WO2011148116A2 - Acide hyaluronique modifie, procede de fabrication et utilisations - Google Patents

Acide hyaluronique modifie, procede de fabrication et utilisations Download PDF

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WO2011148116A2
WO2011148116A2 PCT/FR2011/051228 FR2011051228W WO2011148116A2 WO 2011148116 A2 WO2011148116 A2 WO 2011148116A2 FR 2011051228 W FR2011051228 W FR 2011051228W WO 2011148116 A2 WO2011148116 A2 WO 2011148116A2
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grafting
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Carole Schante
Guy Zuber
Thierry Vandamme
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Laboratoire Idenov
Universite De Strasbourg
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Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid polymer, or hyaluronic acid, modified, to a process for producing this polymer, and to uses of the modified hyaluronic acid.
  • the present invention finds particular applications in the fields of cosmetics, therapeutic areas and reconstructive surgery.
  • references in brackets [] refer to the list of references at the end of the text.
  • Aging is a natural phenomenon that every individual and animal is confronted with. It is inevitably accompanied by a decrease in the cellular activity of the human or animal body which leads to a series of disorders leading up to certain serious pathologies.
  • Another type of treatment consists of injections of active ingredients into the skin of the face.
  • botulinum toxin called Botox
  • Botox works by blocking the contraction of the muscles of the face and thus the appearance of wrinkles. This technique is not natural, it can cause adverse effects.
  • another technique which consists in injecting under the skin of the face so-called filling substances. The role of these substances is to fill the sagging parts of the face by creating a volume under the skin. Through this mechanical effect, the skin is tightened and the wrinkles smoothed, leading to a younger aspect of the face.
  • hyaluronic acid used in dermatology. It is injected into the dermis to restore facial volume and fill wrinkles as described in Kogan, G. et al. (2007) [1]. It has the advantage of being absorbable in case of bad injection and without side effects even after being injected for several years. These injections, due to their gradual disappearance as a result of the degradation of the polymer constituents, must be repeated at regular intervals, usually 6 to 12 months, in order to maintain a filling action. Unfortunately, the residence time of the hyaluronic acid is very short and its elimination is done in a few days, as described in the document Laurent, T. & Fraser (1992) [2]. Thus, hyaluronic acid and its effects are not fully satisfactory and this problem is found in other applications using this product.
  • poly-L-lactic acids or calcium hydroxyapatite spheres
  • the poly-L-lactic acids are synthetic and semi-absorbable. Unlike hyaluronic acid, they have a duration of action of several years because of their low rate of degradation after the moment of the injection. On the other hand, and this poses a problem, no method of correction is possible in the event of a bad injection.
  • Calcium hydroxyapatite spheres are non-absorbable substances. They remain at the beginning where they were injected, but they have the same disadvantage that poly-L-lactic acids can not be eliminated in case of bad injection or in case of migration after several years, as described in the document Athre, R. (2007) [3].
  • osteoarthritis Another pathology often related to age is osteoarthritis. It results in the degeneration of the cartilage composing the joints and causes extremely painful lesions and functional discomfort.
  • Existing treatments include the use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and corticosteroids to relieve pain and slow the progression of the disease.
  • Injection of hyaluronic acid is also used as a treatment against osteoarthritis, as described in Frenkel, S. & Di Cesare, P. (2004) [4].
  • ⁇ is for example injected into the knee joint to restore, thanks to its filling action, the volume between the bony ends and thus lubricate the joints, as described in document [4] above.
  • Cataract is a very common ocular pathology that causes a gradual decline in vision, discomfort with bright lights and color vision problems caused by opacity of the lens of the eye.
  • the only current treatment is the surgical replacement of the opacified lens by an intraocular implant.
  • This act of cataract surgery is very delicate and requires the use of hyaluronic acid to protect ocular tissues and replace fluid losses from vitreous humor, as described in Liesegang, T. (1990) [5]. ].
  • problems related to the instability of this product are also encountered for this application.
  • urinary incontinence Another disorder that also occurs with age, and particularly among women who have had one or more pregnancies, is urinary incontinence. This disorder results from a weakening of the musculature and connective tissues of the pelvic floor.
  • urinary incontinence results from a weakening of the musculature and connective tissues of the pelvic floor.
  • several possibilities can be envisaged, namely, palliative treatments, physiotherapy exercises or surgical procedures.
  • An existing treatment is also the intra-urethral injection of hyaluronic acid. These injections into the mucosa of the urethra strengthen its thickness and reduces the volume of urinary leakage as described in Dmochowski, R. & Appell, R. (2000) [6].
  • the instability of hyaluronic acid is penalizing for the treatment in question.
  • Dermo-aesthetics, arthrology, ophthalmology, urology are examples of the first cosmetic or therapeutic applications of hyaluronic acid as an injection filling agent due to its highly viscoelastic properties and high hydration.
  • hyaluronic acid improves wound healing thanks to its pro-inflammatory properties and by facilitating the migration and proliferation of cells as described in Chen, W. & Abatangelo, G. (1999) [7]. It is also used as an active agent delivery vector. In oncology, it has also been demonstrated that certain oligomers of specific size inhibit the growth of tumor cells, as described in Zeng, C. et al. (1998) [8].
  • Hyaluronic acid is therefore a product used for many cometic or therapeutic applications because of its exceptional physicochemical properties. Unfortunately, it has the aforementioned drawbacks.
  • hyaluronic acid In the body and in solution at physiological pH, hyaluronic acid is negatively charged and is in the form of sodium salt. It is a very hydrophilic polymer capable of surrounding itself with 1000 molecules of water by hydrogen bonds, forming a highly hydrated sphere, as described in document Laurent, T. & Fraser (1992) [2]. These characteristics give it particular rheological properties: a high viscoelasticity and a viscosity strongly dependent on the speed (“shear-dependent"). Hyaluronic acid is also a major component of the extracellular matrix in vertebrates.
  • hyaluronic acid serves as a matrix in which cells are securely embedded.
  • the role of hyaluronic acid is defined by the size of its chain.
  • High molecular weight HAs (10 6 -10 8 Da) are anti-angiogenic, as described in Feinberg, R. (1983) [11] and immunosuppressive whereas smaller polymers (10-20kDa) are angiogenic as described in West D et al. [12] and Stern, R et al. (2004) [13], immunostimulatory and inflammatory, as described in Stern, R et al. (2006) [14].
  • the first methods of producing hyaluronic acid have been carried out by isolation from animal and human tissues, eg vitreous humor, umbilical cord, as described in document
  • hyaluronic acid The degradation of hyaluronic acid occurs naturally in the body by an enzymatic mechanism involving hyaluronidases and CD44 membrane receptors, as described in Knudson, W. et al. (2002) [20]. Due to this natural enzymatic degradation in the body, hyaluronic acid presents the major disadvantage of being very quickly degraded after injection at the desired sites.
  • the enzyme recognition sites are -COOH groups of ⁇ , as described in Banerji, S. et al. (2007) [21].
  • the carbonyl of the N-acetyl group of ⁇ serves as a nucleophile for the hydrolysis of the glycoside linkage ⁇ (1, 4) between N-acetylglucosamine and d-glucuronic acid, as described in the documents Jedrzejas, MJ (2005) [22] and Chen, F. et al. (2009) [23].
  • HA There are two types of chemical modifications of HA: the first type is the grafting of simple molecules onto one or more functional groups of HA.
  • the other type of chemical modification of HA is the grafting of bifunctional molecules that react with two chains of hyaluronic acid to bind them together. This other type is in fact a crosslinking which results in the formation of a crosslinked gel.
  • Crosslinking consists in forming covalent bonds between the chains polymers.
  • the crosslinking makes it possible to form a crosslinked, rigid, elastic gel which hydrates and swells in water. This crosslinked gel is less easily accessible to enzymes than native hyaluronic acid in solution and its rigidity improves its volume loss filling properties.
  • Crosslinking of HA has also been proposed using chloromethylpyridinium iodide (CMPI) as described in Magnani, A. et al. (2000) [33], or di-epoxides such as butane diol-diglycidyl ether (BDDE), as described in WO 86/000079 [34] and WO 02/006350 [35].
  • CMPI chloromethylpyridinium iodide
  • BDDE butane diol-diglycidyl ether
  • crosslinking alone does not sufficiently stabilize the HA and we find substantially the same problems as those mentioned above. Indeed, the crosslinked gels obtained by this method, sold in particular under the names of Juvéderm
  • crosslinking agents are diamine or dihydrazide type molecules.
  • the crosslinking by these molecules is done on the -COOH groups with the formation of an amide bond and requires a first activation step by activators such as carbodiimides (EDC), as described in Kuo et al. (1991) [28] and Bulpitt, P. & Aeschlimann (1999) [29].
  • EDC carbodiimides
  • the present invention is specifically intended to meet this need by providing a modified hyaluronic acid. It is hyaluronic acid modified by the grafting on it of one or more amino acid (s). This modification makes it possible, surprisingly, to reduce the enzymatic degradation of the polymer and thus to reduce its degradation rate and to prolong its duration of action.
  • the present invention relates to a hyaluronic acid modified by the grafting thereon of at least one amino acid.
  • hyaluronic acid may have, for example, a molecular weight of 2,000 Daltons (2 KDa) to 3 million Daltons (3 MDa), preferably a molecular weight ranging from 0.5 to 2.5 Md.
  • a molecular weight of 2 KDa corresponds to a sequence of 4 times the dissacharide base forming hyaluronic acid,
  • the grafting of the amino acid can be carried out by its amine or carboxyl group.
  • the grafting of the amino acid can be carried out by any technique known to those skilled in the art for grafting an amino acid having in particular -COOH and -NH 2 functions , on a polymer having -COOH and / or N-acetyl functions. and / or -OH.
  • the amino acid is grafted by its amine group on a -COOH group of hyaluronic acid.
  • any of the means known to those skilled in the art can be used to form an amide bond between the amine group of the amino acid and the carboxylic group of AH, for example with the aid of an activator of the carboxyl groups.
  • the activator makes it possible to make the carbon of the carboxyl group of the HA more electrophilic, which will therefore be very reactive with respect to the amine group of the molecule to be grafted.
  • the activator may be a condensing agent for example a pyridinium salt such as 2-chloro-1-methylpyridinium described in Magnani, A. et al. (2000) [33].
  • Another activator may be for example a carbodiimide as described in Bulpitt, P. & Aeschlimann (1999) [29] or a triazine derivative as described in Bergman et al. (2007) [32].
  • the present invention therefore also relates to a method for producing a modified hyaluronic acid according to the invention comprising a grafting of an amino acid in ester form on hyaluronic acid.
  • the amino acid can also be grafted by its carboxyl group on the -OH groups of AH.
  • any of the means known to those skilled in the art can be used to carry out an esterification, for example with a halogenating agent, for example thionyl chloride (SOCI2).
  • SOCI2 thionyl chloride
  • the present invention therefore also relates to a process for producing a modified hyaluronic acid according to the invention comprising a grafting of an amino acid in free or protected form on its amine group by a protective group, for example chloroformate (Fmoc) or trifluoroacetyl (TFA), on the hydroxyl groups of AH.
  • a protective group for example chloroformate (Fmoc) or trifluoroacetyl (TFA), on the hydroxyl groups of AH.
  • the amino acid can also be grafted by its carboxyl group on an N-acetyl group of AH.
  • the N-acetyl group can undergo deacetylation to obtain an amine group and then an amidation reaction can be carried out on the -COOH group (s) of the amino acid.
  • the present invention thus also relates to a method for producing a modified hyaluronic acid according to the invention comprising a grafting of an amino acid in protected form on its amine group by a protective group, for example chloroformate (Fmoc ) or trifluoroacetyl (TFA), on the N-acetyl groups of the HA after deacetylation.
  • a protective group for example chloroformate (Fmoc ) or trifluoroacetyl (TFA)
  • the amino acid can also be grafted by its amine group on the -OH groups of AH with the aid of a crosslinking agent, for example a di-epoxide, which reacts on the one hand with the -OH groups. of the HA and on the other hand with the group (s) amine (s) of the amino acid.
  • a crosslinking agent for example a di-epoxide, which reacts on the one hand with the -OH groups. of the HA and on the other hand with the group (s) amine (s) of the amino acid.
  • the present invention therefore also relates to a method for producing a modified hyaluronic acid according to the invention comprising a grafting of an amino acid in free form on the hydroxyl groups of AH using a crosslinking agent.
  • the modified HA of the present invention may further be crosslinked. This makes it possible to obtain a more rigid gel that swells in water.
  • This crosslinked gel can be obtained from hyaluronic acid modified by grafting one or more amino acid (s) according to the present invention.
  • the modified HA of the present invention may be crosslinked by one of the methods known in the art for crosslinking HA. This may be for example one of the methods described in the documents Magnani, A. et al. (2000) [33], WO 86/000079 [34] and WO 98/600912 [36] replacing the hyaluronic acid used in these documents by hyaluronic acid grafted with amino acids.
  • a crosslinking with butanediol diglycidyl ether can advantageously be used.
  • This method of crosslinking with BDDE is indeed used for the majority of the commercial products of hyaluronic acid, as described in Sali, I. et al. (2007) [38], because these cross-links with BDDE have the advantage of being in a single simple step and the safety of the resulting products has been widely demonstrated.
  • the crosslinking with BDDE is done on the hydroxyl groups of the AH to form ether bonds, while in acidic medium, it is done on the carboxyl groups.
  • the hyaluronic acid may also be cross-linked before the grafting of the amino acid (s) thereon.
  • the crosslinking processes that can be used are described above.
  • the methods of grafting the usable amino acids are described above.
  • the modification according to the invention of hyaluronic acid can be carried out with or without crosslinking, and when it is carried out with crosslinking, this modification can be carried out before, during or after the crosslinking of HA.
  • the methods that can be used are described above.
  • the present invention thus also relates to a modified hyaluronic acid polymer according to the invention, said polymer being obtained by one of the methods defined above.
  • the modified AH can be crosslinked.
  • the amino acid may be a natural or non-natural amino acid.
  • the hyaluronic acid can be modified by homogeneous grafting, with a single amino acid, or heterogeneous, with a mixture of two or more different amino acids.
  • glycine or glycine alanine, beta-alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, phenylalanine, proline, hydroxyproline, cysteine, cystine, tyrosine, tryptophan, threonine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, lysine and ornithine. It can be D or L forms, preferably L forms.
  • the amino acid is an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, ⁇ -alanine, serine, arginine, aspartic acid, tyrosine, asparagine, glutamine, the acid glutamic, threonine, or phenylalanine.
  • the grafting of these amino acids makes it possible to obtain modified hyaluronic acids that are more stable with respect to enzymatic degradation.
  • the present invention also relates to a modified hyaluronic acid polymer according to the invention for use as a medicament.
  • the present invention also relates to the use of a modified hyaluronic acid polymer according to the invention for the manufacture of a medicament.
  • the medicament according to the invention may be hyaluronic acid alone or in combination with other suitable substances for formulating the medicament according to the chosen route of administration.
  • the modified AH according to the invention may be, for example, a medicament for treating osteoarthritis, cancer, cataract, urinary incontinence or to improve wound healing.
  • the documents Athre, R. (2007) [3]; Frenkel, S. & Di Cesare, P. (2004) [4]; Liesegang, T. (1990) [5]; Dmochowski, R. & Appell, R. (2000) [6]; and Chen, W. & Abatangelo, G. (1999) [7] present examples of protocols usable for the practice of the present invention. Simply, the AH of the prior art used in the protocols described in these documents is replaced by the modified hyaluronic acid of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of a modified hyaluronic acid polymer according to the invention as a vector for the administration of an active principle.
  • the present invention also relates to a modified hyaluronic acid polymer according to the invention for use as a vector for the administration of an active principle.
  • the present invention also relates to the use of a modified hyaluronic acid according to the invention in one or as a cosmetic and / or aesthetic product.
  • the present invention relates to the use of the modified AH according to the invention as filling material and / or for to increase a body volume, it may be for example a use of the modified HA according to the invention as a wrinkle filling material. It may be for example a use of the modified HA according to the invention to increase the volume of a breast or a gluteal. This use is by simple injection of the modified hyaluronic acid of the present invention into the areas to be treated. The volume used depends in particular on the expected result. WO 86/000079 [34] and WO 02/006350
  • the present invention relates to cosmetic products, for example products for topical application or ingestible products, for example food supplements and / or nutrition.
  • topical applications ie for example skin and
  • the cosmetic composition according to the invention may for example be in the form of a cream, a lotion, a serum, an emulsion or any other form known to a person skilled in the art as being suitable to the chosen topical application.
  • the cosmetic composition of the present invention may comprise, for example, from 0.1% to 20% by weight of hyaluronic acid according to the invention for a total weight of 100 g of cosmetic product.
  • Ingestible products according to the invention for example food supplements and / or nutrition, it can be formulated in any form suitable for ingestion, for example in the form of capsule, capsule, tablet, powder, liquid. It may be, for example, an unmanageable anti-aging and / or moisturizing product and / or combating desiccation.
  • Hyaluronic acid may also be accompanied by other active ingredients in the ingestible products according to the invention. These other active ingredients may be, for example, selenium, prebiotics, antioxidants, Omega 3 and / or Omega 6, lycopene, phenolic antioxidants flavonoids and non-flavonoids, for example polyphenols, for example proanthocyanidins (OPC), etc.
  • the ingestible product according to the invention may for example be in the form of a Solgar capsule (trademark), for example hyaluronic acid 120 mg, a capsule Dermoline Hydric (trademark), Lt Labo, 'Natural Nutrition Hyaluronic acid capsule N'Juv (trademark), Solaray Hyaluronic acid capsule (trademark), Biocyte Microlift capsule (trademark) or Hyaluronic acid capsule Natrol (trademark), in which the hyaluronic acid is replaced in the same proportion, i.e. concentration, by the modified hyaluronic acid of the present invention.
  • a Solgar capsule for example hyaluronic acid 120 mg
  • a capsule Dermoline Hydric trademark
  • Lt Labo 'Natural Nutrition Hyaluronic acid capsule N'Juv
  • Solaray Hyaluronic acid capsule trademark
  • Biocyte Microlift capsule trademark
  • Hyaluronic acid capsule Natrol trademark
  • the ingestible product according to the invention may comprise, for example, from 10 to 300 mg of modified hyaluronic acid according to the invention for 100 gr of unmanageable product.
  • the present invention also relates to the use of a modified hyaluronic acid according to the invention in one or as a hydration product and / or antiallergic.
  • the modified AH of the present invention may be used alone or in a composition, for example a pharmaceutical composition, for example suitable for application to the mucous membranes, for example nasal membranes, for example for upholstering or covering the nasal walls. to prevent pollen from clinging to these walls and thus to prevent pollen from creating the allergic phenomenon.
  • the modified hyaluronic acid of the present invention may represent in this product from 0.1 to 100%.
  • Nozair nasal spray trademark
  • the modified hyaluronic acid of the present invention has a stability beyond 18 months.
  • FIG. 1 represents the unmodified hyaluronic acid molecule of the prior art and the modified hyaluronic acid molecules according to the invention in an example after grafting glycine.
  • FIG. 2 represents the mechanism according to the invention of grafting reaction of glycine tert-butyl ester (Gly tBu) on hyaluronic acid in organic medium with chloromethyl pyridinium iodide (CMPI) as an activator.
  • Gly tBu glycine tert-butyl ester
  • CMPI chloromethyl pyridinium iodide
  • FIG. 3 represents the hyaluronic acid molecules before and after chemical modification by grafting an amino acid R according to the present invention.
  • FIG. 4 represents the mechanism according to the invention of grafting reaction of an amino acid R with hyaluronic acid.
  • FIG. 5 shows the H-NMR spectra of 1 glycine tert butyl ester (1) of the unmodified hyaluronic acid (2), the HA-glycine tert butyl ester (3) and HA-glycine (4).
  • the x-axis represents the chemical shift of the protons.
  • FIG. 6 represents the results of the in vitro enzymatic degradation test carried out on the non-hyaluronic acid molecules. modified (HA nm), on hyaluronic acid grafted with glycine tBu (HAgly tBu) and with glycine (HA-gly).
  • the ordinate axis corresponds to the concentration of N-acetyl glucosamine ends formed in mM (C (mM)) and the abscissa axis corresponds to the incubation time in hours with the enzyme (T (h)).
  • Figure 7 shows the 1 H NMR spectra of serine ethyl ester (1), unmodified hyaluronic acid (2) and HA-serine (3).
  • FIG. 8 represents the results of the enzymatic degradation test in vitro carried out on the molecules of unmodified hyaluronic acid (HA nm), on hyaluronic acid grafted with serine (HA-ser) at different grafting levels.
  • the ordinate axis corresponds to the concentration of N-acetyl glucosamine ends formed in mM (C (mM)) and the abscissa axis corresponds to the incubation time in hours with the enzyme (T (h)).
  • FIG. 9 represents the results of the in vitro enzymatic degradation test carried out on the molecules of unmodified hyaluronic acid (HA nm), on the hyaluronic acid grafted with glycine at 100% (HA-gly 100%), on hyaluronic acid grafted with arginine 70% (HA-arg 70%), on hyaluronic acid grafted with alanine 100% (HA-ala 100%) on hyaluronic acid grafted with aspartic acid 55% (HA-asp 55%), hyaluronic acid grafted with tyrosine 75% (HA-tyr 75%) and hyaluronic acid grafted with 100% serine (HA-ser 100%) .
  • the ordinate axis corresponds to the concentration of N-acetyl glucosamine ends formed in mM (C (mM)) and the abscissa axis corresponds to the incubation time in hours with the enzyme (T (h)).
  • ninhydrin test is carried out This test is derived from the method described in Romberg et al. (2005) [41]. It is a ninhydrin colorimetric test that detects primary and non-secondary amines and thus confirms the grafting of the amino acid by covalent bonding.
  • the tubes are heated in a water bath at 100 ° C for 15 minutes and then allowed to cool to room temperature. 600 ⁇ of 50% ethanol are added to each tube and the absorbance is determined using a UV-Vis spectrometer at 570 nm.
  • Hyaluronic acid in the form of sodium salt (purchased from Sigma Aldrich Brand Fluka Reference 53747 Lot 1351058 Molecular weight 1. 58MDa) is previously converted in its acid form (HA-COOH) and then in the form of tetrabutylammonium salt ( HA-TBA) by dialysis according to the method described in the document by Barbucci et al. (2006) [42].
  • the method used for the grafting of glycine to the tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid is derived from the method described in Magnani et al. (2000) [33] who crosslinked hyaluronic acid with a diamine with carboxylic groups.
  • the mechanism of the reaction is shown schematically in Figures 2 and 4 attached.
  • This first method is carried out in an organic medium in dimethylformamide (DMF).
  • the first step is the formation of the tetrabutyl ammonium salt (TBA) which allows the solubilization of ⁇ in the organic DMF medium.
  • TSA tetrabutyl ammonium salt
  • 100 mg (0.167 mmol) of tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid are dissolved in 25 ml of dimethylformamide (DMF) under argon for 6 hours. The entire reaction is performed under argon to minimize the risk of hydrolysis reagents.
  • the amino acid in the esterified form is first added, a test with tert-butyl ester and a test with the glycine ethyl ester, then the activator of the groups.
  • the reaction is catalyzed by 140 L (1 mmol) of triethylamine.
  • the reaction is initiated by the addition of this triethylamine, a base which will neutralize the H1 and HCl acids formed.
  • the product obtained is diluted in 30 ml of water and then dialyzed against water to remove DMF and excess reagents.
  • Dialysis against water is continued against a solution of NaCl (which may be replaced by NaOH) to remove the ions and reform the sodium salt.
  • Dialysis against NaOH makes it possible to eliminate the tert-butyl or ethyl group from the esterified amino acid. This dialysis against NaOH is carried out with a 0.1 M NaOH solution for 48 h and then against Milli-Q water containing 25% ethanol for 48 h and then against pure Milli-Q water for 48 h.
  • Dialysis against NaOH makes it possible to eliminate the tert-butyl group from grafted glycine, so a part is dialysed against a solution 0.1 M NaCl instead of NaOH in order to be able to determine the glycine grafting rate by 1 H-NMR thanks to the characteristic peak of tert-butyl.
  • the solution is lyophilized to obtain a dry product.
  • the freeze-drying method is as follows: all of the solution obtained after dialysis (approximately 50 ml) is pre-distributed in a 250 ml capacity flask and then frozen for 5 to 10 minutes in liquid nitrogen and the flask is then fixed on a freeze-dryer. CHRIST ALPHA 2-4 LSC 12780. Lyophilization is carried out at 0.2mbar and 25 ° C for 24 hours.
  • the NMR-H1 spectrum indicates the appearance of a new peak corresponding to the tert-butyl group of glycine for the product dialyzed against NaCl (tet-butyl ⁇ -glycine is obtained) and this peak disappears when the product is dialyzed against NaOH ( gets ⁇ -glycine).
  • the peak is identified, which makes it possible to calculate the grafting rate. With this method of synthesis, grafting rates of up to 100% are obtained according to the amounts of activator and base used.
  • the tert-butyl peak obtained in this example indicates a degree of grafting of 100%, as represented in the attached FIG. 5, spectrum No. 3.
  • the elimination of tBu is clearly observed.
  • the product obtained is analyzed with a ninhydrin colorimetric test (ninhydrin test described above) which detects the primary and non-secondary amines and thus confirms the grafting of the amino acid by covalent bonding. Indeed, the results show that 99.5% of glycine detected by 1 H-NMR are grafted covalently on the HA.
  • the method used for the grafting of glycine in aqueous medium to the sodium salt of hyaluronic acid is derived from the method described in Bulpitt, P. et al. (1999) [29], in which molecules were grafted onto hyaluronic acid by their amine function on the carboxylic groups to allow crosslinking by difunctional crosslinking agents.
  • the method used here uses the same activator and the same base but other coupling molecules that will not be used for crosslinking.
  • the grafting method was carried out in an aqueous medium with carbodiimide (1-ethyl-3- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide, EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) as the base as activator.
  • the first step of this second method is the dissolution of ⁇ in the form of sodium salt in water.
  • the esterified amino acid, EDC and NHS are then added after adjusting the pH to neutral pH to allow the reaction and to avoid the risk of hydrolysis of the carbodiimide.
  • the pH is adjusted to 7.5 with 1M NaOH solution 460mg (4mmol) N-hydroxysuccinimide (NHS) and 768mg (4mmol) 1-ethyl-3- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide ( EDC) are dissolved in 1 mL of Milli-Q water and then poured onto the hyaluronic acid solution.
  • the pH is maintained at 7.50 by adding a 1M solution of NaOH. After standing overnight at room temperature, the product obtained is dialyzed against a solution of 0.1 M NaOH for 4 hours and then against a NaCl solution. 0.1 M for 24 hours then against Milli-Q water for 72h.
  • Dialysis is then performed against water to remove excess reagents. Dialysis is continued against a solution of NaCl or NaOH to remove the ions formed. Dialysis against NaOH makes it possible to eliminate the ethyl group from the grafted esterified amino acid (or tert-butyl if the latter is used).
  • Example 2 After dialysis, the solution is lyophilized to obtain a dry product.
  • the lyophilization method is identical to that of Example 1. After lyophilization, 373,7mg product is obtained which is then analyzed by H-NMR spectrometry 1.
  • the NMR spectrum makes it possible to calculate a degree of grafting of approximately 10%.
  • the method used for the grafting of glycine in an aqueous medium to the protonated form of hyaluronic acid is derived from the method described by Bergman et al. (2007) [32] grafted on acid hyaluronic molecules by their amino function on carboxylic groups for the formation of new biomaterials.
  • amino acid grafting was carried out in an aqueous medium comprising one third of acetonitrile to facilitate the solubilization of the reagents.
  • the activator used is 2-chloro-dimethoxy-1,3,5-triazine (CDMT) and the base is N-methylmorpholine.
  • the first step is the formation of the acid form of ⁇ from the sodium salt which is then dissolved in water and acetonitrile.
  • the esterified amino acid, the activator and then the base are then added.
  • hyaluronic acid in the form of sodium salt are dissolved in 400 ml of Milli-Q water.
  • An ion exchange resin (Dowex H +) is added until a pH of 2.5 is reached and the solution is stirred for 1 hour. The solution is then filtered and lyophilized. 1.8 g of hyaluronic acid are obtained in protonated form.
  • NMM N-methylmorpholine
  • Dialysis is then performed against water to remove acetonitrile and excess reagents. Dialysis is continued against a solution of NaCl or NaOH to remove the ions formed. Dialysis against NaOH makes it possible to eliminate the ethyl group from the esterified amino acid. For dialysis against NaOH, after stirring for 1 hour, the solution is filtered and then dialyzed for 4 hours against a 0.1 M sodium hydroxide solution and then for 72 hours against purified water.
  • the last step is lyophilization to obtain a dry product according to the same method as for Example 1.
  • About 10 mg of dry product are then dissolved in 650 ⁇ l of D 2 O to obtain a polymer solution at about 15.4 mg / ml to allow its proton nuclear magnetic resonance characterization ( 1 H NMR) with a Bruker NMR spectrometer 400 MHz.
  • the NMR spectrum makes it possible to calculate a grafting rate of about 20%.
  • the results of the ninhydrin test show that more than 99.5% of the glycine detected by 1 H-NMR are grafted covalently on the HA.
  • Example 2 For the grafting of serine, the protocol described in Example 1 was repeated identically with the exception of the following elements: 400 mg (0.66 mmol) of tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid are dissolved in 80 ml of DMF. 339.22 mg (2 mmol) of L-serine ethyl ester HCI then 510.96 mg (2 mmol) of CMPI are added.
  • the reaction is catalyzed by 560 ⁇ (4 mmol) of triethylamine. After allowing to stand overnight at room temperature, the product obtained is diluted in 80 ml of water and then dialyzed against a 0.1 M solution. NaOH for 8 h and then a solution at 0.1M NaCl for 40 h and then against Milli-Q water containing 25% ethanol for twice 8 h and then against pure Milli-Q water for 72 h. Dialysis against NaOH makes it possible to eliminate the ethyl group from serine.
  • Example 5 The protocol described in Example 5 was repeated identically with the exception of the following elements: 101.8 mg (0.6 mmol) of L-serine ethyl ester HCl and then 102.2 mg (0.4 mmol) of CMPI are added . The reaction is catalyzed by 140 ⁇ (1 mmol) of triethylamine.
  • test results ninhydrine show that more than 99.5% of L-serine detected by 1 H-NMR are grafted by covalent bonding to the HA.
  • Example 7 Grafting of 20% L-serine on Hyaluronic Acid in DMF The protocol described in Example 5 was repeated in identical manner with the exception of the following elements: 50.9 mg (0.3 mmol) of L-serine ethyl ester HCl and then 51.1 mg (0.2 mmol) of CMPI are added . The reaction is catalyzed by 70 ⁇ (0.5 mmol) of triethylamine.
  • test results ninhydrine show that more than 99.5% of L-serine detected by 1 H-NMR are grafted by covalent bonding to the HA.
  • Example 5 For the grafting of ⁇ -alanine, the protocol described in Example 5 was repeated identically with the exception of the following elements: 307.22mg (2mmol) of ⁇ -alanine ethyl ester HCI then 510.96mg (2mmol) ) of CMPI are added. The reaction is catalyzed by 560 ⁇ (4 mmol) of triethylamine.
  • test results ninhydrine show that more than 99.5% of the ⁇ -alanine detected by 1 H-NMR are grafted by covalent bonding to the HA.
  • Example 9 Grafting of Aspartic Acid on Hyaluronic Acid in DMF The protocol described in Example 6 was repeated identically with the exception of the following elements: 169 mg (0.6 mmol) of aspartic acid di-tert-butyl ester HCl are added. Dialysis against NaOH is 8 hours.
  • test results ninhydrine show that more than 99.5% of aspartic detected by 1 HNMR acid are grafted by covalent bonding to the HA.
  • Example 6 The protocol described in Example 6 was repeated identically with the exception of the following elements: 165 mg (0.6 mmol) of arginine ethyl ester diHCI are added. Dialysis against NaOH is 2 hours.
  • the results of the ninhydrin test show that more than 99.5% of the arginine detected by 1 H-NMR are grafted covalently on the HA.
  • Example 6 The protocol described in Example 6 was repeated identically with the exception of the following elements: 147.4 mg (0.6 mmol) of tyrosine ethyl ester HCl are added. Dialysis against NaOH is 2 hours.
  • Example 6 The protocol described in Example 6 was repeated in identical manner with the exception of the following elements: 134.8 mg (0.6 mmol) of asparagine tert-butyl ester HCl are added. Dialysis against NaOH is 8 hours.
  • results of the ninhydrin test show that more than 99.5% of the asparagine detected by 1 H-NMR are grafted covalently on the HA.
  • Example 6 The protocol described in Example 6 was repeated identically with the exception of the following elements: 137.8 mg (0.6 mmol) of 2.HCI phenylalanine ethyl ester are added. Dialysis against NaOH is 2 hours.
  • Example 6 The protocol described in Example 6 was repeated identically with the exception of the following elements: 101.8 mg (0.6 mmol) of threonine methyl ester 2.HCl are added. Dialysis against NaOH is 2 hours.
  • Each polymer modified according to the invention was tested by means of an enzymatic degradation test.
  • This test aims to determine the stability of the product obtained vis-à-vis an enzyme.
  • the colorimetric method used is that of Morgan-Elson: the color formed is proportional to the enzymatic degradation of ⁇ .
  • the principle of this The test is based on the determination of the NAG ends of ⁇ which form a colored product after reaction with DMAB. With this assay, the enzymatic stability of the modified polymers obtained relative to the initial unmodified polymer can be determined.
  • the modified polymers of the present invention showed improved enzyme stability as shown in the accompanying Figures 6 and 8.
  • the enzymatic degradation test carried out is derived from the method described in the document Muckenschnabel et al. (1998) [25].
  • borate solution (1.73 g of H3BO3 and 0.78 g of KOH in 10 ml of water mixed with 1 ml of water containing 0.8 g of K2CO3) are added to each tube.
  • the tubes are then heated in a water bath for 5 minutes and then put in an ice bath for 2 minutes. 0.75 ml of DMAB solution (0.8 g in 1 ml of concentrated HCl and 19 ml of glacial acetic acid) are added to each tube.
  • the absorbance is measured at 586 nm.
  • a hyaluronic acid reference solution alone is used at the same concentration as the samples.
  • the modified HAs obtained in the preceding examples are crosslinked with butanediol diglycidyl ether (BDDE).
  • BDDE butanediol diglycidyl ether
  • AH-serine obtained in Example 6 80 mg are weighed in a 50 ml centrifugation tube and dissolved in 0.8 ml of distilled water for 12 hours. After centrifugation for 4 minutes at 2500 rpm, a solution containing 30 L of glacial acetic acid and 15 L of BDDE is added to the AH solution. The tube is stirred with a vortex mixer for a few minutes and then centrifuged for 4 minutes at 2500 rpm. The tube is then heated in a water bath at 60 ° C for 4 hours. After heating, 25 ml of distilled water are added to the crosslinked gel obtained and then the whole is transferred to a dialysis membrane and then dialyzed for 4 days against purified water. The gel is then recovered on a filter and weighed.
  • AH sodium salt Sigma Aldrich (Fluka brand Reference 53747 Lot 1351058 Molecular weight 1. 58MDa) are weighed in a 50mL centrifuge tube. A solution containing 544mL of 1% NaOH solution and 10.4 ⁇ of BDDE is added to the HA powder. The tube is stirred with a vortex mixer for a few minutes and then centrifuged for 4 minutes at 2500 rpm. The tube is then heated in a water bath at 50 ° C for 1 hour. Then a solution containing 100 L of 1% NaOH solution and 169mg of serine ethyl ester is added to the tube. The heating is prolonged for 2 hours. After heating, 25 ml of distilled water are added to the crosslinked gel obtained and then the whole is transferred to a dialysis membrane and then dialyzed for 4 days against purified water. The gel is then recovered on a filter and weighed.
  • the face After having thoroughly disinfected the area to be treated, here the face, one can inject at the level of the wrinkles of the faces, by means of a glass syringe of 2mL capacity and a needle of size 21 G1 ⁇ 2 (or 27G1 ⁇ 2 or 30G1 ⁇ 2 according to the size of wrinkles), slowly in the deep or medium dermis or subcutaneously up to 2mL of crosslinked HA gel of 20mg / mL concentration modified according to the invention.
  • the injection must be done very slowly by a doctor who has received specific training for this application.
  • the injection is complete, gently massage the treated area and apply a soothing or healing cream to limit the appearance of edema
  • the HAs used are, for example, those modified with glycine, ⁇ -alanine, serine, arginine, aspartic acid, tyrosine, asparagine, threonine or phenylalanine.
  • Example 19 Increasing a body volume After having thoroughly disinfected the area to be treated, here the breast, can be injected into the breast, by means of a glass syringe and a needle size 21 G1 ⁇ 2, up to 100 ml per breast under local anesthesia allowing small increases or corrections of irregularity or waves. 100 ml correspond to a support pad grooves. The injection is done by puncture after application of a cream and local anesthesia.
  • the surgeon can place, using a fine cannula, the gel between the mammary gland and the pectoral muscle.
  • the injection must be done very slowly by a doctor who has received specific training for this application.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un acide hyaluronique modifié et à un procédé de fabrication de ce polymère. L'acide hyaluronique modifié de la présente invention est un acide hyaluronique modifié par greffage sur celui-ci d'au moins un acide aminé. La présente invention se rapporte également à de l'acide hyaluronique modifié pour une utilisation comme médicament pour traiter l'arthrose, le cancer, une incontinence urinaire, comme médicament utilisable en chirurgie oculaire ou pour améliorer la cicatrisation de plaies. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un acide hyaluronique modifié selon l'invention comme produit cosmétique et/ou esthétique. Dans toutes les applications cosmétiques et/ou dermatologiques connues de l'homme du métier où de l'AH est utilisé, on peut avantageusement remplacer l'AH de l'art antérieur par de l'acide hyaluronique modifié selon l'invention. Par exemple, la présente invention se rapporte à l'utilisation de l'AH modifié selon l'invention comme matériau de comblement et/ou pour augmenter un volume corporel, il peut s'agir par exemple d'une utilisation de l'AH modifié selon l'invention comme matériau de comblement de rides. Il peut s'agir par exemple d'une utilisation de l'AH modifié selon l'invention pour augmenter le volume d'un sein ou d'un fessier.

Description

ACIDE HYALURONIQUE MODIFIE, PROCEDE DE FABRICATION ET
UTILISATIONS
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un polymère d'acide hyaluronique, ou acide hyaluronique, modifié, à un procédé de fabrication de ce polymère, et à des l'utilisations de l'acide hyaluronique modifié.
La présente invention trouve notamment des applications dans les domaines de la cosmétique, les domaines thérapeutique et de la chirurgie réparatrice.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
Le vieillissement est un phénomène naturel auquel tout individu et animal est confronté. Il s'accompagne inévitablement d'une diminution de l'activité cellulaire du corps humain ou animal ce qui entraîne tôt au tard une série de troubles allant jusqu'à certaines pathologies graves.
Les signes les plus visibles de l'âge apparaissent au niveau du visage : la peau se détend et les premières rides apparaissent. De nombreuses solutions ont été développées pour tenter de ralentir l'apparition des ces signes de l'âge ou de réparer les signes déjà installés.
Parmi ces solutions, on peut mentionner les traitements par les crèmes anti-rides contenant des actifs rajeunissants. Un autre type de traitement consiste en des injections d'actifs dans la peau du visage. Parmi ces actifs injectés, la toxine botulique, appelée Botox, agit en bloquant la contraction des muscles du visage et donc l'apparition des rides. Cette technique n'étant pas naturelle, elle peut entraîner des effets indésirables. Egalement pour pallier à l'apparition de ces rides, on peut mentionner une autre technique qui consiste à injecter sous la peau du visage des substances dites de comblement. Le rôle de ces substances est de combler les parties affaissées du visage en créant un volume sous la peau. Par cet effet mécanique, la peau est retendue et les rides lissées, conduisant à un aspect plus jeune du visage.
Parmi ces substances de comblement, il en existe des naturelles et résorbables, qui s'éliminent naturellement après injection. Par exemple, on peut citer l'acide hyaluronique (AH) utilisé en dermo- esthétique. Il est injecté dans le derme pour restaurer le volume du visage et combler les rides comme décrit dans le document Kogan, G. et al. (2007) [1 ]. Il présente l'avantage d'être résorbable en cas de mauvaise injection et sans effet secondaire même après avoir été injectées depuis plusieurs années. Ces injections, du fait de leur disparition progressive à la suite de la dégradation du polymère les constituants, doivent être répétées à intervalles réguliers, généralement de 6 à 12 mois, afin de maintenir une action de comblement. Malheureusement, le temps de résidence de l'acide hyaluronique est très court et son élimination se fait en quelques jours, comme décrit dans le document Laurent, T. & Fraser (1992) [2]. Ainsi, l'acide hyaluronique et ses effets ne sont pas pleinement satisfaisants et ce problème se retrouve dans d'autres applications utilisant ce produit.
D'autres substances, par exemple les acides poly-L-lactiques ou les sphères d'hydroxyapatite de calcium, ont été utilisées, les acides poly- L-lactiques sont synthétiques et semi-résorbables. Contrairement à l'acide hyaluronique, ils ont une durée d'action de plusieurs années du fait de leur faible vitesse de dégradation après le moment de l'injection. En revanche, et cela pose problème, aucune méthode de correction n'est possible en cas de mauvaise injection. Les sphères d'hydroxyapatite de calcium sont quant à elles des substances non-résorbables. Elles restent au début là où elles ont été injectées, mais elles ont le même inconvénient que les acides poly-L-lactiques de ne pas pouvoir être éliminées en cas de mauvaise injection ou en cas de migration après plusieurs années, comme décrit dans le document Athre, R. (2007) [3].
Une autre pathologie souvent liée à l'âge est l'arthrose. Elle se traduit par la dégénérescence du cartilage composant les articulations et provoque des lésions extrêmement douloureuses et une gêne fonctionnelle. Les traitements existants consistent en l'utilisation d'anti- inflammatoires non stéroïdiens et de corticoïdes afin de calmer la douleur et de ralentir l'évolution de la maladie. L'injection d'acide hyaluronique est également utilisée comme traitement contre l'arthrose, comme décrit dans le document Frenkel, S. & Di Cesare, P. (2004) [4]. En arthrologie, ΙΉΑ est par exemple injecté dans l'articulation du genou pour restaurer, grâce à son action de comblement, le volume entre les extrémités osseuses et lubrifier ainsi les articulations, comme décrit dans le document [4] précité.
Avec l'âge, les troubles oculaires deviennent aussi plus fréquents. La cataracte est une pathologie oculaire très courante qui entraine une baisse progressive de la vue, une gêne face aux lumières vives et des troubles de la vision des couleurs provoqués par une opacité du cristallin de l'œil. Le seul traitement actuel est le remplacement chirurgical du cristallin opacifié par un implant intraoculaire. Cet acte de chirurgie de la cataracte est très délicat et nécessite l'utilisation d'acide hyaluronique pour protéger les tissus oculaires et remplacer les pertes de fluide de l'humeur vitrée, comme décrit dans le document Liesegang, T. (1990) [5]. Cependant, les problèmes liés à l'instabilité de ce produit sont également rencontrés pour cette application.
Un autre trouble qui apparaît également avec l'âge et en particulier chez les femmes ayant eu une ou plusieurs grossesses est l'incontinence urinaire. Ce trouble provient d'un affaiblissement de la musculature et des tissus conjonctifs du plancher pelvien. Pour y remédier, plusieurs possibilités peuvent être envisagées, à savoir, traitements palliatifs, exercices de kinésithérapie ou actes chirurgicaux. Un traitement existant est également l'injection intra-urétrale d'acide hyaluronique. Ces injections dans la muqueuse de l'urètre renforcent son épaisseur et permet de diminuer le volume des fuites urinaires comme décrit dans le document Dmochowski, R. & Appell, R. (2000) [6]. Là aussi, l'instabilité de l'acide hyaluronique est pénalisante pour le traitement en question.
La dermo-esthétique, l'arthrologie, l'ophtalmologie, l'urologie sont des exemples des premières applications cosmétiques ou thérapeutiques de l'acide hyaluronique en tant qu'agent de comblement par injection dues à ses propriétés hautement viscoélastiques et son haut pouvoir d'hydratation.
D'autres applications thérapeutiques ont également été développées. En effet, l'acide hyaluronique améliore la cicatrisation des plaies grâce à ses propriétés pro-inflammatoires et en facilitant la migration et la prolifération des cellules comme décrit dans le document Chen, W. & Abatangelo, G. (1999) [7]. Il est aussi utilisé en tant que vecteur d'administration de principes actifs. En oncologie, il a aussi été démontré que certains oligomères de taille spécifique inhibent la croissance de cellules tumorales, comme décrit dans le document Zeng, C. et al. (1998) [8].
L'acide hyaluronique est donc un produit utilisé pour de nombreuses applications cométique ou thérapeutiques et ce, en raison de ses propriétés physico-chimiques exceptionnelles. Malheureusement, il présente les inconvénients précités.
Dans le corps et en solution à pH physiologique, l'acide hyaluronique est chargé négativement et se trouve sous forme de sel de sodium. C'est un polymère très hydrophile, capable de s'entourer de 1000 molécules d'eau par liaisons hydrogène, formant une sphère hautement hydratée, comme décrit dans le document Laurent, T. & Fraser (1992) [2]. Ces caractéristiques lui confèrent des propriétés rhéologiques particulières : une haute viscoélasticité et une viscosité fortement dépendante de la vitesse (« shear-dependant »). L'acide hyaluronique est en outre un composant majeur de la matrice extracellulaire chez les vertébrés. Sa concentration est plus élevée dans certains tissus, notamment dans le liquide synovial et le cartilage des articulations, le derme et l'humeur aqueuse et vitrée de l'œil comme décrit dans le document Fraser, J., Laurent, T. & Laurent, U. (1997) [9]. Dans le liquide synovial, sa haute viscosité lui confère le rôle de lubrifiant et d'absorbeur de chocs, comme décrit dans les documents car déjà cité [2] et Goa, K. & Benfield et al. (1994) [10].
L'un des nombreux rôles de l'acide hyaluronique est son rôle structural, il sert de matrice dans laquelle les cellules sont solidement encastrées. Le rôle de l'acide hyaluronique est défini par la taille de sa chaîne. Les HA à hauts poids moléculaires (106-108Da) sont anti- angiogéniques, comme décrit dans le document Feinberg, R. (1983) [1 1] et immunosuppresseurs tandis que les polymères plus petits (10-20kDa) sont angiogéniques, comme décrit dans les documents West D et al. [12] et Stern, R et al. (2004) [13], immunostimulants et inflammatoires, comme décrit dans le document Stern, R et al. (2006) [14].
Les premières méthodes de production de l'acide hyaluronique ont été réalisées par isolation à partir de tissus animaux et humains, par exemple humeur vitrée, cordon ombilical, comme décrit dans le document
Kaye M. et al. (1950) [15], la méthode la plus utilisée étant par extraction de crêtes de coq. Actuellement, il est obtenu par fermentation bactérienne, ce qui minimise les risques d'allergie et la contamination par les endotoxines, comme décrit dans les documents Shiedlin, A et al. (2004) [16], Vâzquez, J. et al. (2009) [17], Kim, J. et al. (1996) [18] et dans le brevet américain US 5,41 1 ,874 [19].
La dégradation de l'acide hyaluronique se fait naturellement dans le corps par un mécanisme enzymatique impliquant les hyaluronidases et les récepteurs membranaires CD44, comme décrit dans le document Knudson, W. et al. (2002) [20]. En raison de cette dégradation enzymatique naturelle dans le corps, l'acide hyaluronique présente l'inconvénient majeur d'être très rapidement dégradé après injection aux sites désirés.
Les sites de reconnaissance de l'enzyme sont les groupements -COOH de ΙΉΑ, comme décrit dans le document Banerji, S. et al. (2007) [21 ]. Le carbonyle du groupement N-acétyle de ΙΉΑ sert de nucléophile pour l'hydrolyse de la liaison glycosidique β(1 ,4) entre le N- acétylglucosamine et l'acide d-glucuronique, comme décrit dans les documents Jedrzejas, M.J. (2005) [22] et Chen, F. et al. (2009) [23].
Pour quantifier la dégradation enzymatique de l'acide hyaluronique, plusieurs méthodes in vitro ont été étudiées, comme exposé dans le document Alkrad, J.A. et al. (2003) [24]. Une de ces méthodes repose sur le principe selon lequel la fragmentation de ΙΉΑ par les hyaluronidases se fait au niveau des liaisons glycosides β(1 ,4), ce qui augmente le nombre d'extrémités N-acétyl-glucosamine (NAG). Ce sont ces extrémités NAG qui peuvent donc servir d'indicateurs de la dégradation enzymatique. Le test colorimétrique de Morgan-Elson dose les extrémités NAG et permet ainsi de quantifier la dégradation enzymatique, comme décrit dans le document Muckenschnabel, I. et al. (1998) [25].
De nombreuses méthodes de modifications chimiques ont été étudiées en vue de diminuer la vitesse de dégradation de l'acide hyaluronique afin de prolonger son temps de résidence dans les tissus après injection. Ces modifications chimiques peuvent être réalisées sur les trois groupements fonctionnels de l'acide hyaluronique : les groupements carboxyle, hydroxyle et N-acétyl.
II existe deux types de modifications chimiques de l'AH : le premier type est le greffage de molécules simples sur un ou plusieurs groupements fonctionnels de l'AH. L'autre type de modification chimique de l'AH est le greffage de molécules bifonctionnelles qui réagissent avec deux chaînes d'acide hyaluronique pour les relier entre elles. Cet autre type est en fait une réticulation qui aboutie à la formation d'un gel réticulé.
La réticulation consiste à former des liaisons covalentes entre les chaînes polymères. La réticulation permet de former un gel réticulé, rigide, élastique qui s'hydrate et gonfle dans l'eau. Ce gel réticulé est moins facilement accessible aux enzymes que l'acide hyaluronique natif en solution et sa rigidité améliore ses propriétés de comblement de pertes de volume.
Certains auteurs ont décrits une modification chimique de ΙΉΑ par les groupements hydroxyles, en greffant par exemple des molécules comprenant une fonction aminé. Il se produit une réaction d'alkylation. Pour cette réaction d'alkylation le bromure de cyanogène a été utilisé pour activer les groupements hydroxyles comme décrit dans le document Micochova et al. (2006) [26]. L'AH ainsi modifié n'a cependant pas démontré de meilleure stabilité par rapport au produit de départ. La modification chimique par cette méthode n'a donc pas permis d'améliorer la stabilité de l'acide hyaluronique.
Certains auteurs ont modifié chimiquement ΙΉΑ par ses groupements carboxyles avec une molécule comprenant un groupement hydroxyl en utilisant une réaction d'estérification avec un alcool sous forme d'iodure ou de bromure comme décrit dans le document US 4,851 ,521 [27]. Les esters d'acides hyaluroniques obtenus ont démontré une meilleure stabilité vis-à-vis des hyaluronidases mais ont un caractère plus hydrophobe par rapport au polymère de départ et perdent donc la capacité d'absorber et de capturer l'eau, propriété nécessaire à l'activité thérapeutique souhaitée.
D'autres on modifié l'AH par une réaction d'amidation en utilisant une carbodiimide comme décrit dans le document Kuo et al.
(1991 ) [28] ou en utilisant le 1 -éthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)- carbodiimide (EDC) et le N-hydroxysuccinimide comme décrit dans le document Bulpitt, P. & Aeschlimann (1999) [29] ou encore le dihydrazide adipique (ADH) comme décrit dans le document Luo et al. (2000) [30]. Les molécules greffées sur l'acide hyaluronique sont respectivement le 1 ,6- diaminohexane, 1 ,4-diaminobutane et le poly(ethylene glycol)- propiodialdehyde. Ces greffages n'ont cependant pas permis d'obtenir un polymère plus stable vis-à-vis de la dégradation enzymatique.
Le document US 7,456,275 [31 ] décrit un greffage sur l'AH de co-polymères de type oxyde de polyéthylène - oxyde de polypropylène. Mais ces co-polymères greffés sont synthétiques et ne sont pas naturellement résorbables par l'organisme. Ce greffage supprime les propriétés de l'acide hyaluronique de départ d'être naturel et biorésorbable. Par ailleurs, aucune méthode de correction ne serait possible en cas de mauvaise injection du produit.
Le document Bergman et al. (2007) [32] décrit lui le greffage d'amines telles que le propylamine, l'aminoacetaldehyde dimethylacétal, la glycine ethyl ester, le furfurylamine et le 7-amino-4-methylcoumarine, en utilisant comme activateur des groupes carboxyles le 2-chloro-dimethoxy- 1 ,3,5-triazine comme dans le protocole décrit dans le document. Les molécules greffées sur l'acide hyaluronique avec cette technique n'ont cependant pas non plus permis d'obtenir un polymère plus stable vis-à-vis de la dégradation enzymatique.
La réticulation de l'AH a également été proposée en utilisant le chloro-methylpyridinium iodide (CMPI) comme décrit dans le document Magnani, A. et al. (2000) [33], ou des di-époxydes comme le butane diol- diglycidyle éther (BDDE), comme décrit dans les documents WO 86/000079 [34] et WO 02/006350 [35]. Mais la réticulation seule ne permet pas de stabiliser suffisamment l'AH et on retrouve sensiblement les mêmes problèmes que ceux précités. En effet, les gels réticulés obtenus par cette méthode, commercialisés notamment sous les noms de Juvéderm
(marque de commerce) ou Restylane (marque de commerce) ont une durée d'action allant de 6 à 12 mois seulement. Cette durée d'action est très courte et il est d'un grand intérêt de la prolonger.
D'autres agents de réticulation sont les molécules de type diamine ou encore dihydrazide. La réticulation par ces molécules se fait sur les groupements -COOH avec la formation d'une liaison amide et nécessite une première étape d'activation par des activateurs comme les carbodiimides (l'EDC), comme décrit dans les documents Kuo et al. (1991 ) [28] et Bulpitt, P. & Aeschlimann (1999) [29]. Les gels réticulés avec cette méthode n'ont pas aboutit à la commercialisation des produits du fait de l'absence d'amélioration par rapport aux gels déjà sur le marché et de la méthode de production qui est plus lourde.
Il existe donc un réel besoin d'une molécule alternative à l'acide hyaluronique qui soit plus stable et également utilisable, notamment dans toutes les applications cosmétique ou thérapeutiques citées ci-dessus.
Exposé de l'invention
La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin en fournissant un acide hyaluronique modifié. Il s'agit d'acide hyaluronique modifié par le greffage sur celui-ci d'un ou de plusieurs acide(s) aminé(s). Cette modification permet de manière surprenante de réduire la dégradation enzymatique du polymère et donc de diminuer sa vitesse de dégradation et de prolonger sa durée d'action.
Aussi, la présente invention se rapporte à un acide hyaluronique modifié par le greffage sur celui-ci d'au moins un acide aminé.
Selon l'invention, l'acide hyaluronique (AH) peut avoir par exemple un poids moléculaire de 2000 Daltons (2 KDa) à 3 millions de Daltons (3 MDa), de préférence un poids moléculaires allant de 0,5 à 2,5 MDa. Un poids moléculaire de 2 KDa correspond à un enchaînement de 4 fois le dissacharide de base formant l'acide hyaluronique,
Selon l'invention, le greffage de l'acide aminé peut être réalisé par son groupement amine ou carboxyle.
Le greffage de l'acide aminé peut être réalisé par toute technique connu de l'homme du métier pour greffer un acide aminé présentant notamment des fonctions -COOH et -NH2, sur un polymère présentant des fonctions -COOH et/ou N-acétyl et/ou -OH. Selon l'invention, de préférence, l'acide aminé est greffé par son groupement amine sur un groupement -COOH de l'acide hyaluronique. Pour cela, on peut utiliser l'un quelconque des moyens connus de l'homme du métier pour réaliser une liaison amide entre le groupement amine de l'acide aminé et le groupement carboxylique de l'AH, par exemple à l'aide d'un activateur des groupements carboxyles. L'activateur permet de rendre plus électrophile le carbone du groupement carboxyle de l'AH qui sera donc très réactif vis-à-vis du groupement amine de la molécule à greffer. L'activateur peut être un agent de condensation par exemple un sel de pyridinium comme le 2-chloro-1 -méthylpyridinium décrit dans le document Magnani, A. et al. (2000) [33]. Un autre activateur peut être par exemple une carbodiimide comme décrit dans le document Bulpitt, P. & Aeschlimann (1999) [29] ou un dérive de triazine comme décrit dans le document Bergman et al. (2007) [32].
Aussi, la présente invention se rapporte donc également à un procédé de fabrication d'un acide hyaluronique modifié selon l'invention comprenant un greffage d'un acide aminé sous forme d'ester sur de l'acide hyaluronique.
L'acide aminé peut aussi être greffé par son groupement carboxyle sur les groupements -OH de l'AH. Pour cela on peut utiliser l'un quelconque des moyens connus de l'homme du métier pour réaliser une estérification, par exemple avec un agent halogénant, par exemple le chlorure de thionyle (SOCI2).
Aussi, la présente invention se rapporte donc également à un procédé de fabrication d'un acide hyaluronique modifié selon l'invention comprenant un greffage d'un acide aminé sous forme libre ou protégée sur son groupement amine par un groupement protecteur, par exemple le chloroformate (Fmoc) ou le trifluoroacétyl (TFA), sur les groupements hydroxyles de l'AH.
L'acide aminé peut aussi être greffé par son groupement carboxyle sur un groupement N-acétyl de l'AH. Pour cela, par exemple, le groupement N-acétyl peut subir une déacétylation afin d'obtenir un groupement amine puis une réaction d'amidation peut être réalisée sur le ou les groupements -COOH de l'acide aminé.
Aussi, la présente invention se rapporte donc également à un procédé de fabrication d'un acide hyaluronique modifié selon l'invention comprenant un greffage d'un acide aminé sous forme protégée sur son groupement amine par un groupement protecteur, par exemple le chloroformate (Fmoc) ou le trifluoroacétyl (TFA), sur les groupements N- acétyl de l'AH après déacétylation.
L'acide aminé peut aussi être greffé par son groupement amine sur les groupements -OH de l'AH à l'aide d'un agent de réticulation, par exemple un di-époxyde, qui réagit d'une part avec les groupements -OH de l'AH et d'autre part avec le ou les groupement(s) amine(s) de l'acide aminé. On obtient ainsi un gel réticulé comprenant des molécules d'acides aminés greffé à l'AH.
Aussi, la présente invention se rapporte donc également à un procédé de fabrication d'un acide hyaluronique modifié selon l'invention comprenant un greffage d'un acide aminé sous forme libre sur les groupements hydroxyles de l'AH à l'aide d'un agent de réticulation.
A titre d'exemples de méthodes de greffage de l'acide aminé sur l'acide hyaluronique utilisable pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, on peut utiliser une méthode de greffage de l'acide aminé en milieu aqueux sur un sel de métal alcalin, par exemple de sodium, de l'acide hyaluronique à la manière du protocole décrit dans le document Bulpitt, P. & Aeschlimann (1999) [29], dans lequel des molécules ont été greffées sur l'acide hyaluronique par leur fonction amine sur les groupements carboxyliques. On peut utiliser également la méthode décrite dans le document Magnani, A. et al. (2000) [33]. On peut utiliser également une méthode de greffage de l'acide aminé en milieu aqueux sur une forme protonée de l'acide hyaluronique par la méthode décrite dans le document
Bergman et al. (2007) [32] qui ont greffé sur l'acide hyaluronique des molécules par leur fonction aminé sur les groupements carboxyliques pour la formation de nouveaux biomatériaux.
Selon l'invention, le AH modifié de la présente invention peut en outre être réticulé. Cela permet l'obtention d'un gel plus rigide et qui gonfle dans l'eau. Ce gel réticulé peut être obtenu à partir de l'acide hyaluronique modifié par greffage d'un ou de plusieurs acide(s) aminé(s) conformément à la présente invention.
L'AH modifié de la présente invention peut être réticulé par une des méthodes connues dans l'art antérieur pour réticuler de l'AH. Il peut s'agir par exemple d'une des méthodes décrites dans les documents Magnani, A. et al. (2000) [33], WO 86/000079 [34] et WO 98/600912 [36] en remplaçant l'acide hyaluronique utilisé dans ces documents par l'acide hyaluronique greffé par les acides aminés.
Selon l'invention, on peut utiliser également une méthode consistant à réaliser le greffage de l'acide aminé sur l'AH et simultanément une réticulation. On peut utiliser par exemple la méthode décrite dans le document Dickerson et al. US 5,677,276 (1997) [37].
Selon l'invention, une réticulation avec du butanediol diglycidyl éther (BDDE) peut avantageusement être utilisée. Cette méthode de réticulation avec la BDDE est en effet utilisée pour la majorité des produits commerciaux de l'acide hyaluronique, comme décrit dans le document Sali, I. et al. (2007) [38], car ces réticulations avec la BDDE présentent l'avantage de se faire en une seule étape simple et l'innocuité des produits résultants a été largement démontrée. En milieu basique, la réticulation avec la BDDE se fait sur les groupements hydroxyles de l'AH pour former des liaisons éthers, tandis qu'en milieu acide, elle se fait sur les groupements carboxyles. On peut utiliser par exemple les protocoles décrits dans le document Zhao, X. et al. (2007) [39] pour réticuler l'AH modifié de la présente invention. Des procédés de réticulation de l'acide hyaluronique avec la BDDE en milieu basique utilisable sur l'AH modifié de la présente invention sont également décrits par exemple dans les documents WO 86/000079 [34] et [36].
Selon l'invention, alternativement, l'acide hyaluronique peut également être réticulé avant le greffage du ou des acides aminés sur celui-ci. Les procédés de réticulation utilisables sont décrits ci-dessus. Les procédés de greffage des acides aminés utilisables sont décrits ci-dessus. Ainsi, la modification selon l'invention de l'acide hyaluronique peut être effectuée avec ou sans réticulation, et lorsqu'elle est réalisée avec réticulation, cette modification peut être réalisée avant, pendant ou après la réticulation de l'AH. Les procédés utilisables sont décrits ci-dessus.
La présente invention se rapporte donc également à un polymère d'acide hyaluronique modifié selon l'invention, ledit polymère étant obtenu par l'un des procédés définis ci-dessus.
Egalement, selon l'invention, l'AH modifié peut être réticulé.
Quel que soit le procédé utilisé, selon l'invention, l'acide aminé peut être un acide aminé naturel ou non naturel.
Selon l'invention, l'acide hyaluronique peut être modifié par un greffage homogène, avec un seul acide aminé, ou hétérogène, avec un mélange de deux, voire plus, acides aminés différents.
Parmi les acides aminés naturels, on peut citer la glycine ou glycocolle, l'alanine, la béta-alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la sérine, la méthionine, la phénylalanine, la proline, l'hydroxyproline, la cystéine, la cystine, la tyrosine, le tryptophane, la thréonine, l'histidine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'arginine, la lysine et l'ornithine. Il peut s'agir des formes D ou L, de préférence des formes L.
Selon l'invention, de préférence, l'acide aminé est un acide aminé choisi dans le groupe comprenant la glycine, l'alanine, β-alanine, sérine, arginine, acide aspartique, tyrosine, asparagine, la glutamine, , l'acide glutamique, thréonine, ou phénylalanine. En effet, le greffage de ces acides aminés permet d'obtenir des acides hyaluroniques modifiés plus stables vis-à-vis de la dégradation enzymatique.
La présente invention se rapporte également à un polymère d'acide hyaluronique modifié selon l'invention pour une utilisation comme médicament. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un polymère d'acide hyaluronique modifié selon l'invention pour la fabrication d'un médicament.
Le médicament selon l'invention peut être de l'acide hyaluronique seul ou combiné à d'autres substances appropriées pour formuler le médicament suivant la voie d'administration choisie. L'AH modifié selon l'invention peut être par exemple un médicament pour traiter l'arthrose, le cancer, la cataracte, une incontinence urinaire ou pour améliorer la cicatrisation de plaies. Les documents Athre, R. (2007) [3] ; Frenkel, S. & Di Cesare, P. (2004) [4] ; Liesegang, T. (1990) [5] ; Dmochowski, R. & Appell, R. (2000) [6] ; et Chen, W. & Abatangelo, G. (1999) [7] présentent des exemples de protocoles utilisables pour la mise en œuvre la présente invention. Simplement, on remplace l'AH de l'art antérieur utilisé dans les protocoles décrits dans ces documents par l'acide hyaluronique modifié de la présente invention.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un polymère d'acide hyaluronique modifié selon l'invention comme vecteur d'administration d'un principe actif. La présente invention se rapporte également à un polymère d'acide hyaluronique modifié selon l'invention pour une utilisation comme vecteur d'administration d'un principe actif. Pour cette mise en œuvre, on peut par exemple procéder comme décrit dans le document Esposito et al. (2005) [40].
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un acide hyaluronique modifié selon l'invention dans un ou comme produit cosmétique et/ou esthétique.
Par exemple, la présente invention se rapporte à l'utilisation de l'AH modifié selon l'invention comme matériau de comblement et/ou pour augmenter un volume corporel, il peut s'agir par exemple d'une utilisation de l'AH modifié selon l'invention comme matériau de comblement de rides. Il peut s'agir par exemple d'une utilisation de l'AH modifié selon l'invention pour augmenter le volume d'un sein ou d'un fessier. Cette utilisation se fait par simple injection de l'acide hyaluronique modifié de la présente invention dans les zones à traiter. Le volume utilisé dépend notamment du résultat escompté. Les documents WO 86/000079 [34] et WO 02/006350
[35] donnent des exemples de protocoles utilisables pour mettre en œuvre la présente invention pour ces applications, dans lesquels on remplace donc l'AH de l'art antérieur par l'AH modifié de la présente invention.
Par exemple aussi, la présente invention se rapporte à des produits cosmétiques, par exemple des produits pour application topique ou des produits ingérables, par exemple des compléments alimentaires et/ou de nutrition.
Pour les applications topiques, c'est-à-dire par exemple peau et
/ ou cheveux, la composition cosmétique selon l'invention peut être par exemple sous la forme d'une crème, d'une lotion, d'un sérum, d'une émulsion ou toute autre forme connue de l'homme du métier comme convenant à l'application topique choisie. La composition cosmétique de la présente invention peut comprendre par exemple de 0,1 % à 20% en poids d'acide hyaluronique selon l'invention pour un poids total de 100 gr de produit cosmétique.
Les produits ingérables selon l'invention, par exemple des compléments alimentaires et / ou de nutrition, il peuvent être formulé sous toute forme appropriée pour leur ingestion, par exemple sous forme de gellule, capsule, tablette, poudre, liquide. Il peut s'agir par exemple d'un produit ingérable anti-age et / ou hydratant et / ou de lutte contre le désèchement. L'acide hyaluronique peut être acompagné également d'autres actifs dans les produits ingérables selon l'invention. Ces autres actifs peuvent être par exemple du sélénium, un prébiotiques, un antioxydants, des Oméga 3 et / ou Oméga 6, du lycopène, des composés phénoliques antioxydants flavonoïdes et non-flavonoïdes, par exemple des polyphénols, par exemple de proanthocyanidines (OPC), etc.
Le produit ingérable selon l'invention peut se présenter par exemple sous la forme d'une capsule Solgar (marque de commerce), par exemple acide hyaluronique 120 mg, d'une capsule Dermoline Hydric (marque de commerce), de Lt Labo, d'une capsule acide Hyaluronique N'Juv (marque de commerce) de Natural Nutrition, d'une capsule acide Hyaluronique de Solaray (marque de commerce), d'une gélule Microlift de Biocyte (marque de commerce) ou d'une capsule acide Hyaluronique de Natrol (marque de commerce), dans laquelle l'acide hyaluronique est remplacé dans la même proportion, c'est-à-dire concentration, par l'acide hyaluronique modifié de la présente invention.
Quels que soient sa forme et les principes actifs éventuellement présents à côté de l'acide hyalurique modifié selon la présente invention, le produit ingérable selon l'invention peut comprendre par exemple de 10 à 300 mg d'acide hyaluronique modifié selon l'invention pour 100 gr de produit ingérable.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un acide hyaluronique modifié selon l'invention dans un ou comme produit d'hydratation et/ou antiallergique. Dans cette utilisation, l'AH modifié de la présente invention peut être utilisé seul ou dans une composition, par exemple une composition pharmaceutique, par exemple adaptée pour une application sur les muqueuses, par exemple nasales, par exemple pour tapisser ou recouvrir les parois nasales afin d'empêcher le pollen de s'accrocher sur ces parois et donc d'empêcher le pollen de créer le phénomène allergique. L'acide hyaluronique modifié de la présente invention peut représenter dans ce produit de 0,1 à 100%. Il peut s'agir par exemple d'une composition comme celle du spray nasal Nozoair (marque de commerce) dans laquelle l'acide hyaluronique est remplacé, dans les mêmes proportions, par l'acide hyaluronique modifié de la présente invention. Selon l'invention, dans toutes les applications connues de l'homme du métier où de l'AH est utilisé, qu'elles soient cosmétiques et/ou dermatologiques et/ou d'hydratation et/ou antiallergique, on peut avantageusement, selon la présente invention, remplacer l'AH par de l'acide hyaluronique modifié selon l'invention.
L'acide hyaluronique modifié de la présente invention présente une stabilité allant au-delà de 18 mois.
D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemple ci-dessous, donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
La figure 1 représente la molécule d'acide hyaluronique non modifiée de l'art antérieur et les molécules d'acide hyaluronique modifiées selon l'invention dans un exemple après greffage de la glycine.
La figure 2 représente le mécanisme selon l'invention de réaction de greffage de la glycine tert butyl ester (Gly tBu) sur l'acide hyaluronique en milieu organique avec le chloro-méthyle pyridinium iodide (CMPI) comme activateur.
La figure 3 représente les molécules d'acide hyaluronique avant et après modification chimique par le greffage d'un acide aminé R selon la présente invention.
La figure 4 représente le mécanisme selon l'invention de réaction de greffage d'un acide aminé R sur l'acide hyaluronique.
La figure 5 représente les spectres RMN-H1 de la glycine tert butyl ester (1 ), de l'acide hyaluronique non modifié (2), de l'HA-glycine tert butyl ester (3) et de l'HA-glycine (4). L'axe des abscisses représente le déplacement chimique des protons.
- La figure 6 représente les résultats du test de dégradation enzymatique in vitro réalisé sur les molécules d'acide hyaluronique non modifié (HA nm), sur l'acide hyaluronique greffé avec la glycine tBu (HA- gly tBu) et avec la glycine (HA-gly). L'axe des ordonnées correspond à la concentration en extrémités N-acetyl glucosamine formées en mM (C(mM)) et l'axe des abscisses correspond à la durée d'incubation en heures avec l'enzyme (T(h)).
La figure 7 représente les spectres RMN-H1 de la sérine ethyl ester (1 ), de l'acide hyaluronique non modifié (2) et de l'HA-sérine (3).
La figure 8 représente les résultats du test de dégradation enzymatique in vitro réalisé sur les molécules d'acide hyaluronique non modifié (HA nm), sur l'acide hyaluronique greffé avec la sérine (HA-ser) à différents taux de greffage. L'axe des ordonnées correspond à la concentration en extrémités N-acetyl glucosamine formées en mM (C(mM)) et l'axe des abscisses correspond à la durée d'incubation en heures avec l'enzyme (T(h)).
- La figure 9 représente les résultats du test de dégradation enzymatique in vitro réalisé sur les molécules d'acide hyaluronique non modifié (HA nm), sur l'acide hyaluronique greffé avec la glycine à 100% (HA-gly 100%), sur l'acide hyaluronique greffé avec l'arginine à 70% (HA- arg 70%), sur l'acide hyaluronique greffé avec l'alanine 100% (HA-ala 100%) sur l'acide hyaluronique greffé avec l'acide aspartique à 55% (HA- asp 55%), sur l'acide hyaluronique greffé avec la tyrosine à 75% (HA-tyr 75%) et sur l'acide hyaluronique greffé avec la sérine à 100% (HA-ser 100%). L'axe des ordonnées correspond à la concentration en extrémités N-acetyl glucosamine formées en mM (C(mM)) et l'axe des abscisses correspond à la durée d'incubation en heures avec l'enzyme (T(h)).
EXEMPLES Après chaque greffage d'acides aminés réalisés dans les exemples ci-dessous, le test de la ninhydrine suivant est réalisé Ce test est dérivé de la méthode décrite dans le document Romberg et al. (2005) [41 ]. Il s'agit d'un test colorimétrique à la ninhydrine qui permet de détecter les aminés primaires et non secondaires et qui confirme ainsi le greffage de l'acide aminé par liaison covalente.
Dans le test utilisé ici, après l'ensemble des protocoles de greffage réalisés : 100μΙ_ d'échantillon d'AH greffé avec l'acide aminé, 100μΙ_ de tampon acétate 1 M pH 5,5 puis 200μΙ_ de solution de ninhydrine (0,20g de ninhydrine + 0,03g d'hydrindantine + 7,5ml_ de 2- methoxyéthanol + 2,5ml_ tampon sodium acétate 4M à pH 5,5) sont prélevés et ajoutés à un microtube.
Après agitation, les tubes sont mis à chauffer au bain-marie à 100°C pendant 15 minutes puis laissés à refroidir à température ambiante. 600μΙ_ d'éthanol à 50% sont ajoutés à chaque tube et l'absorbance est déterminée à l'aide d'un spectromètre UV-Visible à 570nm.
Des échantillons contenant l'acide aminé seul, à différentes concentrations, sont utilisés comme références.
Exemple 1 : Greffage de la glycine sur l'acide hyaluronique en milieu organique avec le CMPI
L'acide hyaluronique (HA) sous forme de sel de sodium (acheté chez Sigma Aldrich Marque Fluka Référence 53747 Lot 1351058 Poids moléculaire 1 ,58MDa) est préalablement transformé sous sa forme acide (HA-COOH) puis sous forme de sel de tétrabutylammonium (HA-TBA) par dialyse selon la méthode décrite dans le document de Barbucci et al. (2006) [42].
La méthode utilisée pour le greffage de la glycine sur le sel de tétrabutylammonium de l'acide hyaluronique est dérivée de la méthode décrite dans le document Magnani et al. (2000) [33] qui ont réticulé l'acide hyaluronique avec une diamine par les groupements carboxyliques. Le mécanisme de la réaction est représenté schématiquement sur les figures 2 et 4 annexées.
Dans le procédé utilisé ici :
Cette première méthode est réalisée en milieu organique dans le diméthylformamide (DMF). La première étape est la formation du sel de tétrabutyl ammonium (TBA) qui permet la solubilisation de ΙΉΑ dans le milieu organique DMF. 100mg (0,167mmol) de sel de tétrabutylammonium d'acide hyaluronique sont dissous dans 25ml_ de diméthylformamide (DMF) sous argon pendant 6h. L'ensemble de la réaction est réalisé sous argon pour réduire le plus possible les risques d'hydrolyse des réactifs.
Après avoir refroidi la solution dans un bain de glace, on ajoute d'abord l'acide aminé sous forme estérifiée, un test avec du tert butyl ester et un test avec l'éthyl ester de la glycine, puis l'activateur des groupements -COOH, le 2-chloro-1 -methylpyridinium iodide (CMPI). 83,8mg (0,5mmol) de glycine tert-butyl ester HCI puis 127,76mg (0,5mmol) de 2-chloro-1 - methylpyridinium iodide (CMPI) sont ajoutés.
La réaction est catalysée par 140 L (1 mmol) de triéthylamine. La réaction est initiée par l'ajout de ce triéthylamine, une base qui va neutraliser les acides Hl et HCI formés. Après avoir laissé agir pendant une nuit à température ambiante, le produit obtenu est dilué dans 30mL d'eau puis une dialyse est ensuite réalisée contre de l'eau pour éliminer le DMF et les réactifs en excès. La dialyse contre de l'eau est poursuivie contre une solution de NaCI (qui peut être remplacée par du NaOH) pour éliminer les ions et reformer le sel de sodium. La dialyse contre NaOH permet d'éliminer le groupement tert butyl ou éthyl de l'acide aminé estérifié. Cette dialyse contre NaOH est réalisée avec une solution à 0,1 M NaOH pendant 48h puis contre l'eau Milli-Q contenant 25% d'éthanol pendant 48h puis contre de l'eau Milli-Q pure pendant 48h.
La dialyse contre NaOH permet d'éliminer le groupement tert- butyl de la glycine greffée, donc une partie est dialysée contre une solution à 0,1 M NaCI au lieu de NaOH pour pouvoir déterminer le taux de greffage de glycine par RMN-H1 grâce au pic caractéristique du tert-butyl.
Après dialyse, la solution est lyophilisée pour obtenir un produit sec. La méthode de lyophilisation est la suivante : la totalité de la solution obtenue après dialyse (environ 50mL) est préalablement répartie dans un ballon de capacité 250mL puis congelée pendant 5 à 10 minutes dans de l'azote liquide puis le ballon est fixé sur un lyophilisateur CHRIST ALPHA 2-4 LSC 12780. La lyophilisation est réalisée à 0,2mbar et 25°C pendant 24 heures.
Suivant ce protocole, on obtient 27,5mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1. Pour cela, environ 10mg de produit sec sont dissouts dans 650 L de D2O pour obtenir une solution de polymère à concentration connue, d'environ 15,4mg/mL, pour permettre sa caractérisation par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN-H1) avec un spectromètre RMN Bruker 400MHz.
Le spectre RMN-H1 indique l'apparition d'un nouveau pic correspondant au groupement tert butyl de la glycine pour le produit dialysé contre NaCI (on obtient ΙΉΑ-glycine tert butyl) et ce pic disparaît lorsque le produit est dialysé contre NaOH (on obtient ΙΉΑ-glycine). Sur le spectre RMN on identifie le pic, ce qui permet de calculer le taux de greffage. Avec cette méthode de synthèse, on obtient des taux de greffage allant jusqu'à 100% selon les quantités d'activateur et de base utilisées.
Le pic du tert butyl obtenu dans cet exemple indique un taux de greffage de 100%, comme représenté sur la figure 5 annexée, spectre n°3. Sur le spectre de ΙΉΑ-glycine dialysé contre NaOH on observe bien l'élimination du tBu.
Le produit obtenu est analysé avec un test colorimétrique à la ninhydrine (test de la ninhydrine décrit ci-dessus) qui détecte les aminés primaires et non secondaires et qui confirme ainsi le greffage de l'acide aminé par liaison covalente. En effet, les résultats montrent que 99,5% de la glycine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 2 : Greffage de glycine sur l'acide hyaluronique en milieu aqueux avec l'EDC
La méthode utilisée pour le greffage de la glycine en milieu aqueux sur le sel de sodium de l'acide hyaluronique est dérivée de la méthode décrite dans le document Bulpitt, P. et al. (1999) [29], dans lequel des molécules ont été greffées sur l'acide hyaluronique par leur fonction amine sur les groupements carboxyliques pour permettre la réticulation par des agents de réticulation bifonctionnels.
La méthode utilisée ici utilise le même activateur et la même base mais d'autres molécules de couplage qui ne serviront pas pour la réticulation. Dans cette méthode, la méthode de greffage a été réalisée en milieu aqueux avec comme activateur une carbodiimide (le 1 -éthyl-3-(3- dimethylamino-propyl)-carbodiimide, EDC) et le N-hydroxysuccinimide (NHS) comme base.
La première étape de cette deuxième méthode est la dissolution de ΙΉΑ sous forme de sel de sodium dans l'eau. On ajoute ensuite l'acide aminé estérifié, l'EDC et le NHS après ajustement du pH à pH neutre pour permettre la réaction et éviter les risques d'hydrolyse de la carbodiimide.
Pour cela, 400mg (1 mmol de disaccharide) de sel de sodium d'acide hyaluronique sont saupoudrés lentement sur 132mL d'eau Milli-Q. La dissolution dure une heure. 2,094g (15mmol) de glycine éthyl ester HCI sont ajoutés.
Le pH est ajusté à 7,5 avec une solution de NaOH à 1 M. 460mg (4mmol) de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 768mg (4mmol) de 1 -éthyl-3- (3-dimethylamino-propyl)-carbodiimide (EDC) sont dissous dans 1 mL d'eau Milli-Q puis versés sur la solution d'acide hyaluronique. Le pH est maintenu à 7,50 en ajoutant une solution de NaOH 1 M. Après avoir laissé agir pendant une nuit à température ambiante, le produit obtenu est dialysé contre une solution à 0,1 M NaOH pendant 4h puis contre une solution de NaCI 0,1 M pendant 24 heures puis contre de l'eau Milli-Q pendant 72h.
Une dialyse est ensuite réalisée contre de l'eau pour éliminer les réactifs en excès. La dialyse est poursuivie contre une solution de NaCI ou de NaOH pour éliminer les ions formés. La dialyse contre NaOH permet d'éliminer le groupement éthyl de l'acide aminé estérifié greffé (ou tert butyl si ce dernier est utilisé).
Après dialyse, la solution est lyophilisée pour obtenir un produit sec. La méthode de lyophilisation est identique que pour l'exemple 1 . Après lyophilisation, on obtient 373,7mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Pour cela, 10mg environ de produit sec sont dissouts dans
650 L de D2O, pour obtenir une solution de polymère à 15,4mg/mL environ, pour permettre sa caractérisation par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN-H1) avec un spectromètre RMN Bruker 400MHz.
Le spectre RMN permet de calculer un taux de greffage de 10% environ.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la glycine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA. Exemple 4 : Greffage de glycine sur l'acide hyaluronique en milieu aqueux avec l'acétonitrile et le CDMT
La méthode utilisée pour le greffage de la glycine en milieu aqueux sur la forme protonée de l'acide hyaluronique est dérivée de la méthode décrite par Bergman et al. (2007) [32] qui ont greffé sur l'acide hyaluronique des molécules par leur fonction aminé sur les groupements carboxyliques pour la formation de nouveaux biomatériaux.
Ici, le greffage d'acides aminés a été réalisé en milieu aqueux comprenant un tiers d'acétonitrile pour faciliter la solubilisation des réactifs. L'activateur utilisé est le 2-chloro-dimethoxy-1 ,3,5-triazine (CDMT) et la base est la N-methylmorpholine.
La première étape est la formation de la forme acide de ΙΉΑ à partir du sel de sodium que l'on dissout ensuite dans l'eau et l'acétonitrile. On ajoute ensuite l'acide aminé estérifié, l'activateur puis la base.
Pour cela, 2g (5mmol) d'acide hyaluronique sous forme de sel de sodium sont dissous dans 400mL d'eau Milli-Q. Une résine échangeuse d'ions (Dowex H+) est ajoutée jusqu'à obtenir un pH de 2,5 puis la solution est agitée pendant 1 heure. La solution est ensuite filtrée et lyophilisée. On obtient 1 ,8g d'acide hyaluronique sous forme protonée.
608mg d'HA sous forme protonée sont ensuite dissous dans
24mL d'eau Milli-Q puis 16mL d'acétonitrile sont ajoutés goutte à goutte puis 176 L (1 ,6mmol) de N-méthylmorpholine (NMM).
La solution est refroidie dans un bain de glace et 144mg (0,8mmol) de 2-chloro-4,5-dimethoxy-1 ,3,5-triazine (CDMT) sont ajoutés à la solution. Après une heure d'agitation magnétique, 223,32mg (1 ,6mmol) de glycine éthyl ester et 176 L de NMM sont ajoutés à la solution. Après 20 heures d'agitation à température ambiante, 2g de résine Dowex H+ sont ajoutés, après 1 heure d'agitation la solution est filtrée et 2 g de résine Dowex sous forme Na+ sont ajoutés.
Une dialyse est ensuite réalisée contre de l'eau pour éliminer l'acétonitrile et les réactifs en excès. La dialyse est poursuivie contre une solution de NaCI ou de NaOH pour éliminer les ions formés. La dialyse contre NaOH permet d'éliminer le groupement éthyl de l'acide aminé estérifié. Pour la dialyse contre NaOH, après 1 heure d'agitation la solution est filtrée puis dialysée pendant 4 heures contre une solution d'hydroxyde de sodium à 0,1 M puis pendant 72 heures contre de l'eau purifiée.
La dernière étape est la lyophilisation pour obtenir un produit sec selon la même méthode que pour l'exemple 1 . Environ 10mg de produit sec sont ensuite dissouts dans 650μΙ_ de D2O pour obtenir une solution de polymère à 15,4mg/mL environ pour permettre sa caractérisation par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN-H1) avec un spectromètre RMN Bruker 400MHz.
Sur le spectre RMN du proton, on identifie le pic du groupement éthyl, ce qui permet de calculer le taux de greffage.
Après lyophilisation, on obtient 546, 3mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Le spectre RMN permet de calculer un taux de greffage de 20% environ.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la glycine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 5 : Greffage de L-sérine à 100% sur l'acide hyaluronique dans le DMF
Pour le greffage de la sérine, le protocole décrit dans l'exemple 1 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 400mg (0,66mmol) de sel de tétrabutylammonium d'acide hyaluronique sont dissous dans 80mL de DMF. 339,22mg (2mmol) de L-sérine éthyl ester HCI puis 510,96mg (2mmol) de CMPI sont ajoutés.
La réaction est catalysée par 560μΙ_ (4mmol) de triéthylamine. Après avoir laissé agir pendant une nuit à température ambiante, le produit obtenu est dilué dans 80mL d'eau puis dialysé contre une solution à 0,1 M NaOH pendant 8h puis une solution à 0,1M NaCI pendant 40h puis contre l'eau Milli-Q contenant 25% d'éthanol pendant deux fois 8h puis contre de l'eau Milli-Q pure pendant 72h. La dialyse contre NaOH permet d'éliminer le groupement éthyl de la sérine.
Suivant cet exemple, on obtient 278, 8mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1. Les résultants sont présentés sur la figure 7, spectre n° 3.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu, le pic à environ 4,3ppm permet de calculer un taux de greffage approximatif de 100%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de
99,5% de la L-sérine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 6 : Greffage de L-sérine à 50% sur l'acide hyaluronique dans le DMF
Le protocole décrit dans l'exemple 5 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 101,8mg (0,6mmol) de L- sérine éthyl ester HCI puis 102,2mg (0,4mmol) de CMPI sont ajoutés. La réaction est catalysée par 140μΙ_ (1 mmol) de triéthylamine.
Suivant cet exemple, on obtient 237, 2mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 50%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la L-sérine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 7 : Greffage de L-sérine à 20% sur l'acide hyaluronique dans le DMF Le protocole décrit dans l'exemple 5 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 50,9mg (0,3mmol) de L- sérine éthyl ester HCI puis 51 ,1mg (0,2mmol) de CMPI sont ajoutés. La réaction est catalysée par 70μΙ_ (0,5mmol) de triéthylamine.
Suivant cet exemple, on obtient 234,5mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 20%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la L-sérine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 8 : Greffage de 3-alanine à 100% sur l'acide hyaluronique dans le DMF
Pour le greffage de la β-alanine, le protocole décrit dans l'exemple 5 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 307,22mg (2mmol) de β-alanine éthyl ester HCI puis 510,96mg (2mmol) de CMPI sont ajoutés. La réaction est catalysée par 560μΙ_ (4mmol) de triéthylamine.
Suivant cet exemple, on obtient 163,8mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 100%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la β-alanine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 9 : Greffage d'acide aspartique sur l'acide hyaluronique dans le DMF Le protocole décrit dans l'exemple 6 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 169mg (0,6mmol) d'acide aspartique di-tert butyl ester HCI sont ajoutés. La dialyse contre NaOH est de 8 heures.
Suivant cet exemple, on obtient 220, 8mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 55%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de l'acide aspartique détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 10 : Greffage d'arginine sur l'acide hyaluronique dans le DMF
Le protocole décrit dans l'exemple 6 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 165mg (0,6mmol) d'arginine éthyl ester diHCI sont ajoutés. La dialyse contre NaOH est de 2 heures.
Suivant cet exemple, on obtient 230, 3mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 70%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de l'arginine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 11 : Greffage de tyrosine sur l'acide hyaluronique dans le
DMF Le protocole décrit dans l'exemple 6 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 147,4mg (0,6mmol) de tyrosine éthyl ester HCI sont ajoutés. La dialyse contre NaOH est de 2 heures.
Suivant cet exemple, on obtient 283, 5mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1. Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 75%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la tyrosine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 12 : Greffage d'asparagine sur l'acide hyaluronique dans le DMF
Le protocole décrit dans l'exemple 6 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 134,8mg (0,6mmol) d'asparagine tert-butyl ester HCI sont ajoutés. La dialyse contre NaOH est de 8 heures.
Suivant cet exemple, on obtient 163,2mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 60 %.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de l'asparagine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 13 : Greffage de phénylalanine à 50% sur l'acide hyaluronique dans le DMF
Le protocole décrit dans l'exemple 6 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 137,8mg (0,6mmol) de phénylalanine éthyl ester 2.HCI sont ajoutés. La dialyse contre NaOH est de 2 heures.
Suivant cet exemple, on obtient 202,4mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 64%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la phenylalanine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA.
Exemple 14 : Greffage de thréonine sur l'acide hyaluronique dans le DMF
Le protocole décrit dans l'exemple 6 a été repris de manière identique à l'exception des éléments suivants : 101 ,8mg (0,6mmol) de thréonine méthyle ester 2.HCI sont ajoutés. La dialyse contre NaOH est de 2 heures.
Suivant cet exemple, on obtient 210,9mg de produit qui est ensuite analysé par spectrométrie RMN-H1.
Sur le spectre RMN-H1 obtenu permet de calculer un taux de greffage approximatif de 83%.
Les résultats du test de la ninhydrine montrent que plus de 99,5% de la thréonine détectée par RMN-H1 sont greffés par liaison covalente sur le HA. Exemple 15 : Test de dégradation enzymatique
Chaque polymère modifié selon l'invention a été testé au moyen d'un test de dégradation enzymatique. Ce test a pour objectif de déterminer la stabilité du produit obtenu vis-à-vis d'un enzyme. La méthode colorimétrique utilisée est celle de Morgan-Elson : la couleur formée est proportionnelle à la dégradation enzymatique de ΙΉΑ. Le principe de ce test repose sur le dosage des extrémités NAG de ΙΉΑ qui forment un produit coloré après réaction avec le DMAB. Grâce à ce dosage, on peut déterminer la stabilité enzymatique des polymères modifiés obtenus par rapport au polymère initial non modifié. Les polymères modifiés de la présente invention ont montré une meilleure stabilité enzymatique, comme montré sur les figures 6 et 8 annexées.
Le test de dégradation enzymatique effectué est dérivé de la méthode décrite dans le document Muckenschnabel et al. (1998) [25].
Dans le test utilisé ici : 200 μί d'échantillon et 50 μί de tampon à 0,2M de NaH2PO , 0,1 M de NaCI, 0,2mg/ml de sérum albumine bovin (BSA), pH 7,4 ajusté avec du NaOH sont ajoutés à un microtube de 1 ,5mL. 25 L de solution de hyaluronidase à 439 U/mg (4.10*6IU/mg) dans NaCI 0,9% (9 g/l) sont ajoutés aux microtubes sauf pour les échantillons témoins dans lesquels 25 L d'une solution de NaCI 0,9% (9 g/l) sont ajoutés. Pendant 4 à 48 heures, les tubes sont incubés à 37°C dans un bain-marie.
Après le temps d'incubation, 50 L de solution de borate (1 ,73g de H3BO3 et 0,78g de KOH dans 10ml d'eau mélangé à 1 mL d'eau contenant 0,8g de K2CO3) sont ajoutés à chaque tube.
Les tubes sont ensuite chauffés dans un bain-marie pendant 5 minutes puis mis dans un bain de glace pendant 2 minutes. Dans chaque tube sont ajoutés 0,75 mL de solution de DMAB (0,8g dans 1 mL de HCI concentré et 19mL d'acide acétique glacial).
Après 60 minutes d'incubation à température ambiante à l'abri de la lumière, l'absorbance est mesurée à 586nm.
Une solution de référence d'acide hyaluronique seul est utilisée à la même concentration que les échantillons.
Les résultats sont représentés sur les figures 6, 8 et 9 annexées. Ils montrent une diminution de la dégradation enzymatique in vitro pour les acides hyaluroniques ayant subi un greffage d'acide aminé. Ces résultats confirment les propriétés de stabilité améliorées de l'acide hyaluronique de la présente invention. Parmi les acides aminés greffés, à savoir glycine, β-alanine, sérine, arginine, acide aspartique, tyrosine, asparagine, thréonine, phenylalanine, c'est la sérine qui a montré la meilleure efficacité.
Exemple 16 : réticulation de l'AH modifié
Les AH modifiés obtenus aux exemples précédants sont réticulés avec le butanediol diglycidyl éther (BDDE).
80mg d'AH-sérine obtenu dans l'exemple 6 sont pesés dans un tube à centrifugation de 50mL et dissous dans 0,8mL d'eau distillée pendant 12 heures. Après centrifugation pendant 4 minutes à 2500rpm, une solution contenant 30 L d'acide acétique glacial et 15 L de BDDE est ajoutée sur la solution d'AH. Le tube est agité avec un agitateur à vortex pendant quelques minutes puis centrifugé pendant 4 minutes à 2500rpm. Le tube est ensuite chauffé au bain-marie à 60°C pendant 4 heures. Après le chauffage, 25mL d'eau distillée sont ajoutés sur le gel réticulé obtenu puis le tout est transférer dans une membrane de dialyse puis dialysé pendant 4 jours contre de l'eau purifiée. Le gel est ensuite récupéré sur un filtre et pesé.
On obtient 7,80g de gel d'AH-sérine réticulé.
Le même protocole a été réalisé avec l'AH non modifié et l'on obtient 3,27g de gel d'AH réticulé.
Exemple 17 : greffage de sérine et réticulation simultanée
La méthode utilisée est dérivée de la méthode décrite dans le document Dickerson et al. US 5,677,276 (1997) [37].
80mg de sel de sodium d'AH Sigma Aldrich (Marque Fluka Référence 53747 Lot 1351058 Poids moléculaire 1 ,58MDa) sont pesés dans un tube à centrifugation de 50mL. Une solution contenant 544mL de solution NaOH à 1 % et 10,4μΙ_ de BDDE est ajoutée sur la poudre d'AH. Le tube est agité avec un agitateur à vortex pendant quelques minutes puis centrifugé pendant 4 minutes à 2500rpm. Le tube est ensuite chauffé au bain-marie à 50°C pendant 1 heure. Puis une solution contenant 100 L de solution NaOH à 1 % et 169mg de sérine éthyl ester est ajouté dans le tube. Le chauffage est prolongé pendant 2 heures. Après le chauffage, 25mL d'eau distillée sont ajoutés sur le gel réticulé obtenu puis le tout est transférer dans une membrane de dialyse puis dialysé pendant 4 jours contre de l'eau purifiée. Le gel est ensuite récupéré sur un filtre et pesé.
On obtient 19,23g de gel d'AH-sérine réticulé.
Le même protocole a été réalisé sans l'ajout de sérine et l'on obtient 22,85g de gel d'AH réticulé.
Exemple 18 : comblement de rides
Après avoir désinfecté rigoureusement la zone à traiter, ici le visage, on peut injecter au niveau des rides du visages, au moyen d'une seringue en verre de contenance 2mL et d'une aiguille de taille 21 G½ (ou 27G½ ou 30G½ selon la taille des rides), lentement dans le derme profond ou moyen ou en sous-cutané jusqu'à 2mL de gel réticulé d'AH de concentration 20mg/mL modifié selon l'invention.
L'injection doit se faire très lentement par un médecin ayant reçu une formation spécifique pour cette application.
L'injection terminée, il faut masser doucement la zone traitée et appliquer une crème apaisante ou cicatrisante pour limiter l'apparition d'un oedème
Les HA utilisés sont par exemple ceux modifiés par la glycine, β-alanine, sérine, arginine, acide aspartique, tyrosine, asparagine, thréonine, ou phenylalanine.
Exemple 19 : augmentation d'un volume corporel Après avoir désinfecté rigoureusement la zone à traiter, ici le sein, on peut injecter au niveau du sein, au moyen d'une seringue en verre et d'une aiguille de taille 21 G½, jusqu'à 100 ml par sein sous anesthésie locale permettant de petites augmentations ou des corrections d'irrégularité ou de vagues. 100 ml correspondent à un coussinet de soutien gorges. L'injection se fait par piqûre après application d'une crème et anesthésie locale.
Par une micro incision, le chirurgien peut placer, à l'aide d'une fine canule, le gel entre la glande mammaire et le muscle pectoral. L'injection doit se faire très lentement par un médecin ayant reçu une formation spécifique pour cette application.
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Acide hyaluronique modifié par le greffage sur celui-ci d'au moins un acide aminé.
2. Acide hyaluronique modifié selon la revendication 1 , dans lequel l'acide aminé est greffé sur un groupement -COOH de l'acide hyaluronique.
3. Acide hyaluronique modifié selon la revendication 1 , ledit acide aminé étant obtenu par un greffage choisi dans le groupe comprenant un greffage de l'acide aminé sous forme d'ester sur l'acide hyaluronique ; un greffage de l'acide aminé sous forme libre ou protégée sur son groupement amine par un groupement protecteur sur les groupements hydroxyles de l'acide hyaluronique ; un greffage d'un acide aminé sous forme protégée sur son groupement amine par un groupement protecteur sur les groupements N-acétyl de l'acide hyaluronique après déacétylation ; un greffage d'un acide aminé sous forme libre sur les groupements hydroxyles de l'acide hyaluronique à l'aide d'un agent de réticulation ; ou un greffage de l'acide aminé sur l'acide hyaluronique et simultanément une réticulation de l'acide hyaluronique.
4. Acide hyaluronique modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'acide aminé est un acide aminé naturel ou non naturel.
5. Acide hyaluronique modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'acide aminé est un acide aminé choisi dans le groupe comprenant la glycine, β-alanine, sérine, arginine, acide aspartique, tyrosine, asparagine, thréonine et phenylalanine.
6. Acide hyaluronique modifié selon l'une quelconque des revendications précédente, ledit acide hyaluronique étant en outre réticulé.
7. Acide hyaluronique modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour une utilisation comme médicament.
8. Acide hyaluronique modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour une utilisation comme médicament pour traiter l'arthrose, le cancer, une incontinence urinaire, comme médicament utilisable en chirurgie oculaire ou pour améliorer la cicatrisation de plaies.
9. Acide hyaluronique modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour une utilisation comme comme vecteur d'administration d'un principe actif pour une délivrance transdermique.
10. Procédé de fabrication d'un acide hyaluronique modifié par greffage sur de l'acide hyaluronique d'au moins un acide aminé, ledit procédé comprenant un greffage choisi parmi un greffage de l'acide aminé sous forme d'ester sur l'acide hyaluronique ; un greffage de l'acide aminé sous forme libre ou protégée sur son groupement amine par un groupement protecteur sur les groupements hydroxyles de l'acide hyaluronique ; un greffage d'un acide aminé sous forme protégée sur son groupement amine par un groupement protecteur sur les groupements N- acétyl de l'acide hyaluronique après déacétylation ; un greffage d'un acide aminé sous forme libre sur les groupements hydroxyles de l'acide hyaluronique à l'aide d'un agent de réticulation ; ou un greffage de l'acide aminé sur l'acide hyaluronique et simultanément une réticulation de l'acide hyaluronique.
1 1 . Utilisation d'un acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme produit cosmétique et/ou esthétique.
12. Utilisation selon la revendication 1 1 comme matériau de comblement et/ou pour augmenter un volume corporel.
13. Utilisation selon la revendication 1 1 comme matériau de comblement de rides.
14. Utilisation selon la revendication 1 1 pour augmenter le volume d'un sein ou d'un fessier.
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