DE102009028526A1

DE102009028526A1 - Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden

Info

Publication number: DE102009028526A1
Application number: DE102009028526A
Authority: DE
Inventors: Mikhail Dr. Tsurkan; Uwe Dr. Freudenberg; Carsten Prof. Dr. Werner
Original assignee: Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV
Current assignee: Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV
Priority date: 2009-08-13
Filing date: 2009-08-13
Publication date: 2011-02-24
Also published as: EP2464669A2; WO2011018496A2; WO2011018496A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden, umfassend die Verfahrensschritte: a) Aktivierung der Carboxylgruppen der Saccharide durch eine primäre Reaktion der jeweiligen Carboxylgruppe mit einem Carbodiimid oder einem Triazol als Aktivierungsreagenz und eine anschließende Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder einem von dessen Derivaten, b) Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit primären Aminogruppen von aminfunktionalisierten, optisch oder biologisch aktiven Molekühlen unter Ausbildung einer Amidbindung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden.
Modifikationen an Sacchariden werden insbesondere durchgeführt, um für die Verwendung von verschiedenen Analysemethoden, sowohl bei in vivo- als auch bei in vitro-Techniken, chromophore Marker an den Sacchariden anzubringen. Insbesondere können auf diese Weise Fluoreszenzmarker-Moleküle für die Mikroskopie an die Saccharide angebunden werden. Die Markierung von funktionellen OH-Gruppen der Saccharide wird aufgrund der geringen Reaktivität der OH-Gruppe in wässrigen Lösungen häufig in organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Somit werden diese allgemeinen Markierungstechniken in organischen Lösungsmitteln unter ”nicht-natürlichen” Bedingungen angewandt, begleitet von möglichen irreversiblen strukturellen Veränderungen des Polysaccharid-Zielmoleküls aufgrund der harten Bedingungen. Außerdem sind viele natürlich vorkommende Polysaccharide, wie zum Beispiel Glykosaminoglykane, in organischen Lösungsmitteln schlecht löslich und konnten unter solchen Bedingungen nicht modifiziert werden.
Es gibt mehrere Veröffentlichungen über die Markierung von Glykosaminoglykanen und anderen Polysacchariden in wässrigen Lösungen. Bei diesen Ansätzen werden in der Regel drei verschiedene Techniken, wie die reduktive Aminierung, die Umsetzung freier Amine mit NHS-Estern und die Reaktion von Carbodiimiden mit freien Carboxylgruppen, angewendet. Der derzeitige wissenschaftliche Stand in der Entwicklung und Anwendung dieser Techniken ist sehr gut in Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 (2006) 2300–2313 und Carbohydrate Research 341 (2006) 1253–1265 beschrieben. Die reduktive Aminierung als Markierungstechnik wird in der Regel für das Produkt der Spaltung von Glykosaminoglykanen mit salpetriger Säure angewendet. Es folgt die Reaktion mit einem Marker, der ein primäres Amin innerhalb seiner Struktur enthält. Der letzte Schritt ist die Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid oder einem ähnlichen Reduktionsmittel. Dieser Prozess wurde im Detail bei der Markierung von Glykosaminoglykanen mit 2-Aminopyridin untersucht [J. Biochem. 95 (1984), 197–203; J. Biochem 110 (1991) 132–135]. Die wesentlichen Nachteile bestehen in niedrigen Ausbeuten bei Polysacchariden mit höheren Molekulargewichten und in der Aufwendigkeit dieses Verfahrens, was seiner breiten Anwendung entgegensteht. Ein alternatives Verfahren besteht in der Umsetzung der freien Amine der Polysaccharide durch selektive Bindung der Zielmoleküle an die Amin-Gruppen über Hydroxysuccinimid(NHS)-Ester, was in der Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 (2006) 2300–2313 offenbart ist. Diese hochselektive Technik unterliegt umfangreichen Beschränkungen. Insbesondere kann diese Technik nur auf Polysaccharide, die freie Amino-Gruppen enthalten, angewendet werden. Eine weitere wesentliche Einschränkung besteht darin, dass die Moleküle, die chemisch an ein Polysaccharid gebunden werden sollen, eine NHS-Estergruppe oder eine funktionelle Gruppe brauchen, die in einen NHS-Ester überführt werden kann, was im Umkehrschluss wiederum die möglichen funktionellen Reste der anzulagernden Moleküle dahingehend beschränkt, dass keinerlei Amino-Gruppen oder ähnliche nukleophile Gruppen vorhanden sein dürfen, die in der Lage wären, selbst mit dem NHS-Ester zu reagieren. Somit wird die Auswahl der für die chemische Modifizierung von Polysacchariden (nach der zuvor beschriebenen Methode) anwendbaren Moleküle und auch die biologische oder physikalische Vielseitigkeit der Endprodukte erheblich eingeschränkt. Genauer gesagt ist diese Technik vor allem auf Fluorescein, Cumarin, Dansyl und Biotin, die keine freien Amino-Gruppen enthalten, beschränkt. Auf die Markierung von Polysacchariden durch die Familie der üblichen chromophoren Markierungen, wie Alexa^TM Flour, HiLyte^TM Flour, DyLight^TM Flour und andere, kann diese Chemie nicht angewendet werden.
Die Anwendung der Carbodiimid-Chemie für die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen den freien Carboxylgruppen des Ziel-Moleküls und einer beliebigen Amino-Gruppe eines Markers ist eine weitere Methode zur Funktionalisierung von Polysacchariden. Das Standardverfahren umfasst die Verwendung von Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) oder ähnlichen Aktivierungsreagenzien für die Modifikation eines Polysaccharids im Gemisch mit einem Marker in einem Ein-Schritt-Mechanismus. Hydroxysuccinimid (NHS) oder Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) wird als Katalysator für die Erhöhung der Ausbeute bei dieser Reaktion durch Bildung einer stabileren Zwischenstufe, dem NHS oder s-NHS Ester der Carboxylgruppen, verwendet. Allerdings ist die durchschnittliche Ausbeute in den bis jetzt beschriebenen Verfahren im Bereich zwischen 30 bis 50%, was für den Einsatz kostenintensiver Marker wie Alexa^TM Flour unrentabel ist. Weiterhin ist dieses Verfahren aufgrund der Struktur der verwendeten Marker und funktionellen Moleküle auch nur eingeschränkt anwendbar. Es dürfen beispielsweise keine Carboxylfunktionen vorhanden sein, damit eine intermolekulare Vernetzung verhindert wird.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens für die Durchführung von Modifikationen an Sacchariden mit einer Vielzahl von Markern oder funktionellen Molekülen, das auch unter wässrigen Bedingungen kostengünstig und mit hohen Ausbeuten durchführbar ist. Ein solches Verfahren sollte geeignet sein, eine Vielzahl von physikalisch oder biologisch aktiven Molekülen für die Nutzung im Tissue-Engineering und für die Entwicklung von Arzneimitteln kovalent an die Saccharid-Einheiten anzubinden. In diesem Zusammenhang sollte das Verfahren die Anwendung einer Vielzahl von veränderlichen Molekülen für moderne in vitro- und in vivo-Tests mit Polysacchariden, einschließlich Glykosaminoglykanen und ihren Derivaten, ermöglichen.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden, umfassend die einzelnen Verfahrensschritte:

a) Aktivierung der Carboxylgruppen der Saccharide durch eine primäre Reaktion der jeweiligen Carboxylgruppe mit einem Carbodiimid oder einem Triazol als Aktivierungsreagenz und eine anschließende Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder einem von dessen Derivaten,
b) Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit primären Aminogruppen von aminfunktionalisierten, optisch oder biologisch aktiven Molekülen unter Ausbildung einer Amidbindung.

Gemäß der Konzeption der Erfindung wird diese kovalente Modifikation der Saccharide in wässrigen Lösungen in einem Zwei-Stufen-Mechanismus durchgeführt, um unerwünschte Nebenreaktionen zu vermeiden. In einem ersten Schritt werden dabei NHS-Ester der freien Carboxylgruppen am Saccharid gebildet. In einem zweiten Schritt erfolgt dann die Umwandlung durch die Reaktion der NHS-aktivierten Saccharidcarboxylgruppen mit primären Amino-Gruppen eines Markermoleküls beziehungsweise eines anderen funktionellen Moleküls.
Das vorgeschlagene Verfahren kann für die Funktionalisierung einer Vielzahl von Sacchariden durch Bildung einer Amid-Bindung mit einer Vielzahl anderer Moleküle (zum Beispiel Signalmoleküle und Marker) genutzt werden. Die Besonderheit dieses Verfahrens besteht darin, dass fast alle Moleküle, die in wässrigen Lösungen löslich sind und eine freie Amino-Gruppe enthalten, kovalent an Saccharide angebunden werden können. Diese Anforderung erfüllen beispielsweise fast alle Proteine. Die Möglichkeit der kovalenten Anbindung in wässriger Lösung verringert störende Nebenreaktionen, die durch andere funktionelle Gruppen innerhalb des Markermoleküls beziehungsweise des funktionellen Moleküls verursacht werden. Dieses Verfahren erlaubt es, die Reaktion zwischen einem Saccharid und einem Marker oder einem ähnlichen funktionellen Molekül für die Bildung von einem kovalent markierten Produkt in der Form zu kontrollieren, dass Ausbeuten größer als 90% erreicht werden. Oft werden mit der erfindungsgemäßen Technik auch Ausbeuten bis zu 95% (bezogen auf den Umsatz der Carboxylgruppen an den Sacchariden) erreicht. Daher ist bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Verwendung äquimolarer Mengen an Saccharid und an Markermolekülen beziehungsweise biofunktionellen Molekülen möglich, so dass Modifikationen sogar mit kostenintensiven Markern, wie zum Beispiel Fluoreszenz-Farbstoffen, oder maßgeschneiderten Proteinen wirtschaftlich vertretbar sind.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Markierung beziehungsweise Modifikation durch die kovalente Anbindung einer primären Amino-Gruppe von einem Marker oder einem funktionellen Molekül an eine NHS-aktivierte Carboxylgruppe der Saccharide erreicht. Die Reaktion findet in wässrigen Lösungen statt, was die Funktionalisierung von sehr hydrophilen Sacchariden wie Glykosaminoglykanen erlaubt. Als Saccharide beziehungsweise Polysaccharide können in dem erfindungsgemäßen Verfahren somit Polyglukosaminoglykane, wie insbesondere Heparin oder auch Hyaluronsäure, modifiziert und funktionalisiert werden.
Als Aktivierungsreagenzien, die im primären Aktivierungschritt bei der Aktivierung von Carboxylgruppen eingesetzt werden, sind insbesondere Verbindungen aus der Klasse der Carbodiimide vorgesehen, vorzugsweise 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), wobei aber auch ähnliche Verbindungen, wie zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid (DIC), eingesetzt werden können. Alternativ zur Verwendung von Carbodiimiden sind als Aktivierungsreagenz für die primäre Reaktion des Aktivierungsschritts a) auch Verbindungen aus der Klasse der Triazole möglich. Dazu gehören 1-Hydroxy-benzotriazol (HOBt) und 1-Hydroxy-7-aza-Benzotriazol (HOAt), aber auch andere ähnliche Verbindungen.
In einer besonders bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als N-Hydroxysuccinimid-Derivat für die Aktivierung der Carboxylgruppen N-Hydroxysulfosuccinimid (s-NHS) verwendet. Insbesondere reagieren mit 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl-)carbodiimid (EDC) in der primären Reaktion und mit N-hydroxysulfosuccinimid (s-NHS) in der anschließenden Reaktion aktivierte Carboxylgruppen von Sacchariden mit den Amino-Gruppen von aminfunktionalisierten funktionellen Molekülen beziehungsweise chromophoren Markern. Dies erlaubt die Bildung von modifizierten oder markierten Sacchariden mit einer breiten Palette von optisch und biologisch aktiven Einheiten oder Funktionen, deren Eigenschaften in Biomaterialstudien sowie in biologischen und medizinischen Untersuchungen von Nutzen sind. In dieser Ausführungsform des Verfahrens werden in dem ersten so genannten Aktivierungsschritt die Carboxylgruppen des jeweiligen Saccharids beziehungsweise Polysaccharids in hochreaktive Sulfo-NHS-Ester umgewandelt, die für die spätere stöchiometrische Reaktion von annähernd 1:1 mit primären Amino-Gruppen geeignet sind, welche zu dem jeweiligen funktionellen Molekül oder chromophoren Marker gehören.
Die Besonderheit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die spezielle Anbindung eines chromophoren Markers, zum Beispiel eines Markers mit einer starken Fluoreszenz, aus einer Vielzahl von optisch aktiven Molekülen auch in Anwesenheit von Carboxylgruppen innerhalb der anzubindenden Moleküle selbst möglich ist. Das Gleiche gilt auch für an den Carboxylgruppen der Saccharide anzubindende biologisch aktive Moleküle, wie zum Beispiel biologisch aktive Peptide und Proteine. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die kovalente Anlagerung von Markern/funktionellen Molekülen an Saccharidmolekülen in wässriger Lösung, ohne dabei komplizierte Markierungstechniken in organischen Lösungsmitteln anwenden zu müssen, wie sie zum Beispiel bei der Umsetzung (Markierung) von Hydroxylgruppen (OH-) unter absolut wasserfreien Bedingungen notwendig sind. Daher ist es auch möglich, stark geladene Glykosaminoglykane wie Heparin zu markieren, die in organischen Lösungsmitteln aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit nicht modifiziert werden können. In der Regel erlaubt dieses Verfahren eine ”sanftere” Markierung. Aus diesem Grund können bioaktive Moleküle markiert werden, ohne dass sie ihre biologische Funktionalität beziehungsweise ihre strukturelle Integrität verlieren. Neben wirtschaftlichen Vorteilen, die sich aus dem Umstand ergeben, dass die Reaktionsausbeuten von mehr als 95% Abfälle von teuren Reagenzien vermeiden und diese Reaktion sehr günstig für den industriellen Einsatz gestalten, ermöglicht das Verfahren eine genaue Kontrolle der Stöchiometrie zwischen den Sacchariden und den Markern, was sehr wichtig ist, um die Eigenschaften des gebildeten Konjugats präzise einzustellen.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:
1a: ein UV-Vis-Spektrum von Azur A;
1b: ein UV-Vis-Spektrum von Heparin;
1c: übereinandergelegte normalisierte UV-Vis-Spektren von Heparin und Heparin-Azur A;
2a: ein Hochdruck-Größenausschluss-Chromatogramm (HPSEC) von Heparin bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
2b: ein Hochdruck-Größenausschluss-Chromatogramm (HPSEC) vom Heparin-Azur-A-Produkt bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
3a: ein HPSEC-Chromatogramm von Heparin bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
3b: ein HPSEC-Chromatogramm einer Heparin-Alexa^TM Flour 488 Reaktionsmischung bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
3c: ein HPSEC-Chromatogramm von gereinigtem Heparin-Alexa^TM-Flour-488-Produkt bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
4a: ein HPSEC-Chromatogramm von Alexa^TM Flour 488 bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
4b: ein UV-Vis Spektrum von Alexa^TM Flour 488 in Phosphatpuffer vom pH 7;
4c: ein UV-Vis-Spektrum von Heparin-Alexa^TM Flour 488 in Phosphatpuffer vom pH 7;
5a: Emissions-Spektren von Alexa^TM Flour 488, Anregung bei 488 nm in Phosphatpuffer vom pH 7;
5b: Emissions-Spektren von Heparin-Alexa^TM Flour 488, Anregung bei 488 nm in Phosphatpuffer vom pH 7;
6a: HPSEC-Chromatogramm der Hyaluronsäure bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
6b: HPSEC-Chromatogramm von Alexa^TM Flour 488 bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
6c: HPSEC-Chromatogramm von Alexa^TM-Flour-488- Hyaluronsäure-Produkt bei Verwendung einer 8 μm-Säule PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
7a: HPSEC-Chromatogramm von Hyaluronsäure mit niedrigem Molekulargewicht bei Verwendung einer Phenomenex^®-BioSep-S-2000-Säule und 100 mM Phosphat-Puffer vom pH 7;
7b: HPSEC-Chromatogramm von Alexa^TM-Hyaluronsäure-Produkt bei Verwendung einer Phenomenex^® BioSep S-2000-Säule und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
8a: HPSEC-Chromatogramm von Heparin bei Verwendung einer 8 μm-Säule von PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
8b: HPSEC-Chromatogramm von cRGD bei Verwendung einer 8 μm-Säule von PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
9a: HPSEC-Chromatogramm der Reaktionsmischung von Heparin-cRGD bei Verwendung einer 8 μm-Säule von PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
9b: HPSEC-Chromatogramm von dem gereinigten Heparin-cRGD bei Verwendung einer 8 μm-Säule von PL-Aquagel-OH-Gemisch und 100 mM Phosphatpuffer vom pH 7;
10a: ein UV-Vis-Spektrum von unmodifiziertem Heparin;
10b: ein UV-Vis-Spektrum von Heparin-c-RGD-Produkt und
10c: ein UV-Vis-Spektrum von c-RGD-Peptid.
Ausführungsbeispiel I:
Das Ausführungsbeispiel I bezieht sich auf die Markierung von Heparin mit Azur A. Heparin wird häufig als Arzneimittel genutzt. In jüngster Zeit wurde Heparin auch als aktive Komponente von einigen Bio-Hybrid-Materialien angewendet, die ein großes Potenzial sowohl in „Tissue-Engineering”-Anwendungen als auch als Freisetzungsmedium für pharmazeutische Wirkstoffe aufweisen. Heparin ist ein natürliches Polyglukosaminoglykan-Molekül. Dieses Biopolymer weist eine sehr hohe negative Ladungsdichte auf, die auf den starken Sulfatierungsgrad zurückzuführen ist. Diese Charakteristik des Heparins ist entscheidend für seine biologische Aktivität, daher ist die Anwendung der reduktiven Aminierung zur Markierung wegen einer möglichen Desulfatation seiner Amino-Gruppen nachteilig.
Heparin besitzt kein charakteristisches Absorptionsmuster im UV-Vis-Spektrum, doch die Markierung mit einem starken Farbstoff ermöglicht eine einfache Beobachtung und Quantifizierung des Heparins in Geweben oder Biohybrid-Materialien. Die geringe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und hohe Hydrolyseempfindlichkeit beschränkt die Chemie für die Modifikation. Heparin variiert in seinem Molgewicht. Ein kommerziell verfügbares Heparin hat ein mittleres Molgewicht von ca. 14 kDa und etwa 28 Carboxylgruppen pro Molekül, die mit Farbstoffen, die eine primäre Aminogruppe enthalten, reagieren. Für Azur A konnte gezeigt werden, dass es mit Heparin durch die Bildung von Amidbindungen reagiert.
Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt: 0655 mg EDC [10-facher Überschuss] und 0,45 mg NHS [5-facher Überschuss] wurden zu einer Lösung von 5 mg Heparin in Boratpuffer (pH = 8) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Als Nächstes wurde die äquimolare Lösung Azur A in Boratpuffer (pH = 8) hinzugefügt. Das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches betrug 100 μl. Die Reaktion wurde über Nacht bei 40°C fortgesetzt. Die Reinigung des Heparin-Azur-A-Produkts erfolgte durch Dialyse gegen 800 ml 1 M Natriumchloridlösung, gefolgt von der dreimaligen Dialyse gegen 800 ml deionisiertem Wasser unter Verwendung einer Membran mit einer Molmassenausschlussgröße (MWCO) von 1000 Da. Dabei sollte unumgesetztes Azur A quantitativ entfernt werden. Danach wurde das Produkt gefriergetrocknet und es wurden 4,8 mg amorpher blauer Rückstand gesammelt.
Ergebnisse des Ausführungsbeispiels I:
Heparin zeigt kein Absorptionsmuster im UV-Vis-Spektrum und daher auch gemäß 1b keine Absorption bei 600 nm, wohingegen das Azur-A-Molekül gemäß 1a eine charakteristische Absorption bei 290 nm und bei 600 nm zeigt. Die UV-Vis-Spektren des gereinigten Heparin-Azur-A-Konjugates zeigen die charakteristischen Absorptionen bei 290 nm und 600 nm gemäß 1c.
Der Unterschied zwischen den UV-Vis-Spektren des Heparin-Azur-A-Konjugates und Heparin ist deutlich zu erkennen:
Die Reinheit des Produktes wird durch Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie (HPSEC) bestätigt. Heparin eluiert gemäß 2a als ein Peak im HPSE-Chromatogramm mit einer Elutionszeit von 17 Minuten, was sich durch das Auftreten der Absorption bei 210 nm zeigt. Das HPSE-Chromatogramm des gereinigten Produktes zeigte, wie in 2b zu sehen, nur einen Peak bei 17 Minuten, der charakteristisch für Heparin ist. Das Produkt bewirkt eine starke Absorption bei 600 nm, wie in 1a und 1c zu sehen ist, die eindeutig das Vorhandensein von Azur A innerhalb der Struktur des Produktes anzeigt.
Ausführungsbeispiel II:
Das Ausführungsbeispiel II betrifft beispielhaft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Markierung von Heparin mit nichtmodifiziertem Alexa^TM-Flour-488-Farbstoff unter Nutzung eines zweistufigen Verfahrens, basierend auf der Carbodiimidchemie. Alexa^TM ist eine US-Marke für molekulare Sonden. Die aliphatische Amino-Gruppe in der Struktur des Farbstoffes wird für die kovalente Anbindung dieses Farbstoffes an eine Carboxylgruppe des Heparins durch Bildung einer Amid-Bindung genutzt, wobei die Ausbeute mehr als 90% beträgt.
Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt: 30 mg EDC [3,5-facher Überschuss] und 0,17 mg NHS [2,0-facher Überschuss] wurden zu einer Lösung von 5,4 mg Heparin (3,85·10^–4 mmol) in Boratpuffer vom pH = 8 hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten lang bei 5°C gehalten. Als Nächstes wurden 0,25 mg Alexa^TM Flour 488 (3,9·10^–4 mmol) in Boratpuffer vom pH = 8 hinzugefügt. Das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches betrug 50 μl. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Heparin-Alexa^TM 488-Produkt wurde durch Dialyse gegen 800 ml 1 M Natriumchloridlösung gereinigt, um unumgesetztes Alexa^TM Flour 488 quantitativ zu entfernen, wobei eine Membran mit einer mittleren Molmassenausschlussgröße von 1000 Da verwendet wurde. Es folgte die dreimalige Dialyse gegen 800 ml Wasser. Danach wurde das Produkt gefriergetrocknet und es wurden 5,35 mg amorpher orangefarbener Rückstand gesammelt, was einer Ausbeute von 95% entspricht.
Ergebnisse des Ausführungsbeispiels II:
Die starke Absorption des Heparin-Alexa^TM-Produktes bei 488 nm gemäß 3c und ihre Abwesenheit bei reinem Heparin, wie in 3a gezeigt, ermöglicht eine einfache Überwachung der Reaktion mittels Hochdruck-Größenausschluss-Chromatographie (HPSEC). Die Elutionszeit des Heparins beträgt 17 Minuten, was durch die Überwachung der Absorption bei 230 nm im HPSE-Chromatogramm in 3a erkennbar ist. Das Reaktionsgemisch liefert gemäß 3b mehrere Peaks im HPSE-Chromatogramm bei 17, 19 und 20 Minuten, die dem Heparin (Peak bei 17 Minuten), unumgesetztem Alexa^TM Flour (Peak bei 19 Minuten) und niedermolekularem Nebenprodukt von EDC und NHS (Peak bei 20 Minuten) entsprechen. Das HPSE-Chromatogramm des gereinigten Produktes sollte nur einen Peak bei 17 Minuten zeigen, welcher bei der Überwachung der Absorption bei 230 nm charakteristisch für Heparin ist. Dennoch hat das Produkt gemäß 3c auch eine starke Absorption bei 488 nm, die auf das Vorhandensein von Alexa^TM Flour 488 in der Struktur des Produktes hinweist.
Alexa^TM Flour 488 besitzt eine starke Absorption bei 488 nm, die in UV-Vis-Spektren sichtbar ist und gemäß 4a durch Hochdruck-Größenausschluss-Chromatographie (HPSEC) überwacht werden kann. Für das Heparin-Alexa^TM-Flour-488-Produkt wurde erwartet, dass es ein ähnliches Absorptionsverhalten wie Alexa^TM Flour aufweist. Offenbar liefert das Heparin-Alexa^TM-Flour-488-Produkt fast identische UV-Vis-Spektren wie Alexa^TM Flour 488, was durch einen Vergleich der 4b und 4c zu erkennen ist.
Ähnlich verhält es sich beim Vergleich der wässrigen Lösung von Alexa^TM Flour 488, gezeigt in 5a, und dem Heparin-Alexa^TM-Flour-488-Produkt, gezeigt in 5b. Das Reaktionsprodukt liefert gemäß 5b eine starke Emission bei 530 nm, was auf die Emission des während der Konjugationsreaktion in seiner Funktionalität nicht veränderten Alexa^TM-Farbstoffes zurückzuführen ist.
Ausführungsbeispiel III:
Das Ausführungsbeispiel III betrifft die Markierung von Hyaluronsäure durch Alexa^TM Flour 488. Hyaluronsäure, auch bekannt als Hyaluronan, ist ein nicht sulfatisiertes Glykosaminoglykan, das weithin als Arzneimittel und in der Kosmetik genutzt wird. Wie die meisten Polysaccharide hat Hyaluronsäure kein charakteristisches Absorptionsmuster im UV-Vis-Spektrum, weshalb eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen notwendig ist, damit sie mit dieser Methode nachweisbar ist. Jeder Disaccharidrückstand der Hyaluronsäure enthält eine Carbonsäure-Gruppe, die mit Farbstoffen modifiziert werden kann, welche jeweils eine primäre Amino-Gruppe besitzen. Alexa^TM Flour 488 reagiert mit Hyaluronsäure (17 kDa) unter Bildung einer Amid-Bindung.
Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt: Ähnlich wie im Ausführungsbeispiel II wurden 0,14 mg EDC [2,0-facher Überschuss] und 0,086 mg NHS [1-facher Überschuss (= äquimolare Menge)] einer Lösung von 3,03 mg Hyaluronsäure, die 3,85·10^–4 mmol bei einem Molekulargewicht von = 17.000 Da entsprechen, in Boratpuffer (pH = 8) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten lang bei 5°C gehalten. Als Nächstes wurden 0,25 mg Alexa^TM Flour 488, die 3,9·10^–4 mmol entsprechen, in Boratpuffer (pH = 8) hinzugefügt. Das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches betrug 50 μl. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt.
Das Alexa^TM-Flour-488-Hyaluronsäure-Produkt wurde unter Nutzung einer Membran mit einer mittleren Molemassenausschlussgröße von 1.000 Da durch Dialyse gegen 800 ml 1 M Natriumchloridlösung gereinigt, um unumgesetztes Alexa^TM Flour 488 quantitativ zu entfernen; es folgte eine dreimalige Dialyse gegen 800 ml Wasser. Danach wurde das Produkt gefriergetrocknet. Es wurden 3,0 mg eines amorphen orangefarbenen Rückstands erhalten, was einer Ausbeute von 95,6% entspricht.
Ergebnisse des Ausführungsbeispiels III:
Die starke Absorption des Alexa^TM-Hyaluronsäure-Produktes bei 488 nm und ihre Abwesenheit für Hyaluronsäure ermöglicht eine einfache Überwachung der Reaktion durch Hochdruck-Größenausschluss-Chromatographie (HPSEC). Die unumgesetzte Hyaluronsäure ergibt im HPSE-Chromatogramm zwei Peaks, wobei der Hauptteil von jedem Peak bei 18 Minuten eluiert. Der kleine Anteil im HPSE-Chromatogramm der Hyaluronsäure gemäß 6a kann auf niedermolekulare Saccharide zurückgeführt werden. Unter ähnlichen Bedingungen eluiert Alexa^TM Flour 488 bei 19 Minuten, wie in 6b sowohl anhand der Absorption bei 210 nm als auch anhand der Absorption bei 488 nm gezeigt wird. Das gereinigte Konjugat der Hyaluronsäure mit Alexa^TM Flour 488 zeigt gemäß 6c mehrerer Peaks bei der Eluation, wobei der Hauptteil der Peaks bei 18 Minuten auftritt, was dem Verhalten unumgesetzter Hyaluronsäure ähnlich ist. Alle Anteile im HPSE-Chromatogramm des Produktes zeigen jedoch auch eine starke Absorption bei 488 nm, was deutlich das Vorhandensein von Alexa^TM Flour 488 innerhalb der Struktur des Produktes anzeigt.
Ausführungsbeispiel IV:
Das Ausführungsbeispiel IV betrifft die Markierung von niedermolekularer Hyaluronsäure mit Alexa^TM Flour 488. Das Beispiel zeigt die Markierung niedermolekularer Hyaluronsäure (4,7 kDa), die nur wenige Disaccharidrückstände enthält. Ähnlich wie das Ausführungsbeispiel III zeigt Alexa^TM Flour 488 die Bildung eines Amids mit der Carboxylgruppe von Hyaluronsäure bei Anwendung der Standard-Carbodiimidchemie.
Das Verfahren wurde wie folgt durchgeführt: Ähnlich wie in Ausführungsbeispiel III wurden 0,14 mg EDC [2,0-fachen Überschuss] und 0,086 mg NHS [die äquimolare Menge] einer Lösung von 0,84 mg Hyaluronsäure, die 3,85·10^–4 mmol bei einem Molekulargewicht von 4.700 Da entsprechen, in Boratpuffer vom pH 8 hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten lang bei 5°C gehalten. Danach wurden 0,25 mg Alexa^TM Flour 488, die 3,9·10^–4 mmol entsprechen, in Boratpuffer vom pH 8 hinzugefügt. Das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches betrug 50 μl. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt.
Das Alexa^TM-Flour-488-Hyaluronsäure-Produkt wurde unter Verwendung einer Membran mit mittlerer Molmassenausschlussgröße von 1.000 Da durch Dialyse gegen 800 ml 1 M Natriumchloridlösung gereinigt, um unumgesetztes Alexa^TM Flour 488 quantitativ zu entfernen. Es folgte die dreimalige Dialyse gegen 800 ml Wasser. Als Nächstes wurde das Produkt gefriergetrocknet. Es wurden 0,8 mg an amorphem orangefarbenen Rückstand erhalten, die einer Ausbeute von 84,4% entsprechen.
Ergebnisse des Ausführungsbeispiels IV:
Ähnlich dem Ausführungsbeispiel III eluiert die unumgesetzte niedermolekulare Hyaluronsäure im HPSEC in Form von zwei Peaks, wobei der erste Peak gemäß 7a sehr breit und mit einem Maximum bei 16 Minuten ausgebildet ist. Das gereinigte Konjugat der niedermolekularen Hyaluronsäure mit Alexa^TM Flour 488 zeigt gemäß 7b ein sehr ähnliches Muster von Peaks im HPSE-Chromatogramm an, die im Gegensatz zur Ausgangskomponente auch eine sehr starke Absorption bei 488 nm liefern. Dies zeigt deutlich die Anwesenheit von Alexa^TM Flour 488 innerhalb der Struktur des Produktes an.
Ausführungsbeispiel V:
Das Ausführungsbeispiel V betrifft die Funktionalisierung von Heparin durch ein cRGD-Peptid. Die Modifikation von Sacchariden mit biologisch aktiven Molekülen, wie den zelladhäsiven Peptid-Sequenzen, sind von hohem wissenschaftlichem und technologischem Interesse. Exemplarisch beschreibt das folgende Ausführungsbeispiel die Modifikation des Polysaccharids Heparin mit dem Integrin bindenden zyklischen RGD-Peptid, welches im Allgemeinen als häufig angewendeter zelladhäsiver Ligand in der Biomaterialforschung bekannt ist. Die Peptid-Sequenz ist KYRGD in zyklischer Form (cRGD). Die Seitenkettenaminogruppe von Lysin wird für die kovalente Kopplung von cRGD an Heparin-Carboxylgruppen unter jeweiliger Bildung einer Amid-Bindung genutzt. Aufgrund der Tatsache, dass dieses Peptid sowohl Carbonsäuren als auch primäre Amin-Gruppen innerhalb seiner Struktur enthält, ist die kovalente Anlagerung an Polysaccharide durch die Carbodiimidchemie eine Herausforderung, da in einem einstufigen Mechanismus durch Nebenreaktionen zwischen den Carboxyl-Gruppen der Peptide und den Amin-Gruppen von anderen Peptid-Molekülen unerwünschte Aggregationsprodukte produziert würden. Um diese Nebenreaktionen zu vermeiden und die Menge des Peptids, das an ein Polysaccharid gebunden wird, genau zu kontrollieren, wurde das erfindungsgemäße zweistufige Konjugationsverfahren angewendet. Im Einzelnen konnte die stöchiometrische Kopplung von cRGD an Heparin durch Bildung von Amid-Bindungen zwischen den aktivierten Carboxyl-Gruppen des Heparins und den Amino-Gruppen der Lysinmoleküle gezeigt werden. Die Standard EDC-, Sulfo-NHS-Chemie wurde mit 2-fachem Überschuss der Vernetzungsreagenzien angewendet. Die Menge des Peptids innerhalb des Heparin-cRGD-Konjugats erwies sich durch die angewandte Chemie als regulierbar.
Das Verfahren wurde wie folgt durchgeführt: 2,71 mg EDC [1,75-facher Überschuss] und 1,75 mg NHS [1-facher Überschuss (äquimolare Menge)] wurden zu den Lösungen von sowohl 29 mg als auch 19 mg Heparin (3,85·10^–4 mmol) in Boratpuffer vom pH 8 hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei 5°C gehalten. Als Nächstes wurden 2,5 mg cRGD in Boratpuffer vom pH 8 zu jedem Reaktionsgemisch hinzugefügt, was jeweils dem zweifachen oder dreifachen Überschuss von cRGD entspricht. Das Gesamtvolumen der Reaktionsgemische betrug etwa 100 μl. Die Reaktionen wurden über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Um jegliches unumgesetztes cRGD zu entfernen, wurde das cRGD-Heparin-Produkt durch Dialyse gegen 1 M Natriumchloridlösung gereinigt. Es folgte die dreimalige Dialyse gegen Wasser. Danach wurde das Produkt gefriergetrocknet und es wurden 28 mg, was einer Ausbeute von 88,9% entspricht, beziehungsweise 18 mg, was einer Ausbeute von 87,2% entspricht, des amorphen weißen Rückstands erhalten.
Ergebnisse des Ausführungsbeispiels V:
Der Tyrosin-Aminosäure-Rückstand innerhalb der cRGD-Struktur hat eine charakteristische Absorption bei 274 nm mit einem Extensionskoeffizienten von 1405. Diese Absorption des cRGD-Heparin-Produktes bei 274 nm ermöglicht die Überwachung der Reaktion durch die Hochdruck-Größenausschluss-Chromatographie (HPSEC). Das HPSE-Chromatogramm von Heparin hat gemäß 8a nur einen Peak bei 17 Minuten, der keine wesentliche Absorption bei 274 nm aufweist. Das cRGD eluiert gemäß 8b bei 21 Minuten unter den ähnlichen Bedingungen, liefert aber eine relativ starke Absorption bei 274 nm.
Die Reaktionsgemische liefern gemäß 9a jeweils drei Hauptpeaks im HPSE-Chromatogramm bei 17, 19 und 21 Minuten, die im Einzelnen jeweils Heparin (17 Minuten), einem Nebenprodukt niedrigen Molekulargewichts von EDC und NHS (19 Minuten) und unumgesetztem cRGD-Peptid (21 Minuten) zugeordnet werden können. Nach der Reinigung zeigten beide Reaktionsgemische nur einen Hauptpeak im HPSE-Chromatogramm gemäß 9b mit der Elutionzeit von 17 Minuten an, was dem Chromatogramm von unumgesetztem Heparin ähnlich ist. Im Gegensatz zum Heparin lieferten diese Produkte aber eine stärkere Absorption bei 274 nm, was auf das Vorhandensein von cRGD innerhalb ihrer Strukturen schließen lässt.
Die 10a zeigt ein UV-Vis-Spektrum von unmodifiziertem Heparin, die 10b ein UV-Vis-Spektrum vom Heparin-c-RGD-Produkt und 10c ein UV-Vis-Spektrum von c-RGD-Peptid. Der Gehalt an cRGD-Peptid innerhalb des durch cRGD modifizierten Heparins (Heparin-cRGD) wird durch Vergleich der Absorbanz von Lösungen gleicher Molarität von unmodifiziertem Heparin in 10a einerseits und dem cRGD-Heparin-Produkt gemäß 10b andererseits bei 274 nm bestimmt. Der Betrag an cRGD-Peptid im Heparin-cRGD-Produkt (Konjugat) wird unter Anwendung des Extinktionskoeffizienten von 1405 bei 274 nm von Tyrosin ermittelt. Durch den Vergleich der berechneten cRGD-Peptid-Molarität und der Gesamtmasse des Heparin-cRGD-Produktes wird der Gehalt des cRGD-Peptids innerhalb des cRGD-Heparin-Produktes bestimmt.
Beide cRGD-Heparin-Proben, synthetisiert mit zwei- beziehungsweise dreifachem Überschuss des cRGD-Peptids, zeigten eine starke Absorption bei 274 nm. Die Berechnung des cRGD-Gehaltes hat gezeigt, dass beide Proben jeweils etwa ein bis zwei Moleküle cRGD pro Molekül Heparin enthalten.
LISTE DER ABKÜRZUNGEN

DCC

Dicyclohexylcarbodiimid

DIC

Diisopropylcarbodiimid

EDC

Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid

HOAt

1-Hydroxy-7-aza-Benzotriazol

HOBt

1-Hydroxy-benzotriazol (HOBt)

HPSEC

Hochdruck-Größenausschluss-Chromatographie

NHS

Hydroxysuccinimid

s-NHS

Hydroxysulfosuccinimid

RGD

steht für die Aminosäuresequenz Arginin, Glycin und Asparaginsäure

cRGD

zyklisches RGD

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 (2006) 2300–2313 [0003]
- Carbohydrate Research 341 (2006) 1253–1265 [0003]
- J. Biochem. 95 (1984), 197–203 [0003]
- J. Biochem 110 (1991) 132–135 [0003]
- Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 (2006) 2300–2313 [0003]

Claims

Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden, umfassend die Verfahrensschritte: a) Aktivierung der Carboxylgruppen der Saccharide durch eine primäre Reaktion der jeweiligen Carboxylgruppe mit einem Carbodiimid oder einem Triazol als Aktivierungsreagenz und eine anschließende Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder einem von dessen Derivaten, b) Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit primären Aminogruppen von aminfunktionalisierten, optisch oder biologisch aktiven Molekülen unter Ausbildung einer Amidbindung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Saccharide Polyglukosaminoglykane, insbesondere Heparin, oder Hyaluronsäure eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbodiimid-Aktivierungsreagenzien für die primäre Reaktion des Aktivierungsschritts a) Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) vorgesehen sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Triazol-Aktivierungsreagenzien für die primäre Reaktion des Aktivierungsschritts a) 1-Hydroxy-benzotriazol (HOBt) und 1-Hydroxy-7-aza-Benzotriazol (HOAt) vorgesehen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als N-Hydroxysuccinimid-Derivat für die Aktivierung der Carboxylgruppen N-Hydroxysulfosuccinimid (s-NHS) verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das aminfunktionelle Molekül ein chromophorer Marker ist, der eine primäre Aminogruppe enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das aminfunktionelle Molekül ein zyklisches RGD-Peptid ist.