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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft in Wasser unlösliche Gele, bestehend aus
Hyaluronsäure,
die vernetzt ist mit bifunktionellen L-Aminosäuren, L-Aminoestern oder deren
Mischungen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
in pharmazeutischen, kosmetischen und medizinischen Gebieten.
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Stand der Technik
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Hyaluronsäure ist
ein Mucopolysaccharid, bestehend aus alternierenden Einheiten von
D-Glucuronsäure
und N-Acetylglucosamin, aneinander gebunden durch β1-3- und β1-4-Bindungen (1).
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Hyaluronsäure wird
in der Natur in der Gelenkflüssigkeit
von Gelenken, im Glaskörper
von Augen, in der Nabelschnur und im Bindegewebe gefunden; es kann
erhalten werden durch Extraktion aus tierischen Geweben wie Hahnenkämmen oder Nabelschnüren, oder
kann aus der Fermentierbrühe
spezifischer Streptococcen zurückgewonnen
werden.
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Die
Entwicklung der Biotechnologie erlaubt die Optimierung und Verbesserung
des letzten beschriebenen Herstellungsverfahrens von Hyaluronsäure (Zurückgewinnung
aus Fermentationsbrühen)
und wird heutzutage als einfachste und lohnendste angesehen.
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Die
wesentliche Rolle, die Hyaluronsäure
im menschlichen Körper
spielt, beruht auf den besonderen viskoelastischen, Schmier- und
hydrophilen Eigenschaften ihrer wässrigen Lösungen.
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Die
Anwendungen von Hyaluronsäure
in verschiedenen Gebieten, den chirurgischen, pharmakologischen
oder allgemeinen biologischen, sind in der Literatur ausführlich beschrieben,
siehe z. B. Balazs et al. "Hyaluronan
Biomaterials: Medical Applications", Handbook of Biomaterials and Applications,
Hrsg., DL Wise et al., 1995, 2719–2741;
US 5,559,104 , 1996; Pape, Balazs,
Ophthalmology, 87, Nr. 7, 1980; Iwata, Clin. Orthop., 289, 285–291; 1993;
US 5,128,326 ;
US 4,500,676 ;
US 5,840,046 ;
US 5,795,584 ;
US 6,010,692 ;
US 5,658,331 .
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Außerdem beschreibt
eine umfangreiche Literatur verschiedene Verbindungen, erhalten
durch Vernetzen von Hyaluronsäure
mit z. B. Formaldehyd (Balazs,
US
4,713,448 , 1987), Divinylsulfon (Balazs,
US 4,582,865 , 1986), Aziridin, Alkoholen
(Della Valle,
US 4,851,521 ,
1989) und monofunktionellen Aminosäuren (Hamilton,
US 4,937,270 , 1990).
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Wie
aus Obigem ersichtlich, kann Hyaluronsäure chemisch modifiziert werden,
um ihre Eigenschaften zu verändern
und Produkte zu erhalten, die für
verschiedene Anwendungen geeignet sind.
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Die
Wichtigkeit zur Bereitstellung neuer Verbindungen, die die Verwendung
von Hyaluronsäure
in bekannten oder neuen Gebieten erweitern oder verbessern können, ist
deshalb offensichtlich.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft in Wasser unlösliche Gele, hergestellt durch
Vernetzen von Hyaluronsäure
mit bifunktionellen Aminosäuren
oder L-Aminoestern oder ihren Mischungen.
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Die
Einführung
von kleinen biokompatiblen Molekülen
wie den α-L-Aminosäuren in
die Hyaluronsäureketten,
unter besonderen Reaktionsbedingungen, erlaubte die Herstellung
von Gelen mit einem charakteristischen farblosen und transparenten
Erscheinungsbild und hochbiokompatiblen und viskoelastischen Eigenschaften.
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Die
Produkte gemäß der vorliegenden
Erfindung können
in einem organischen Lösungsmittel
hergestellt werden, wie Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid
(DMSO) oder in Wasser in der Gegenwart von Carbodiimid gemäß einem
bekannten Verfahren (siehe z. B. Tomihata, J. Biomed. Mater. Res.,
1997, 37 (2), 243–251;
Danishefsky, Carbohydrate Res., 1971, 16, 199–205).
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Diese
Reaktion wird in zwei aufeinander folgenden Schritten durchgeführt: Der
erste Schritt betrifft die Aktivierung von Hyaluronsäure und
der zweite die Bildung von Bindungen zwischen Hyaluronsäure und
dem Vernetzungsmittel.
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Während dem
Aktivierungsschritt reagieren die Carbonsäuren von Hyaluronsäurenatriumsalz
mit der Aktivierungsverbindung, wodurch ein neues chemisches Produkt
gebildet wird mit einem erhöhten
elektrophilen Charakter der Carbonsäuregruppen.
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Im
folgenden Schritt wird ein Vernetzungsmittel zugegeben, wobei dieses
Mittel zwei nukleophile Funktionen umfasst, die die aktivierten
Carbonsäuregruppen
binden können,
wodurch Vernetzungen, d. h. Brückenbindungen
zwischen den Hyaluronsäuremolekülen, erzeugt
werden. Außerdem
begünstigen
die guten anregenden Eigenschaften des Aktivierungsmittels die Reaktion.
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Die
Aktivierungsmittel sind die in der Literatur für diesen Zweck üblicherweise
verwendeten, und insbesondere die wasserlöslichen Carbodiimide; gemäß der vorliegenden
Erfindung ist N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid
besonders bevorzugt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung sind die Vernetzungsmittel bifunktionelle α-L-Aminosäuren, d.
h. sie weisen eine zweite funktionelle Gruppe neben der Aminosäuregruppe
auf, oder L-Aminoester oder Mischungen davon. Besonders bevorzugt
sind L-Lysin, L-Serin, L-Lysinethylesterdihydrochlorid und L-Serinmethylesterhydrochlorid
oder Mischungen davon.
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Die
Verwendung von Aminoestern anstelle von Aminosäuren erlaubt das Schützen der
Carbonsäurefunktionen
von Aminosäuren,
bezogen auf eine mögliche
Aktivierung und Beteiligung in sekundären Reaktionen.
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Das
gesamte Herstellungsverfahren wird wie nachstehend beschrieben ausgeführt.
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Die
Reaktion wird durch Verwenden eines Glasreaktors, versehen mit einem
Rührsystem
und einem Temperaturregler, durchgeführt. Das kommerziell erhältliche
Hyaluronsäurenatriumsalz
wird gemäß den Eigenschaften
des Endprodukts in Wasser in einer Konzentration zwischen 0,5 und
2,5% (G/G) gelöst.
Zum Beispiel werden, um kompakte und dicke Gele zu erhalten, hohe
Konzentrationen benötigt,
z. B. Konzentrationen von 2 bis 2,5%; wohingegen bei Konzentrationen
zwischen 0,5 und 1% fluide Gele erhältlich sind.
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Die
Temperatur ist eine wesentliche Bedingung zum Erhalt der erfindungsgemäßen Produkte,
und sie muss sich zwischen 0°C
und 25°C
und vorzugsweise zwischen 0°C
und 10°C
befinden.
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Die
Reaktionsmischung wird dann angesäuert durch Zugabe einer verdünnten Säure, wie
Salzsäure 0,5–1 M, bis
ein pH-Wert zwischen 3 und 6, vorzugsweise 5, erreicht wird. Ein
Aktivierungsmittel, das die Carbonsäuregruppen von Hyaluronsäure für das Vernetzen
aktivieren kann, wird dann zugegeben. Das Aktivierungsmittel wird
vorzugsweise in einer Menge zwischen 0,2 und 2 Äquivalenten pro Äquivalent
Monomereinheit der Ausgangs-Hyaluronsäure zugegeben.
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Anschließend wird
das Vernetzungsmittel in einer Menge vorzugsweise zwischen 0,1 und
2 Äquivalenten
pro Äquivalent
Monomereinheit der Ausgangs-Hyaluronsäure zugegeben.
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Nach
obigen Zugaben wird die Reaktionsmischung für eine Zeit zwischen 5 Minuten
und 48 Stunden und vorzugsweise zwischen 15 Minuten und 5 Stunden
gerührt.
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Nach
Vervollständigung
der Reaktion wird ein Volumen einer 1 M NaCl-Lösung zugegeben, die Mischung
einige Minuten gerührt,
dann wird eine Reinigung gemäß bekannten
Verfahren durchgeführt,
wie Dialyse und/oder Ausfällen
mit organischem Lösungsmittel
und/oder unter Vakuumverdampfen und/oder Gefriertrocknen.
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Die
Reaktion kann in einem organischen Lösungsmittel, wie DMSO oder
DMF, oder einer Mischung von Wasser/organischem Lösungsmittel
in verschiedenen Verhältnissen
durchgeführt
werden; die Verwendung von Wasser als Reaktionsmittel ist zweifellos
bevorzugt, aber manchmal ist es notwendig, organische Lösungsmittel
für spezifische
Anwendungen der vorliegenden Produkte zu verwenden.
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Somit
wird die Reaktion durch anschließende Zugabe einer Lösung des
Aktivierungsmittels in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, vorzugsweise
2-Chlor-1-methylpyridiniodid,
und eine Suspension der Vernetzungsaminosäure, zu einer Lösung des
Hyaluronsäuresalzes
von Tetrabutylammonium im organischen Lösungsmittel oder in einer Mischung
des organischen Lösungsmittels
und Wassers, in der Gegenwart von Triethylamin und unter Rühren, wobei
die Temperatur auf unter 5°C
gehalten wird.
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Die
so erhaltene Mischung wird zwischen 5 Minuten und 48 Stunden, und
vorzugsweise zwischen 15 Minuten und 5 Stunden gerührt. Das
Produkt wird dann zurückgewonnen
und gereinigt gemäß oben genannten
Verfahren. Das feste Produkt kann wieder in Wasser oder in einer
physiologischen Lösung,
in unterschiedlichen Konzentrationen zum Erhalt von viskosen Lösungen,
Gelen, dünnen
Filmen usw., gelöst
werden.
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In
den folgenden Beispielen werden beide Herstellungsverfahren veranschaulicht.
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Die
Verhältnisse
von Hyaluronsäure-/Aktivierungsmittel/Vernetzungsmittel,
ausgewählt
für die
Synthese, hängen
von dem gewünschten
Vernetzungsgrad und den viskoelastischen Eigenschaften ab.
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Die
Eigenschaften des Endprodukts werden durch die Art der Ausgangs-Hyaluronsäure beeinflusst. Als
eine Tatsache ist es offensichtlich, dass unter den gleichen Bedingungen
eine Hyaluronsäure
mit höherem Molekulargewicht
ein viskoseres und kompakteres Gel erzeugt, bezogen auf das Gel,
erhältlich
ausgehend von Hyaluronsäure
mit einem niedrigeren Molekulargewicht.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird eine Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht
zwischen 100.000 und 2.000.000 verwendet, und die erhaltenen Endprodukte
weisen ein Molekulargewicht zwischen 200.000 und 2.500.000 auf.
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Die
Endprodukte zeigen einen Vernetzungsgrad zwischen 10 und 40% und
eine intrinsische Viskosität zwischen
300 und 1.500 mg/l.
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Das
Aktivierungsmittel ist vorzugsweise ein in Wasser lösliches
Carbodiimid, insbesondere N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid.
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Das
Vernetzungsmittel ist vorzugsweise L-Lysin oder L-Serin oder Ester
davon, vorzugsweise Ethyl- oder Methylester.
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Die
Erfindung wird angesichts folgender Beispiele besser verstanden
werden.
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Beispiel 1
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1
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 20°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
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0,58
g (1,2 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,44 g (1,2 Äq) L-Lysin
werden zugegeben.
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Nach
2 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben, und die Lösung
mit destilliertem Wasser dialysiert; das Produkt wird mit Aceton
ausgefällt,
wieder in Wasser gelöst
und schließlich
gefriergetrocknet.
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Beispiel 2
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1
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 20°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
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0,58
g (1,2 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,74 g (1,2 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid
werden zugegeben.
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Nach
1 Stunde werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben und die Lösung
3 Mal dialysiert und schließlich
gefriergetrocknet.
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Beispiel 3
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1
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 4°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
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0,48
g (1,0 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,62 g (1,2 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid
werden zugegeben.
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Nach
3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben und die Lösung
3 Mal dialysiert und schließlich
gefriergetrocknet.
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Die 1H-NMR-Analyse des so erhaltenen Produkts
zeigte die folgenden charakteristischen Signale (Lösungsmittel
D2O):
1,2 ppm (t, 3H, J = 10,6 Hz,
CH3-CH2CH2O-Lys)
1,4 ppm (m, 2H, CH2 δ Lys)
1,6
ppm (m, 2H, CH 2 γ Lys)
1,7–1,9 ppm
(m, 2H, CH 2 β Lys)
1,9–2,0 ppm
(m, 3H, CH 3-CONH
Hyaluronsäure)
2,9
ppm (t, 2H, J = 11,2 Hz, CH 2 ε Lys)
3,0–3,9 ppm
(m, CHOH Hyaluronsäure)
4,0
ppm (t, 1H, J = 9,6 Hz, CH α Lys)
4,2
ppm (q, 2H, J = 10,6 Hz, CH3-CH2O-Lys)
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Beispiel 4
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1,0
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 4°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
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0,24
g (0,5 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,62 g (1,0 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid
werden zugegeben.
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Nach
3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben und die Lösung
3 Mal dialysiert und schließlich
gefriergetrocknet.
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Beispiel 5
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1,0
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 4°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
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0,24
g (0,5 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,62 g (1,0 Äq) L-Lysinethylesterdihydrochlorid
werden zugegeben.
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Nach
20 Minuten werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben und die Lösung
3 Mal dialysiert und schließlich
gefriergetrocknet.
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Beispiel 6
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1,0
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 20°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
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0,58
g (1,2 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,47 g (1,2 Äq) L-Serinmethylesterhydrochlorid
werden zugegeben.
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Nach
3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben, und die Lösung
mit destilliertem Wasser dialysiert; das Produkt wird mit Aceton
ausgefällt,
wieder in Wasser gelöst
und schließlich
gefriergetrocknet.
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Beispiel 7
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1,0
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 5°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
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0,47
g (1,0 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,19 g (0,5 Äq) L-Serinmethylesterhydrochlorid
werden zugegeben.
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Nach
3 Stunden werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben und die Lösung
3 Mal dialysiert und schließlich
gefriergetrocknet.
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Beispiel 8
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1,0
g Hyaluronsäurenatriumsalz
(2,5 mmol) werden in 80 ml vollentsalztem Wasser gelöst. Die
Temperatur wird durch ein thermostatisches Bad auf 0°C gehalten,
und der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl 0,75 M auf 5 gebracht.
-
0,24
g (0,5 Äq)
N-3-Dimethylaminopropylethylcarbodiimidhydrochlorid und 0,19 g (0,5 Äq) L-Serinmethylesterdihydrochlorid
werden zugegeben.
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Nach
15 Minuten werden 80 ml NaCl-Lösung
1 M zugegeben und die Lösung
3 Mal dialysiert und schließlich
gefriergetrocknet.
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Beispiel 9
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0,5
g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz
werden in 45 ml DMF unter Rühren
und bei einer Temperatur von 5°C
gelöst.
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Sobald
das Salz sich vollständig
gelöst
hat, werden 200 μl
Triethylamin, 0,20 g 2-Chlor-1-methylpyridiniodid und 0,5 g L-Lysin
zugegeben.
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Das
resultierende Gel wird filtriert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet.
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Beispiel 10
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0,3
g Hyaluronsäuretetrabutylammoniumsalz
werden in 30 ml DMF unter Rühren
und bei einer Temperatur von 5°C
gelöst.
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Sobald
das Salz sich vollständig
gelöst
hat, werden 120 ml Triethylamin, 0,12 g 2-Chlor-1-methylpyridiniodid
und 0,21 g L-Serin zugegeben.
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Das
resultierende Gel wird filtriert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet.
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Analog
werden Gele von Hyaluronsäure
hergestellt unter Verwendung der Vernetzungsmittelmischungen von
L-Lysin und L-Serin, L-Lysinethylesterdihydrochlorid und L-Serinmethylesterhydrochlorid
oder Mischungen von Aminosäure/veresterte
Aminosäure,
wodurch dann Produkte mit Eigenschaften, die zu den oben beschriebenen
Produkten analog sind, erhalten werden.