DE60009574T2

DE60009574T2 - Chondroitinsulfat aus lachsen

Info

Publication number: DE60009574T2
Application number: DE60009574T
Authority: DE
Inventors: Mitsuo Sapporo-shi Takai; Hiroyuki Sapporo-shi Kono
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-02
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2020-12-16
Also published as: EP1270599B1; EP1270599A1; KR20020086594A; JP2001247602A; NO20024146L; WO2001064756A1; DE60009574D1; CA2401704A1; NO20024146D0; US20030162744A1; EP1270599A4

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Chondroitinsulfat, von dem eine Nützlichkeit für verschiedene Zwecke in den Bereichen von Arzneimitteln, Kosmetika und Nahrungsmittelzusätzen erwartet wird.
Hintergrund
Bei einem Chondroitinsulfat handelt es sich um ein saures Mucopolysaccharid, das im Bindegewebe von Tieren enthalten ist. Es besteht aus einer wiederkehrenden Disaccharid-Struktur der D-Glucuronsäure und einem sulfierten N-Acetylgalactosamin, und es existieren verschiedene Isomere in Abhängigkeit von der Sulfierung einer Hydroxylgruppe des Zuckerbestandteils.
Bei den zu sulfierenden Stellen handelt es sich um die Hydroxylgruppen in den 2- und 3-Positionen der Glucuronsäure, einer Hydroxylgruppe in der 2-Position der Iduronsäure und den Hydroxylgruppen in den 4- und 6-Positionen des N-Acetylgalactosamins. Bei einer Chondroitinsulfatkette handelt es sich um ein lineares Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10⁴ bis 10⁵, welches als ein Proteogulykan in kovalenter Bindung an ein Kernprotein vorliegt. Generell kommt als eine natürlich vorkommende Chondroitinsulfatkette eine aus einer sich wiederholenden Einheit lediglich eines Typs von sulfiertem Disaccharid bestehende kaum jemals vor, sondern enthält diese vielmehr verschiedene Arten von sulfierten oder nicht-sulfierten Disacchariden in unterschiedlichen Verhältnissen.
Bei Chondroitinsulfat handelt es sich um eine Substanz, die zuerst bei sauren Mucopolysacchariden gefunden wurde. Im Jahre 1886 wurde sie von Fischer und Boedeker aus Knorpel isoliert und zunächst als Chondroitsäure bezeichnet. Später wurde festgestellt, dass diese einen Sulfatester enthält, und wurde daraufhin als Chondroitinsulfat bezeichnet. Dann wurde im Jahre 1951 von Meyer et al. festgestellt, dass ein Chondroitinsulfat drei Typen (A, B und C) umfasst und dass A und C in Knorpel vorhanden sind.
Als ein Proteoglykan mit einer Chondroitinsulfatkette existieren Aggrecan, Versican, Decholin und ähnliche. Ihre Funktionen sind jedoch in vielen Fällen unbekannt. Obschon die Wirksamkeit des Aglykans in der Kontrolle der Knorpelgewebefunktion oder die Anti-Zelladhäsions-Aktivität von Versican durch eine Chondrokinase-Behandlung vollständig verlorengeht, wird die Chondroitinsulfatkette nichtsdestotrotz als diese Aktivitäten aufweisend erachtet. Weiterhin wurde ein Chondroitinsulfat-Proteoglykan als ein neurotropher Faktor der Netzhaut-Neuronen und als ein Axon-verlängernder Faktor isoliert. Diese Aktivitäten gingen ebenfalls durch Chondrokinase-Behandlung verloren. Vor kurzem wurde auch berichtet, dass ein von einem Chondroitinsulfat stammendes Disaccharid die Aktivierung natürlicher Killerzellen unterdrückt. Darüber hinaus war schon vor dem Auftauchen des humanen Immunschwäche-Virus (HIV) bekannt, dass sulfierte Polysaccharide wie Chondroitinsulfate, Karrageen, Dextransulfate und ähnliches die Infizierung von Zellen mit einer großen Zahl von Viren wie dem Influenza-Virus, Herpes simplex-Virus und ähnlichen hemmen.
Da demnach verschiedenartige physiologische Aktivitäten und Eigenschaften beim Chondroitinsulfat festgestellt wurden, wurde es in Arzneimitteln wie entzündungshemmenden Mitteln und ähnlichem, außerdem in Kosmetika oder Augenlotionen als Benetzungsmittel und in Nahrungsmittelzusätzen, z.B. als Gelbildner, Geliermittel und ähnliches, verwendet. In Molkereiprodukten ist es bei einem unerwartet breiten Bereich zu finden. Über diese herkömmlichen Anwendungen hinaus wird aufgrund seiner Eigenschaften ein latenter Nutzwert als Arzneimittel für verschiedene Zwecke erwartet.
Das derzeit in der ärztlichen Versorgung oder ähnlichen Bereichen verwendete Chondroitinsulfat umfasst ein aus Walknorpel extrahiertes Chondroitinsulfat A (ChS-A, Chondroitin-4-sulfat), und ein aus einer Haifischflosse extrahiertes Chondroitinsulfat C (ChS-C, Chondroitin-6-sulfat). In letzter Zeit hat sich aufgrund des Walfangverbots der Schwerpunkt von ChS-A zu ChS-C verlagert. Allerdings steigt der Preis für Haifischflossen als einem Nahrungsmittelbestandteil der chinesischen Küche. Aus diesem Grund besteht Bedarf nach einem Rohstoff und einem Verfahren, mittels dessen das Chondroitinsulfat in großer Menge bei geringeren Kosten gewonnen werden kann. Takeda et al. (J. JPN. SOC. Nutr. Food Sci. 51, 213–217 (1990) beschreibt die Gewinnung von Chondroitinsulfat und seinem Oligosaccharidgemisch aus Lachsnasenknorpel und untersuchte die Wirkungen auf die Darmabsorption von Glucose.
Demgemäß richtet sich die Erfindung auf die Bereitstellung eines neuartigen Chondroitinsulfats, welches in einer großen Menge bei geringeren Kosten gewonnen werden kann und welches als für verschiedene Zwecke nützlich zu erachten ist, als auch einer Methode zur Gewinnung desselben.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Chondroitinsulfat, welches eine Disaccharid-Einheit umfasst, die ein nicht-sulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin (im folgenden als nicht-sulfiertes GalNAc abgekürzt) zu 11,0 ± 3,3% enthält, eine Disaccharid-Einheit, die ein C6-monosulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin (im folgenden als C6-monosulfiertes GalNAc abgekürzt) zu 52,8 ± 15,8% enthält, eine Disaccharid-Einheit, die ein C4-sulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin (im folgenden als C4-monosulfiertes GalNAc abgekürzt) zu 28,4 ± 8,5% enthält und eine Disaccharid-Einheit, die ein C4,C6-disulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin (im folgenden als C4,C6-desulfiertes GalNAc abgekürzt) zu 7,8 ± 2,3% enthält, ein Verfahren zur Herstellung des Chondroitinsulfats, welches das Mahlen von Lachsnasenknorpel bei einer niedrigen Temperatur, das Entfetten des gemahlenen Materials, dann sein Behandeln mit einem Alkali und einer Pronase, das Zentrifugieren des resultierenden flüssigen verdauten Materials und dann sein Ausfällen mit Ethanol umfasst, als auch ein Verfahren zur Herstellung des Chondroitinsulfats, welches außerdem das Behandeln des resultierenden Präzipitats mit einem Kationenaustauscherharz umfasst. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein entzündungshemmendes Mittel und ein Benetzungsmittel, das das Chondroitinsulfat enthält.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Das Chondroitinsulfat der Erfindung wird in großer Menge zum Beispiel aus Lachsnasenknorpel erhalten.
Nachfolgend wird das Verfahren skizziert, wobei zunächst ein Produkt, das durch Entfernung der Haut, der harten Knochen, der Fleischteilchen vom während der Verarbeitung eines Lachses abgetrennten Kopf erhalten wird, wobei lediglich herausgetrennter und bei –120°C gemahlener Nasenknorpel als ein Rohmaterial verwendet wird. Durch das Mahlen bei einer niedrigen Temperatur kann der Abbau und die Oxidation des Produkts aufgrund der Wärmeerzeugung beim Mahlen vermieden werden. Außerdem wird durch das Mahlen bei normaler Temperatur eine Feinvermahlung zu einer Kleinstgröße ermöglicht und außerdem eine gleichförmige Teilchengröße erhalten. Ein saures Mucopolysaccharid wird aus dem Knorpelpulver extrahiert und dieses mit einem Protonenaustauscherharz behandelt, um die Chondroitinsulfat-Fraktion zu erhalten. Die Vorgehensweise kann auf einem Verfahren zum Extrahieren eines Chondroitinsulfats aus Wal- oder Haifischknorpel basieren.
Die Herstellung eines gereinigten Chondroitinsulfats aus dem Knorpelpulver wird nachstehend ausführlicher beschrieben und im Überblick wiedergegeben.
Das Knorpelpulver wird zunächst mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton entfettet. Dann wird dieses mit einer alkalischen wässrigen Lösung, z.B. einer wässrigen Natriumhydroxidlösung, behandelt, neutralisiert und dann mit einer Pronase wie Actinase E verdaut. Anschließend wird das flüssige verdaute Material zentrifugiert und der pH-Wert mit Essigsäure auf einen Säurewert verändert. Dann wird Ethanol zur Bildung eines Präzipitats zugegeben. Das resultierende Präzipitat wird durch zentrifugale Abtrennung abgesammelt und mit Ethanol gewaschen und daraufhin vakuumgetrocknet.
Das derart erhaltene saure Mucopolysaccharid wird in einer geringen Menge an entionisiertem Wasser gelöst und in dieser Form mit einem Kationenaustauscherharz wie DOWEX 50WX2 behandelt. Das Eluat wird dann neutralisiert und gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die derart erhaltene Lösung wird konzentriert, zum Beispiel durch einen Membranfilter filtriert und dann gefriergetrocknet, um ein gereinigtes Produkt des Chondroitinsulfats zu erhalten.
Das vorhandene Verhältnis der Disaccharide, aus denen das Chondroitinsulfat der Erfindung besteht, beträgt gewöhnlich:
nicht-sulfiertes GalNAc (%): 11,0 ± 3,3
C6-monosulfiertes GalNAc (%): 52,8 ± 15,8
C4-monosulfiertes GalNAc (%): 28,4 ± 8,5
C4,C6-disulfiertes GalNAc (%): 7,8 ± 2,3
vorzugsweise
nicht-sulfiertes GalNAc (%): 11,0 ± 2,2
C6-monosulfiertes GalNAc (%): 52,8 ± 10,6
C4-monosulfiertes GalNAc (%): 28,4 ± 5,7
C4,C6-disulfiertes GalNAc (%): 7,8 ± 1,6.
Dieses vorhandene Verhältnis der Disaccharide, aus denen das Chondroitinsulfat besteht, war bisher unbekannt.
Bei einem bisher bekannten, aus Walknorpel stammendem Chondroitinsulfat beläuft sich das C4-monosulfiertes GalNAc auf etwa 70%, während das C4,C6-disulfierte GalNAc lediglich 1% oder weniger beträgt. Außerdem beträgt bei einem bisher bekannten, von Haifischknorpel stammendem Chondroitinsulfat der C6-monosulfierte GalNAc-Anteil etwa 70%, während der C4-monosulfierte GalNAc-Anteil lediglich gut 10% ausmacht.
Bezüglich der Verteilung der Schwefelsäuregruppe weist das Chondroitinsulfat der Erfindung eine willkürlichere Struktur als die gewöhnlichen auf. Das heißt, es weist eine Struktur auf, bei der eine nicht-sulfiertes GalNAc enthaltende Disaccharid-Einheit, eine C6-monosulfiertes GalNAc enthaltende Disaccharid-Einheit, eine C4-monosulfiertes GalNAc enthaltende Disaccharid-Einheit und eine C4,C6-disulfiertes GalNAc enthaltende Disaccharid-Einheit willkürlich angeordnet sind.
Das Chondroitinsulfat der Erfindung kann, ähnlich wie die herkömmlichen, in Arzneistoffen wie einem entzündungshemmenden Mittel und ähnlichem, außerdem in Kosmetika oder Augenlotionen als einem Benetzungsmittel und in Nahrungsmittelzusätzen, z.B. als Gelbildner und Geliermittel, verwendet werden.
Da darüber hinaus das Chondroitinsulfat eine hohe physiologische Viskosität aufweist, wird eine verlängernde Wirkung auf die lokale Verweildauer von Kombinationswirkstoffen durch Mischen der Wirkstoffe für die künftige Entwicklung erwogen. Außerdem wurde berichtet, dass das Chondroitinsulfat die Stabilisierung der Collagenfasern der Hornhaut fördert und in der Aufrechterhaltung der Funktion des Augengewebes wirksam ist. Entsprechend wird seine Anwendung als ein in hohem Maße funktionelles Hautsurrogat durch Mischen mit Collagenen wie den aus Lachshaut, Rinderhaut extrahierten ebenfalls erwogen. Da es darüber hinaus nicht nur physiologische und pharmazeutische Aktivitäten aufweist, sondern auch Eigenschaften als ein polymeres Elektrolyt, ist seine industrielle Anwendung ebenfalls möglich. Da das Chondroitinsulfat der Erfindung eine Zwischenstruktur zwischen dem von Wal stammenden Chondroitinsulfat und dem von Haifisch stammenden Chondroitinsulfat aufweist, steht zu erwarten, dass es relativ breite Akzeptanz finden wird.
Beispiele
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf Beispiele spezifischer erläutert werden. Allerdings ist die Erfindung in keinster Weise auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
(1) Entfetten von Knorpel
Ein Produkt, das durch Entfernen der Haut, der harten Knochen, der Fleischteilchen vom während der Verarbeitung eines Lachses abgetrennten Kopf erhalten wurde, wobei lediglich Nasenknorpel herausgetrennt und bei –120°C unter flüssigem Stickstoff gemahlen wurde, wurde als ein Rohmaterial verwendet.

1) Etwa 100 mg des Knorpelpulvers wurden in einen 2.000-Millimeter-Erlenmeierkolben eingebracht und dem 700 ml Aceton zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt.
2) Das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten lang stehengelassen und die Überstandslösung entfernt.
3) Die Vorgehensweise aus 1)–2) wurde weitere drei Male wiederholt.
4) Das verbliebene Präzipitat wurde mit einem Vakuumtrockner getrocknet.
5) Die resultierende Probe wurde bei –30°C gelagert.

(2) Alkalibehandlung

1) Fünf Gramm des entfetteten Knorpelpulvers wurden in 80 ml an 0,2 M NaOH gelöst.
2) Das Gemisch wurde in einem Wasserbad von 37°C für 3 Stunden gerührt.
3) Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 7,0 mit Essigsäure neutralisiert.

(3) Pronase-Verdau

1) Zehn Milliliter einer 0,2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,8) wurden zugegeben.
2) Calciumacetat wurde zu einer Endkonzentration von 0,02 M zugegeben.
3) Zur Konservierung wurden 5 ml Methanol zugegeben.
4) Fünfzig Milligramm Actinase E wurden zugegeben.
5) Das Gemisch wurde in einem Wasserbad von 37°C 48 Stunden lang langsam gerührt.

(4) Ethanol-Ausfällung

1) Das flüssige verdaute Material wurde bei 10.000 UpM und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
2) Der Überstand wurde unter Verwendung eines 0,45-Mikrometer-Membranfilters saugfiltriert.
3) Ein Calciumacetat-Äquivalent zu 5% wurde dem Filtrat zugegeben.
4) Das Gemisch wurde auf pH 4,5 mit Essigsäure eingestellt.
5) Ein zweifache Menge an Ethanol wurde zugegeben und das Gemisch 48 Stunden lang stehengelassen.

(5) Waschen und Trocknen des Präzipitats

1) Die Ethanollösung wurde bei 7.000 UpM und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
2) Das Präzipitat wurde rückgewonnen und dem 300 ml an 80% Ethanol zugegeben. Die Lösung wurde 12 Stunden lang langsam gerührt.
3) Die Lösung wurde bei 10.000 UpM und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
s4) Die Vorgehensweise aus 2)–3) wurde wiederholt.
5) Dem Präzipitat wurden 200 ml an 100% Ethanol zugegeben und das Gemisch 6 Stunden lang langsam gerührt.
6) Das Reaktionsgemisch wurde bei 10.000 UpM und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
7) Das derart erhaltene Präzipitat (saures Mucopolysaccharid) wurde mit einem Vakuumtrockner getrocknet. (Scheinbare Ausbeute aus dem entfetteten Knorpelpulver: 44,0%).

(6) Reinigung des Chondroitinsulfats
(6-1) Vorbehandlung

1) Einhundert Milliliter eines Kationenaustauscherharzes DOWEX 50WX2 wurden in 3 N HCl 2 Stunden lang gerührt, mit Wasser gewaschen und dann in 2 N NaOH für 2 Stunden gerührt.
2) Die vorangegangene Verfahrensweise wurde dreimal wiederholt und daraufhin das Reaktionsgemisch mit Wasser gewaschen.
3) Eine Saugwatte wurde unter eine Säule von 2,4 × 40 cm gepackt und ein Harz eingebracht, um den Durchtritt von Luft zu verhindern.

(6-2) Behandlung mit dem Kationenaustauscherharz DOWEX 50WX2

1) Das oben in (5) erhaltene saure Mucopolysaccharid wurde in einer ziemlich kleinen Menge an entionisiertem Wasser gelöst.
2) Das Produkt aus 1) wurde durch eine Säule geschickt und 20 Minuten lang stehengelassen.
3) Durch die Säule wurden 400 ml (etwa das Vierfache des Volumens des Harzes) an entionisiertem Wasser geschickt.
4) Das Eluat wurde sofort mit 1 N NaOH neutralisiert.

(6-3) Reinigung

1) Die neutralisierte Lösung wurde 3 Tage lang gegen entionisiertes Wasser dialysiert.
2) Die resultierende Lösung wurde mit einem Verdampfer auf 20 ml konzentriert.
3) Das Produkt wurde mit einem 0,22-Mikrometer-Membranfilter filtriert und dann zum Erhalt einer trockenen Probe gefriergetrocknet. (Scheinbare Ausbeute aus dem entfetteten Knorpelpulver: 24,0%).

Ergebnisse der Analyse
Die Ergebnisse und die Betrachtungen zur Analyse des oben erhaltenen Chondroitinsulfats (im folgenden als ChS-S abgekürzt) der Erfindung sind nachstehend beschrieben. Übrigens wurden bei der Analyse der Zusammensetzung, ihrer Struktur und ähnlichem, die Bestimmungen des Aminozuckers und der Uronsäure mittels der Morgan-Elson-Methode und der Bitter-Muir-Methode vorgenommen. Ferner wurde der Grad der Substitution der Schwefelsäuregruppe mittels der Rhodizonat-Methode und der Elementaranalyse gemessen. Beim Messen des Molekulargewichts und der Reinheit von ChS-S wurden die GPC, FT-IR und Celluloseacetat-Elektrophorese in korrekter Weise angewendet. Bei der Strukturanalyse wurde die ¹³C-NMR (100 MHz) und ¹H-NMR (400 MHz) angewendet. Außerdem wurde die Bestimmung der Position für die Substitution der Schwefelsäure und ihre Verteilung mittels HPLC eines ungesättigten Disaccharids durchgeführt, wie durch einen zweischrittigen Lyase-Abbau von ChS-S mit Chondroitinase ABC und Chondroitinase ACII und einer zweidimensionalen NMR-(COSY ¹H-NMR-Wasserstoffkern-Verschiebungskorrelation oder ähnliches)-Analyse erhalten. Als Kontrollproben wurde handelsübliches Chondroitin-4-sulfat (ChS-A, von Walknorpel stammend) und Chondroitin-6-sulfat (ChS-C, von Haifischknorpel stammend) (beide hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K.) verwendet.
(1) Quantitative Bestimmung der Uronsäure
Das Verhältnis von in jeder Probenlösung enthaltener Uronsäure und dem aus diesem Wert erhaltenen Chondroitinsulfat-Gehalt (Reinheit) wurden in Tabelle 1 zusammengefasst; der Einfluss der Behandlung mit dem Kationenaustauscherharz (DOWEX 50WX2) (im folgenden als Protonenaustausch-Behandlung abgekürzt) auf die Reinheit bzw. Ausbeute sind in Tabelle 2 gezeigt. Übrigens beträgt der Uronsäuregehalt bei standardmäßigem Chondroitinsulfat 37%.
Aus diesen Ergebnissen wurde befunden, dass mittels dieses Verfahrens ein Chondroitinsulfat von recht hoher Reinheit erhalten wurde. Außerdem ist die Reinheit nach der Protonenaustausch-Behandlung im Vergleich zu der vor der Protonenaustausch-Behandlung viel höher. Aus dieser Tatsache wird in Erwägung gezogen, dass andere saure Mucopolysaccharide wie Hyaluronsäure, Dermatansulfat und ähnliches durch die Protonenaustausch-Behandlung vollständig entfernt werden können.
Tabelle 1 Uronsäure-Gehalt und -Reinheit
Tabelle 2 Ausbeute an Chondroitinsulfat der Erfindung bei jedem Schritt
(2) Analyse des Aminozuckers
Der Gehalt N-Acetylgalactosamin (GalNAc) jeder Probenlösung ist in Tabelle 3 gezeigt. Obschon etwa 0,3% N-Acetylglucosamin vom sauren Mucopolysaccharid vor der Protonenaustausch-Behandlung nachgewiesen wurden, war dieses in ChS-S, ChS-A und ChS-C überhaupt nicht identifizierbar. Keiner der anderen Aminozucker war darin enthalten. Aus dieser Tatsache ist erkennbar, dass der im Chondroitinsulfat vorhandene Aminozucker lediglich N-Acetylgalactosamin war und das andere Aminozucker durch die Protonenaustausch-Behandlung vollständig entfernt werden konnten.
Tabelle 3 N-Acetylgalactosamin-Gehalt von Chondroitinsulfat
(3) Elementaranalyse
Das Gewichtsverhältnis von in jeder Probe enthaltenem Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und der Grad der Sulfierung sind in Tabellen 4 bzw. 5 gezeigt. Aus Tabelle 4 ist erkennbar, dass alle Proben dieselbe Zusammensetzung aufwiesen. Aus Tabelle 5 wurde als Ergebnis erhalten, dass das von Haifischknorpel stammende Chondroitinsulfat den höchsten Sulfierungsgrad aufwies und dass das Chondroitinsulfat der Erfindung einen geringfügig niedrigeren Sulfierungsgrad im Vergleich zu den anderen aufwies.
Tabelle 4 Ergebnisse der Analyse der Zusammensetzung des Chondroitinsulfats
Tabelle 5 Gehalt an der Schwefelsäuregruppe pro Molekül Chondroitinsulfat
(4) Quantitative Bestimmung der Schwefelsäuregruppe
Die in jeder Probe enthaltene Schwefelsäuregruppe und das daraus errechnete Verhältnis an Schwefel sind in Tabelle 6 gezeigt. Aus den Ergebnissen wurde befunden, dass ChS-C einen geringfügig höheren Gehalt an der Schwefelsäuregruppe aufwies und dass ChS-S und ChS-A etwa denselben Gehalt davon zeigten. Weiterhin stimmten die Ergebnisse mit den Ergebnissen der oben bei (3) beschriebenen Elementaranalyse überein.
Tabelle 6 Gehalt an Schwefelsäure und Schwefel bei jedem Chondroitinsulfat
(5) Messung des Molekulargewichts
Das mittlere Molekulargewicht und die Molekulargewichts-Verteilung jeder Probe sind in Tabelle 7 gezeigt. Das mittlere Molekulargewicht des Chondroitinsulfats der Erfindung betrug 173.000. Zwar ist dieser Wert etwas höher als bei den anderen, doch sind die Molekulargewichts-Verteilungen nahezu dieselben. Es ist allgemein bekannt, dass das Molekulargewicht eines Chondroitinsulfats sich mittels der Extraktionsmethode auf 50.000 bis 300.000 beläuft. Die hier erhaltene Molekulargewichts-Verteilung des Chondroitinsulfats stimmte ebenfalls damit überein.
Tabelle 7 Mittleres Molekulargewicht und Molekulargewichts-Verteilung des Chondroitinsulfats
(6) HPLC
Das vorhandene Verhältnis der Disaccharide, aus denen das Chondroitinsulfat besteht, wie durch Fraktionieren des einer Enzymolyse unterzogenen Chondroitinsulfats unter Verwendung einer Kombination aus zwei Arten von Chondroitinhydrolyasen durch HPLC und Durchführen der quantitativen Bestimmung erhalten, ist in Tabelle 8 gezeigt. Der Sulfierungsgrad (Anzahl der Schwefelsäuregruppen pro Molekül GalNAc) des daraus erhaltenen Chondroitinsulfats ist in Tabelle 9 gezeigt.
Aus Tabelle 9 ist feststellbar, dass das Chondroitinsulfat der Erfindung eine Intermediärstruktur zwischen dem von Wal stammendem Chondroitinsulfat und dem von Haifisch stammendem Chondroitinsulfat aufwies. Entsprechend wird davon ausgegangen, dass das Chondroitinsulfat der Erfindung auf einen relativ breiten Bereich anwendbar ist.
Tabelle 8 Das Chondroitinsulfat bildende ungesättigte Disaccharide

ΔDi-0S:

nicht-sulfiertes GalNAc

ΔDi-6S:

C6-monosulfiertes GalNAc

ΔDi-4S:

C4-monosulfiertes GalNAc

ΔDi-di4, 6S:

C4,C6-disulfiertes GalNAc

Tabelle 9 Sulfierungsgrad jedes Chondroitinsulfats
Industrielle Anwendbarkeit
Das Chondroitinsulfat der Erfindung weist eine Intermediärstruktur zwischen dem bisher bekannten, vom Wal stammenden Chondroitinsulfat und vom Haifisch stammenden Chondroitinsulfat auf. Entsprechend ist die Möglichkeit sehr hoch, dass es auf einen relativ breiten Bereich anwendbar ist. Wie die herkömmlichen Produkte kann es in Arzneimitteln wie einem entzündungshemmenden Mittel und ähnlichem, außerdem in Kosmetika oder Augenlotionen als einem Benetzungsmittel und in Nahrungsmittelzusätzen, z.B. als Gelbildner und Geliermittel, verwendet werden. Da außerdem das mittlere Molekulargewicht höher ist als bei den herkömmlichen, wird davon ausgegangen, dass die physiologische Viskosität höher als bei den herkömmlichen ist. Durch Mischen mit Kombinationswirkstoffen kann eine die lokale Verweildauer der Wirkstoffe verlängernde Wirkung erwartet werden. Außerdem liegt ein Bericht aus der letzten Zeit über Chondroitinsulfat vor, der angibt, dass es die Stabilisierung der Collagenfasern der Hornhaut fördert und in der Aufrechterhaltung der Funktion des Augengewebes wirksam ist. Daher kann auch die Anwendung als ein in hohem Maße funktionelles Hautsurrogat durch Mischen mit Collagenen erwartet werden, wie zum Beispiel den aus Lachshaut und Rinderhaut extrahierten Collagenen. Da es nicht nur physiologische und pharmazeutische Wirksamkeiten zeigt, sondern auch Eigenschaften als ein polymeres Elektrolyt aufweist, steht auch eine industrielle Anwendung zu erwarten.

Claims

Chondroitinsulfat, das eine Disaccharid-Einheit, welche ein nicht-sulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin enthält: (11,0 ± 3,3%), eine Disaccharid-Einheit, welche ein C6-monosulfiertes N-Acetyl-D-Galactosamin enthält: (52,8 ± 15,8%), eine Disaccharid-Einheit, welche ein C4-sulfiertes N-Acetyl-D-Galactosamin enthält: (28,4 + 8,5%) und eine Disaccharid-Einheit, welche ein C4,C6-disulfiertes N-Acetyl-D-Galactosamin enthält: (7,8 ± 2,3%), umfasst.
Chondroitinsulfat nach Anspruch 1, welches eine Struktur aufweist, bei der eine Disaccharid-Einheit, welche ein nicht-sulfiertes N-Acetyl-D-Galactosamin enthält, eine Disaccharid-Einheit, welche ein C6-monosulfiertes N-Acetyl-D-Galactosamin enthält, eine Disaccharid-Einheit, welche ein C4-monosulfiertes N-Acetyl-D-Galactosamin enthält und eine Disaccharid-Einheit, welche ein C4,C6-disulfiertes N-Acetyl-D-Galactosamin enthält, willkührlich angeordnet sind.
Chondroitinsulfat nach Anspruch 1, welches aus Lachs-Nasenknorpel erhalten wird.
Verfahren zum Herstellen eines Chondroitinsulfats nach Anspruch 1, welches das Mahlen von Lachs-Nasenknorpel bei einer niedrigen Temperatur, das Entfetten des gemahlenen Materials, dann dessen Behandeln mit einem Alkali und einer Pronase, das Zentrifugieren des resultierenden flüssigverdauten Materials und dann sein Ausfällen mit Ethanol umfasst.
Verfahren zum Herstellen des Chondroitinsulfats nach Anspruch 4, welches außerdem das Behandeln des resultierenden Präzipitats mit einem Kationenaustauscherharz umfasst.
Entzündungshemmendes Mittel, das das Chondroitinsulfat nach Anspruch 1 enthält.
Feuchthaltemittel, das das Chondroitinsulfat nach Anspruch 1 enthält.