DE60222172T2

DE60222172T2 - Verfahren zur sulfonierung von verbindungen mit freien hydroxylgruppen (oh-gruppen) oder primären oder sekundären aminen

Info

Publication number: DE60222172T2
Application number: DE60222172T
Authority: DE
Inventors: Emmanuel Petit; Dulce Garcia-Papy; Veronique Barbier-Chassefiere
Original assignee: ORGANES TISSUS
Current assignee: ORGANES TISSUS
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2002-11-28
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2022-11-29
Also published as: CA2468759C; US7396923B2; IL162192A; FR2832708A1; DE60222172D1; EP1456247B1; JP4394950B2; JP2005510587A; WO2003046014A1; CN1617889A; EP1456247A1; ES2292851T3; CN1286852C; FR2832708B1; ATE371674T1; AU2002365302B2; US20040242801A1; IL162192A0; CA2468759A1; AU2002365302A1

Description

Die vorliegende Erfindung hat ein Verfahren zur Zubereitung von sulfatierten Verbindungen unter nicht degradierenden, reproduzierbaren Bedingungen, die mit den Verwendungen dieser Verbindungen kompatibel sind, wobei eine präzise Molekulardefinition zu beschreiben ist, zum Beispiel als therapeutisches Mittel zur Aufgabe.
Das erfindungsgemäße Verfahren findet bei allen Monomer-, Oligomer- oder Polymerverbindungen Anwendung, die freie Hydroxylgruppen (OH) oder Primär- oder Sekundäramine, substituiert oder nicht, umfassen. Im Besonderen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren der O- und N-Sulfonierung funktionalisierter Polymere.
Die nach dem Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Zubereitung sulfatierter Verbindungen induzieren im Allgemeinen Schnitte der Polymerketten bei der O- oder N-Sulfonierung und damit die Bildung potentiell toxischer Reaktionsreste. Das erfindungsgemäße Verfahren zielt darauf ab, genau diesen Nachteil zu vermeiden, indem es die kontrollierte Addition von Sulfonatgruppen unter schonenden Bedingungen in der Art erlaubt, dass die strukturelle Integrität des Ausgangspolymers, wie ein Oligosaccharid, nicht beeinträchtigt wird.
Nach dem Stand der Technik sind funktionalisierte Polymere mit antikoagulierenden Eigenschaften und vor allem eine Familie von Derivaten, die durch Substitutionen auf einer Dextrankette (D) hergestellt wurden, Carboxymethyl- (CM), Methylbenzylamid- (B) und Methylbenzylamidesulfonat(S)-Gruppen, die mit der Abkürzung CMDBS bezeichnet werden, bekannt. Die Verfahren zur Zubereitung dieser Polymere wurden vor allem in dem französischen Patent beschrieben, das unter der Nr. 2 461 724 veröffentlicht wurde, sowie in dem US-Patent Nr. 4 740 594 . Keines dieser Patente liefert eine präzise Analyse der erhaltenen Polymerstrukturen, und die beschriebenen Verfahren weisen nicht klar nach, dass die hergestellten Produkte homogen sind. Die in diesen Patenten beschriebenen Experimentalbedingungen der Sulfonierungsreaktion bevorzugen die Fixierung der Sulfone auf den freien OH-Gruppen des Glycosidrests, und die aus der dargestellten Analyse geht das Vorhandensein von Benzylaminsulfonat nicht klar hervor.
Andere Mitglieder der Familie der CMDBS, die als HBGF für „Heparin Einding Growth Factor" bezeichnet werden, wurden in dem unter der Nr. 5693625 veröffentlichten US-Patent als wundheilende Mittel beschrieben. Weiterhin sind die HBFGPP wegen ihrer Eigenschaften beschrieben, die die Reparatur und die Renegerierung von Verletzungen der Muskel- ( französisches Patent Nr. 2 718 024 ) und Nervengewebe ( französisches Patent Nr. 2 718 026 ), des Gewebes des Verdauungskanals ( französisches Patent Nr. 2 718 023 ) stimulieren, sowie wegen ihrer entzündungshemmenden Wirkung ( französisches Patent Nr. 2 718 025 ). Diese Patente stellen eine Reihe funktionaler Kriterien auf, die es erlauben, unter allen biokompatiblen Polymeren diejenigen zu identifizieren, die den vier folgenden funktionalen Eigenschaften entsprechen:

– Schutz der für das Heparin (HBGF) affinen Wachstumsfaktoren wie Wachstumsfaktoren der Fibroblasten, wie 1 & 2, oder transformierende Faktoren, wie TGF betal, vor proteolytischen Beeinträchtigungen, sowie Potentialisierung ihrer biologischen Aktivitäten in einer Testreihe auf Zellkultur,
– Vorhandensein einer antikoagulierenden Aktivität unter 10 internationale Einheiten je mg,
– Hemmung der Aktivität der Leukozytenelastase unter physiologischen Bedingungen,
– Hemmung der Aktivität des Plasmins unter physiologischen Bedingungen.

In der französischen Patentanmeldung Nr. 9809309 wird die Struktur einer Familie von Polymeren behandelt, die als RGTA für „ReGeneraTing Agent" bezeichnet werden und die Eigenschaften von HBGFPP aufweisen, und ihr Zubereitungsverfahren und Eigenschaften beschrieben. Die RGTA weisen antifibrotische Wirkungen auf, die vor allem eine Verbesserung der Qualität der Wundheilung der Haut erlauben, antioxidative Wirkungen, um vor allem die schädlichen Wirkungen der freien Radikale zu behandeln (nach ionisierender Bestrahlung oder bei durch Ischämien verursachtem oxidativem Stress), und Eigenschaften zur Regulierung der Gewebshomöostase, vor allem der Knochenmassen. Diese Eigenschaften ergänzen die für die HBGFPP beschriebenen.
Die im französischen Patent Nr. 98 09309 beschriebenen Polymere entsprechen der folgenden Formel: AaXxYy (I) in der:
A ein Monomer ist, X eine RCOOR'-Gruppe darstellt, Y eine O- oder N-Sulfonat-Gruppe gebunden auf A darstellt und einer der folgenden Formeln ROS03R', RNS03R' entspricht, die R-Gruppen aliphatische Kohlenwasserstoffketten sind, eventuell verzweigt und/oder ungesättigt und die einen oder mehrere aromatische Ringe enthalten können mit Ausnahme von Benzylamin und Benzylaminsulfonat, R' ein Wasserstoffatom oder ein Kation darstellt, a die Monomeranzahl darstellt, x den Anteil oder den Grad der Substitution der A-Monomere durch X-Gruppen darstellt, y den Anteil oder den Grad der Substitution der A-Monomere durch Y-Gruppen darstellt.
Unter den im französischen Patent Nr. 98 09309 beschriebenen Polymeren wären Dextranderivate wie die CMDS zu nennen. Polymere vom Typ CMDS wurden ebenfalls als Antikoagulantien beschrieben (Maiga et al., Carbohydrate Polymers, 1997, 32, 89-93).
In allen diesen Beispielen nach dem Stand der Technik erlauben die beschriebenen Synthesemethoden keine Gewinnung von Produkten gemäß Reproduktionskriterien, die ausreichend sind, um die Aufrechterhaltung der molekularen Integrität und die Abwesenheit von Kontaminanten zu gewährleisten. Auch wenn die Substitutionsverfahren von Carboxylgruppen nach dem Stand der Technik ausführlich beschrieben wurden und die kontrollierte und schonende Substitution erlauben, die eine ausreichende Reproduzierbarkeit gewährleistet, sind Sulfonierungsverfahren schwerer zu beherrschen.
Die Sulfonierungsverfahren werden bei einem sehr sauren pH durchgeführt, bei dem die Integrität der Poly merkette nicht aufrecht erhalten werden kann, vor allem, wenn sie von natürlichen Zuckern gebildet wird. Weiterhin führen diese Sulfonierungsbedingungen zu schwer kontrollierbaren Decarboxylierungen.
So beschreiben zahlreiche Arbeiten nach dem Stand der Technik Methoden, die es erlauben, Polysaccharide vom Typ Aa zu sulfatieren. So wurden zum Beispiel das Dextransulfat (oder O-Sulfonat) (DS), das Carboxymethyldextransulfate (CM-D-S) (oder O-Sulfonat) oder andere sulfatierte Oligosaccharide (oder O-sulfoniert) wie das Xylan oder die Stärke anhand solcher Verfahren, wie im US-Patent US Nr. 4 814437 beschrieben, sulfatiert (oder O-sulfoniert). Von diesen Methoden wurde von zahlreichen Autoren auf solche verwiesen, die eine Sulfonierung von Polysacchariden unter Einsatz starker Säuren als Sulfonierungsmittel vorschlagen. Zum Beispiel beschreiben die US-Patente Nr. 4,740,594 und Nr. 4,755,379 und das französische Patent Nr. 2 772 382 eine Behandlung mit Chlorsulfonsäure unter Verwendung von Dichlormethan (CH₂Cl₂) als Solvens zur Herstellung von Molekülen vom Typ CM-D-S und CM-D-B-S. Dieses Verfahren ist in früheren Arbeiten bereits ausführlich beschrieben worden, da für die DS-Synthese mit Pyridin als Solvens mit basischem Charakter dieselbe Säure verwendet wurde (Ricketts, Biochem J. 51, 210-133, 1952). Weiterhin wurden ebenfalls die Schwefelsäure und die Sulfonsäure in Anwesenheit von Formamid für die Zubereitung von DS bei niedrigen Temperaturen verwendet, wie in den US-Patenten Nr. 3 498 972 und 3 141 014 beschrieben. Es ist bekannt, dass diese stark sauren Reaktionsbedingungen zu einem teilweisen Produktabbau führen, auch bei Anwesenheit von basischen Lösungsmitteln oder niedrigen Temperaturen. Sie führen zu einer starken Fragmentierung der Polymerkette bei Polymerprodukten und zu einer teilweisen Hydrolyse bestimmter Funktionsgruppen, die in den zu sulfonierenden Molekülen enthalten sind. Diese Bedingungen starken Säuregehalts wurden durch die Verwendung besser gepufferter Milieus oder geringeren Säuregehalts mehrmals verbessert. So wurde bereits die Verwendung von Schwefeltrioxid (SO₃)-Komplexen als weniger schweres Sulfonierungsmittel als die Schwefel- und Sulfonsäure eingeführt (Archives of biochemistry and biophysics, 95, 36-41, 1961; tetrahedron Letters, 29, 7, 803-806, 1988; J. Chem. Soc. Perkin trans. 1, 157, 1995). Es werden mehrere Komplexe vom Typ SO₃-Amin kommerziell vertrieben, wie das SO₃-ME₃N (Trimethylamin), das SO₃-Et₃N (Triethylamin), das SO₃-Pyridin und das SO₃-Piperidin. Diese Reagenzien werden in nichtwässrigem Milieu in Lösungsmitteln wie DMF, Formamid und DMSO verwendet. Allerdings weisen diese Methoden, obwohl sie zur Produktion von sulfatierten Polysacchariden verwendet werden, vor allem von solchen, die von Dextran abgeleitet sind und von Ester-, Ether- oder Amidgruppen funktionalisiert, erhebliche Nachteile auf, da sie:

– zu einer zufälligen Fragmentierung der makromolekularen Polymerkette, wenn auch in weniger erheblichem Maße als mit Sulfonsäuren, führen,
– einer teilweisen Hydrolyse der bereits auf den oben genannten Polymeren vorhandenen Funktionsgruppen, und
– durch die Bildung von Aminen Nebenprodukte erzeugen, die die Zubereitungen kontaminieren und die sich nach in vivo-Inokulation als toxisch erwiesen haben (Brain Res 16, 208-2, 473-478, 1981).

Diese Techniken wurden weiter verbessert, um die toxischen Reste maximal zu reduzieren, so wie vom im US-Patent Nr. 4 814 437 für das Pyridin beschriebene Verfahren vorgeschlagen. Die in diesem Verfahren nach dem Stand der Technik verwendeten SO₃-Amine sind nämlich mit den Aldehydgruppen, die auf dem reduzierenden Ende der meisten Polysaccharide, vor allem im Dextran, vorhanden sind, reaktiv, und die derart gebildete Bindung ist kovalent und damit permanent.
Der Nachteil der Verwendung von Komplexen vom Typ SO₃-Amin wurde ebenfalls durch Verwendung von Komplexen vom Typ SO₃-Amid wie SO₃-DMF und SO₃-FA überwunden. Zum Beispiel werden die DS-Salze, insbesondere die Natriumsalze, derzeit wie im US-Patent Nr. 4 855 416 beschrieben durch O-Sulfonierung des Dextrans durch einen SO₃-Komplex in Verbindung mit Formamid (SOs-FA) mit Formamid als Solvens zubereitet. Diese Methode umfasst die in situ-Bildung des SO₃-FA-Komplexes und die darauffolgende Dextranreaktion. Die starke Reaktivität des SO₃-FA-Komplexes führt trotz Verwendung einer Inertgasatmosphäre (N₂) und wasserfreier Lösungsmittel zu einem starken Säuregehalt des Reaktionsmilieus. Dieser Fakt führt ebenfalls zu einem Abbau der Polymerkette.
Ein anderer nicht aminierter, häufig verwendeter Komplex ist das SO₃-DMF. Dieser wurde auch im französischen Patent Nr. 2 772 382 für die Synthese von sulfatierten Polysacchariden vom Typ CM-D-S und CM-D-B-S vorgeschlagen. Allerdings führen der SO₃-DMF-Komplex wie auch der SO₃-FA-Komplex zu einem starken Säuregehalt des Reaktionsmilieus, was ebenfalls die Fragmentierung der Polymerkette und die Hydrolyse labiler Gruppen hervorruft, wodurch eine Kontrolle der Synthese und der Endprodukte verloren geht. Dieses Verfahren ist im demzufolge für die Zubereitung von polyanionischen Polymeren mit hohen Mole kulargewichten, die nicht zufällig und unkontrolliert durchtrennt werden sollen, ebenso unzureichend wie die anderen Verfahren.
Die Druckschrift US 5,229,504 beschreibt ein Verfahren zur Zubereitung von sulfoniertem Chitosan, vor allem durch Reaktion eines SO₃-DHF-Komplexes mit vorbehandeltem Chitosan.
In der Absicht, die Synthesemethoden zu verbessern, wurden Protokolle zur Herstellung von CMDBS und CMDS im französischen Patent Nr. 97 15702 beschrieben. Dem französischen Patent Nr. 97 15702 zufolge erlaubt diese Verbesserung einerseits die Gewinnung von Dextranderivaten mit einer größeren Homogenität des Molekulargewichts und andererseits, den Substitutionsgrad zu kontrollieren, wodurch eine bessere Homogenität der Strukturen und damit eine bessere Definition gewährleistet werden. Allerdings basiert die in dem französischen Patent Nr. 97 15702 beschriebene Methode wie im Stand der Technik auf der Sulfonierung der Polysaccharide unter Einsatz von SO₃-Amin (DMF, Pyridin oder Triethylamin), und die gegebenen Beispiele wurden ausschließlich mit SO₃-Pyridin erzielt. Außerdem führt diese Methode zur Bildung von Pyridin-Restspuren, dessen Toxizität für den Menschen gut bekannt ist, und scheint die Bildung von Fragmenten der Polysaccharidkette nicht ausschließen zu können.
Die vorliegende Erfindung zielt genau darauf ab, neue allgemeine Methoden zur Sulfonierung anzubieten, die es erlauben, die Substitutionsbedingungen von Sulfonatgruppen auf Verbindungen, die Hydroxylfunktionen oder primäre oder sekundäre Aminfunktionen enthalten, sehr streng und präzise zu kontrollieren.
Dieses Ziel wird mit einem Sulfonierungsverfahren von Verbindungen erreicht, die eine oder mehrere freie Hydroxylfunktionen und/oder eine oder mehrer primäre oder sekundäre substituierte oder nicht substituierte Aminfunktionen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass es die Behandlung der besagten Verbindung mit dem Komplex SO₃-DMF in Gegenwart eines Säuresensors umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die die Alkene oder Alkine bei einem Siedepunkt unter 100°C oder ein Gemisch derselben umfasst.
Man versteht unter Säuresensor eine Substanz oder ein Gemisch von Substanzen, die in der Lage sind, selektiv mit den in der Lösung freien Protonen zu reagieren. Nach Zugabe dieses Säuresensors zu dem Reaktionsgemisch werden die Protonen von dem Säuresensor gefangen und nehmen an der Absenkung des pH nicht mehr teil, weil sie nicht mehr reaktiv sind.
In vorteilhafter Weise ist der Säuresensor ein Buten wie das 2-Methyl-2-buten (2M2B), das 2-Methyl-propen, das 2-Methyl-penten oder ihre Isomere oder ein Gemisch derselben.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist deswegen bemerkenswert, da es die Umsetzung zu saurer pHs vermeidet und damit das Risiko der Durchtrennung behandelter Verbindungen ausschaltet. Weiterhin weist es den Vorteil auf, keine toxischen Substanzen einzuführen, die nur schwierig oder gar nicht komplett entfernt werden können.
Speziell umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte:

a) die Solubilisierung oder die Zubereitung einer homogenen Lösung der zu sulfonierenden Verbindung in einem Solvens oder einem nicht wässrigen Co-Solvens, wie dem Dimethylformamid (DMF) oder einem Co-Solvens, zusammengesetzt aus Formamin und aus Dimethlyformamin,
b) die Zugabe bei Raumtemperatur (20-22°C) eines Molüberschusses eines Säuresensors bzw. -fängers, wie das 2-Methyl-2-buten, mischbar in dem Co-Solvens,
c) die schnelle Zugabe des Komplexes SO₃-DM unter Rühren,
d) das Rühren des im vorangehenden Schritt hergestellten Gemischs während einer bis zwei Stunden bei einer kontrollierten Temperatur und unter 30°C,
e) das Anhalten der Reaktion durch schrittweise Zugabe des Gemischs auf eine alkalische Lösung, zum Beispiel eine Lösung mit 2 Natriumhydrogencarbonat (NaHCO₃) oder ein anderes Alkali, mit einer pH-Kontrolle nie unter 4, um die Salze der zu sulfonierenden Verbindung herzustellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in vorteilhafter Weise die die Reinigung der in Schritt (e) hergestellten sulfonierten Verbindung, zum Beispiel durch tangentiale Ultrafiltration gegen Wasser (in einer beim Menschen injizierbaren Qualität) durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Spaltungskoeffizienten von 1000 Dalton.
Vorzugsweise ist das in Schritt (a) umgesetzte Solvens nicht das Dimethylsulfoxid (DMSO), da im Rahmen der für die vorliegende Erfindung durchgeführten Arbeiten ermittelt werden konnte, dass dieses Solvens aus sulfonierten Polysaccharidzubereitungen nur sehr schwer eliminierbar ist und damit ein Hindernis für ihre Verwendung bei der Zubereitung pharmazeutischer Formen darstellt.
Wenn die zu sulfonierende Verbindung in einem Solvens oder einem nicht wässrigem Co-Solvens wenig löslich ist, besteht eine besondere Form der Umsetzung des Verfahrens darin, die besagte Verbindung zu protonieren, um ihre Solubilisierung zu fördern. Es handelt sich vor allem um zu sulfonierende Verbindungen, die Polymere eines Zuckers, wie das Dextran, substituiert durch eine oder mehrere Carboxylatgruppen, deren Protonierung zur Bildung von -COOH-Gruppen führt, zum Beispiel durch Passage über eine Kationenaustauschersäule.
Damit sind die Sulfonierungsbedingungen ausreichend schonend und kontrolliert, um eine Decarboxylierung des ursprünglich durch Carboxylgruppen substituierten Polymers zu vermeiden. Folglich sind die Sulfonierungsbedingungen in vorteilhafter Weise die folgenden: Das zu sulfonierende Polymer wird in einem nicht wässrigen Solvens gelöst (siehe Beispiel II,1). Ein Säuresensor-Molüberschuss (wie das Alken 2M2B) wird hinzugefügt. Das Sulfonierungsreagenz (SO₃) wie der SO₃-DMF-Komplex wird hinzugefügt, und die Reaktion findet bei einer Temperatur statt, die unter der Verdampfungstemperatur des Säurefängers liegt. Die Reaktion wird durch Hinzufügen einer alkalischen Lösung wie NaHCO₃ angehalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird auf Monomere, Oligomere oder Polymere angewendet. Es ist insbesondere geeignet für Polymere wie die zuvor definierten HBGFPP oder die RGTA, und damit vor allem für Dextranderivat-Verbindungen oder Apfelsäure-Copolymere. Damit ist die Erfindung ganz speziell für Polymere mit der Formel: AaXxYy (I)interessant, in der
A ein Monomer ist, X eine RCOOR'-Gruppe darstellt, Y eine O- oder N-Sulfonat-Gruppe gebunden auf A darstellt und einer der folgenden Formeln ROSO3R', RNSO3R' entspricht, die R-Gruppen aliphatische Kohlenwasserstoffketten sind, eventuell verzweigt und/oder ungesättigt und die einen oder mehrere aromatische Ringe enthalten können mit Ausnahme von Benzylamin und Benzylaminsulfonat, R' ein Wasserstoffatom oder ein Kation darstellt, a die Monomeranzahl darstellt, x den Anteil oder den Grad der Substitution der A-Monomere durch X-Gruppen darstellt, y den Anteil oder den Grad der Substitution der A-Monomere durch Y-Gruppen darstellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf Polymeren umgesetzt werden, vor allem der Formel (I), wobei die Bindungen zwischen den Monomeren oder zwischen den Monomeren und ihren Substituenten, wie die Bindungen A-A der A-X der Polymeren der Formel (I) durch in saurem Milieu instabile Funktionen durchgeführt werden, vor allem von Ester-, Amid-, Ether-, (osidischen) Acetalfunktionen oder durch andere Gruppen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist demzufolge besonders für die Zubereitung von sulfatierten monomeren oder oligomeren Zuckern geeignet, wie bestimmte Heparinfragmente, oder auch für Polymere der Familie der RGTA, vor allem, wenn A ein osidisches Monomer ist wie im Fall der Polymere mit Dextranbasis oder aller anderen Polysaccharidverbindungen.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung sind aus den folgenden Beispielen, die sich auf die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens beziehen, ersichtlich, die sich auf die Zeichnungen in der Anlage beziehen, von denen:
die 1 eine grafische Darstellung eines CMDS-Moleküls ist, bei dem das terminale Aldehyd sichtbar ist. Für ein CMDS, bei dem die Werte x und y unterschiedlich von 0 sind, gibt es 3 Typen von Z-Einheiten a) das Aldehyd oder Halbacetal, b) das Carboxymethylglucosid und c) das Sulfonatglucosid.
die 2 das Gleichgewicht zwischen der Aldehydfunktion und dem Halbacetal der terminalen Einheit eines substituierten Dextrans darstellt. Die an anomerer Position substituierte Einheit ist am Gleichgewicht nicht mehr beteiligt.
die 3 das chromatographische Profil eines Moleküls vom Typ CMDS mit strukturellen Merkmalen wie in Tabelle 3 beschrieben darstellt,
die 4 die chromatographischen Profile zeigt, die für dasselbe Produkt PA 07 über verschiedenen Gelfiltrationssäulen ermittelt wurden,
die 5 die Struktur des CMDS zeigt. Diese Beispiele umfassen ebenfalls den Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Verfahren nach dem Stand der Technik, vor allem für die Sulfonierung von Polymeren, die von Dextran abgeleitet sind, wie die CMDS oder CMDBS. Dieser Vergleich zeigt, dass es die in den französischen Patenten Nr. FR 97 15702 und Nr. FR 9907636 vorgeschlagenen Protokolle nicht erlauben, die molekulare Integrität der Dextranpolymere gut zu schützen, da sie zu Fragmentierungen führen, die mit einfachen Methoden nachweisbar und quantifizierbar sind, sowie zu Hydrolysen von Gruppen, die auf die Polymerketten aufpolymerisiert wurden.
Evaluierung der Sulfonierung
Methoden zur Messung der Carboxyl- und Sulfonatgruppen
Um die verschiedenen Sulfonierungsmethoden vergleichen zu können, haben wir den Substitutionsgrad (ds) von Carboxylgruppen (x) und Sulfonatgruppen (y) je Glucoseeinheit gemessen. Da das Dextran ein Glucosepolymer ist, besitzt es auf jeder Glucoseeinheit 3 reaktive OH-Gruppen. Aus diesem Grund ist der theoretisch maximale ds 3. Die Gehaltsbestimmung erfolgt durch titrimetrische Methoden und durch Elementaranalyse anhand der üblichen Protokolle, die nach dem Stand der Technik beschrieben sind.
Mit der titrimetrischen Bestimmung können in Kombination mit der Elementaranalyse die globalen Substitutionsgrade (x und y) der Carboxymethylether- (x) und Sulfonatgruppen (y) ermittelt werden.
Bestimmung der Position der Substitutionsgruppen
Um die Position der auf die osidischen Einheiten aufpolymerisierten Gruppen zu präzisieren, haben wir eine NMR-Analysemethode (Protonen-Kernspinresonanz) gemäß den üblichen, dem Fachmann bekannten Bedingungen verwendet (J. Biol. Chem. 275, 38, 29383-29390, 2000). Wir haben ein Bruker-Spektrometer 200 MHz verwendet.
Methode zur Messung der Fragmentierung der polyosidischen Ketten
Um die Integrität der Polymerkette vor und nach der Additionsreaktion der Sulfonatgruppen zu messen, wurden die im Produkt in Lösung vorhandenen Aldehyde quantitativ bestimmt.
Mit der quantitativen Bestimmung der Aldehyde kann die Anzahl der terminalen Reduktionseinheiten der Produkte bestimmt werden, da nur das terminale Reduktionsende des Polymers eine Aldehydgruppe aufweist, wie auf der 1 gezeigt. Damit wird die Anzahl der Aldehydgruppen auf dem zu sulfonierenden Produkt quantitativ bestimmt; in diesem Fall beträgt sie gleich 1 Mikromol Aldehyd je Gramm Produkt. Dieser Wert muss auf jeden Fall unter oder gleich dem Wert des Ausgangsprodukts bleiben, wenn im Reaktionsverlauf keine Durchtrennungen stattgefunden haben.
In der Tat ist der Wert des freien Aldehyds, gemessen nach der Sulfonierungsreaktion, unter dem Wert, der vor der Einführung der Sulfonatgruppen gemessen wurde (1,0 Mikromol/g für ein CMDS 0,5 mmol/g). Die für ein Produkt von Typ CMDS, wobei x = 0,5 und y = 1,25 ist, üblicherweise ermittelten freien Aldehydwerte bewegen sich in der Nähe von 0,4 Mikromol Aldehyd je Gramm Produkt. Wenn dem gegenüber diese Zahl über den Ausgangswert (1,0) steigt, kommt es zwangsläufig zu Durchtrennungen.
Folglich kann mit dieser Methode die Bildung von Fragmenten gemessen werden, da jede Durchtrennung der Kette zur Entstehung einer neuen reaktiven und nachweisbaren Aldehydgruppe führt.
Methode zur Messung der Molekulargewichte und Untersuchung der scheinbaren Homogenität der Zubereitung
Die Messung des Molekulargewichts wird mittels sterischer Hochleistungs-Ausschlusschromatographie 0,1 M NaNO₃ über Gelfiltrationssäulen KB-804 und KB-805 (Shodex Japon) in Reihe mit 0,7 ml/min durchgeführt. Die Produkte werden am Säulenausgang von einem Minidetektor Dawn Light Scattering und einem Refraktometer vom RID 10 erfasst (J. Biol. Chem. 275, 38, 29383-29390, 2000). Die Homogenität der Zubereitung wird von der Verteilungskurve des Molekulargewichts und der Messung der Breite (in halber Höhe) des Peaks sowie durch die Messung der Kurvensymmetrie widergespiegelt.
Eine zweite Technik der HPLC-Gelfiltration erlaubt, die Homogenität des Moleküls bezüglich der Verteilung der Molekulargewichte zu zeigen. Die 3 zeigt eine Gauß-Verteilung.
Die chromatographischen Bedingungen sind: Säule: TSKgelG4000PWX(TOSOHAAS) bei 30°C, 7,8 mm ID × 30 cm; mobile Phase: NaCl 0,3 M; Durchsatz: 0,7 ml/min; Detektion: IR 0,06.
Es wurde festgestellt, dass für die Produkte, die gemäß Techniken synthetisiert wurden, die die SO₃-Amin-Komplexe verwenden, die Homogenität der Zubereitung ja nach verwendetem Chromatographiesystem schwankt.
Wenn das Produkt von Shodex-Säulen separiert wird, ist der Peak asymmetrisch, aber wenn das zweite System der chromatographischen Separierung verwendet wird, erscheint der demselben Produkt entsprechende Peak symmetrisch, wie auf der 4 gezeigt. Das weist darauf hin, dass die Homogenität der Dispersion der Molekulargewichte in diesen Zubereitungen sowie in denen nach dem Stand der Technik relativ zum verwendeten Separierungssystem ist.
Beispiele für O-Sulfonation von Carboxymethyldextran unter Einsatz der Erfindung und Vergleich mit dem Stand der Technik
In den folgenden Beispielen werden verschiedene O-Sulfonationsreaktionen durch Reagenzien wie der Chlorsulfonsäure, oder auch SO₃-Amin-Komplexe, den SO₃-DMF-Komplex und den SO₃-DMF-Komplex in Anwesenheit des Säuresensors bzw. '-fängers 2-Methyl-2-buten (SO₃-DMF/2m2B), Gegenstand der vorliegenden Erfindung, beschrieben.
Um diese Vergleiche durchführen zu können, wurde das Carboxymethyldextran als Ausgangspolymer ausgewählt.
Reaktion in Anwesenheit des Säuresensors mit dem Komplex SO₃-DMF/2-Methyl-2-buten
5 g Carboxymethyldextran Säureform (CMDH+), (24,27 mmol) werden in 40 mL Formamid in einem 500 mL Kolben gelöst, danach werden 40 mL 2-Methyl-2-buten (25 Äquivalente) unter Rühren hinzugegeben. 7,90 g SO₃-DMF (5 Äquivalente je Glucoseeinheit) werden hinzugegeben. Die Reaktion erfolgt 2 Stunden lang bei 30°C unter Rühren.
Die Reaktion wird durch sehr langsames Umschütten des Reaktionsmediums in 200 ml NaHCO₃ 2% angehalten. Der pH muss ungefähr 7 betragen. Wenn das nicht der Fall ist, wird die Lösung durch Hinzugabe von Soda oder HCl neutralisiert. In jedem Fall darf der pH der Lösung nie unter 5 sein, um einen Abbau der Produkte zu verhindern.
Nach Entfernung der Überschüsse an Wasser, DMF und 2M2B durch Rotationsverdampfung unter geringem Druck wird das Produkt durch tangentiale Ultrafiltration gereinigt, gefolgt von einer Lyophilisation. Man erhält 6 g sulfoniertes Produkt in Form eines weißen Pulvers.

Die folgende Tabelle 1 gibt Auskunft über die Reproduzierbarkeit der O-Sulfonierung von CMDH⁺ (x = 0,52) mit 5 Äquivalenten SO₃-DMF und 25 Äquivalenten 2M2B je Glucoseeinheit. Der EM-Prozentsatz (Abweichung vom Mittelwert) wird anhand der Produkte sichtbar, die aus demselben CMD zubereitet wurden. Tabelle 1

	(x) vor der Sulfonierung	COO^– in mA-qu./g (x) nach der Sulfonierung	EM %	SO₃– in mÄqu./g (y)	EM %	Aldehyd in mol/g	EM %
1	0,52	1,58 (0,53)	2	3,82 (1,28)	5	0,35	5
2	0,52	1,54 (0,50)	1	3,76 (1,25)	1	0,49	3
3	0,52	1,57 (0,52)	1	3,79 (1,26)	1	0,55	3
4	0,52	1,52 (0,48)	2	3,64 (1,17)	1	0,60	8
EM= Abweichung vom Mittelwer t (%)

Die folgende Tabelle 2 gibt über die O-Sulfonierung von CMDH⁺ in Abhängigkeit der Menge des Reagenz SO₃-DMF/2M2B (1 : 5) Auskunft. Tabelle 2

Äquivalente SO₃/DMF(2M2B) je Glucoseeinheit	Substitutionsgrad (ds)
Äquivalente SO₃/DMF(2M2B) je Glucoseeinheit	X	Y
0,0	0,50	–
2,0 (10,0)	0,49	0,42
2,5 (12,5)	0,52	0,89
3,0 (15,0)	0,52	1,00
4,0 (20,0)	0,49	1,10
5,0 (25,0)	0,52	1,20

Gemäß diesem Protokoll wurden zehn unabhängige Behandlungen durchgeführt: Fünf Behandlungen wurden streng gemäß demselben Protokoll mit 5 Äquivalenten SO₃-DMF und 25 Äquivalenten 2M2B gemäß Tabelle 1, Eingaben 1-4 durchgeführt. Fünf andere Behandlungen wurden mit von 2 bis 5 Äquivalenten Reagenz je Glucoseeinheit schwankender Rea genzmenge SO₃-DMF/2M2B durchgeführt. Das Verhältnis SO₃-DMF versus 2M2B bleibt immer konstant 1 : 5 (Tabelle 2, Eingaben 1-5).
Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode für die Herstellung von Produkten, die Ethergruppen und osidische Bindungen besitzen, reproduzierbar ist.
In allen Fällen ist der EM-Prozentsatz (Abweichung vom Mittelwert) unter dem maximalen Grenzwert, der auf 10% festgelegt ist.
Es ist darauf hinzuweisen, dass (x) nicht signifikant schwankt (EM <2%) (es findet keine Decarboxylierung statt) und dass (y) < 3% ist.
Die Messungen der Molekulargewichte bestätigen die Abwesenheit von Heterogenität (3 entspricht dem Produkt, das in Tabelle 1, Eingabe 4, beschrieben ist) PM = 67500 +/–7500.
Die ermittelten Ergebnisse zeigen, dass die erzielten Sulfonierungsgrade bei Anwesenheit von 2M2B von der Reaktionsstöchiometrie abhängen. Weiterhin wird der Grad der Carboxymethylethergruppen, die zuvor auf CMD aufpolymerisiert wurden, nicht von den Reaktionsbedingungen beeinträchtigt.
Definition des Moleküls durch Protonen-Kernspinresonanz
Die Analyse der synthetisierten Produkte wurde unter Verwendung derartiger analytischer Techniken wie der titrimetrischen Bestimmung, der Elementaranalyse, der quantitativen Bestimmung der reduzierenden Zucker und der HPLC/Gelfiltration mit MALLS-Detektion und ¹H NMR-Spektroskopie, durchgeführt.

Mit der ¹H NMR-Spektroskopie können die Position und das Verhältnis der Substitutionsgrade der verschiedenen Gruppen auf den 3 Reaktionshydroxylen bei C-2 und C-3,4 der osidischen Einheiten des Ausgangsdextrans genau bestimmt werden. Die folgende Tabelle 3 gibt die Position der X- und Y-Substitutionen auf A an, die mit Hilfe der NMR-Analyse für das Beispiel des Dextrans vom Typ CM-D-S ermittelt wurde. Tabelle 3

Poly mer	Ds			Positionen der Grup-pen, ausgedrück t in ds	Molekulargewicht
	Ds			X					Y
	X	Y	OH	C2		C3+C 4	C2	C3+C 4
CMDS	0,5 0± 0,4	1,2 0± 0,4	1,3 0± 0,4	0,3 5		0,15	0,5 2	0,68	67.000 ± 5.000
d.s.: Substitutionsgrad für jede Gruppe je Glucoseeinheit (A). X = CM: CH₂COONa; Y = SO₃Na. OH: steht für die Anzahl der OH-Gruppen, die nicht durch Monomer A reagiert haben. d.s. wird auf der Grundlage der restlichen Hydroxylgruppen berechnet, die nicht substituiert wurden (zu Anfang beträgt die Anzahl freier OH 3 je Glucosemonomer A. (n = 3). C3+C4: allgemeine Substitution in die Positionen C-3+C-4, berechnet für X, Y und freies OH als Differenz zwischen dem d.s. insgesamt und dem an Position C-2 bestimmten d.s.

Vergleich mit dem Stand der Technik
O-Sufonierung durch Chlorsulfonsäure. Reaktion mit ClSO₃H
5 g Carboxymethyldextran (24,27 mmol, ein Äquivalent je Glucoseeinheit) werden 162 mL Dichlormethan hinzugefügt. Man erhält ein heterogenes Gemisch. Das Gemisch wird stark gerührt, um eine homogene Suspension des Produkts in dem Dichlormethan zu erzielen.
1,6 mL Chlorsulfonsäure (24,27 mmol, ein Äquivalent je Glucoseeinheit) werden dem Gemisch langsam hinzugefügt. Das Reaktionsmedium wird 2 Stunden gerührt. Während der Reaktion bilden sich braun gefärbte Produktagglomerate. Das Gemisch wird filtriert (Glassinterfilter Nr. 4), und das aufgefangene Produkte zweimal mit 100 mL Dichlormethan, dreimal mit 100 mL eines Gemischs aus Dichlormethan/Dioxan (1:1) und zuletzt mit 100 mL Dioxan gewaschen. Das gewonnene Produkt wird in 200 mL destilliertem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird durch Hinzufügen von Soda 2 M auf einen pH von 9,5 gebracht, danach auf pH 7 durch Hinzufügen von HCl bis –0,05 mol/L.
Die Lösung wird filtriert, konzentriert und anhand von 500 mL Methanol ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wird dann, bevor er gereinigt wird, in einem Ofen getrocknet.
Gemäß diesem Protokoll wurden drei unabhängige Behandlungen durchgeführt:
eine Behandlung mit einem Äquivalent Chlorsulfonsäure bei Raumtemperatur,
eine Behandlung mit zwei Äquivalenten Chlorsulfonsäure bei Raumtemperatur,
eine Behandlung mit zwei Äquivalenten Chlorsulfonsäure bei 4°C.
Reaktion mit SO₃-Amin oder -Amidkomplexen
Die darunter detailliert beschriebenen Protokolle wurden unter Verwendung verschiedener Komplexe auf SO₃-Basis durchgeführt: SO₃-Pyridin, SO₃-Trimethylamin, SO₃-Triethylamin und SO₃-DMF (Dimethylformamid).
Die nachfolgende Tabelle 4 gibt über die strukturellen und biologischen Eigenschaften der Produkte Auskunft, die durch O-Sulfonierung eines CMD (d.s. C = 0,56) durch verschiedene SO₃-Komplexe gewonnen wurden.
5 g Carboxymethyldextran (24,27 mmol, ein Äquivalent je Glucoseeinheit) werden in einem Kolben 500 mL in 50 mL Formamid aufgelöst. Um die Auflösung des Carboxymethyldextrans zu fördern, wird die Temperatur des Reaktionsmilieus auf zirka 50°C geführt. Sobald das Produkt solubilisiert ist, wird die Lösung auf Raumtemperatur gebracht. Für jede durchgeführte Reaktion wird eine Lösung, die jeweils die in nachfolgender Tabelle 4 aufgeführten Komplexe enthält, unabhängig in 50 mL Formamid vorbereitet und der Carboxymethyldextranlösung unter Rühren hinzugefügt. Die Reaktion erfolgt während 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Die Reaktion wird durch Hinzufügen von 21 mL destilliertem Wasser 4°C angehalten. Es wird gemischt, und man führt den pH des Mediums mit Hilfe einer Lösung NaOH 2M auf 7,5-8.
Nach Entfernung des überschüssigen Wassers durch Rotationsverdampfung unter geringem Druck wird das Produkt durch tangentiale Ultrafiltration gereinigt, gefolgt von einer Lyophilisation. Man erhält 6 g sulfatiertes Produkt in Form eines weißen Pulvers.
Gemäß diesem Protokoll wurden vier unabhängige Behandlungen durchgeführt:
eine Behandlung mit zwei Äquivalenten SO₃-Pyridin-Komplex bei Raumtemperatur,
eine Behandlung mit zwei Äquivalenten SO₃-Trimethylamin-Komplex bei Raumtemperatur,
eine Behandlung mit zwei Äquivalenten SO₃-Triethylamin-Komplex bei Raumtemperatur,
eine Behandlung mit zwei Äquivalenten SO₃-DMF-Komplex bei Raumtemperatur.
Desweiteren wurde eine Reaktion (Tabelle 4, Zeile 8) exakt gemäß dem Protokoll durchgeführt, das in Beispiel 5 des französischen Patents Nr. FR 97 15702 beschrieben ist, wo die Solubilisierung des CMD durch Bildung von Triethylammoniumsalzen erreicht wird. Das SO₃-Pyridin in einem komplexen molaren Verhältnis von freiem OH gleicht 0,4 (was 2 Äquivalenten Komplex je Glucoseeinheit entspricht) wird in DMSO gelöst und der Polymerlösung hinzugegeben. Die Reaktion erfolgt in Dimethylformamid bei Raumtemperatur.

Die Tabelle 4 zeigt die strukturellen Eigenschaften mehrerer Polymere von Typ CMDS, die nach verschiedenen Methoden synthetisiert wurden und welchen Zwängen diese unterworfen sind. Das erfindungsgemäße Verfahren entspricht den Eingaben 10 und 11 der Tabelle 4 und den in Beispiel Nr. 1 beschriebenen Bedingungen. Tabelle 4

	Sulfonie rungsreagenz	Reaktionsbedingungen	X	Y	x y terminales Aldehyd (mol/g)	Akti vität (in vivo)	Toxi zität (in vivo)
1	–	–	0,56	0,0	1,00	(–)	(–)
2	ClSO₃H	1 Äqu./22°C	0,41	0,2 2	12,7	variabel	variabel
3	ClSO₃H	2 Äqu./22°C	0,37	0,3 5	11,0	variabel	variabel
4	ClSO₃H	2 Äqu./4°C	0,51	0,3 5	4,0	variabel	variabel
5	SO₃-Me₃N	2 Äqu./22°C	0,50	0,0 0	1,9	(+)	(+)
6	SO₃-Et₃N	2 Äqu./22°C	0,29	0,4	1,6	(+)	(+)
7	SO₃-Pyridin	2 Äqu./22°C	0,44	0,1 7	1,8	(+)	(+)
8	SO₃-Pyridin	2 Äqu./22°C	1,00 *	0,3 5	1,9	(–)	(+)
9	SO₃-DMF	2 Äqu./22°C	0,37	0,2 3	1,5	Nd	Nd
10	SO₃-DMF/2M2B	2 Äqu./22°C	0,57	0,6 2	0,8	(+)	(–)
11	SO₃-DMF/2M2B	5 Äqu./22°C	0,55	1,1 5	0,5	(+)	(–)
Nd = nicht bestimmt * Das Ausgangsprodukt dieses Versuchs wurde in CM mit 1 Rest je Glucoseeinheit substituiert.

Die verschiedenen Produkte vom Typ DCS wurden aus einer einzigen Charge carboxyliertem Dextran (Tabelle 4, Eingabe 1) mit einem Carboxylat-Substitutionsgrad von x = 0,56 synthetisiert. Nach ihrer Purifizierung wurden die Produkte anhand der verschiedenen Techniken zur Strukturanalyse charakterisiert.
Die titrimetrischen Ergebnisse zeigen, dass die O-Sulfonierungsreaktionen durch die Chlorsulfonsäure und die SO₃-Amid- oder -Aminkomplexe eine Spaltung der Etherbindungen der aufpolymerisierten Caroxylgruppen (dsC oder x) und einen Abbau der Polymerkette (Molekulargewicht und quantitative Bestimmung der reduzierenden Zucker) hervorrufen. Diese Spaltung ist um so ausgeprägter, je größer die Anzahl Reagenzäquivalent ist. Dieser Abbau kann durch Absenken der Temperatur des Reaktionsmediums begrenzt werden.
Es ist darauf hinzuweisen, dass das durch den SO₃-Et₃N-Komplex vorbereitete Produkt (Tabelle 4, Eingabe 6) das am meisten sulfonierte Produkt ist, aber auch der stärksten Decarboxylierung unterworfen wurde. Andere Produkte bestätigen diesen Trend.
Die zwei letzten Tabelleneingaben (Eingaben 10 und 11) bringen das Produkt 2M2B ins Spiel, das wie ein Säuresensor bzw. -fänger wirkt, um den Abbau der Etherbindungen der aufpolymersierten Carboxylatgruppen und der Polymerkette und den Abbau der Kette zu begrenzen.
Es ist festzustellen, dass bei Anwesenheit des Produkts 2M2B der dsC des nach Sulfonierung entstandenen Produkts mit dem Vorläufer-dsC identisch ist. Das bestätigt sich, unabhängig von der Menge des hinzugefügten Reagenz. Auch mit 2,5 Mal mehr Komplex SO₃-DMF (Eingabe 11) erhalten wir zwar einen höheren dsS, der dsC hingegen ändert sich nicht. Damit ist die Effizienz des Protokolls bei Anwesenheit von 2M2B nachgewiesen.
Während es für die bereits bekannten Techniken der O-Sulfonierung zu einer Decarboxylierung und einem Abbau der Polymerkette kommt, erlaubt die Technik der O-Sulfonierung bei Anwesenheit des Produkts 2M2B, das Prob lem des Verlusts der auf das Dextran aufpolymerisierten Carboxylatgruppen zu lösen.
Die Messungen der in vivo-Aktivitäten sowie der in vivo-Toxizität wurden anhand von Modellen der Muskelregenerierung des Muskels Extensor Digitorum Longus des Hinterbeins der adulten Rate nach Zerquetschen gemäß den von GAUTRON J., KEDZIA C., HUSMANN I. und BARRITAULT D. in „Accélération de la régénération d'un muscle squelettique de rat adulte par des dérivés de dextranes" [Beschleunigung der Regenerierung eines Skelettmuskels der adulten Ratte durch Dextranderivate], C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la Vie (1995), 318: 671-676 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die Regenerierung wurde auf histologischen Schnitten durch Messung der Anzahl der regenerierten Muskelfasern gemessen. Die Toxizität wurde anhand einer Abnahme der Bildung von Fasern (verglichen mit den Kontrollen, denen eine physiologische Serumlösung injiziert wurde) sowie durch die Analyse des Aussehens der Regeneration und der Identifizierung von abnormen Regenerationsbereichen oder die Bildung von entzündlichen Bereichen, die eine Degenerierung des Muskelgewebes zeigen, gemessen.
Verallgemeinerung des Verfahrens für andere Polymertypen

Die Tabelle 5 zeigt die Synthese mehrerer Polymere der Formel AaXxYy, in der A ein Zucker ist und a größer als 1 ist anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens und ihre analytischen Eigenschaften. Tabelle 5

	Ausgangsprodukt_dsc	Umfang	dsS	dsC	Terminales Aldehyd (mol/g)
1	Dextran (D)	2 g	1,19	–	0,15 mol/g
2	D	2 g	1,24	–	0,15 mol/g
3	CM₅₀-D	2 g	1,22	0,5	0,20 mol/g
4	CM₅₀-Cellulose (C)	2 g	1,23	0,5	0,20 mol/g
5	CM₅₀-D	10 g	1,17	0,5	0,20 mol/g
6	CM₅₀-C	10 g	1,22	0,5	0,20 mol/g
7	CM₆₀-B₆₀-D	50 g	1,24	0,5	0,20 mol/g
8	CM₆₀-B₂₀-C	10 g	1,23	0,6	0,05 mol/g
9	CM60-PhA60-D	10 g	1,23	0,6	0,05 mol/g
10	CM60-PhA60-C	10 g	1,22	0,6	0,05 mol/g

Claims

Verfahren zur Sulfonierung einer Verbindung, eine oder mehrere freie Hydroxylfunktionen und/oder eine oder mehrere primäre oder sekundäre substituierte oder nicht substituierte Aminfunktionen aufweisend, dadurch gekennzeichnet, dass es die Behandlung der besagten Verbindung mit dem Komplex SO₃-DMF in Gegenwart eines Säuresensors, ausgewählt aus der Gruppe, die die Alkene oder Alkine bei einem Siedepunkt unter 100°C oder ein Gemisch derselben, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Säuresensor aus der Gruppe ausgewählt ist, die das 2-Methyl-2-buten (2M2B), das 2-Methyl-propen, das 2-Methyl-penten oder ihre Isomere oder ein Gemisch derselben umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) die Solubilisierung oder die Zubereitung einer homogenen Lösung der zu sulfonierenden Verbindung in einem Solvens oder einem nicht wässrigem Co-Solvens, wie dem Dimethylformamid (DMF) oder einem Co-Solvens, zusammengesetzt aus Formamin und aus Dimethlyformamin, b) die Zugabe bei Raumtemperatur (20-22°C) eines Molüberschusses eines Säuresensors, wie des 2-Methyl-2-butens, mischbar in dem Co-Solvens, c) die schnelle Zugabe des Komplexes SO₃-DMF unter Rühren, d) das Rühren des im vorangehenden Schritt hergestellten Gemischs während einer bis zwei Stunden bei einer kontrollierten Temperatur und unter 30°C, e) das Anhalten der Reaktion durch schrittweise Zugabe des Gemischs auf eine alkalische Lösung, zum Beispiel eine Lösung mit 2% Natriumhydrogencarbonat ((NaHCO₃) oder ein anderes Alkali, mit einer pH-Kontrolle nie unter 4, um die Salze der zu sulfonierenden Verbindung herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es die Reinigung der in Schritt (e) hergestellten sulfonierten Verbindung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es vor dem Schritt (a) die Protonierung der besagten Verbindung umfasst, um ihre Solubilisierung bei Schritt (a) zu fördern.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu sulfonierende Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die die Monomere, die Oligomere und die Polymere umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu sulfonierende Verbindung ein Polymer der Formel AaXxYy (I)ist, in der A ein Monomer ist, X eine RCOOR'-Gruppe darstellt, Y eine Gruppe O oder N-Sulfonat gebunden auf A darstellt und einer der folgenden Formeln ROSO₃R', RNSO₃R' entspricht, die R-Gruppen aliphatische Kohlenwasserstoffketten sind, eventuell verzweigt und/oder ungesättigt und die einen oder mehrere aromatische Ringe enthalten können mit Ausnahme von Benzylamin und Benzylamin sulfonat, R' ein Wasserstoffatom oder ein Kation darstellt, a die Monomeranzahl darstellt, x den Anteil oder den Grad der Substitution der A-Monomere durch X-Gruppen darstellt, y den Anteil oder den Grad der Substitution der A-Monomere durch Y-Gruppen darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Derivat des Dextrans oder ein Copolymer von Apfelsäuren ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer Bindungen zwischen den Monomeren oder zwischen den Monomeren und ihren Substituenten umfasst, durchgeführt von in saurem Milieu instabilen Funktionen, vor allen von Ester-, Amid-, Ether-, Acetalfunktionen.