩａ分子に結合される１〜４のシアル酸ユニットからなる少なくとも１つの生理的に許容される鎖であって、該生理的に許容される鎖の各々の該シアル酸ユニットが該ＦＶＩＩａ分子の異なるアミノ酸残基に直接的に共有結合している、生理的に許容される鎖
   を含む化学修飾された活性化型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）分子であって、
   ここで、化学修飾されていないＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、該化学修飾されたＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が哺乳類の血中において延長している、化学修飾された活性化型第ＶＩＩ因子分子。
2. 前記化学修飾されたＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、前記化学修飾されていないＦＶＩＩａ分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比較すると、少なくとも２倍増加する、請求項１に記載の化学修飾されたＦＶＩＩａ分子。
3. 請求項１に記載の化学修飾されたＦＶＩＩａ分子の有効量と、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤、および賦形剤からなる群から選択される１つ以上の化合物とを含む、医薬組成物。
4. ＦＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、および第ＩＸ因子（ＦＩＸ）のうちの少なくとも１つの機能上の欠損または欠乏に関連する出血性障害を有する哺乳類において出血を制御するための組成物であって、該組成物は、請求項１に記載の化学修飾されたＦＶＩＩａ分子を含む、組成物。
5. 哺乳類において手術または外傷の間に出血を制御するための組成物であって、該組成物は、請求項１に記載の化学修飾されたＦＶＩＩａ分子を、出血を制御するため有効量で含む、組成物。
6. 容器にパッケージされた、請求項１に記載の化学修飾されたＦＶＩＩａ分子の有効量を含むキットであって、該キットが場合により第２の治療薬を含有し、該容器に添付されたまたは該容器とともにパッケージされたラベルをさらに含み、該ラベルが該容器の内容物を説明し、哺乳類における出血を制御するための該容器の該内容物の使用に関する適応および／または使用説明書を提供する、キット。
7. 前記容器がバイアルまたは瓶または予め充填されたシリンジである、請求項６に記載のキット。