ES2292851T3 - Procedimiento de sulfonacion de compuestos que comprenden grupos hidroxilos (oh) libres o aminas primarias o secundarias. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de sulfonación de compuesto que presenta una o varias funciones hidroxilos libres y/o una o varias funciones aminas primarias o secundarias sustituidas o no, caracterizado porque comprende el tratamiento de dicho compuesto con el complejo SO3-DMF en presencia de un captador de ácido, elegido entre el grupo que comprende los alquenos o alquinos de punto de ebullición inferior a 100 ºC o una de sus mezclas.
Description
Procedimiento de sulfonación de compuestos que
comprenden grupos hidroxilos (OH) libres o aminas primarias o
secundarias.
La presente invención tiene por objeto un
procedimiento de preparación de compuestos sulfatados, en
condiciones, no degradantes, reproducibles y compatibles con
utilizaciones de dichos compuestos en las que debe describirse una
definición molecular precisa, como por ejemplos como agentes
terapéuticos.
El procedimiento de la invención se aplica a
todo compuesto monomérico, oligomérico o polimérico que comprende
grupos hidroxilo (OH) libres o aminas primarias o secundarias
sustituidas o no. Más particularmente, la invención se refiere a un
procedimiento de O y N sulfonación, de polímeros
funcionalizados.
Los procedimientos de preparación de compuestos
sulfatados descritos en la técnica anterior inducen generalmente
roturas de las cadenas de los polímeros durante la O o N sulfonación
y por lo tanto la formación de residuos de reacción potencialmente
tóxicos. El procedimiento según la presente invención pretende
precisamente evitar este inconveniente al permitir la adición
controlada de grupos sulfonatos en condiciones acondicionadas tal
que la integridad estructural del polímero inicial, como un
oligosacárido, no sea alterada.
Se conoce en la técnica anterior polímeros
funcionalizados con propiedades anticoagulantes y principalmente
una familia de derivas obtenidos por sustituciones, sobre una cadena
de dextranos (D), grupos carboximetílicos (CM),
metil-bencilamida (B) y
metil-bencilamidosulfonato (S), designados bajo la
abreviación CMDBS. Los procedimientos de preparación de estos
polímeros han sido descritos en particular en la patente francesa
publicada con el Nº 2 461 724 así como en la patente de EE.UU.
publicada con el Nº 4 740 594. Ninguna de estas patentes proporciona
un análisis preciso de las estructuras poliméricas obtenidas y los
procedimientos descritos no permiten aportar la evidencia de que
los productos obtenidos son homogéneos. Las condiciones
experimentales de la reacción de sulfonación descritas en estas
patentes dan prioridad a la fijación de sulfonas sobre los grupos OH
libres del residuo glucosídico, y el análisis presentado no permite
poner claramente en evidencia la presencia de
bencilamina-sulfonato.
Se han descrito otros miembros de la familia de
los CMDBS, designados HBGF por "Heparin Binding Growth Factor"
(factor de crecimiento unido a heparina en el idioma inglés), como
agentes de cicatrización en la patente de EE.UU. publicada con el
Nº 5693625. Los HBFGPP se describen también por sus propiedades de
estimulaciones de la reparación y de la regeneración de lesiones
inducidas en los tejidos musculares (Patente francesa Nº 2 718
024), nervioso (Patente francesa Nº 2 718 026), del tracto digestivo
(Patente francesa Nº 2 718 023) así como su propiedad
antiinflamatoria (Patente francesa Nº 2 718 025). Estas patentes
establecen una serie de criterios funcionales que permiten cribar
entre todos los polímeros biocompatibles los que responden a las
cuatro propiedades funcionales siguientes:
- -
- Proteger los factores de crecimiento a la afinidad por heparina (HBGF) como los factores de crecimiento de los fibroblastos tales como los FGF1&2 o los factores transformantes, como el TGF beta, contra las degradaciones proteolíticas así como potenciar sus actividades biológicas en una serie de ensayos sobre cultivo celular.
- -
- Presentar una actividad anticoagulante inferior a 10 unidades internacionales por mg.
- -
- Inhibir la actividad de la elastasa leucocitaria en condiciones fisiológicas.
- -
- Inhibir la actividad de la plasmina en condiciones fisiológicas.
La solicitud de patente francesa Nº 9809309
describe la estructura de una familia de polímeros, designados RGTA
por "ReGeneraTing Agent" (agente regenerador en el idioma
inglés), que presentan propiedades de los HBGFPP y describe su
procedimiento de preparación y propiedades. Los RGTA presentan
efectos antifibróticos, principalmente que permiten mejorar la
calidad de las cicatrices cutáneas, de los efectos antioxidantes
principalmente para tratar los efectos deletéreos de los radicales
libres (después de radiaciones ionizantes o durante el estrés
oxidativo inducido por isquemias) y propiedades de regulación de la
homeostasia tisular principalmente de masas óseas. Estas propiedades
completan aquellas descritas para los HBGFPP.
Los polímeros descritos en la patente francesa
Nº 98 09309 responden a la fórmula siguiente:
(I)AaXxYy
en la
que:
A es un monómero; X representa un grupo RCOOR';
Y representa un grupo O o N-sulfonato fijado sobre A
y que responde a una de las fórmulas siguientes ROSO3R'; RNSO3R';
los grupos R son cadenas hidrocarbonadas alifáticas, opcionalmente
ramificadas y/o insaturadas y que pueden contener uno o varios
ciclos aromáticos con la excepción de la bencilamina y de la
bencilamina-sulfonato; R' representa un átomo de
hidrógeno o un catión; a representa el número de monómeros; x
representa la tasa o grado de sustitución de los monómeros A con
grupos X; y representa la tasa o grado de sustitución de los
monómeros A con grupos Y.
Entre los polímeros descritos en la patente
francesa Nº 98 09309, se pueden citar derivados de dextrano como
los CDMS. Se han descrito igualmente polímeros del tipo CMDS como
anticoagulantes (Maiga et al. Carbohydrate Polymers, 1997,
32, 89-93).
En todos estos ejemplos de la técnica anterior,
los métodos de síntesis descritos no permiten la obtención de
productos según los criterios de reproducibilidad suficiente que
asegure el mantenimiento de la integridad molecular y la ausencia
de contaminantes. En efecto, si los procedimientos de sustituciones
de grupos carboxílicos se describen ampliamente en la técnica
anterior y permiten la sustitución controlada y acondicionada
asegurando una reproducibilidad suficiente, los procedimientos de
sulfonación son más difíciles de dominar.
Los procedimientos de sulfonación se realizan a
un pH muy ácido lo que no permite preservar la integridad de la
cadena del polímero principalmente si esta está constituida por
azúcares naturales. Además, estas condiciones de sulfonación
conllevan descarboxilaciones difíciles de controlar.
Así numerosos trabajos de la técnica anterior
describen métodos que permiten sulfatar polisacáridos del tipo Aa.
Por ejemplo el dextrano sulfato (u O-sulfonato)
(DS), el
carboximetil-dextrano-sulfato
(CM-D-S) (u
O-sulfonato), u otros oligosacáridos sulfatos (u
O-sulfonatado) como el xilano o el almidón se han
sulfatado (u O-sulfonatado) mediante procedimientos
del tipo del que se describe en la patente de EE.UU. Nº 4 814437.
Entre estos métodos, se han descrito los que proponen una
sulfonación de polisacáridos que utilizan ácidos fuertes como
agentes de sulfonación por numerosos autores. Por ejemplo, las
patentes de EE.UU. Nº 4 740 594 y Nº 4 755 379 y francesa Nº 2 772
382 describen un tratamiento con ácido clorosulfónico que utiliza
diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) como disolvente para la producción
de moléculas del tipo CM-D-S y
CM-D-B-S. Este
procedimiento ya se había descrito ampliamente en antiguos trabajos
ya que se había utilizado el mismo ácido para la síntesis del DS
con la piridina como disolvente de carácter básico (Ricketts,
Biochem J. 51, 210-133, 1952). El ácido sulfúrico y
el ácido sulfónico en presencia de la formamida también han sido
utilizados para la preparación de DS a bajas temperaturas, como se
describe en las patentes de EE. UU. Nº 3 498 972 y 3 141 014. Se
conoce que estas condiciones de reacción fuertemente ácidas
provocan la degradación parcial de los mismos productos en presencia
de disolventes de carácter básico o a bajas temperaturas. Conllevan
una importante fragmentación de la cadena macromolecular en el caso
de productos poliméricos y una hidrólisis parcial de ciertos grupos
funcionales contenidos en las moléculas a sulfonatar. Se han
aportado varias mejoras a estas condiciones de fuerte acidez con la
utilización de medios mejor tamponados o de menor acidez. Así, la
utilización de complejos de trióxido de azufre (SO_{3}) como
agentes de sulfonación menores severos que los ácidos sulfúricos y
sulfónicos ya se han introducido (Archives of biochemistry and
biophysics, 95, 36-41, 1961; tetrahedron letters,
29, 7, 803-806, 1988; J. Chem. Soc. Perkin trans.
1, 157, 1995). Se han comercializado varios complejos del tipo
SO_{3}-amina, como el
SO_{3}-ME_{3}N (trimetilamina), el
SO_{3}-Et_{3}N (trietilamina), el
SO_{3}-piridina, y el
SO_{3}-piperidina. Estos reactivos se utilizan en
un medio anhidro en disolventes como DMF, formamida y DMSO. Sin
embargo estos métodos a pesar de ser utilizados para la producción
de polisacáridos sulfatos, principalmente como los derivados de
dextrano, funcionalizados por grupos éster, éter o amida, presentan
inconvenientes mayores ya que
conllevan:
conllevan:
- -
- la fragmentación aleatoria de la cadena macromolecular de los polímeros, sin embargo en proporciones menos importantes que con los ácidos sulfónicos,
- -
- una hidrólisis parcial de los grupos funcionales ya presentes sobre los polímeros citados anteriormente, y
- -
- generan productos secundarios por formación de aminas que contaminan las preparaciones y que han resultado ser tóxicos después de inoculación in vivo (Brain Res 16, 208-2, 473-478, 1981).
Estas técnicas se han mejorado más con el fin de
eliminar al máximo los residuos tóxicos así como lo propone para la
piridina el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. Nº 4 814
437. En efecto, los SO_{3}-aminas utilizados en
este procedimiento de la técnica anterior son reactivos con los
grupos aldehídos presentes sobre el extremo reductor de la mayoría
de los polisacáridos, principalmente en el dextrano, y el enlace así
formado es covalente y por lo tanto permanente.
El inconveniente de la utilización de complejos
del tipo SO_{3}-amina se ha superado igualmente al
emplear complejos del tipo SO_{3}-amida como el
SO_{3}-DMF y el SO_{3}-FA. Por
ejemplo, las sales de DS, más particularmente las sales de sodio,
se preparan actualmente como se describe en la patente de EE.UU. Nº
4 855 416, por la O-sulfonación del dextrano con un
complejo de SO_{3} asociado a la formamida
(SO_{3}-FA) con la formamida como disolvente.
Este método comprende la formación in situ del complejo
SO_{3}-FA y luego su reacción con el dextrano. La
fuerte reactividad del complejo SO_{3}-FA provoca
una fuerte acidez del medio de reacción a pesar de la utilización
de una atmósfera inerte (N_{2}) y de disolventes anhidros. Este
hecho conlleva igualmente la degradación de la cadena
macromolecular.
Otro complejo no-aminado muy
utilizado es el SO_{3}-DMF. También se ha
propuesto en la patente francesa Nº 2 772 382 para la síntesis de
polisacáridos sulfatados del tipo
CM-D-S y
CM-D-B-S. Sin
embargo, el complejo SO_{3}-DMF como el complejo
SO_{3}-FA, producen una fuerte acidez del medio de
reacción, lo que genera igualmente la fragmentación de la cadena
macromolecular y la hidrólisis de grupos lábiles que conlleva una
pérdida del control de la síntesis y de los productos finales. Este
procedimiento es por lo tanto tan imperfecto como los otros
procedimientos en el caso de la preparación de polímeros
poli-aniónicos de altos pesos moleculares que no se
desea cortar de una manera aleatoria y no controlada.
El documento US 5 229 504 describe un
procedimiento para preparar quitosano sulfonatado, en particular por
reacción de un complejo SO_{3}-DHF con quitosano
tratado previamente.
Es en esta inquietud de mejora de los métodos de
síntesis, que se han descrito protocolos que permiten la obtención
de CMDBS y CMDS en la patente francesa Nº 97 15702. Según la patente
francesa Nº 97 15702, esta mejora permite por una parte la
obtención de derivados de dextrano que presentan una mayor
homogeneidad de peso molecular y por otra parte controlar las tasas
de sustitución que aseguran una mejor homogeneidad de las
estructuras y así una mejor definición. Ahora bien, el método
descrito en la patente francesa Nº 97 15702 reposa, como en la
técnica anterior, en la sulfonación de polisacáridos que utilizan
SO_{3}-amina (DMF, piridina o trietilamina), y
los ejemplos dados se obtienen exclusivamente con la
SO_{3}-piridina. Además, este método conduce a la
formación de trazas residuales de piridina cuya toxicidad para el
ser humano es bien conocida y no parece permitir la ausencia de
formación de fragmentos de la cadena del polisacárido.
La presente invención tiene precisamente por
objetivo ofrecer nuevos métodos generales de sulfonación que
permiten controlar con mucho rigor y precisión las condiciones de
sustituciones de grupos sulfonatos sobre compuestos que contienen
funciones hidroxilos o funciones aminas primarias o secundarias.
Este objetivo se alcanza gracias a un
procedimiento de sulfonación de compuesto que presenta una o varias
funciones hidroxilos libres y/o una o varias funciones aminas
primarias o secundarias sustituidas o no, caracterizado porque
comprende el tratamiento de dicho compuesto con el complejo
SO_{3}-DMF en presencia de un captador de ácido,
elegido entre el grupo que comprende: los alquenos o alquinos con
punto de ebullición inferior a 100ºC o una de sus mezclas.
Se entiende por captador de ácido una sustancia
o una mezcla de sustancias capaces de reaccionar selectivamente con
los protones libres en solución. Después de la adición de este
captador de ácido en la mezcla de reacción, los protones son
atrapados por el captador de ácido y no participan más al descenso
del pH ya que ya no son reactivos.
Ventajosamente, el captador de ácido es un
buteno como el
2-metil-2-buteno
(2M2B), 2-metil-propeno,
2-metil-penteno, o sus isómeros, o
una de sus mezclas.
El procedimiento según la invención es
remarcable porque permite evitar la aplicación de pH muy ácidos y
así suprimir el riesgo de roturas de los compuestos tratados.
Además, presenta la ventaja de no introducir sustancias tóxicas
difíciles o imposibles de eliminar completamente.
Más particularmente, el procedimiento según la
invención comprende las etapas siguientes:
- a)
- la disolución o la preparación de una solución homogénea del compuesto a sulfonatar en un disolvente o un co-disolvente anhidro, como la dimetilformamida (DMF) o un co-disolvente compuesto de formamida y de dimetilformamida.
- b)
- la adición a temperatura ambiente (20-22ºC) de un exceso molar de un captador de ácido, como el 2-metil-2-buteno, miscible en el co-disolvente.
- c)
- la adición rápida del complejo SO_{3}-DMF bajo agitación,
- d)
- la agitación de la mezcla obtenida en la etapa precedente durante una o dos horas a una temperatura controlada e inferior a 30ºC,
- e)
- la parada de la reacción por adición progresiva de la mezcla sobre una disolución alcalina, por ejemplo una solución al 2% de bicarbonato de sodio (NaHCO_{3}) u otra base, con un control de pH nunca inferior a 4 con el fin de obtener las sales del compuesto a sulfonatar.
El procedimiento de la invención comprende
ventajosamente la purificación del compuesto sulfonatado obtenido en
la etapa (e), por ultrafiltración tangencial contra el agua (ella
misma de calidad inyectable para el ser humano) a través de una
membrana de ultrafiltración con un umbral de corte de 100
Dalton.
Preferentemente, el disolvente empleado en la
etapa (a) no es dimetilsulfóxido (DMSO), ya que los trabajos
realizados en el marco de la presente invención han puesto en
evidencia que este disolvente se elimina muy difícilmente de las
preparaciones de polisacáridos sulfonatados y por lo tanto
constituye un obstáculo para su utilización en la preparación de
formas farmacéuticas.
Cuando el compuesto a sulfonatar es poco soluble
en un disolvente o un co-disolvente anhidro una
forma particular de realización del procedimiento consiste en
protonar dicho compuesto con el fin de favorecer su disolución. Se
trata principalmente de compuestos a sulfonatar que son polímeros de
un azúcar, como el dextrano, sustituido con uno o varios grupos
carboxilato, cuya protonación conduce a la formación de grupos
-COOH, por ejemplo por el paso sobre una columna de intercambio de
cationes.
Así, las condiciones de sulfonación son
suficientemente adecuadas y controladas para evitar una
descarboxilación del polímero inicialmente sustituido con grupos
carboxílicos. En consecuencia, las condiciones de sulfonación son
ventajosamente las siguientes:
El polímero a sulfonatar se disuelve en un
disolvente anhidro (véase el ejemplo II,1). Un exceso molar de
captador de ácido (como el alqueno 2M2B) se adiciona. Se adiciona el
reactivo de sulfonación (SO3) como el complejo
SO_{3}-DMF y la reacción se desarrolla a una
temperatura inferior a la temperatura de evaporación del captador de
ácido. La reacción se para mediante la adición de una solución
alcalina, como NaHCO_{3}.
El procedimiento de la invención se aplica a
monómeros, oligómeros o polímeros. Se adapta más particularmente a
los polímero como los HBGFPP o los RGTA definidos anteriormente, y
por lo tanto principalmente a compuestos derivados de dextranos o
de copolímeros de ácidos málicos. Así, la invención se interesa más
especialmente en los polímeros de fórmula:
(I)AaXxYy
en la
que:
A es un monómero; X representa un grupo RCOOR';
Y representa un grupo O o N-sulfonato fijado sobre A
y que responde a una de las fórmulas siguientes ROSO3R'; RNSO3R';
los grupos R son cadenas hidrocarbonadas alifáticas, opcionalmente
ramificadas y/o insaturadas y que pueden contener uno o varios
ciclos aromáticos con la excepción de la bencilamina y de la
bencilamina-sulfonato; R' representa un átomo de
hidrógeno o un catión; a representa el número de monómeros; x
representa la tasa o grado de sustitución de los monómeros A con
grupos X; y representa la tasa o grado de sustitución de los
monómeros A con grupos Y.
El procedimiento de la invención puede
realizarse sobre polímeros, principalmente de fórmula (I), donde los
enlaces entre los monómeros o entre los monómeros y sus
sustituyentes, como los enlaces A-A o
A-X de los polímeros de fórmula (I), se realizan
con funciones inestables en medio ácido, principalmente funciones
éter, amida, éter, acetal (osídico) u otros grupos.
El procedimiento de la invención está adaptado
por lo tanto más particularmente a la preparación de azúcares
sulfatados, monoméricos u oligoméricos, como ciertos fragmentos de
heparina, o también para polímeros de la familia de los RGTA
principalmente cuando A es un monómero osídico como en el caso de
los polímeros a base de dextrano o de cualquier otro compuesto
polisacarídico.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán de los ejemplos que siguen que se refieren a la
realización del procedimiento según la invención y que harán
referencia a los dibujos en el anexo en los que:
- La figura 1 es una representación gráfica de
una molécula de CMDS en la que se evidencia el aldehído terminal.
Para un CMDS en el que los valores x e y son diferentes de 0 existen
3 tipos de unidades Z, a) el aldehído, o hemiacetal, b) el
carboximetil-glucósido y c) el
sulfonato-glucósido.
- La figura 2 representa el equilibrio entre la
función aldehído y el hemiacetal de la unidad terminal de un
dextrano sustituido. La unidad sustituida en posición anomérica no
participa más en el equilibrio.
- La figura 3 representa el perfil
cromatográfico de una molécula del tipo CMDS con las características
estructurales descritas en la tabla 3.
- La figura 4 muestra los perfiles
cromatográficos obtenidos para un mismo producto PA07 sobre columnas
diferentes de gel de filtración.
- La figura 5 da la estructura del CMDS.
Estos ejemplos comprenden así la comparación del
procedimiento de la invención con los de la técnica anterior,
principalmente para la sulfonación de los polímeros derivados de
dextrano como los CMDS o CMDBS. Esta comparación muestra que los
protocolos propuestos en las patentes francesas Nº FR 97 15702 y Nº
9907636 no permiten obtener una buena preservación de la integridad
molecular de los polímeros de dextrano ya que generan
fragmentaciones detectables y cuantificables mediante métodos
simples así como hidrólisis de grupos injertados sobre las cadenas
macromoleculares.
Para permitir comparar los diferentes métodos de
sulfonación, hemos medido el grado de sustitución (ds) en grupos
carboxilos (x) y en grupos sulfonatos (y) por unidad de glucosa. El
dextrano siendo un polímero de glucosa, posee sobre cada unidad de
glucosa 3 grupos OH reactivos. Por este hecho el ds máximo teórico
es de 3. Las valoraciones se hacen mediante métodos titrimétricos y
mediante análisis elemental, según los protocolos habituales
descritos en la técnica anterior.
La valoración titrimétrica, en combinación con
el análisis elemental, permite determinar las tasas de sustitución
global (x e y) de grupos, carboximetil-éter (x) y sulfonatos
(y).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de precisar la posición de los grupos
injertados sobre las unidades osídicas, hemos utilizado un método
de análisis por RMN (Resonancia Magnética Nuclear de Protón) según
las condiciones habituales conocidas por el experto en la técnica
(J. Biol. Chem. 275, 38, 29383-29390, 2000). Hemos
utilizado un espectrómetro Bruker 200 Mhz.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de medir la integridad de la cadena
polimérica antes y después de la reacción de adición de los grupos
sulfonatos, se han valorado los aldehídos presentes en el producto
en solución.
La valoración de los aldehídos permite
determinar el número de unidades terminales reductoras de los
productos, ya que solamente el extremo terminal reductor del
polímero presenta un grupo aldehído como muestra la figura 1. Así
el número de grupo aldehído se valora sobre le producto a
sulfonatar, en este caso, es igual a 1 micromol de aldehído por
gramo de producto. Este valor debe quedar en todos los casos
inferior o igual al valor del producto de partida si no ha habido
formación de roturas a lo largo de la reacción.
En efecto el valor del aldehído libre medido
después de la reacción de sulfonación es inferior al valor medido
antes de la introducción de grupos sulfonato (1,0 micromol/g por un
CMDS a 0,5 mmol/g). Los valores del aldehído libre habitualmente
encontrados para un producto tipo CMDS en el que x= 0,5 e y = 1,25
son próximos a 0,4 micromoles de aldehído por gramo de producto.
Por el contrario, si este número supera el valor de partida (1,0)
forzosamente ha habido formación de roturas.
Este método permite por lo tanto medir la
formación de fragmentos ya que cada rotura de cadena genera un nuevo
grupo aldehído reactivo y detectable.
\vskip1.000000\baselineskip
La medida del peso molecular se realiza por
cromatografía de exclusión estérica de alta eficacia en NaNO_{3}
0,1 M sobre columnas de gel de filtración KB-804 y
KB-805 (Shodex Japon) en serie a 0,7 ml/min. Los
productos se detectan en la salida de la columna mediante un
detector mini de dispersión de luz modelo Dawn y un refractómetro
del tipo RID 10 (J. Biol. Chem. 275, 38,
29383-29390, 2000). La homogeneidad de la
preparación se refleja mediante la curva de distribución del peso
molecular y la medida de la anchura (a media altura) del pico así
como por la medida de la simetría de la curva.
Una segunda técnica de HPLC-gel
de filtración permite mostrar la homogeneidad de la molécula en lo
que se refiere a la repartición de los pesos moleculares. Una
distribución gausiana se muestra en la figura 3.
Las condiciones cromatográficas son: Columna:
TSKgelG4000PWX(TOSOHAAS) a 30ºC, 7,8 mm DI x 30 cm; fase
móvil: NaCl 0,3 M; caudal: 0,7 ml/min; detección: IR 0,06.
Se ha constatado que para productos sintetizados
según las técnicas que utilizan los complejos de
SO3-amina la homogeneidad de la preparación varía
según el sistema cromatográfico utilizado.
Cuando el producto se separa mediante las
columnas Shodex el pico es asimétrico pero cuando se utiliza el
segundo sistema de separación cromatográfico, el pico
correspondiente al mismo producto aparece simétrico como muestra la
figura 4. Esto indica que la homogeneidad de la dispersión de pesos
moleculares en estas preparaciones así como en las de la técnica
anterior es relativa al sistema de separación utilizado.
Diferentes reacciones de
O-sulfonación mediante reactivos como el ácido
clorosulfónico, o bien también complejos
SO_{3}-amina, el complejo
SO_{3}-DMF, y el complejo
SO_{3}-DMF en presencia del captador de ácido, el
2-metil-2-buteno
(SO_{3}-DMF/2m2B), objeto de la presente invención
se describen en los ejemplos siguientes.
Con el fin de establecer estas comparaciones, se
ha elegido el carboximetil de dextrano como polímero de partida.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de fondo redondo de 500 mL, se
disolvieron 5 g de carboximetil-dextrano en forma
ácida (CMDH^{+}), (24,27 mmol) en 40 mL de formamida, luego se
añadieron 40 mL de
2-metil-2-buteno (25
equivalentes) bajo agitación. Se añadieron 7,90 g de
SO_{3}-DMF (5 equivalentes por unidad de glucosa).
La reacción se desarrolla durante 2 horas a 30ºC bajo agitación.
La reacción se paró vertiendo muy lentamente el
medio de reacción en 200 mL de NaHCO_{3} al 2%. El pH debía estar
próximo a 7. Si no fue el caso, la solución se neutralizó por
adición de sosa o de HCl. En todos los casos, el pH de la solución
no debía ser inferior a 5 con el fin de evitar la degradación de los
productos.
Después de la eliminación del exceso de agua, de
la DMF y del 2M2B por evaporación en el rotavapor a presión
reducida el producto se purificó por ultrafiltración tangencial
seguida de una liofilización. Se obtuvieron 6 g de producto
sulfonatado en forma de un polvo blanco.
La Tabla 1, a continuación, indica la
reproducibilidad de la O-sulfonación del CMDH^{+}
(x= 0,52) con 5 equivalentes de SO_{3}-DMF y 25
equivalentes de 2M2B por unidad de glucosa. El porcentaje EM
(desviación de la media) tiene que ver con productos preparados a
partir del mismo CMD.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2, a continuación, indica que la
O-sulfonación del CMDH^{+} en función de la
cantidad de reactivo SO_{3}-DMF/2M2B (1:5)
\vskip1.000000\baselineskip
Se han efectuado diez manipulaciones
independientes según este protocolo: cinco se han realizado
siguiendo estrictamente el mismo protocolo con 5 equivalentes de
SO_{3}-DMF y 25 equivalentes de 2M2B, conforme a
la Tabla 1, entradas 1-4. Otras cinco se han
realizado haciendo variar la cantidad de reactivo
SO_{3}-DMF/2M2B de 2 a 5 equivalentes de
reactivos por unidad de glucosa. La relación
SO_{3}-DMF versus 2M2B se queda siempre constante
1:5 (Tabla 2, entradas 1-5).
Los resultados muestran que el método es
reproducible para la obtención de productos que poseen grupos éteres
y de enlaces osídicos.
En todos los casos, el porcentaje EM (desviación
de la media) es inferior al límite máximo fijado al 10%.
Conviene anotar que (x) no varía
significativamente (EM<2%) (no hay descarboxilación) y que (y)
es<3%).
Las medidas de pesos moleculares confirman la
ausencia de heterogeneidad (figura 3 correspondiente al producto
descrito en la Tabla 1, entrada 4) PM= 67500 +/-7500.
Los resultados obtenidos demuestran que en
presencia de 2M2B, las tasas de sulfonación obtenidas son función
de la estequiometría de la reacción. Además, las condiciones de
reacción no afectan a las tasas de grupos carboximetil-éter
previamente injertados sobre el CMD.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de los productos sintetizados se ha
efectuado utilizando las técnicas analíticas como la valoración
titrimétrica, el análisis elemental, la valoración de azúcares
reductores, y el HPLC/filtración sobre gel acoplado a una detección
MALLS completadas por espectroscopía
^{1}H-RMN.
La espectroscopía ^{1}H-RMN
permite precisar la posición y la relación de las tasas de
sustitución de los diferentes grupos sobre los 3 hidroxilos
reaccionables en C-2 y C-3,4 de las
unidades osídicas del dextrano de partida. La tabla 3, a
continuación, indica la posición de sustituciones X e Y sobre A por
análisis RMN en el ejemplo del dextrano del tipo
CM-D-S.
Se añadieron 5 g de
carboximetil-dextrano (24,27 mmol, un equivalente
por unidad de glucosa) en 162 mL de diclorometano. Se obtuvo una
mezcla heterogénea. La mezcla se agitó fuertemente con el fin de
obtener una suspensión homogénea del producto en diclorometano.
Se añadieron lentamente a la mezcla 1,6 mL de
ácido clorosulfónico (24,27 mmol, un equivalente por unida de
glucosa). El medio de reacción se mantuvo bajo agitación durante 2
horas. A lo largo de la reacción, se formaron aglomerados de
productos de un color marrón. La mezcla se filtró (sobre vidrio
fritado nº 4) y el producto recuperado se lavó 2 veces con 100 mL
de diclorometano, 3 veces con 100 mL de una mezcla
diclorometano/dioxano (1:1) y una última vez con 100 mL de dioxano.
El producto obtenido se disolvió en 200 mL de agua destilada y la
solución se llevó a pH 9,5 por adición de sosa 2M luego a pH 7 por
adición de HCl 0,05 mol/L.
La solución se filtró, se concentró y se
precipitó con 500 mL de metanol. El precipitado así obtenido se secó
luego en una estufa, antes de ser purificado.
Se efectuaron tres manipulaciones independientes
según este protocolo:
Una con un equivalente de ácido clorosulfónico a
temperatura ambiente.
Una con dos equivalentes de ácido clorosulfónico
a temperatura ambiente.
Una con dos equivalentes de ácido clorosulfónico
a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los protocolos detallados a continuación se
realizaron utilizando diferentes complejos a base de SO_{3}:
SO_{3}-piridina,
SO_{3}-trimetilamina,
SO_{3}-trietilamina y SO_{3}-DMF
(dimetilformamida).
La Tabla 4, a continuación, indica las
características estructurales y biológicas de los productos
obtenidos por O-sulfonación de un CMD (d.s. C= 0,56)
por los diferentes complejos de SO_{3}.
En un matraz de fondo redondo de 500 mL, se
disolvieron 5 g de carboximetil-dextrano (24,27
mmol, un equivalente por unidad de glucosa) en 50 mL de formamida.
Para favorecer la disolución del
carboximetil-dextrano, la temperatura del medio de
reacción se llevó hasta aproximadamente 50ºC. Una vez disuelto el
producto, la solución se llevó a temperatura ambiente. Por cada
reacción efectuada, se preparó independientemente una disolución que
contenía cada uno de los complejos descritos en la Tabla 4
siguiente en 50 mL de formamida y se añadió a la disolución de
carboximetil-dextrano bajo agitación. La reacción se
desarrolló durante 2 h a temperatura ambiente.
La reacción se paró al añadir 2l de agua
destilada a 4ºC. Se mezcló y se llevó el pH del medio hasta
7,5-8 con ayuda de una disolución de NaOH 2M.
Después de la eliminación del exceso de agua por
evaporación con el rotavapor a presión reducida el producto se
purificó por ultrafiltración tangencial seguida de una
liofilización. Se obtuvieron 6 g de producto en forma de un polvo
blanco.
Se efectuaron cuatro manipulaciones
independientes según este protocolo:
Una con dos equivalentes de complejo
SO_{3}-piridina a temperatura ambiente.
Una con dos equivalentes de complejo
SO_{3}-trimetilamina a temperatura ambiente.
Una con dos equivalentes de complejo
SO_{3}-trietilamina a temperatura ambiente.
Una con dos equivalentes de complejo
SO_{3}-DMF a temperatura ambiente.
Por otro lado se realizó una reacción (Tabla 4
línea 8) exactamente según el protocolo descrito en el ejemplo 5 de
la patente francesa Nº FR 97 15702, en la que la disolución del CMD
se obtuvo por la formación de sales de trietilamonio. El
SO_{3}-piridina en una relación molar compleja de
OH libre es igual a 0,4 (lo que corresponde a 2 equivalentes de
complejo por unidad de glucosa) se disolvió en DMSO y se añadió a la
solución de polímero. La reacción se hizo en dimetilformamida a
temperatura ambiente.
La Tabla 4 muestra las características
estructurales de varios polímeros del tipo CMDS sintetizados según
los diferentes métodos y las restricciones de cada método. El
procedimiento según la invención corresponde a las entradas 10 y 11
de la Tabla 4 y las condiciones descritas en el ejemplo Nº 1.
Los diferentes productos del tipo DCS se
sintetizaron a partir de un lote único de dextrano carboxilado
(Tabla 4, entrada 1) teniendo un grado de sustitución en
carboxilato de x= 0,56. Después de su purificación, los productos
se caracterizaron mediante las diferentes técnicas de análisis
estructural.
Los resultados de titrimetría muestran que las
reacciones de O-sulfonación por ácido clorosulfónico
y los complejos de SO_{3}-amida o amina provocan
una rotura del enlace éter de los grupos carboxilos injertados (dsC
o x) y una degradación de la cadena macromolecular (peso molecular y
valoración de los azúcares reductores). Esta rotura es más marcada
cuanto más importante es el número de equivalente de reactivo
añadido. El descenso de la temperatura del medio de reacción permite
limitar esta degradación.
Es de notar que el producto preparado por el
complejo SO_{3}-Et_{3}N (Tabla 4, entrada 6) es
el producto más sulfonatado pero también el que ha sufrido la mayor
descarboxilación. La tendencia se confirma con los otros
productos.
Las dos últimas entradas de la tabla (entradas
10 y 11) ponen en juego el producto 2M2B que actúa como un captador
de ácido con el fin de limitar la degradación de los enlaces éteres
de los grupos carboxilatos injertados y de la cadena macromolecular
y la degradación de la cadena.
Conviene constatar que en presencia del producto
2M2B el dsC del producto obtenido después de sulfonación es
idéntico al dsC precursor. Esto se verifica cualquiera que sea la
cantidad de reactivo añadido. En efecto, con 2,5 veces más de
complejo SO_{3}-DMF (entrada 11), se obtiene un
dsS superior pero sobre todo el dsC no cambia. La eficacia del
protocolo en presencia de 2M2B por lo tanto se demuestra.
\newpage
Mientras que para las otras técnicas de
O-sulfonación ya conocidas, hay descarboxilación y
degradación de la cadena macromolecular, la técnica de
O-sulfonación en presencia del producto 2M2B permite
resolver el problema de la pérdida de los grupos carboxilatos
injertados sobre el dextrano.
Las medidas de actividades in vivo así
como las de toxicidades in vivo se realizaron sobre modelos
de regeneración musculares del músculo Extensor Digitorum Longus de
la pata trasera de la rata adulta después de aplastamiento según
las condiciones experimentales descritas en GAUTRON J., KEDZIA C.,
HUSMANN I. AND BARRITAULT D. "Accélération de la régénaration de
un muscle squelettique de rat adulte par des dérivés de
dextranes" C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la Vie (1995),
318: 671-676. La regeneración se cuantificó sobre
los cortes histológicos por medidas del número de fibras musculares
regeneradas. La toxicidad se midió mediante una disminución de la
formación de fibras (comparadas con los testigos inyectados por una
solución de suero fisiológico) así como por el análisis del aspecto
de la regeneración y la evidencia de zonas anormales de regeneración
o la formación de zonas inflamatorias que muestran una degeneración
del tejido muscular.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 5 muestra la síntesis de varios
polímeros de fórmula AaXxYy, en la que A es un azúcar y a es
superior a 1 por el procedimiento de la invención y sus
características analíticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Procedimiento de sulfonación de compuesto que
presenta una o varias funciones hidroxilos libres y/o una o varias
funciones aminas primarias o secundarias sustituidas o no,
caracterizado porque comprende el tratamiento de dicho
compuesto con el complejo SO_{3}-DMF en presencia
de un captador de ácido, elegido entre el grupo que comprende los
alquenos o alquinos de punto de ebullición inferior a 100ºC o una de
sus mezclas.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el captador de ácido se elige entre el
grupo que comprende
2-metil-2-buteno
(2M2B), 2-metil-propeno,
2-metil-penteno o sus isómeros, o
una de sus mezclas.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- la disolución o la preparación de una solución homogénea del compuesto a sulfonatar en un disolvente o un co-disolvente anhidro, como la dimetilformamida (DMF) o un co-disolvente compuesto de formamida y de dimetilformamida.
- b)
- la adición a temperatura ambiente (20-22ºC) de un exceso molar de un captador de ácido, como el 2-metil-2-buteno, miscible en el co-disolvente.
- c)
- la adición rápida del complejo SO_{3}-DMF bajo agitación,
- d)
- la agitación de la mezcla obtenida en la etapa precedente durante una o dos horas a una temperatura controlada e inferior a 30ºC,
- e)
- la parada de la reacción por adición progresiva de la mezcla sobre una disolución alcalina, por ejemplo una solución al 2% de bicarbonato de sodio (NaHCO_{3}) u otra base, con un control de pH nunca inferior a 4 con el fin de obtener las sales del compuesto a sulfonatar.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque comprende la purificación del compuesto
sulfonatado obtenido en la etapa (e).
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque comprende antes
de la etapa (a), la protonación de dicho compuesto con el fin de
favorecer su disolución durante la etapa (a).
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
compuesto a sulfonatar se elige entre el grupo que comprende los
monómeros, los oligómeros y los polímeros.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el compuesto a sulfonatar es un polímero
de fórmula:
(I)AaXxYy
en la que, A es un monómero; X
representa un grupo RCOOR'; Y representa un grupo O o
N-sulfonato fijado sobre A y que responde a una de
las fórmulas siguientes ROSO3R', RNSO3R'; los grupos R son cadenas
hidrocarbonadas alifáticas, opcionalmente ramificadas y/o
insaturadas y que pueden contener uno o varios ciclos aromáticos con
la excepción de la bencilamina y de la
bencilamina-sulfonato; R' representa un átomo de
hidrógeno o un catión; a representa el número de monómeros; x
representa la tasa o grado de sustitución de los monómeros A con
grupos X; y representa la tasa o grado de sustitución de los
monómeros A con grupos
Y.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque el polímero es
un derivado del dextrano o un copolímero de ácidos málicos.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 6 ó 8, caracterizado porque el polímero
comprende los enlaces entre los monómeros o entre los monómeros y
sus sustituyentes realizados por funciones inestables en medio
ácido, principalmente las funciones éster, amida, éter, acetal.
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