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Fachgebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Chondroitinsulfat,
von dem eine Nützlichkeit
für verschiedene
Zwecke in den Bereichen von Arzneimitteln, Kosmetika und Nahrungsmittelzusätzen erwartet
wird.
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Hintergrund
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Bei
einem Chondroitinsulfat handelt es sich um ein saures Mucopolysaccharid,
das im Bindegewebe von Tieren enthalten ist. Es besteht aus einer
wiederkehrenden Disaccharid-Struktur der D-Glucuronsäure und einem
sulfierten N-Acetylgalactosamin, und es existieren verschiedene
Isomere in Abhängigkeit
von der Sulfierung einer Hydroxylgruppe des Zuckerbestandteils.
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Bei
den zu sulfierenden Stellen handelt es sich um die Hydroxylgruppen
in den 2- und 3-Positionen der Glucuronsäure, einer Hydroxylgruppe in
der 2-Position der Iduronsäure
und den Hydroxylgruppen in den 4- und 6-Positionen des N-Acetylgalactosamins.
Bei einer Chondroitinsulfatkette handelt es sich um ein lineares
Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 104 bis
105, welches als ein Proteogulykan in kovalenter Bindung
an ein Kernprotein vorliegt. Generell kommt als eine natürlich vorkommende
Chondroitinsulfatkette eine aus einer sich wiederholenden Einheit
lediglich eines Typs von sulfiertem Disaccharid bestehende kaum jemals
vor, sondern enthält
diese vielmehr verschiedene Arten von sulfierten oder nicht-sulfierten
Disacchariden in unterschiedlichen Verhältnissen.
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Bei
Chondroitinsulfat handelt es sich um eine Substanz, die zuerst bei
sauren Mucopolysacchariden gefunden wurde. Im Jahre 1886 wurde sie
von Fischer und Boedeker aus Knorpel isoliert und zunächst als Chondroitsäure bezeichnet.
Später
wurde festgestellt, dass diese einen Sulfatester enthält, und
wurde daraufhin als Chondroitinsulfat bezeichnet. Dann wurde im
Jahre 1951 von Meyer et al. festgestellt, dass ein Chondroitinsulfat
drei Typen (A, B und C) umfasst und dass A und C in Knorpel vorhanden
sind.
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Als
ein Proteoglykan mit einer Chondroitinsulfatkette existieren Aggrecan,
Versican, Decholin und ähnliche.
Ihre Funktionen sind jedoch in vielen Fällen unbekannt. Obschon die
Wirksamkeit des Aglykans in der Kontrolle der Knorpelgewebefunktion
oder die Anti-Zelladhäsions-Aktivität von Versican
durch eine Chondrokinase-Behandlung
vollständig
verlorengeht, wird die Chondroitinsulfatkette nichtsdestotrotz als
diese Aktivitäten
aufweisend erachtet. Weiterhin wurde ein Chondroitinsulfat-Proteoglykan als
ein neurotropher Faktor der Netzhaut-Neuronen und als ein Axon-verlängernder
Faktor isoliert. Diese Aktivitäten
gingen ebenfalls durch Chondrokinase-Behandlung verloren. Vor kurzem wurde
auch berichtet, dass ein von einem Chondroitinsulfat stammendes
Disaccharid die Aktivierung natürlicher
Killerzellen unterdrückt.
Darüber
hinaus war schon vor dem Auftauchen des humanen Immunschwäche-Virus
(HIV) bekannt, dass sulfierte Polysaccharide wie Chondroitinsulfate,
Karrageen, Dextransulfate und ähnliches
die Infizierung von Zellen mit einer großen Zahl von Viren wie dem
Influenza-Virus, Herpes simplex-Virus und ähnlichen hemmen.
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Da
demnach verschiedenartige physiologische Aktivitäten und Eigenschaften beim
Chondroitinsulfat festgestellt wurden, wurde es in Arzneimitteln
wie entzündungshemmenden
Mitteln und ähnlichem,
außerdem in
Kosmetika oder Augenlotionen als Benetzungsmittel und in Nahrungsmittelzusätzen, z.B.
als Gelbildner, Geliermittel und ähnliches, verwendet. In Molkereiprodukten
ist es bei einem unerwartet breiten Bereich zu finden. Über diese
herkömmlichen
Anwendungen hinaus wird aufgrund seiner Eigenschaften ein latenter
Nutzwert als Arzneimittel für
verschiedene Zwecke erwartet.
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Das
derzeit in der ärztlichen
Versorgung oder ähnlichen
Bereichen verwendete Chondroitinsulfat umfasst ein aus Walknorpel
extrahiertes Chondroitinsulfat A (ChS-A, Chondroitin-4-sulfat),
und ein aus einer Haifischflosse extrahiertes Chondroitinsulfat
C (ChS-C, Chondroitin-6-sulfat). In letzter Zeit hat sich aufgrund
des Walfangverbots der Schwerpunkt von ChS-A zu ChS-C verlagert.
Allerdings steigt der Preis für
Haifischflossen als einem Nahrungsmittelbestandteil der chinesischen
Küche.
Aus diesem Grund besteht Bedarf nach einem Rohstoff und einem Verfahren,
mittels dessen das Chondroitinsulfat in großer Menge bei geringeren Kosten gewonnen
werden kann. Takeda et al. (J. JPN. SOC. Nutr. Food Sci. 51, 213–217 (1990)
beschreibt die Gewinnung von Chondroitinsulfat und seinem Oligosaccharidgemisch
aus Lachsnasenknorpel und untersuchte die Wirkungen auf die Darmabsorption
von Glucose.
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Demgemäß richtet
sich die Erfindung auf die Bereitstellung eines neuartigen Chondroitinsulfats,
welches in einer großen
Menge bei geringeren Kosten gewonnen werden kann und welches als
für verschiedene Zwecke
nützlich
zu erachten ist, als auch einer Methode zur Gewinnung desselben.
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Beschreibung
der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Chondroitinsulfat, welches eine Disaccharid-Einheit
umfasst, die ein nicht-sulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin (im folgenden
als nicht-sulfiertes GalNAc abgekürzt) zu 11,0 ± 3,3%
enthält, eine
Disaccharid-Einheit, die ein C6-monosulfiertes
N-Acetyl-D-galactosamin (im folgenden als C6-monosulfiertes GalNAc
abgekürzt)
zu 52,8 ± 15,8%
enthält,
eine Disaccharid-Einheit, die ein C4-sulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin
(im folgenden als C4-monosulfiertes GalNAc abgekürzt) zu 28,4 ± 8,5%
enthält
und eine Disaccharid-Einheit, die ein C4,C6-disulfiertes N-Acetyl-D-galactosamin (im
folgenden als C4,C6-desulfiertes GalNAc abgekürzt) zu 7,8 ± 2,3%
enthält,
ein Verfahren zur Herstellung des Chondroitinsulfats, welches das Mahlen
von Lachsnasenknorpel bei einer niedrigen Temperatur, das Entfetten
des gemahlenen Materials, dann sein Behandeln mit einem Alkali und
einer Pronase, das Zentrifugieren des resultierenden flüssigen verdauten
Materials und dann sein Ausfällen
mit Ethanol umfasst, als auch ein Verfahren zur Herstellung des Chondroitinsulfats,
welches außerdem
das Behandeln des resultierenden Präzipitats mit einem Kationenaustauscherharz
umfasst. Darüber
hinaus betrifft die Erfindung ein entzündungshemmendes Mittel und
ein Benetzungsmittel, das das Chondroitinsulfat enthält.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Das
Chondroitinsulfat der Erfindung wird in großer Menge zum Beispiel aus
Lachsnasenknorpel erhalten.
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Nachfolgend
wird das Verfahren skizziert, wobei zunächst ein Produkt, das durch
Entfernung der Haut, der harten Knochen, der Fleischteilchen vom
während
der Verarbeitung eines Lachses abgetrennten Kopf erhalten wird,
wobei lediglich herausgetrennter und bei –120°C gemahlener Nasenknorpel als
ein Rohmaterial verwendet wird. Durch das Mahlen bei einer niedrigen
Temperatur kann der Abbau und die Oxidation des Produkts aufgrund
der Wärmeerzeugung
beim Mahlen vermieden werden. Außerdem wird durch das Mahlen
bei normaler Temperatur eine Feinvermahlung zu einer Kleinstgröße ermöglicht und
außerdem
eine gleichförmige Teilchengröße erhalten.
Ein saures Mucopolysaccharid wird aus dem Knorpelpulver extrahiert
und dieses mit einem Protonenaustauscherharz behandelt, um die Chondroitinsulfat-Fraktion zu erhalten.
Die Vorgehensweise kann auf einem Verfahren zum Extrahieren eines
Chondroitinsulfats aus Wal- oder Haifischknorpel basieren.
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Die
Herstellung eines gereinigten Chondroitinsulfats aus dem Knorpelpulver
wird nachstehend ausführlicher
beschrieben und im Überblick
wiedergegeben.
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Das
Knorpelpulver wird zunächst
mit einem organischen Lösungsmittel
wie Aceton entfettet. Dann wird dieses mit einer alkalischen wässrigen
Lösung,
z.B. einer wässrigen
Natriumhydroxidlösung,
behandelt, neutralisiert und dann mit einer Pronase wie Actinase
E verdaut. Anschließend
wird das flüssige
verdaute Material zentrifugiert und der pH-Wert mit Essigsäure auf
einen Säurewert
verändert.
Dann wird Ethanol zur Bildung eines Präzipitats zugegeben. Das resultierende
Präzipitat
wird durch zentrifugale Abtrennung abgesammelt und mit Ethanol gewaschen
und daraufhin vakuumgetrocknet.
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Das
derart erhaltene saure Mucopolysaccharid wird in einer geringen
Menge an entionisiertem Wasser gelöst und in dieser Form mit einem
Kationenaustauscherharz wie DOWEX 50WX2 behandelt. Das Eluat wird dann
neutralisiert und gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die derart
erhaltene Lösung
wird konzentriert, zum Beispiel durch einen Membranfilter filtriert
und dann gefriergetrocknet, um ein gereinigtes Produkt des Chondroitinsulfats
zu erhalten.
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Das
vorhandene Verhältnis
der Disaccharide, aus denen das Chondroitinsulfat der Erfindung
besteht, beträgt
gewöhnlich:
nicht-sulfiertes
GalNAc (%): 11,0 ± 3,3
C6-monosulfiertes
GalNAc (%): 52,8 ± 15,8
C4-monosulfiertes
GalNAc (%): 28,4 ± 8,5
C4,C6-disulfiertes
GalNAc (%): 7,8 ± 2,3
vorzugsweise
nicht-sulfiertes
GalNAc (%): 11,0 ± 2,2
C6-monosulfiertes
GalNAc (%): 52,8 ± 10,6
C4-monosulfiertes
GalNAc (%): 28,4 ± 5,7
C4,C6-disulfiertes
GalNAc (%): 7,8 ± 1,6.
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Dieses
vorhandene Verhältnis
der Disaccharide, aus denen das Chondroitinsulfat besteht, war bisher unbekannt.
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Bei
einem bisher bekannten, aus Walknorpel stammendem Chondroitinsulfat
beläuft
sich das C4-monosulfiertes GalNAc auf etwa 70%, während das
C4,C6-disulfierte GalNAc lediglich 1% oder weniger beträgt. Außerdem beträgt bei einem
bisher bekannten, von Haifischknorpel stammendem Chondroitinsulfat
der C6-monosulfierte GalNAc-Anteil etwa 70%, während der C4-monosulfierte
GalNAc-Anteil lediglich gut 10% ausmacht.
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Bezüglich der
Verteilung der Schwefelsäuregruppe
weist das Chondroitinsulfat der Erfindung eine willkürlichere
Struktur als die gewöhnlichen
auf. Das heißt,
es weist eine Struktur auf, bei der eine nicht-sulfiertes GalNAc
enthaltende Disaccharid-Einheit, eine C6-monosulfiertes GalNAc enthaltende
Disaccharid-Einheit, eine C4-monosulfiertes GalNAc enthaltende Disaccharid-Einheit
und eine C4,C6-disulfiertes GalNAc enthaltende Disaccharid-Einheit
willkürlich
angeordnet sind.
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Das
Chondroitinsulfat der Erfindung kann, ähnlich wie die herkömmlichen,
in Arzneistoffen wie einem entzündungshemmenden
Mittel und ähnlichem,
außerdem
in Kosmetika oder Augenlotionen als einem Benetzungsmittel und in
Nahrungsmittelzusätzen,
z.B. als Gelbildner und Geliermittel, verwendet werden.
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Da
darüber
hinaus das Chondroitinsulfat eine hohe physiologische Viskosität aufweist,
wird eine verlängernde
Wirkung auf die lokale Verweildauer von Kombinationswirkstoffen
durch Mischen der Wirkstoffe für die
künftige
Entwicklung erwogen. Außerdem
wurde berichtet, dass das Chondroitinsulfat die Stabilisierung der
Collagenfasern der Hornhaut fördert
und in der Aufrechterhaltung der Funktion des Augengewebes wirksam
ist. Entsprechend wird seine Anwendung als ein in hohem Maße funktionelles
Hautsurrogat durch Mischen mit Collagenen wie den aus Lachshaut,
Rinderhaut extrahierten ebenfalls erwogen. Da es darüber hinaus
nicht nur physiologische und pharmazeutische Aktivitäten aufweist,
sondern auch Eigenschaften als ein polymeres Elektrolyt, ist seine
industrielle Anwendung ebenfalls möglich. Da das Chondroitinsulfat
der Erfindung eine Zwischenstruktur zwischen dem von Wal stammenden
Chondroitinsulfat und dem von Haifisch stammenden Chondroitinsulfat
aufweist, steht zu erwarten, dass es relativ breite Akzeptanz finden
wird.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf Beispiele spezifischer
erläutert
werden. Allerdings ist die Erfindung in keinster Weise auf diese
Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1
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(1) Entfetten von Knorpel
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Ein
Produkt, das durch Entfernen der Haut, der harten Knochen, der Fleischteilchen
vom während
der Verarbeitung eines Lachses abgetrennten Kopf erhalten wurde,
wobei lediglich Nasenknorpel herausgetrennt und bei –120°C unter flüssigem Stickstoff
gemahlen wurde, wurde als ein Rohmaterial verwendet.
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- 1) Etwa 100 mg des Knorpelpulvers wurden in einen 2.000-Millimeter-Erlenmeierkolben
eingebracht und dem 700 ml Aceton zugegeben. Das Gemisch wurde 10
Minuten lang gerührt.
- 2) Das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten lang stehengelassen
und die Überstandslösung entfernt.
- 3) Die Vorgehensweise aus 1)–2) wurde weitere drei Male
wiederholt.
- 4) Das verbliebene Präzipitat
wurde mit einem Vakuumtrockner getrocknet.
- 5) Die resultierende Probe wurde bei –30°C gelagert.
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(2) Alkalibehandlung
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- 1) Fünf
Gramm des entfetteten Knorpelpulvers wurden in 80 ml an 0,2 M NaOH
gelöst.
- 2) Das Gemisch wurde in einem Wasserbad von 37°C für 3 Stunden
gerührt.
- 3) Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 7,0 mit Essigsäure neutralisiert.
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(3) Pronase-Verdau
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- 1) Zehn Milliliter einer 0,2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH
7,8) wurden zugegeben.
- 2) Calciumacetat wurde zu einer Endkonzentration von 0,02 M
zugegeben.
- 3) Zur Konservierung wurden 5 ml Methanol zugegeben.
- 4) Fünfzig
Milligramm Actinase E wurden zugegeben.
- 5) Das Gemisch wurde in einem Wasserbad von 37°C 48 Stunden
lang langsam gerührt.
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(4) Ethanol-Ausfällung
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- 1) Das flüssige
verdaute Material wurde bei 10.000 UpM und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
- 2) Der Überstand
wurde unter Verwendung eines 0,45-Mikrometer-Membranfilters saugfiltriert.
- 3) Ein Calciumacetat-Äquivalent
zu 5% wurde dem Filtrat zugegeben.
- 4) Das Gemisch wurde auf pH 4,5 mit Essigsäure eingestellt.
- 5) Ein zweifache Menge an Ethanol wurde zugegeben und das Gemisch
48 Stunden lang stehengelassen.
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(5) Waschen und Trocknen
des Präzipitats
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- 1) Die Ethanollösung
wurde bei 7.000 UpM und 4°C
für 30
Minuten zentrifugiert.
- 2) Das Präzipitat
wurde rückgewonnen
und dem 300 ml an 80% Ethanol zugegeben. Die Lösung wurde 12 Stunden lang
langsam gerührt.
- 3) Die Lösung
wurde bei 10.000 UpM und 4°C
für 30
Minuten zentrifugiert.
- s4) Die Vorgehensweise aus 2)–3) wurde wiederholt.
- 5) Dem Präzipitat
wurden 200 ml an 100% Ethanol zugegeben und das Gemisch 6 Stunden
lang langsam gerührt.
- 6) Das Reaktionsgemisch wurde bei 10.000 UpM und 4°C für 30 Minuten
zentrifugiert.
- 7) Das derart erhaltene Präzipitat
(saures Mucopolysaccharid) wurde mit einem Vakuumtrockner getrocknet. (Scheinbare
Ausbeute aus dem entfetteten Knorpelpulver: 44,0%).
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(6) Reinigung des Chondroitinsulfats
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(6-1) Vorbehandlung
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- 1) Einhundert Milliliter eines Kationenaustauscherharzes
DOWEX 50WX2 wurden in 3 N HCl 2 Stunden lang gerührt, mit Wasser gewaschen und
dann in 2 N NaOH für
2 Stunden gerührt.
- 2) Die vorangegangene Verfahrensweise wurde dreimal wiederholt
und daraufhin das Reaktionsgemisch mit Wasser gewaschen.
- 3) Eine Saugwatte wurde unter eine Säule von 2,4 × 40 cm
gepackt und ein Harz eingebracht, um den Durchtritt von Luft zu
verhindern.
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(6-2) Behandlung mit dem
Kationenaustauscherharz DOWEX 50WX2
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- 1) Das oben in (5) erhaltene saure Mucopolysaccharid wurde
in einer ziemlich kleinen Menge an entionisiertem Wasser gelöst.
- 2) Das Produkt aus 1) wurde durch eine Säule geschickt und 20 Minuten
lang stehengelassen.
- 3) Durch die Säule
wurden 400 ml (etwa das Vierfache des Volumens des Harzes) an entionisiertem
Wasser geschickt.
- 4) Das Eluat wurde sofort mit 1 N NaOH neutralisiert.
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(6-3) Reinigung
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- 1) Die neutralisierte Lösung
wurde 3 Tage lang gegen entionisiertes Wasser dialysiert.
- 2) Die resultierende Lösung
wurde mit einem Verdampfer auf 20 ml konzentriert.
- 3) Das Produkt wurde mit einem 0,22-Mikrometer-Membranfilter
filtriert und dann zum Erhalt einer trockenen Probe gefriergetrocknet.
(Scheinbare Ausbeute aus dem entfetteten Knorpelpulver: 24,0%).
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Ergebnisse der Analyse
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Die
Ergebnisse und die Betrachtungen zur Analyse des oben erhaltenen
Chondroitinsulfats (im folgenden als ChS-S abgekürzt) der Erfindung sind nachstehend
beschrieben. Übrigens
wurden bei der Analyse der Zusammensetzung, ihrer Struktur und ähnlichem,
die Bestimmungen des Aminozuckers und der Uronsäure mittels der Morgan-Elson-Methode
und der Bitter-Muir-Methode vorgenommen. Ferner wurde der Grad der Substitution
der Schwefelsäuregruppe
mittels der Rhodizonat-Methode und der Elementaranalyse gemessen. Beim
Messen des Molekulargewichts und der Reinheit von ChS-S wurden die
GPC, FT-IR und Celluloseacetat-Elektrophorese in korrekter Weise
angewendet. Bei der Strukturanalyse wurde die 13C-NMR
(100 MHz) und 1H-NMR (400 MHz) angewendet.
Außerdem
wurde die Bestimmung der Position für die Substitution der Schwefelsäure und
ihre Verteilung mittels HPLC eines ungesättigten Disaccharids durchgeführt, wie
durch einen zweischrittigen Lyase-Abbau von ChS-S mit Chondroitinase
ABC und Chondroitinase ACII und einer zweidimensionalen NMR-(COSY 1H-NMR-Wasserstoffkern-Verschiebungskorrelation
oder ähnliches)-Analyse
erhalten. Als Kontrollproben wurde handelsübliches Chondroitin-4-sulfat (ChS-A, von
Walknorpel stammend) und Chondroitin-6-sulfat (ChS-C, von Haifischknorpel
stammend) (beide hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K.) verwendet.
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(1) Quantitative Bestimmung
der Uronsäure
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Das
Verhältnis
von in jeder Probenlösung
enthaltener Uronsäure
und dem aus diesem Wert erhaltenen Chondroitinsulfat-Gehalt (Reinheit)
wurden in Tabelle 1 zusammengefasst; der Einfluss der Behandlung
mit dem Kationenaustauscherharz (DOWEX 50WX2) (im folgenden als
Protonenaustausch-Behandlung abgekürzt) auf die Reinheit bzw.
Ausbeute sind in Tabelle 2 gezeigt. Übrigens beträgt der Uronsäuregehalt
bei standardmäßigem Chondroitinsulfat
37%.
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Aus
diesen Ergebnissen wurde befunden, dass mittels dieses Verfahrens
ein Chondroitinsulfat von recht hoher Reinheit erhalten wurde. Außerdem ist
die Reinheit nach der Protonenaustausch-Behandlung im Vergleich
zu der vor der Protonenaustausch-Behandlung viel höher. Aus
dieser Tatsache wird in Erwägung
gezogen, dass andere saure Mucopolysaccharide wie Hyaluronsäure, Dermatansulfat
und ähnliches
durch die Protonenaustausch-Behandlung vollständig entfernt werden können.
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Tabelle
1
Uronsäure-Gehalt
und -Reinheit
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Tabelle
2
Ausbeute an Chondroitinsulfat der Erfindung bei jedem Schritt
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(2) Analyse des Aminozuckers
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Der
Gehalt N-Acetylgalactosamin (GalNAc) jeder Probenlösung ist
in Tabelle 3 gezeigt. Obschon etwa 0,3% N-Acetylglucosamin vom sauren
Mucopolysaccharid vor der Protonenaustausch-Behandlung nachgewiesen
wurden, war dieses in ChS-S, ChS-A und ChS-C überhaupt nicht identifizierbar.
Keiner der anderen Aminozucker war darin enthalten. Aus dieser Tatsache
ist erkennbar, dass der im Chondroitinsulfat vorhandene Aminozucker
lediglich N-Acetylgalactosamin war und das andere Aminozucker durch
die Protonenaustausch-Behandlung vollständig entfernt werden konnten.
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Tabelle
3 N-Acetylgalactosamin-Gehalt von Chondroitinsulfat
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(3) Elementaranalyse
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Das
Gewichtsverhältnis
von in jeder Probe enthaltenem Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff,
Sauerstoff und Schwefel und der Grad der Sulfierung sind in Tabellen
4 bzw. 5 gezeigt. Aus Tabelle 4 ist erkennbar, dass alle Proben
dieselbe Zusammensetzung aufwiesen. Aus Tabelle 5 wurde als Ergebnis
erhalten, dass das von Haifischknorpel stammende Chondroitinsulfat
den höchsten
Sulfierungsgrad aufwies und dass das Chondroitinsulfat der Erfindung
einen geringfügig
niedrigeren Sulfierungsgrad im Vergleich zu den anderen aufwies.
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Tabelle
4
Ergebnisse der Analyse der Zusammensetzung des Chondroitinsulfats
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Tabelle
5
Gehalt an der Schwefelsäuregruppe
pro Molekül
Chondroitinsulfat
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(4) Quantitative Bestimmung
der Schwefelsäuregruppe
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Die
in jeder Probe enthaltene Schwefelsäuregruppe und das daraus errechnete
Verhältnis
an Schwefel sind in Tabelle 6 gezeigt. Aus den Ergebnissen wurde
befunden, dass ChS-C einen geringfügig höheren Gehalt an der Schwefelsäuregruppe
aufwies und dass ChS-S und ChS-A etwa denselben Gehalt davon zeigten.
Weiterhin stimmten die Ergebnisse mit den Ergebnissen der oben bei
(3) beschriebenen Elementaranalyse überein.
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Tabelle
6
Gehalt an Schwefelsäure
und Schwefel bei jedem Chondroitinsulfat
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(5) Messung des Molekulargewichts
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Das
mittlere Molekulargewicht und die Molekulargewichts-Verteilung jeder
Probe sind in Tabelle 7 gezeigt. Das mittlere Molekulargewicht des
Chondroitinsulfats der Erfindung betrug 173.000. Zwar ist dieser
Wert etwas höher
als bei den anderen, doch sind die Molekulargewichts-Verteilungen
nahezu dieselben. Es ist allgemein bekannt, dass das Molekulargewicht
eines Chondroitinsulfats sich mittels der Extraktionsmethode auf 50.000
bis 300.000 beläuft.
Die hier erhaltene Molekulargewichts-Verteilung des Chondroitinsulfats
stimmte ebenfalls damit überein.
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Tabelle
7
Mittleres Molekulargewicht und Molekulargewichts-Verteilung
des Chondroitinsulfats
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(6) HPLC
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Das
vorhandene Verhältnis
der Disaccharide, aus denen das Chondroitinsulfat besteht, wie durch Fraktionieren
des einer Enzymolyse unterzogenen Chondroitinsulfats unter Verwendung
einer Kombination aus zwei Arten von Chondroitinhydrolyasen durch
HPLC und Durchführen
der quantitativen Bestimmung erhalten, ist in Tabelle 8 gezeigt.
Der Sulfierungsgrad (Anzahl der Schwefelsäuregruppen pro Molekül GalNAc) des
daraus erhaltenen Chondroitinsulfats ist in Tabelle 9 gezeigt.
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Aus
Tabelle 9 ist feststellbar, dass das Chondroitinsulfat der Erfindung
eine Intermediärstruktur
zwischen dem von Wal stammendem Chondroitinsulfat und dem von Haifisch
stammendem Chondroitinsulfat aufwies. Entsprechend wird davon ausgegangen,
dass das Chondroitinsulfat der Erfindung auf einen relativ breiten
Bereich anwendbar ist.
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Tabelle
8
Das Chondroitinsulfat bildende ungesättigte Disaccharide
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- ΔDi-0S:
- nicht-sulfiertes GalNAc
- ΔDi-6S:
- C6-monosulfiertes
GalNAc
- ΔDi-4S:
- C4-monosulfiertes
GalNAc
- ΔDi-di4, 6S:
- C4,C6-disulfiertes
GalNAc
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Tabelle
9
Sulfierungsgrad jedes Chondroitinsulfats
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Industrielle Anwendbarkeit
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Das
Chondroitinsulfat der Erfindung weist eine Intermediärstruktur
zwischen dem bisher bekannten, vom Wal stammenden Chondroitinsulfat
und vom Haifisch stammenden Chondroitinsulfat auf. Entsprechend ist
die Möglichkeit
sehr hoch, dass es auf einen relativ breiten Bereich anwendbar ist.
Wie die herkömmlichen Produkte
kann es in Arzneimitteln wie einem entzündungshemmenden Mittel und ähnlichem,
außerdem
in Kosmetika oder Augenlotionen als einem Benetzungsmittel und in
Nahrungsmittelzusätzen,
z.B. als Gelbildner und Geliermittel, verwendet werden. Da außerdem das
mittlere Molekulargewicht höher
ist als bei den herkömmlichen,
wird davon ausgegangen, dass die physiologische Viskosität höher als
bei den herkömmlichen ist.
Durch Mischen mit Kombinationswirkstoffen kann eine die lokale Verweildauer
der Wirkstoffe verlängernde Wirkung
erwartet werden. Außerdem
liegt ein Bericht aus der letzten Zeit über Chondroitinsulfat vor,
der angibt, dass es die Stabilisierung der Collagenfasern der Hornhaut
fördert
und in der Aufrechterhaltung der Funktion des Augengewebes wirksam
ist. Daher kann auch die Anwendung als ein in hohem Maße funktionelles
Hautsurrogat durch Mischen mit Collagenen erwartet werden, wie zum
Beispiel den aus Lachshaut und Rinderhaut extrahierten Collagenen.
Da es nicht nur physiologische und pharmazeutische Wirksamkeiten
zeigt, sondern auch Eigenschaften als ein polymeres Elektrolyt aufweist,
steht auch eine industrielle Anwendung zu erwarten.