ES2302065T3 - Polisacaridos de bajo peso molecular que tienen actividad antitrombotica. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado que contiene el 40%-60% de unidades idurónicas y que tiene un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta 2,9 y caracterizado por la estructura (a'') (Ver fórmula) en la que R representa hidrógeno o SO3-, en el extremo reductor de la mayoría de sus cadenas, que comprende (a) tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado que contiene el 40%-60% de unidades idurónicas, obtenido sometiendo un epiK5-N-sulfato a una despolimerización nitrosa seguida de reducción, con un agente de sulfatación en condiciones de O-sobresulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado; (b) someter el LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado así obtenido a una O-desulfatación selectiva para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado; (c) tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado así obtenido con un agente de O-sulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato; (d) someter el LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato así obtenido a una reacción de N-sulfatación y aislar el LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado así obtenido.
Description
Polisacáridos de bajo peso molecular que tienen
actividad antitrombótica.
La presente invención se refiere a polisacáridos
de bajo peso molecular novedosos derivados del polisacárido K5, que
tienen una buena actividad en los parámetros de coagulación con un
riesgo hemorrágico bajo, útiles como medicamentos para la
regulación de la coagulación y para la prevención y el tratamiento
de la trombosis. Más particularmente, la invención se refiere a
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
novedosos que tienen un grado de sulfatación de
2,7-2,9, que pueden obtenerse tratando
LMW-epiK5-N-sulfatos
novedosos (preparados a su vez mediante despolimerización nitrosa
de epiK5-N-sulfatos), con un agente
de O-sulfatación en condiciones de
O-sobresulfatación, sometiendo el
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
así obtenido a una O-desulfatación selectiva,
tratando el producto parcialmente O-desulfatado así
obtenido para dar una
6-O-sulfatación y finalmente
tratando el producto 6-O-resulfatado
así obtenido con un agente de sulfatación en condiciones de
N-sulfatación. Además, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de dichos
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta 2,9 y a
productos intermedios nuevos.
Los glicosaminoglicanos tales como heparina,
heparán sulfato, dermatán sulfato, condroitina sulfato y ácido
hialurónico son biopolímeros que se extraen industrialmente a partir
de diversos órganos animales.
En particular, la heparina, obtenida
principalmente mediante la extracción a partir de la mucosa
intestinal del cerdo o a partir del pulmón bovino, es un copolímero
polidispersado con una distribución del peso molecular desde
aproximadamente 3.000 hasta aproximadamente 30.000 D que consiste en
una mezcla de cadenas que consisten fundamentalmente en un ácido
urónico (ácido glucurónico o ácido idurónico) y en un aminoazúcar
(glucosamina) unidos mediante enlaces
\alpha-1\rightarrow4 o
\beta-1\rightarrow4. En la heparina, la unidad
urónica puede estar O-sulfatada en la posición 2 y
la unidad de glucosamina está N-acetilada o
N-sulfatada,
6-O-sulfatada y
3-O-sulfatada en aproximadamente el
0,5% de las unidades de glucosamina presentes.
Se han descrito las propiedades y la biosíntesis
natural de la heparina en mamíferos por Lindahl et al., 1986
en Lane, D. y Lindahl, U. (Editores) "Heparin. Chemical and
Biological Properties; Clinical Applications", Edward Arnold,
Londres, páginas 159-190, por Lindahl, U, Feingold
D. S. y Rodén L, 1986 TIBS, 11, 221-225 y por
Conrad H. E. "Heparin Binding Proteins", Capítulo 2: Structure
of Heparinoids, Academic Press, 1998. La biosíntesis de la heparina
se produce partiendo de su precursor
N-acetil-heparosán que consiste en
una mezcla de cadenas que consiste en la unidad repetitiva
disacárida
glucuronil-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina.
Dicho precursor experimenta modificaciones enzimáticas que
hidrolizan parcialmente el grupo N-acetilo, lo
sustituyen con un grupo SO_{3}^{-}, epimerizan el carboxilo en
la posición 5 de una parte de las unidades glucurónicas, las
transforma en unidades idurónicas e introduce grupos
O-sulfato para obtener un producto que, una vez se
extrae industrialmente, tiene aproximadamente un doble número de
grupos sulfato con respecto a los grupos carboxi por unidad
disacárida. Estas modificaciones enzimáticas conducen, entre otras
cosas, a la formación de la región de unión a antitrombina III
(ATIII) pentasacárida, denominada pentasacárido activo, que es la
estructura necesaria para el enlace de alta afinidad de heparina a
ATIII y fundamental para la actividad antitrombótica y
anticoagulante de la heparina. Este pentasacárido, presente sólo
dentro de algunas de las cadenas que forman la heparina, contiene
una unidad de glucosamina sulfatada en la posición 3 y un ácido
glucurónico espaciados entre los disacáridos que contienen ácidos
idurónicos.
En la naturaleza, la formación del pentasacárido
activo se hace posible mediante la reacción de epimerización del
carboxilo de una parte de las unidades glucurónicas en unidades
idurónicas proporcionadas por la D-glucuronilo
C5-epimerasa (epimerización en C5) y por una
sulfatación adecuada que también conduce a la introducción de un
grupo sulfato en el hidroxilo en la posición 3 de la glucosamina.
Más particularmente, en la naturaleza la formación del
pentasacárido activo se hace posible mediante el hecho de que la
epimerización en C5 se produce en agrupaciones, es decir en partes
de las cadenas, y ampliamente, lo que da como resultado un producto
que contiene más unidades idurónicas que glucurónicas. La heparina
comercial, de hecho, contiene aproximadamente el 70% de unidades
idurónicas y el 30% de unidades glucurónicas.
Se sabe que el polisacárido K5 capsular aislado
a partir de Escherichia coli, descrito por Vann W. F. et
al., en European Journal of Biochemistry, 1981, 116,
359-364 ("Vann 1981"), consiste en una mezcla
de cadenas formadas de la unidad repetitiva disacárida
glucuronil-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina
y por tanto muestra la misma unidad repetitiva disacárida (A)
del precursor
N-acetil-heparosán de la heparina.
El polisacárido K5 capsular, denominado a continuación en el
presente documento "polisacárido K5" o más sencillamente
"K5", se modificó químicamente por Lormeau et al. tal
como se describe en el documento US 5.550.116 y por Casu et
al. tal como se describe en Carbohydrate Research, 1994, 263,
271-284. Los
K5-O-sulfatos que tienen actividades
antitumorales, antimetastásicas, antivirales, en particular
anti-VIH, se describen en el documento EP 333243 y
el documento WO 98/34958. El K5 se modificó también por medios
químicos y enzimáticos con el fin de obtener productos que tienen el
mismo tipo de actividad biológica in vitro en la coagulación
que la de la heparina tal como se extrae a partir de órganos
animales (heparina
extractiva).
La consecución de los productos que tienen una
actividad en la coagulación del mismo tipo que la de heparina
extractiva se produce mediante procedimientos que imitan lo que se
produce en la naturaleza y comprenden la etapa clave de
epimerización en C5 con D-glucuronilo
C5-epimerasa.
Los procedimientos descritos en los documentos
IT 1230785, WO 92/17507, WO 96/14425 y WO 97/43317 utilizan K5 como
material de partida. El K5 originado a partir de fermentación se
somete a N-desacetilación seguida de
N-sulfatación y, en el
K5-N-sulfato así obtenido, de una
epimerización en C5 con C5-epimerasa, obtenida o
bien mediante cromatografía de una disolución de enzimas
microsomales a partir de mastocitoma de ratón (documento IT 1 230
785) o bien a partir de hígado bovino (documentos WO 92/17507, WO
96/14425 y WO 97/43317), se lleva a cabo en disolución.
La D-glucuronilo
C5-epimerasa a partir de hígado bovino se purificó
por Campbell, P. et al. en J. Biol. Chem., 1994, 269/43,
26953-26958 ("Campbell 1994") quién suplió
también su composición en amino ácidos y describió su uso en
disolución para la transformación de un
K5-N-sulfato en el 30% del producto
epimerizado correspondiente, demostrando la formación de ácido
idurónico mediante el método de HPLC seguido de un despolimerización
nitrosa total hasta el disacárido.
El documento WO 98/48006 describe la secuencia
de ADN que se codifica para la D-glucuronilo
C5-epimerasa y una D-glucuronilo
C5-epimerasa recombinante, obtenida a partir de un
vector de expresión recombinante que contiene dicho ADN,
posteriormente purificado por Campbell et al. tal como se
muestra por Jin-Ping L. et al. en J. Biol.
Chem. 2001, 276, 20069-20077
("Jin-Ping 2001").
La secuencia completa de
C5-epimerasa se describió por Crawford B. E. et
al. en J. Biol. Chem., 2001, 276 (24),
21538-21543 (Crawford 2001).
El documento WO 01/72848 describe un método para
la preparación de derivados N-desacetilados
N-sulfatados del polisacárido K5, epimerizado hasta
al menos el 40% de ácido idurónico con respecto al total de los
ácidos urónicos, que tiene un peso molecular de desde 2.000 hasta
30.000, que contiene desde el 25 hasta el 50% de cadenas de alta
afinidad para ATIII y que tiene actividad anticoagulante y
antitrombótica, expresada como razón HCII/antiXa, de desde 1,5 hasta
4.
Dicho procedimiento, que comprende en secuencia
la preparación de K5 a partir de Escherichia coli, la
N-desacetilación y N-sulfatación, la
epimerización en C5, la sobresulfatación, la
O-desulfatación selectiva, la
6-O-sulfatación y la
N-sulfatación, proporciona una epimerización en C5
llevada a cabo con C5-epimerasa, en disolución o
inmovilizada, en presencia de cationes bivalentes específicos. Según
el documento WO 01/72848, la epimerización en C5 puede llevarse a
cabo indiferentemente con una enzima natural o recombinante,
inmovilizada o en disolución, a una temperatura de desde 30 hasta
40ºC durante un periodo de tiempo de desde 1 hasta 24 horas.
Además, dicho documento da a conocer una
reacción de despolimerización con ácido nitroso, llevada a cabo en
el producto final en el extremo de la secuencia de reacción
mencionada anteriormente.
El documento US 2002/0062019 describe un
procedimiento para la preparación de
epiK5-N,O-sulfatos, activos en la
regulación de la coagulación, que tienen un grado de sulfatación de
desde 2,3 hasta 2,9 y un peso molecular de desde 2.000 hasta
30.000, o de desde 4.000 hasta 8.000, o de desde 18.000 hasta
30.000. El procedimiento mencionado anteriormente implica las
etapas: (s-a) una N-desacetilación
de polisacárido K5 y una N-sulfatación de la
K5-amina resultante, (s-b) una
epimerización en K5-N-sulfato,
(s-c) una O-sobresulfatación de
epiK5-N-sulfato,
(s-d) una O-desulfatación parcial,
(s-e) una
6-O-sulfatación selectiva,
(s-f) una N-sulfatación del producto
así obtenido, siendo cualquier producto obtenido al final de
cualquiera de las etapas (s-b)-(s-f)
susceptible de someterse a despolimerización. Dicho documento
describe un epiK5-N,O-sulfato que
tiene un peso molecular de 7.400, obtenido mediante las etapas
mencionadas anteriormente
(s-a)-(s-f) seguidas de una
despolimerización nitrosa al final de la etapa
(s-f), con un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9.
El mismo documento también describe una fracción
de K5 con un peso molecular de aproximadamente 5.000 que también
puede someterse a las etapas (s-a) -
(s-f).
Con el fin de hacer uniforme la terminología y
hacer el texto más comprensible, en la presente descripción se
usarán expresiones o términos convencionales, en singular o plural.
En particular:
- -
- por "K5" o "polisacárido K5" se entiende el polisacárido capsular a partir de Escherichia coli obtenido mediante fermentación, es decir una mezcla de cadenas que consiste en unidades disacáridas (A) que contienen opcionalmente un doble enlace en el extremo no reductor tal como se ilustró anteriormente, comoquiera que se prepare y se purifique según los métodos descritos en la bibliografía, en particular según Vann 1981, según Manzoni M. et al., Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311 ("Manzoni 1996") o según el método descrito en el documento WO 01/72848 o en el documento US 2002/0062019; es obvio para un experto en la técnica que lo que se muestra más adelante en el presente documento puede aplicarse a cualquier N-acetilheparosán;
- -
- por "C5-epimerasa" se entiende la D-glucuronilo C5-epimerasa, extractiva o recombinante, comoquiera que se prepare, aislada y purificada, en particular tal como se describe en Campbell 1994, en el documento WO 98/48006, en Jin-Ping L. et al. en J. Biol Chem. 2001, 276, 20069-20077 ("Jin-Ping 2001") o en Crawford 2001;
- -
- por K5-amina se entiende K5 N-desacetilado al menos el 95%, preferiblemente N-desacetilado de manera completa, concretamente en el que los grupos N-acetil son imperceptibles con un aparato de RMN normal;
- -
- por "K5-N-sulfato" se entiende al menos el 95%, preferiblemente el 100%, de K5 N-desacetilado y N-sulfatado, ya que los grupos N-acetil son imperceptibles con un aparato de RMN normal;
- -
- por "epiK5" se entiende el K5 y su derivados en los que el 40%-60% de las unidades glucurónicas es epimerizado en C5 a unidades idurónicas
- -
- por "epiK5-N-sulfato" se entiende K5-N-sulfato en el que el 40%-60% de las unidades glucurónicas es epimerizado en C5 a unidades idurónicas;
- -
- por "epiK5-amino-O-sobresulfato" se entiende un epiK5-amino-O-sulfato con un grado de sulfatación de al menos 2;
- -
- por "epiK5-N,O-sulfato" se entiende un K5-N,O-sulfato en el que el 40%-60% de las unidades glucurónicas es epimerizado en C5 a unidades idurónicas, con un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta 2,9;
- -
- las expresiones y términos convencionales definidos anteriormente en el presente documento se refieren a K5 como aislado tras la fermentación, generalmente con una distribución del peso molecular desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 50.000 con un peso molecular medio de 12.000-25.000, ventajosamente de 15.000-25.000;
- -
- a menos que el peso molecular se especifique de otra manera, las expresiones y términos convencionales definidos anteriormente en el presente documento, si están precedidos por el acrónimo "LMW" (low molecular weight, bajo peso molecular), en particular LMW-epiK5-N-sulfato, LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato, LMW-epiK5-N,O-sulfato, designan productos de bajo peso molecular que tienen un peso molecular medio de desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 12.000;
- -
- si van precedidos de "derivado", las expresiones y términos convencionales tal como se definen anteriormente en el presente documento, indican tanto los derivados a partir de K5 nativo como los de K5 de bajo peso molecular, como un todo;
- -
- el término "LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado", designa un LMW-epiK5-N-sulfato obtenido según la secuencia (i)\rightarrow(ii) o la secuencia (ii)\rightarrow(i) tal como se ilustra a continuación en el presente documento; análogamente, las expresiones "LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado" y "LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado" designan un LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato y, respectivamente, un LMW-epiK5-N,O-sulfato obtenido partiendo de un LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado;
- -
- el prefijo "(epi)", que precedes a "K5" en expresiones y términos convencionales tal como se definen anteriormente en el presente documento, indica tanto los productos a partir de K5 nativo como aquéllos a partir de epiK5 (epimerizado al 40-60%), tal como se definen anteriormente, como un todo.
Además:
- -
- a menos que se indique específicamente lo contrario, el término "peso molecular" o "peso molecular medio" indica el peso molecular determinado mediante HPLC frente al patrón de heparina y heparina de bajo peso molecular;
- -
- por el término "aproximadamente", referido al peso molecular, se entiende el peso molecular medido por viscosimetría \pm el peso teórico de una unidad disacárida, incluyendo el peso del sodio, calculado como 461 en el caso de un derivado de epiK5-N-sulfato y 644 en el caso de un derivado de epiK5-N,O-sulfato con un grado de sulfatación de 2,8;
- -
- por la expresión "especie predominante", se entiende el compuesto que, en la mezcla que constituyen el LMW-epiK5-N-sulfato, el LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato o el LMW-epiK5-N,O-sulfato, es la especie más representada, determinada mediante el pico de la curva del peso molecular medido por HPLC;
- -
- a menos que se declare específicamente lo contrario, por "grado de sulfatación" se entiende la razón SO_{3}^{-}/COO^{-}, que puede expresarse también como el número de grupos sulfato por unidad disacárida, medido por el método conductimétrico descrito por Casu B. et al. en Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176 (Casu 1975);
- -
- por "condiciones de O-sobresulfatación" se entiende una O-sulfatación extrema realizada, por ejemplo, según el método C descrito por B. Casu et al. en Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284 (Casu 1994);
- -
- por el término "alquilo" se entiende un alquilo lineal o ramificado, mientras que "tetrabutilamonio" indica el grupo tetra(n-butil)amonio.
Finalmente, se observa que, en la bibliografía,
el polisacárido K5 (K5) se denomina también
"acetilaminoheparosán". Por tanto, K5-amina
corresponde a "aminoheparosán",
K5-N-sulfato corresponde a
"sulfaminoheparosán", y así sucesivamente, mientras que, si
estos productos están epimerizados, en la bibliografía los términos
anteriores están seguidos del término "epimerizado". En este
contexto, la presente descripción se refiere a "K5" con el fin
de enfatizar el origen de los productos dados a conocer en el
presente documento.
En la solicitud de patente PCT/IB03/02338 se dan
a conocer derivados de
epiK5-amino-O-sobresulfato
útiles como productos intermedios en la preparación de derivados de
epiK5-N,O-sobresulfato que tienen
actividad antiviral y antiangiogenética. Dichos derivados de
epiK5-amino-O-sobresulfato
se preparan mediante un procedimiento que comprende tratar un
derivado de epiK5-N-sulfato con,
preferiblemente, hidróxido de tetrabutilamonio, dejando la mezcla
de reacción en reposo durante un periodo de tiempo de
30-60 minutos a un pH de aproximadamente 7 y aislar
la sal, preferiblemente la sal de tetrabutilamonio, así obtenida; y
tratar dicha sal con un agente de O-sulfatación en
condiciones de O-sobresulfatación. El documento
mencionado anteriormente da a conocer la preparación de
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfatos
partiendo de un
LMW-epiK5-N-sulfato.
El mismo documento PCT/IB03/02338, así como los
documentos IT MI2002A001346 e IT MI2002A001854, dan a conocer por
primera vez
LMW-epiK5-N-sulfatos,
preferiblemente libres de grupos N-acetilo, en los
que el contenido en ácido idurónico con respecto al total de ácidos
urónicos es del 40%-60%, preferiblemente de manera aproximada del
50%. Dichos
LMW-epiK5-N-sulfatos
son productos intermedios útiles en la preparación de
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
que tienen un alto grado de actividad en diversos parámetros
biológicos, en particular en parámetros de coagulación (documento
IT MI2002A001346). La preparación de dichos
LMW-epiK5-N-sulfatos
se describe en detalle en los tres documentos anteriores.
Además, el documento PCT/IB03/02339 da a conocer
composiciones farmacéuticas que comprenden, como principio activo,
un derivado de
(epi)K5-amino-O-sobresulfato
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que puede obtenerse
mediante un procedimiento que comprende
- -
- tratar un derivado de (epi)K5-N-sulfato, en forma ácida, con una base orgánica terciaria o cuaternaria, dejando la mezcla de reacción en reposo durante un periodo de tiempo de 30-60 minutos, manteniendo el pH de la disolución a un valor de aproximadamente 7 mediante la adición de dicha base orgánica terciaria o cuaternaria y aislar la sal con dicha base orgánica; y
- -
- tratar dicha sal de base orgánica de dicho derivado de (epi)K5-N-sulfato con un reactivo de O-sulfatación en condiciones de O-sobresulfatación y aislar el derivado de (epi)K5-amino-O-sobresulfato.
En la preparación de derivados
N,O-sulfatados N-desacetilados de
polisacárido K5, epimerizado al menos al 40% a ácido idurónico con
respecto a los ácidos urónicos totales y que tiene bajo peso
molecular tal como se describe en el documento WO 01/72848 y en el
documento US 2002/0062019, se observó que la despolimerización del
producto de alto peso molecular obtenido al final de la etapa (g)
del procedimiento descrito en el documento WO 01/72848 y en al
final de la etapa (vi) del procedimiento descrito en el documento US
2002/0062019 puede proporcionar resultados no uniformes ya que, en
general, proporciona productos despolimerizados que tienen una
actividad muy inferior en todos los parámetros de coagulación que la
de los productos de alto peso molecular a partir de los que se
derivan. Se supone que esto tiene lugar porque la degradación con
ácido nitroso está influenciada por la presencia de los grupos
sulfato. En particular la presencia de sulfatos en la posición 3 de
la glucosamina da lugar a productos heterogéneos, tal como se
describe por Nagasawa et al. en Thrombosis Research, 1992,
65, 463-467 (Nagasawa 1992). En el documento US
2002/0062019, la desventaja se ha superado realizando la etapa de
O-desulfatación selectiva manteniendo el tiempo de
reacción del producto sobresulfatado con dimetilsulfóxido/metanol
en el intervalo de 135-165 minutos, preferiblemente
a aproximadamente 60ºC durante 150 minutos. Este método ventajoso,
particular se describe en detalle en el documento WO 02/50125.
Se ha encontrado ahora que los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación de desde
aproximadamente 2,3 hasta 2,9 y una buena actividad en los
parámetros de coagulación pueden prepararse sometiendo un
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado a una reacción de
O-sobresulfatación, por ejemplo según el método C
descrito por B. Casu et al. en Carbohydrate Research, 1975,
39, 168-176 (Casu 1975) para obtener un
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado, sometiendo el producto
despolimerizado-sobresulfatado a una
O-desulfatación selectiva, entonces a una
6-O-sulfatación y finalmente
tratando el producto parcialmente desulfatado, despolimerizado así
obtenido con un agente de sulfatación en las condiciones de una
N-sulfatación para aislar el
LMW-epi-K5-N,O-sulfato
despolimerizado deseado que tiene un grado de sulfatación de desde
aproximadamente 2,3 hasta aproximadamente 2,9.
También se ha encontrado que, actuando partiendo
de un
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado, la O-desulfatación selectiva
parcial con dimetilsulfóxido/metanol puede llevarse a cabo en un
intervalo más largo de tiempos de calentamiento, obteniendo por
tanto, en una manera reproducible,
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados finales que tienen siempre un alta actividad en
los parámetros de coagulación, aun cuando varíen en función de los
tiempos de O-desulfatación selectiva empleados.
En particular, sorprendentemente se ha
encontrado que, si un
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado que tiene un peso molecular medio de
aproximadamente 6.000 se somete a una
O-sobresulfatación, el
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado así obtenido a una O-desulfatación
selectiva, el producto parcialmente O-desulfatado
despolimerizado a una
6-O-sulfatación y entonces a una
N-sulfatación en condiciones similares a las
descritas en el documento WO 02/50125, se obtiene un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que tiene un peso molecular medio de aproximadamente
6.000, un grado de sulfatación de 2,7-2,9, una
actividad anti-Xa y una actividad
anti-IIa ambas tan altas como un medio de la
actividad de la heparina de bajo peso molecular convencional
(HBPMc), concretamente una razón antiXa/anti-IIa
idéntica a la de HBPMc, pero una capacidad de aumentar el tiempo de
coagulación desde 5 hasta veces 8 inferior a la de HBPMc. Por
tanto, por primera vez se ha obtenido un glicosaminoglicano derivado
del polisacárido K5 que puede asimilarse a la HBPMc en lo que
respecta a la razón anti-Xa/anti-IIa
y que, en dosificaciones iguales, presenta un riesgo hemorrágico de
2,5 a 4 veces inferior que la HBPMc.
Además, se ha encontrado que todos lo
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfatos
despolimerizados que pueden obtenerse mediante el procedimiento que
comprende el tratamiento de un
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado con un agente de O-sulfatación en
condiciones de O-sobresulfatación, están
sustancialmente desprovistos de actividad anticoagulante y tienen
una buena actividad microbicida, como la de los
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfatos
descritos en el documento PCT/IB03/02339.
Finalmente, se ha encontrado que todos los
derivados de
(epi)K5-amino-O-sobresulfatos
que tienen un grado de sulfatación de desde 2 hasta 4, obtenidos
mediante el tratamiento de los correspondientes derivados de
(epi)K5-N-sulfato con un
agente de O-sulfatación en condiciones de
O-sobresulfatación, están sustancialmente
desprovistos de actividad anticoagulante, tienen una buena actividad
microbicida y por tanto son principios activos para la preparación
de composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones farmacéuticas
están destinadas al tratamiento de infección de origen microbiano,
en particular viral.
La figura 1 muestra el espectro de
^{13}C-RMN del
LMW-epiK5-amino-O-sulfato
despolimerizado del ejemplo 1(b).
La figura 2 muestra el espectro de
^{13}C-RMN del
LMW-epiK5-amino-O-sulfato
despolimerizado que contiene el 80% de
6-O-sulfato del ejemplo
1(c).
La figura 3 muestra el espectro de
^{13}C-RMN del
LMW-epiK5-amino-N,O-sulfato
despolimerizado final del ejemplo 1(d), indicando la
presencia de unidades de 2,5-anhidromanitol
sulfatadas.
Por tanto, es un objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la preparación de
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados novedosos que tengan un grado de sulfatación de
desde 2,3 hasta 2,9 y de sus sales farmacéuticamente aceptables, que
comprende
- (a)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria de un LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado con un agente de sulfatación en condiciones de O-sobresulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado;
- (b)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado así obtenido a una O-desulfatación selectiva para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado;
- (c)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado así obtenido con un agente de O-sulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato;
- (d)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato así obtenido a una reacción de N-sulfatación y aislar el LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado así obtenido, preferiblemente como la sal de sodio del mismo que se transforma opcionalmente en otra sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Son sales farmacéuticamente aceptables
preferidas las sales con metales alcalinos, en particular sodio o
potasio, con metales alcalinotérreos, en particular calcio y
magnesio, con aluminio y con zinc.
Los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados de partida pueden prepararse sometiendo un
epiK5-N-sulfato a una
despolimerización nitrosa seguida de una reducción normalmente con
borohidruro de sodio. Los
epiK5-N-sulfatos usados para la
preparación de los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados de partida anteriores son aquéllos que tienen un
contenido en ácido idurónico del 40-60% y contienen
al menos el 95% de grupo N-sulfato, como por
ejemplo aquéllos descritos en el documento WO 01/72848, en el
documento US 2002/0062019 o en el documento WO 02/068477.
Más particularmente, los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados de partida tal como se ilustró anteriormente se
preparan mediante un procedimiento que comprende someter un
K5-N-sulfato, en cualquier
orden,
- (i)
- a una epimerización en C5 con una D-glucuronilo C5-epimerasa, aislada, purificada y en disolución o inmovilizada en un soporte sólido, a un pH de aproximadamente 7, a una temperatura de aproximadamente 30ºC y durante un periodo de tiempo de 12-24 horas en presencia de al menos un ión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso; y
- (ii)
- a una despolimerización nitrosa seguida de una reducción, normalmente con borohidruro de sodio.
La expresión "en cualquier orden" significa
que el procedimiento puede llevarse a cabo indiferentemente o bien
en la dirección (i)-(ii), es decir en la secuencia mostrada
anteriormente, o bien en la dirección opuesta (ii)-(i), es decir
sometiendo el K5-N-sulfato en primer
lugar a la reacción de despolimerización nitrosa, seguida de
reducción con borohidruro de sodio, y entonces a la epimerización en
C5 en las condiciones mencionadas anteriormente. El orden preferido
es en la dirección (i)\rightarrow(ii). La secuencia
(ii)\rightarrow(i) se utiliza preferiblemente
partiendo de
LMW-K5-N-sulfatos
que tienen un peso molecular medio superior a 4.000,
preferiblemente partiendo de aproximadamente 6.000. Por ejemplo,
puede determinarse la cantidad de nitrito de sodio que, empezando
con 1 g de epiK5-N-sulfato, permite
la consecución de un
LMW-epiK5-N-sulfato
con un peso molecular medio superior a 4.000, en particular de al
menos 6.000, con el fin de obtener productos intermedios útiles
para la preparación de los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
correspondientes que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9. De hecho, en este caso, en la etapa (ii) se obtiene el
porcentaje de epimerización óptima. Por tanto, si la preparación
del
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado se lleva a cabo según la secuencia
(ii)\rightarrow(i), la epimerización se produce en
una manera óptima si se lleva a cabo en un
LMW-K5-N-sulfato
despolimerizado que tiene un peso molecular medio superior a 4.000,
ventajosamente de desde 5.000 hasta 7.500, preferiblemente desde
6.000 hasta 7.500.
Los símbolos (i) y (ii), tal como se usan a
continuación en el presente documento, designan la etapa de
despolimerización y, respectivamente, la etapa de epimerización en
C5, cualquiera que sea el orden en que se llevan a cabo estas
etapas.
La C5-epimerasa puede usarse en
disolución o inmovilizada en un soporte sólido inerte. En el último
caso, la C5-epimerasa, preferiblemente
recombinante, aislada y purificada por ejemplo según Campbell 1994,
documento WO 98/48006, Jin-Ping 2001 o Crawford
2001, se inmoviliza en un soporte inerte en presencia del sustrato,
es decir en presencia del
K5-N-sulfato de partida o del
LMW-K5-N-sulfato,
teniendo el último normalmente un peso molecular medio superior a
4.000, ventajosamente de desde 4.000 hasta 7.500, más ventajosamente
desde 5.000 hasta 7.500, preferiblemente de al menos 6.000. La
inmovilización se lleva a cabo según métodos convencionales, por
ejemplo tal como se describe en el documento WO 01/72848.
La reacción de epimerización en C5 se lleva a
cabo recirculando 20-1.000 ml de una disolución
HEPES 25 mM a un pH de aproximadamente 7 que contiene
0,001-10 g de sustrato
(K5-N-sulfato o
LMW-K5-N-sulfato, el
último normalmente con un peso molecular medio superior a 4.000, en
particular desde 4.000 hasta 7.500) y un catión seleccionado entre
calcio, magnesio, bario y manganeso a una concentración de desde 10
hasta 60 mM a través de una columna que contiene desde 1,2 x
10^{7} hasta 3 x 10^{11} cpm de la enzima inmovilizada,
manteniendo el pH a aproximadamente 7 a aproximadamente 30ºC, a un
flujo de 30-220 ml/hora durante un periodo de tiempo
de 12-24 horas, ventajosamente 15-24
horas.
Preferiblemente dicha disolución se hace
recircular a un flujo de aproximadamente 200 ml/hora durante la
noche (15-20 horas). El producto obtenido se
purifica y se separa según métodos conocidos, por ejemplo mediante
ultrafiltración y precipitación con etanol. El producto así obtenido
consiste o bien en epiK5-N-sulfato
(y en tal caso se disuelve en agua y se somete a despolimerización)
o bien en
LMW-epiK5-N-sulfato
(en tal caso es el producto final). El porcentaje de epimerización,
en la práctica la cantidad de unidades idurónicas con respecto a
las glucurónicas, se calcula usando ^{1}H-RMN
según el método descrito en el documento WO 96/4425.
La reacción de despolimerización nitrosa se
lleva a cabo según métodos de despolimerización de heparina
conocidos, por ejemplo según el método descrito en el documento EP
37319, en el documento WO 82/03627 o según el método de
despolimerización de un K5-N-sulfato
descrito en el documento EP 544592, pero partiendo de un
K5-N-sulfato o un
epiK5-N-sulfato que contiene desde
el 0 hasta no más del 5% de grupos acetilo. La despolimerización,
realizada con nitrito de sodio y ácido clorhídrico en un
epiK5-N-sulfato está seguida de una
reducción in situ con borohidruro de sodio.
En la práctica, una disolución acuosa fría de
(epi)K5-N-sulfato se lleva a
pH ácido (aproximadamente 2) con ácido clorhídrico y, todavía en
frío, se trata con nitrito de sodio, manteniendo la temperatura
(aproximadamente a 4ºC) y el pH (aproximadamente 2) constantes y,
tras finalizar la despolimerización (aproximadamente
15-30 minutos) la disolución se neutraliza con
hidróxido de sodio y se trata, todavía a aproximadamente 4ºC, con
una disolución acuosa de borohidruro de sodio. Tras finalizar la
reducción (aproximadamente 4 horas) el exceso de borohidruro de
sodio se elimina con ácido clorhídrico, la disolución se neutraliza
con hidróxido de sodio y el producto despolimerizado (y reducido)
se aísla según métodos conocidos, por ejemplo mediante precipitación
directa con etanol o acetona.
El producto obtenido al final de la
despolimerización puede ser o bien un
LMW-epiK5-N-sulfato
(en tal caso constituye el producto final) o un
LMW-K5-N-sulfato (y
en tal caso está sometido directamente a epimerización en C5 tal
como se muestra anteriormente en el presente documento, tras el
aislamiento), en particular si tiene un peso molecular medio
superior a 4.000, ventajosamente desde 4.000 hasta 7.500, más
ventajosamente desde 5.000 hasta 7.500, preferiblemente de al menos
6.000. Controlando apropiadamente la reacción de despolimerización,
en particular usando cantidades diferentes de nitrito de sodio/ácido
clorhídrico, se obtienen
LMW-K5-N-sulfatos o
LMW-epiK5-N-sulfatos
que tienen un peso molecular medio en todo el intervalo desde
aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 12.000, ventajosamente
desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 10.000,
preferiblemente desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente
7.500, calculado en el espectro de ^{13}C-RMN
mediante la integración de la señal atribuida al C2 de
2,5-anhidromanitol con la del carbono anomérico de
la glucosamina dentro de la cadena de polisacárido.
Según una manera general de procedimiento,
partiendo por ejemplo de 1 g de
epiK5-N-sulfato, se disuelve el
producto de partida en 100-200 ml de agua
desionizada y termostatizada a 4ºC. Entonces se añade una cantidad
de nitrito de sodio tal como para obtener el peso molecular medio
deseado. Con el fin de obtener, por ejemplo, un
LMW-(epi)K5-N-sulfato con un
peso molecular medio de desde aproximadamente 2.000 hasta
aproximadamente 4.000 partiendo de un
(epi)K5-N-sulfato que tiene
un peso molecular medio de aproximadamente 20.000 (medido con el
método de HPLC equipado con una columna BioRad BioSil 250 y usando
una heparina convencional de peso molecular conocido), se requerirá
la adición de 330 a 480 mg de nitrito de sodio disueltos en
disolución acuosa al 0,2 %. La disolución que contiene el
(epi)K5-N-sulfato y el
nitrito de sodio, mantenidos a 4ºC, se lleva a pH 2 mediante la
adición de HCl 0,1 N enfriado hasta 4ºC. Se deja reaccionar con
agitación lenta durante 20-40 minutos, entonces se
neutraliza con NaOH 0,1 N. La disolución que contiene el producto
así obtenido se lleva a temperatura ambiente y se trata con un
agente reductor tal como por ejemplo borohidruro de sodio
(250-500 mg disueltos en 50-100 ml
de agua) y se deja reaccionar durante 4-8 horas. El
exceso de borohidruro de sodio se elimina llevando el pH hasta
5-5,5 con HCl 0,1 N y dejando la mezcla en reposo
durante 2-4 horas más. Al final, la mezcla se
neutraliza con NaOH 0,1 N y el producto se recupera mediante
precipitación con acetona o etanol tras haber concentrado el
producto mediante evaporación a presión reducida.
Análogamente, pueden determinarse las cantidades
de nitrito de sodio que, partiendo de 1 g de
K5-N-sulfato o
epiK5-N-sulfato, permiten la
consecución de un
LMW-K5-N-sulfato
despolimerizado o un
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado con un peso molecular medio de desde aproximadamente
4.000 hasta aproximadamente 12.000, ventajosamente desde
aproximadamente 4.000 hasta aproximadamente 7.500, en particular de
6.000-7.500.
Los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados así obtenidos, con un contenido en ácido idurónico
de desde el 40% hasta el 60%, ventajosamente del
50-55% y preferiblemente casi libre de NH_{2} y
grupos N-acetilo, que tienen un peso molecular
medio de desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 12.000,
ventajosamente de desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente
10.000, preferiblemente desde aproximadamente 1.500 hasta
aproximadamente 7.500 y sus sales farmacéutica o químicamente
aceptables son materiales de partida en la preparación de los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados de la presente invención.
Ventajosamente, los materiales de partida en la
preparación de los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados de la presente invención son derivados de
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que consisten en una mezcla de cadenas en las que al
menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I
en las que el 40%-60%,
preferiblemente el 50%-55% de las unidades urónicas consisten en
ácido idurónico, n es un número entero desde 2 hasta 20,
ventajosamente desde 3 hasta 15, y el catión correspondiente es uno
farmacéutica o químicamente
aceptable.
En este contexto, el término "químicamente"
se refiere a un catión utilizable en síntesis química, tal como
iones sodio, amonio,
tetraalquil(C_{1}-C_{4})amonio, o
para la purificación del producto.
Cationes ventajosos son aquéllos derivados de
metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio,
tetraalquil(C_{1}-C_{4})amonio,
aluminio y zinc. Cationes preferidos son los iones sodio, calcio y
tetrabutilamonio.
Los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados, que consisten en una mezcla de cadenas en las que
al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I anterior en
el presente documento, obtenidos mediante despolimerización nitrosa
de los epiK5-N-sulfatos
correspondientes mostrados anteriormente y la posterior reducción
por ejemplo con borohidruro de sodio, son compuestos de partida
particularmente interesantes. Entre estos, los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados que consisten en una mezcla de cadenas en las que
la especie predominante tiene la fórmula I'a
\vskip1.000000\baselineskip
en la que el 40%-60% de las
unidades urónicas son las de ácido idurónico, p es un número entero
desde 4 hasta 8 y el catión correspondiente es uno farmacéutica o
químicamente aceptable, son materiales de partida particularmente
ventajosos. El peso molecular medio de estos productos es de desde
aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente
4.000.
El origen de estos
epiK5-N-sulfatos a partir de una
etapa de despolimerización nitrosa seguida de una reducción con,
por ejemplo, borohidruro de sodio supone, en el extremo reductor de
la mayoría de las cadenas en dicha mezcla de cadenas, la presencia
de una unidad de 2,5-anhidromanitol de estructura
(a)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X representa un grupo
hidroximetilo. Por tanto, el extremo reductor de la mayoría de las
cadenas está representado en realidad mediante la estructura
(b)
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es tal como se define
anteriormente.
\newpage
Otros materiales de partida de
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados particularmente ventajosos según la presente
invención consisten en mezclas de cadenas en las que la especie
predominante es un compuesto de fórmula I'b
en la que X es hidroximetilo, m es
4, 5 ó 6, el catión correspondiente es un ión farmacéutica o
químicamente aceptable y las unidades glucurónicas e idurónicas
están presentes de manera alternante, siendo la extremidad no
reductora una unidad glucurónica o idurónica. En tal caso la razón
glucurónicas/idurónicas es de desde 45/55 hasta 55/45, es decir
aproximadamente
50/50.
El uso de la C5-epimerasa,
preferiblemente recombinante, preferiblemente inmovilizada en un
soporte sólido en las condiciones mostradas anteriormente no
permite por tanto la epimerización en agrupaciones de derivados de
K5-N-sulfato en derivados de
epiK5-N-sulfatos tal como se produce
en la naturaleza, sino en un manera regular.
En la preparación de los nuevos
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados según el procedimiento (a)-(d) ilustrado
anteriormente, la etapa (a) consiste en una
O-sobresulfatación de los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados de partida, que puede llevarse a cabo según
cualquiera de los métodos descritos en la bibliografía, por ejemplo
según el método C descrito por Casu et al., o según
variaciones del mismo método, por ejemplo tal como se describe en
el documento US 2002/0062019, con el fin de obtener un
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado.
El origen de los
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfatos
despolimerizados a partir de
LMW-epiK5-sulfatos despolimerizados
obtenidos mediante despolimerización nitrosa y posterior reducción
con, por ejemplo, borohidruro de sodio, supone, en el extremo
reductor de la mayoría de las cadenas en dicha mezcla de cadenas, la
presencia de una unidad de 2,5-anhidromanitol
sulfatada de estructura (a')
en la que R representa hidrógeno o
SO_{3}^{-}.
Por tanto, el extremo reductor de la mayoría de
las cadenas en dicha mezcla de cadena se representa mediante la
estructura (b')
en la que R, R' y R'' representan H
o SO_{3}^{-} y la unidad urónica puede ser glucurónica o
idurónica.
Actuando tal como se describe en el documento US
2002/0062019, una disolución que contiene el
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado a una concentración del 10% se enfría hasta 10ºC y
entonces se hace pasar a través de una resina de intercambio
catiónico IR-120 H^{+} o un equivalente de la
misma (35-100 ml). Tanto la columna como el
recipiente que contiene el eluato se mantienen a 10ºC. Tras el paso
de la disolución, la resina se lava con agua desionizada hasta que
el pH del permeado es superior a 6 (aproximadamente 3 volúmenes de
agua desionizada). La disolución ácida se lleva hasta neutralidad
con una base orgánica terciaria o cuaternaria tal como por ejemplo
hidróxido de tetrabutilamonio (disolución acuosa al 15%) para
obtener la sal de amonio correspondiente. La disolución se
concentra hasta un volumen mínimo y se liofiliza. El producto
obtenido se suspende en 20-500 ml de
dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO) y se le añaden
15-300 g de un agente de sulfatación, tal como el
aducto de piridina.SO_{3}, en forma sólida o disueltos en DMF o
DMSO. La disolución se mantiene a 20-70ºC,
preferiblemente a 40-60ºC durante
2-24 horas.
Se añade un volumen de agua con el fin de
detener la reacción, el pH se lleva hasta neutralidad con NaOH 1 N.
La muestra se recupera mediante precipitación con una disolución
saturada de NaCl en acetona. El precipitado se separa del
disolvente mediante filtración. El sólido obtenido se disuelve en
100 ml de agua desionizada y se purifica a partir de las sales
residuales mediante ultrafiltración. El producto obtenido muestra
una razón sulfato/carboxilo de desde 2 hasta un máximo de 3,2,
calculada según Casu et al. Carbohydrate Res. 1975, 39,
168-176. La posición 6 del aminoazúcar está
sulfatada al 80-95% y la posición 2 no está
sulfatada. Los otros grupos sulfato están presentes en la posición
3 del aminoazúcar y en las posiciones 2 y 3 del ácido urónico.
Un
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado que tiene una razón sulfato/carboxilo mayor,
concretamente de al menos 3,4, ventajosamente de al menos 3,5, más
ventajosamente desde 3,55 hasta 4, preferiblemente desde 3,55 hasta
3,8, se obtiene llevando a cabo la etapa anterior (a)
- (a1)
- tratando un dicho LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado, en forma ácida, con una base orgánica terciaria o cuaternaria, dejando la mezcla de reacción en reposo durante un periodo de tiempo de 30-60 minutos, manteniendo el pH de la disolución a un valor de aproximadamente 7 mediante la adición de dicha base orgánica terciaria o cuaternaria y aislando su sal con dicha base orgánica;
- (a2)
- tratando dicha sal de base orgánica de dicho LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado con un agente de O-sulfatación en condiciones de O-sobresulfatación y aislando el LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado.
El
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado obtenido al final de la etapa (a) o de la etapa (a1)
+ (a2) tiene un grado de sulfatación de desde 2 hasta 4 y un peso
molecular medio de desde aproximadamente 2.500 hasta
aproximadamente 12.500, ventajosamente desde aproximadamente 2.500
hasta aproximadamente 10.500, preferiblemente desde aproximadamente
2.500 hasta aproximadamente 8.000 y el catión correspondiente es
farmacéutica o químicamente aceptable.
Como puede observarse, a pesar de la adición de
1-3 grupos SO_{3}^{-} por disacárido, partiendo
de un
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado que tiene un peso molecular medio de desde
aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 12.000, se obtiene al
final de la etapa (a) un
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado con un peso molecular medio de desde
aproximadamente 2.500 hasta aproximadamente 12.500, de manera
concreta ligeramente superior al del material de partida en lugar
de un intervalo de peso molecular teórico de desde aproximadamente
2.000 hasta aproximadamente 15.000. Esta disminución del peso
molecular está provocada por una despolimerización adicional debida
al medio fuertemente ácido en el que se lleva a cabo la etapa
(a).
Los
LMW-epiK5-amino-O-sulfatos
despolimerizados se forman ventajosamente de una mezcla de cadenas
en la que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula II
en la que el 40%-60%,
preferiblemente el 50%-55%, de las unidades urónicas son las de
ácido idurónico, R, R' e R'' representan hidrógeno o un grupo
SO_{3}^{-}, para un grado de sulfatación de desde 2 hasta 4, q
es un número entero desde 2 hasta 17, ventajosamente desde 2 hasta
14, preferiblemente desde 2 hasta 11, presenta una unidad (a') tal
como se define anteriormente en el extremo reductor de la mayoría de
sus cadenas y el catión correspondiente es uno farmacéutica o
químicamente
aceptable.
Los
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación muy alto (al
menos 3,4, ventajosamente al menos 3,5, más ventajosamente desde
3,55 hasta 4, preferiblemente desde 3,55 hasta 3,8) que pueden
obtenerse según las etapas (a1) + (a2) mencionadas anteriormente se
forman mediante una mezcla de cadenas en la que al menos el 90% de
dichas cadenas tienen la fórmula II en la que el 40%-60%,
preferiblemente el 50%-55% de las unidades urónicas son las del
ácido idurónico, R es al menos el 40%, ventajosamente el 50%-80%,
de manera preferible aproximadamente el 65% de SO_{3}^{-}, R' y
R'' son ambos SO_{3}^{-} o uno de ellos es hidrógeno y el otro
es el 5%-10% de SO_{3}^{-} en ácido glucurónico y el 10%-15% de
SO_{3}^{-} en ácido idurónico, q es tal como se define
anteriormente y el catión correspondiente es uno farmacéutica o
químicamente aceptable.
En la etapa (b) del procedimiento de la presente
invención, la O-desulfatación selectiva del
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado obtenido al final de la etapa (a) se lleva a cabo
mediante el tratamiento del
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado con una mezcla de DMSO/metanol 9/1, por ejemplo
según los métodos descritos por A. Naggi et al.,
Carbohydrate Research, 2001, 336, 283-290, en el
documento WO 01/72848 o en el documento US 2002/0062019.
En la práctica, una disolución del
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado obtenido al final de la etapa (a) se hace pasar
sobre una resina de intercambio catiónico tal como
IR-120 H^{+} lavando con agua desionizada y la
disolución percolada se lleva hasta pH desde 6 hasta 7 con una base
orgánica terciaria o cuaternaria tal como piridina. La sal del
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado con la base orgánica, por ejemplo su sal de
piridina, se aísla mediante la liofilización de la disolución
concentrada adecuadamente. El producto obtenido se trata con una
disolución de dimetilsulfóxido/metanol aproximadamente 9/1 (V/V) y
la disolución obtenida se mantiene a 45-90ºC
durante un periodo de tiempo de desde 1 hasta 8 horas,
ventajosamente de desde 2 hasta 4 horas, preferiblemente de desde
135 hasta 155 minutos. El producto parcialmente
O-desulfatado, que consiste en un
LMW-epiK5-amino-O-sulfato
despolimerizado parcialmente desulfatado frecuentemente en los
hidroxilos primarios y en los hidroxilos de los ácidos urónicos, se
aísla mediante precipitación a partir de la disolución mediante la
adición de agua desionizada y, posteriormente, de acetona, que
contiene opcionalmente cloruro de sodio en una cantidad hasta la
saturación.
Según una realización preferida, la mezcla de
dimetilsulfóxido/metanol aproximadamente 9/1 (V/V) se calienta
previamente hasta la temperatura deseada, se le añade la sal de
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado y la duración de la reacción de
O-desulfatación se considera partiendo del momento
en el que todos los reactivos están a la temperatura seleccionada
previamente. El
LMW-epiK5-amino-O-sulfato
despolimerizado, parcialmente desulfatado frecuentemente en los
hidroxilos primarios y en los hidroxilos de los ácidos urónicos, se
aísla tal como se describe anteriormente. Una pequeña muestra puede
separarse para la caracterización y el producto restante se usa para
la posterior etapa de
6-O-sulfatación (c).
En la etapa (c), el precipitado a partir de
acetona se lava con acetona, se disuelve en agua y la disolución se
lleva hasta un pH de aproximadamente 7,5 con NaOH 2 N, se hace pasar
a través de una resina IR-120 H^{+}, entonces se
neutraliza con una base orgánica terciaria o cuaternaria tal como
piridina o hidróxido de tetrabutilamonio y la sal obtenida se aísla
mediante liofilización. La
6-O-sulfatación se lleva a cabo
disolviendo la sal mencionada anteriormente en DMF y añadiendo el
agente de sulfatación, por ejemplo piridina.SO_{3}, también
disuelto en DMF, en una cantidad de 2,15 gramos por gramo de
producto (sal de tetrabutilamonio). La reacción se lleva a cabo
manteniendo la mezcla a aproximadamente 0ºC durante aproximadamente
60-120 minutos y el producto
6-O-sulfatado se aísla
neutralizando la disolución con NaOH y mediante posterior
precipitación con acetona, que contiene opcionalmente cloruro de
sodio en una cantidad hasta la saturación. La operación de
precipitación puede repetirse varias veces. El
LMW-epiK5-amino-O-sulfato
despolimerizado 6-O-resulfatado así
obtenido tiene un contenido en
6-O-sulfato de al menos el 80%.
En la etapa (d), el
LMW-epiK5-O-sulfato
despolimerizado 6-O-resulfatado se
trata con un agente de sulfatación en las condiciones clásicas de
N-sulfatación. En particular, la operación se lleva
a cabo tratando una disolución acuosa del
LMW-epiK5-O-sulfato
despolimerizado 6-O-resulfatado
obtenido al final de la etapa (c) con carbonato de sodio y entonces
con un agente de sulfatación tal como piridina.SO_{3} a una
temperatura de 35-45ºC y el producto final, que
consiste en el
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que tiene un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9, se aísla como sal de sodio, por ejemplo mediante
diafiltración. La reacción de N-sulfatación puede
repetirse.
La sal de sodio del
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que tiene un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta
2,9 puede transformarse en otra sal farmacéutica aceptable, tal
como la de otra sal de metal alcalino, de un metal alcalinotérreo,
de aluminio o de zinc según métodos conocidos, por ejemplo mediante
intercambio iónico con una resina adecuada, mediante precipitación
con disolventes o mediante ultrafiltración a través de membranas
adecuadas. Sales ventajosas son las de sodio, potasio, magnesio,
calcio, aluminio y zinc. Se prefieren las sales de sodio y
calcio.
Según una realización preferida, la presente
invención proporciona un procedimiento para la preparación de
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9 y de sus sales farmacéuticas aceptables, que comprende
- (ii)
- someter un K5-N-sulfato a una despolimerización nitrosa para obtener un LMW-K5-N-sulfato despolimerizado que tiene un peso molecular medio superior a 4.000, ventajosamente desde aproximadamente 5.000 hasta aproximadamente 7.500, preferiblemente desde aproximadamente 6.000 hasta aproximadamente 7.500;
- (i)
- someter el LMW-K5-N-sulfato despolimerizado así obtenido a una epimerización en C5 con D-glucuronilo C5-epimerasa para obtener un LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado correspondiente que contiene desde el 40% hasta el 60% de unidades idurónicas;
- (a)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado así obtenido con un agente de sulfatación en condiciones de O-sobresulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado;
- (b)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado así obtenido a una O-desulfatación selectiva para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado;
- (c)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado así obtenido con un agente de O-sulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato;
- (d)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato así obtenido a una reacción de N-sulfatación y aislar el LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado así obtenido como la sal de sodio del mismo que se transforma opcionalmente en otra sal farmacéuticamente aceptable.
Según este procedimiento preferido, se obtienen
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9 y un peso molecular medio de al menos 6.000, en particular
de desde aproximadamente 6.000 hasta aproximadamente 12.000,
ventajosamente desde aproximadamente 6.000 hasta aproximadamente
11.000.
Los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9 y sus sales farmacéuticamente aceptables, que pueden
obtenerse mediante este procedimiento preferido, representan otra
realización preferida de la presente invención. Las sales preferidas
son las mencionadas anteriormente, en particular las sales de sodio
y calcio.
Según una realización preferida adicional, la
presente invención proporciona un procedimiento que, partiendo de
un K5-N-sulfato, por medio de la
secuencia (i)\rightarrow(ii), permite la preparación
de
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9 y un peso molecular medio en todo el intervalo de desde
aproximadamente 1.000 hasta aproximadamente 12.000.
Este procedimiento, que es particularmente
apropiado para la preparación de
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un peso molecular medio muy bajo (de
desde aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente 5.000) que no
pueden obtenerse mediante el procedimiento realizado por medio de la
secuencia (ii)-(i), comprende
- (i)
- someter un K5-N-sulfato a una epimerización en C5 con una D-glucuronilo C5-epimerasa aislada, purificada y en disolución o inmovilizada en un soporte sólido, a un pH de aproximadamente 7, a una temperatura de aproximadamente 30ºC y durante un periodo de tiempo de 12-24 horas en presencia de al menos un ión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso para dar un epiK5-N-sulfato que tiene un contenido de desde el 40% hasta el 60% en ácido idurónico;
- (ii)
- someter el epiK5-N-sulfato así obtenido a una despolimerización nitrosa seguida de una reducción, normalmente con borohidruro de sodio para obtener un LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado;
- (a)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado así obtenido con un agente de sulfatación en condiciones de O-sobresulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado;
- (b)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado así obtenido a una O-desulfatación selectiva para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado;
- (c)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado así obtenido con un agente de O-sulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato;
- (d)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato así obtenido a una reacción de N-sulfatación y aislar el LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado así obtenido como la sal de sodio del mismo que se transforma opcionalmente en otra sal farmacéuticamente aceptable.
Los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9 y sus sales farmacéuticas aceptables, que pueden
obtenerse mediante este otro procedimiento preferido, representan
un realización preferida adicional de la presente invención. Las
sales preferidas son las mencionada anteriormente, en particular las
sales de sodio y calcio.
En particular, según este aspecto adicional, la
presente invención se refiere a
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados novedosos que tienen un grado de sulfatación de
desde 2,3 hasta 2,9 y a sus sales farmacéuticas aceptables, que
tienen un peso molecular medio de desde aproximadamente 1.500 hasta
aproximadamente 12.000, pero, en particular, inferior a 5.000,
preferiblemente inferior a 4.000, ventajosamente de desde
aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 5.000, preferiblemente
de desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 4.000.
Debe observarse que el peso molecular de los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados nuevos es aproximadamente igual al de los
LMW-epiK5-N-sulfatos
despolimerizados de partida debido a la despolimerización parcial
que se produce en la etapa de O-sobresulfatación (a)
o (a1) + (a2).
Más particularmente, según su realización más
preferida, la presente invención se refiere a
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9, ventajosamente desde 2,5 hasta 2,9, preferiblemente
desde 2,7 hasta 2,9, y un peso molecular medio de desde
aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 12.000, ventajosamente
desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 10.000,
preferiblemente desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente
8.000 y caracterizados por la presencia de la estructura (a') en el
extremo reductor de la mayoría de sus cadenas y sus sales
farmacéuticamente aceptables. Un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
que presenta una actividad antitrombótica interesante, comparable
con la de la HBPM pero con un riesgo de 2,5 a 4 veces inferior para
inducir hemorragia que la HBPM, tiene un peso molecular medio de
aproximadamente 6.000. Preferiblemente, este
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado tiene un grado de sulfatación de desde 2,7 hasta
2,9, un contenido del 80-95% en
6-O-sulfato de glucosamina, del
95-100% en N-sulfato de glucosamina,
del 45-55% en
3-O-sulfato de glucosamina, del
35-45% en
3-O-sulfato de ácido glucurónico,
del 15-25% en
2-O-sulfato de ácido idurónico y
presenta una unidad (a') tal como se define anteriormente en el
extremo reductor de la mayoría de sus cadenas.
Los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados ventajosos de la presente invención consisten en
mezclas de cadenas en las que al menos el 80% de dichas cadenas
tienen la fórmula III
en las que las unidades urónicas
son el 40%-60% de las de ácido idurónico, q es un número entero
desde 2 hasta 17, ventajosamente desde 2 hasta 14, preferiblemente
desde 2 hasta 11, R, R' y R'' son hidrógeno o SO_{3}^{-}, para
un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta 2,9, y el extremo
reductor de la mayoría de las cadenas en dicha mezcla de cadenas
presenta una unidad de 2,5-anhidromanitol sulfatada
de estructura
(a')
en la que R representa hidrógeno o
SO_{3}^{-}, y el catión correspondiente es farmacéutica o
químicamente
aceptable.
Un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado preferido, o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo, consiste en una mezcla de cadenas en la que la especie
predominante es un compuesto de fórmula III en la que q es 8 ó 9, R
es el 45%-55% de SO_{3}^{-}, R' es el 35%-45% de SO_{3}^{-}
en ácido glucurónico, R'' es el 15%-25% de SO_{3}^{-} en ácido
idurónico, para un grado de sulfatación de desde 2,7 hasta 2,9, y
presenta una unidad de 2,5-anhidromanitol sulfatada
de estructura (a') tal como se define anteriormente en el extremo
reductor de la mayoría de sus cadenas.
Los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados nuevos de la presente invención tienen una
actividad muy interesante en los parámetros de coagulación. De
hecho, tienen actividades anti-Xa y
anti-IIa altas y suponen un riesgo muy bajo de
inducción de hemorragia en pacientes que necesitan un tratamiento
heparínico para la regulación de la coagulación. Son
particularmente interesantes los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados que tienen un peso molecular medio de
aproximadamente 6.000, N-sulfatados al
95-100%,
6-O-sulfatados en glucosamina al
80-95%,
3-O-sulfatados en glucosamina al
45-55%,
3-O-sulfatados en ácido glucurónico
al 35-45%,
2-O-sulfatados en ácido idurónico
al 15-25%, para un grado de sulfatación de desde 2,7
hasta 2,9, que presentan una unidad (a') en el extremo reductor de
la mayoría de sus cadenas, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Uno de esos
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados, ilustrado a continuación en el presente documento
en el ejemplo 1, se ha sometido a prueba en los ensayos clásicos de
las actividades anti-Xa y anti-IIa,
y también se ha sometido a prueba su efecto en el Tiempo de
Tromboplastina Parcial Activada (TTPA).
Los ensayos de actividad usados para la
determinación de las actividades anti-IIa y
anti-Xa se basan en la inhibición de enzimas de
coagulación mediante el complejo formado por heparina y antitrombina
III (ATIII). Se añaden en exceso ATIII y factor IIa o factor Xa. La
enzima de coagulación residual reacciona con un sustrato dando como
resultado una liberación de paranitroanilina medible
espectrofotométricamente, cuyo nivel es inversamente proporcional
al nivel de la enzima de coagulación. Los tampones usados son: NaCl
al 0,9% en la determinación de la actividad anti-Xa
y Tris 0,05 M + NaCl 0,15 M y BSA (albúmina sérica bovina) al 1% en
la determinación de la actividad anti-IIa. La
actividad del
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado y de los compuestos de referencia (una heparina no
fraccionada comercial y una HBPM comercial) se midieron frente a un
patrón de HBPM internacional en cuanto a actividades
anti-Xa y anti-IIa. Se determinaron
las diluciones que indican actividad aproximadamente en 0,5 U/ml en
cuanto a la actividad anti-Xa y 0,05 U/ml para la
actividad anti-IIa. Se asumió para los cálculos una
actividad específica para la heparina no fraccionada de 160
U/ml.
El efecto del
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado de la invención y de los productos de referencia en
TTPA se midió usando el kit de sílice liofilizada de TTPA IL
Test^{TM}. La coagulación se inicia en plasma citrado añadiendo
fosfolípidos que se requieren para formar complejos que activan el
factor X y la protrombina. Se usa un activador de contacto para
estimular la producción del factor XIIa proporcionando una
superficie para la función de cininógeno de alto peso molecular,
calicreína y factor XIIa. Se añade calcio para desencadenar
reacciones adicionales. Se mide el tiempo requerido para formación
de coágulos.
En la comparación del efecto de los compuestos
de referencia y prueba en el tiempo de coagulación, se usó una
dosis estimada que provoca coagulación de 100 s. Para conseguir este
valor se preparó una curva de respuesta a la dosis usando dosis que
provocan tiempos de coagulación en el intervalo de 50 y 230
segundos. Se obtuvo una dosis que provoca un tiempo de coagulación
de 100 s como estimación a partir de una línea de tendencia.
A partir de los ensayos mencionados
anteriormente, resultó que las actividades anti-Xa y
anti-IIa del
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado de la invención son aproximadamente el 50% de las
de la HBPM. Como consecuencia, el
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado de la invención, como agente antitrombótico, puede
considerarse como una HBPM con una anti-Xa y
anti-IIa del mismo orden de magnitud.
También, resultó que la potencia del
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado de la invención para aumentar la coagulación es
débil. En comparación con la heparina no fraccionada y HBPM, se
necesitaron aproximadamente dosis 5-8 veces mayores
de
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado para inducir el mismo efecto en el TTPA.
Por tanto, la presente invención proporciona,
por primera vez, un producto derivado del polisacárido K5 que tiene
las mismas características biológicas que la HBPMc, pero con un
riesgo hemorrágico inferior. Los
LMW-epiK5-N,O-sulfatos
despolimerizados nuevos de la presente invención, y sus sales
farmacéuticamente aceptables, son por tanto útiles como
medicamentos para la regulación de la coagulación y para la
prevención o el tratamiento de la trombosis así como principios
activos de composiciones farmacéuticas para las indicaciones
mencionadas anteriormente.
Según un aspecto adicional, la presente
invención proporciona una composición farmacéutica que comprende,
como principio activo, una cantidad farmacológicamente activa de un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado como se ilustró anteriormente, en particular un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que tiene un grado de sulfatación de desde 2,3
hasta 2,9, un peso molecular medio de desde aproximadamente 1.500
hasta aproximadamente 12.000 y que presenta la estructura (a'), tal
como se define anteriormente, en el extremo reductor de la mayoría
de sus cadenas, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en mezcla con un excipiente farmacéutico.
En las composiciones farmacéuticas de la
presente invención para administración oral, subcutánea,
intravenosa, transdérmica, oftálmica o tópica, los principios
activos se administran preferiblemente como unidades de
dosificación, en mezcla con los vehículos o excipientes
farmacéuticos clásicos.
La dosis puede cambiar ampliamente en función de
la edad, el peso y las condiciones de salud del paciente. Esta
dosis comprende la administración de una unidad de dosificación de
desde 1 hasta 1.000 mg, ventajosamente desde 10 hasta 750 mg,
preferiblemente desde 250 hasta 500 mg, de una a tres veces al día,
por vía intravenosa, subcutánea, oral, transdérmica, oftálmica o
tópica. Mediante administración parenteral (subcutánea o
intravenosa) la dosis preferida es de desde 5 hasta 100 mg.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas
de la presente invención comprenden, como principio activo de las
mismas, un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que puede obtenerse partiendo de un
K5-N-sulfato, según las etapas
(i)\rightarrow(ii)\rightarrow(a)-(d)
o
(ii)\rightarrow(i)\rightarrow(a)-(d)
del procedimiento ilustrado anteriormente, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo. Más ventajosamente, dicho
principio activo es un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que tiene un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta
2,9, un peso molecular medio de desde aproximadamente 1.500 hasta
aproximadamente 12.000 y presenta la estructura (a') tal como se
define anteriormente en el extremo reductor de la mayoría de sus
cadenas. Preferiblemente, dicho
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado tiene un peso molecular medio de aproximadamente
6.000, está N-sulfatado al 95%-100%,
6-O-sulfatado en glucosamina al
80%-95%, 3-O-sulfatado en
glucosamina al 45%-55%,
3-O-sulfatado en ácido glucurónico
al 35%-45%, 2-O-sulfatado en ácido
idurónico al 15%-25%, para un grado de sulfatación de desde 2,7
hasta 2,9.
Según otro de sus aspectos, la presente
invención proporciona un método para la regulación de la coagulación
en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero que
necesita dicha regulación de la coagulación una cantidad eficaz de
un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado como se ilustró anteriormente. Además, la invención
proporciona un método para prevenir o tratar la trombosis en un
mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad
eficaz de un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado como se ilustró anteriormente. Para la regulación
de la coagulación o para prevenir o tratar la trombosis, la cantidad
eficaz de
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado es de desde 5 hasta 100 mg. Dicha cantidad eficaz
se administra en una composición farmacéutica entre las ilustradas
anteriormente. Ventajosamente, dicho
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado tiene un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta
2,9, un peso molecular medio de desde aproximadamente 1.500 hasta
aproximadamente 12.000 y presenta la estructura (a') tal como se
define anteriormente en el extremo reductor de la mayoría de sus
cadenas.
Preferiblemente, dicho
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado tiene un peso molecular medio de aproximadamente
6.000, está N-sulfatado al 95%-100%,
6-O-sulfatado en glucosamina al
80%-95%, 3-O-sulfatado en
glucosamina al 45%-55%,
3-O-sulfatado en ácido glucurónico
al 35%-45%, 2-O-sulfatado en ácido
idurónico al 15%-25%, para un grado de sulfatación de desde 2,7
hasta 2,9.
Finalmente, tal como se ilustra anteriormente en
el presente documento, todos los derivados de
(epi)K5-amino-O-sobresulfatos
que tienen un grado de sulfatación de desde 2 hasta 4 tienen
actividad microbicida y son principios activos de composiciones
farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, en
particular virales. Ventajosamente, dichas composiciones
farmacéuticas comprenden, como principio activo de los mismas, una
cantidad farmacológicamente eficaz de un derivado de
(epi)K5-amino-O-sobresulfato,
que tiene un grado de sulfatación de desde 2 hasta 4, que puede
obtenerse tratando una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria
de un (epi)K5-N-sulfato con
un agente de sulfatación en condiciones de
O-sobresulfatación, o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en mezcla con un excipiente farmacéutico.
En particular, según otro de sus aspectos, la
invención proporciona una composición farmacéutica que comprende,
como principio activo, una cantidad farmacológicamente activa de un
derivado de
(epi)K5-amino-O-sobresulfato
que tiene un grado de sulfatación de desde 2 hasta 4, o de una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, que puede obtenerse tratando
una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria de un derivado de
(epi)K5-N-sulfato con un
agente de O-sulfatación en condiciones de
O-sobresulfatación, habiéndose aislado dicha sal de
derivado de
(epi)K5-N-sulfato con dicha
base orgánica según métodos conocidos, en particular mediante
liofilización, inmediatamente tras su formación a un pH de desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9, en mezcla con un
excipiente farmacéutico.
Más concretamente, el derivado de
(epi)K5-amino-O-sobresulfato
usado como principio activo de las composiciones de la presente
invención puede obtenerse
- (a1')
- tratando un derivado de (epi)K5-N-sulfato, en su forma ácida, con una base orgánica terciaria o cuaternaria y aislar su sal con dicha base orgánica terciaria o cuaternaria inmediatamente tras su formación, a un pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9;
- (a2')
- tratando dicha sal de base orgánica terciaria o cuaternaria de dicho derivado de (epi)K5-N-sulfato con un agente de O-sulfatación en condiciones de una O-sobresulfatación y aislando el derivado de (epi)K5-amino-O-sobresulfato como la sal de sodio del mismo que puede posteriormente transformarse en otra sal.
En las composiciones farmacéuticas de la
presente invención para administración oral, subcutánea,
intravenosa, transdérmica, oftálmica o tópica, los principios
activos derivados de
(epi)K5-amino-O-sobresulfatos
se administran preferiblemente en la forma de unidades de
dosificación, en mezcla con los vehículos o excipientes
farmacéuticos clásicos. El régimen de dosis puede variar
ampliamente dependiendo de la edad, el peso y el estado de salud
del paciente. Este régimen de dosis incluye la administración de una
dosis de un derivado de
(epi)K5-amino-O-sobresulfato
de desde 1 hasta 1000 mg, ventajosamente desde 10 hasta 750 mg,
preferiblemente de 250 a 500 mg de una a tres veces al día mediante
administración intravenosa, subcutánea, oral, transdérmica,
oftálmica o tópica.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
un derivado de
(epi)K5-amino-O-sobresulfato
tales como las mostradas anteriormente se formulan con los
excipientes clásicos adecuados para la diferentes formas de
administración. Son particularmente ventajosas las formulaciones en
forma de cremas, ungüentos, linimentos, geles, espumas, bálsamos,
pesarios vaginales, supositorios, disoluciones o suspensiones
adecuados para administración local.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Preparación
I
Se disuelven diez gramos de
K5-N-sulfato obtenido tal como se
describe en el ejemplo 2, etapas (i) y (ii), del documento WO
02/068477, cuyo espectro de ^{1}H-RMN no muestra
señales relacionadas con grupos acetilo o NH_{2}, en 600 ml de
tampón HEPES 25 mM a pH 7, que contiene CaCl_{2} a una
concentración de 50 mM y se hace recircular la disolución así
obtenida a través de una columna de 50 ml llena de Resina Sepharose
4B que contiene 5 g de C5-epimerasa recombinante
(documento WO 96/14425) inmovilizada tal como se describe en el
ejemplo 1 del documento WO 01/72848. Se lleva a cabo la reacción a
30ºC a pH 7 con un flujo de 200 ml/h durante 24 horas. Se purifica
el producto obtenido mediante ultrafiltración y precipitación con
etanol. Por tanto, se obtiene un
epiK5-N-sulfato que tiene un
contenido en ácido idurónico del 54%
Se añaden 230 mg de nitrito de sodio disueltos
en 115 ml de agua destilada a una disolución de 1 g del producto
así obtenido, en 25 ml de agua destilada. Se lleva la disolución
entonces hasta 4ºC, se ajusta el pH a 2 con HCl 0,1 N y se mantiene
durante 30 minutos. Al final de la reacción se lleva la disolución
hasta temperatura ambiente y el pH a 7 con NaOH 0,1 N. Se le añaden
a la disolución entonces 450 mg de NaBH_{4} y se deja reaccionar
durante 4 horas. Se recupera el producto mediante precipitación con
3 volúmenes de acetona a 4ºC, filtración con embudo filtrante y
secado a 40ºC en un horno de vacío para dar 900 mg de
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado con un contenido en ácido
idurónico del 54% y una distribución del peso molecular de desde 1.000 hasta 4.000, medido con método de HPLC.
idurónico del 54% y una distribución del peso molecular de desde 1.000 hasta 4.000, medido con método de HPLC.
Preparación
II
Se despolimerizan 2 g de
K5-N-sulfato, obtenidos tal como se
describe en el ejemplo 2, etapas (i) y (ii), del documento WO
02/068477, tal como se describe en la etapa (ii) de la preparación I
anterior, usando 100 mg de nitrito de sodio y 300 mg de borohidruro
de sodio. Se obtiene una cantidad de 1,8 g de
LMW-K5-N-sulfato
despolimerizado con un peso molecular medio de 5.000.
Se trata 1 g de
LMW-K5-N-sulfato
despolimerizado obtenido en la etapa (ii) anteriormente en el
presente documento tal como se describe en la etapa (i) de la
preparación I. Se obtiene un producto epimerizado con una razón
ácido idurónico/ácido glucurónico de 44/56 frente a una razón de
0/100 del producto de partida, con una distribución del peso
molecular de desde 2.000 hasta 10.000 y con un peso molecular medio
de 5.000 D. El rendimiento en
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado, calculado midiendo el contenido de ácidos urónicos
frente al patrón con el método de carbazol (Bitter y Muir, Anal.
Biochem. 1971, 39, 88-92) es del 90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación
III
Se disuelve una cantidad de 2 g de
K5-N-sulfato, obtenido tal como se
describe en el ejemplo 2, etapas (i) y (ii), del documento WO
02/068477, en 120 ml de tampón HEPES 25 mM, pH 7, que contiene
CaCl_{2} 50 mM. Se hace recircular la disolución obtenida a
través de una columna de 50 ml llena de la resina que contiene la
enzima inmovilizada obtenida tal como se describe en el documento WO
96/14425. Esta operación se lleva a cabo a 30ºC con un flujo de 200
ml/h durante 24 horas. Se purifica el producto obtenido mediante
ultrafiltración a través de una membrana de 1000 D y pasa por una
columna de intercambio iónico IR 120 H^{+}, se neutraliza el
eluato con NaOH 1 N. Se recupera la muestra mediante precipitación
con etanol o acetona. Se obtiene un producto epimerizado con una
razón ácido idurónico/ácido glucurónico de 55/45 frente a una razón
de 0/100 del producto de partida. Se calculó el porcentaje de
epimerización con ^{1}H-RMN según los métodos
descritos en el documento WO 96/14425. El rendimiento en
epiK5-N-sulfato, calculado midiendo
el contenido en ácidos urónicos frente a un patrón con el método de
carbazol (Bitter y Muir Anal. Biochem. 39,
88-92-1971) es del 90%.
Se despolimeriza un gramo de producto obtenido
en la etapa (a) mediante el método de degradación con ácido nitroso
y la posterior reducción del aldehído que forma. En particular la
operación se lleva a cabo disolviendo el producto en 25 ml de agua
destilada y añadiéndole 230 mg de nitrito de sodio disuelto en 115
ml de agua destilada. Se lleva la disolución entonces hasta 4ºC y
el pH a 2 con HCl 0,1 N y se mantiene durante 30 minutos. Al final
de la reacción la disolución se lleva hasta temperatura ambiente y
el pH hasta 7 con NaOH 0,1 M. Se le añaden a la disolución entonces
450 mg de NaBH_{4} y se deja reaccionar durante 4 horas. Se
recupera el producto mediante precipitación con 3 volúmenes de
acetona a 4ºC, filtración con embudo filtrante y secado a 40ºC en
un horno de vacío para dar 900 mg de
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado con una distribución del peso molecular medido con
método de HPLC que oscila desde 1.000 hasta 4.000 y con un contenido
en unidades glucurónicas del 45% y un contenido en unidades
idurónicas del 55%.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación
IV
Se añaden a una disolución de 1 g de
epiK5-N-sulfato, obtenido tal como
se describe en el ejemplo 12, párrafos [0251]-[0265] del documento
US 2002/0062019, en 200 ml de agua destilada, 480 mg de nitrito de
sodio disueltos en 240 ml de agua destilada. Se lleva la disolución
entonces hasta 4ºC, se ajusta el pH hasta 2 con HCl 0,1 N y se
mantiene durante 30 minutos. Al final de la reacción la disolución
se lleva hasta pH 7 con NaOH 0,1 M y entonces hasta temperatura
ambiente. Se le añaden a la disolución entonces 450 mg de NaBH_{4}
y reacciona durante 4 horas. Se elimina el exceso de NaBH_{4}
ajustando el pH hasta 5-6 con HCl. Se recupera el
producto, neutralizado con NaOH 0,1 M, mediante precipitación con 3
volúmenes de acetona a 4ºC, filtración con embudo filtrante y
secado a 40ºC en un horno de vacío. Se obtienen 900 mg de
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado con un peso molecular medio de aproximadamente
2.000, que consiste en una mezcla de cadenas en las que la especie
predominante es un compuesto de fórmula I'b en la que m es 4.
Preparación
V
Se calienta una disolución de 8 g de K5 puro al
95% en 800 ml de NaOH 2 N hasta 60ºC durante 24 horas. Tras el
enfriamiento, se lleva la disolución hasta pH 7 mediante HCl 6 N. A
la disolución así neutralizada, se le añaden en primer lugar 12,8 g
de carbonato de sodio, entonces, en porciones en 4 horas, 12,8 g de
aducto de piridina.SO_{3} en forma sólida. Se mantiene la mezcla
de reacción a 40ºC durante 24 horas. Tras eliminación de la sales
mediante ultrafiltración en membrana Prepscale TFF de punto de corte
de 1000 D de Millipore, se recupera el producto obtenido mediante
precipitación con 3 volúmenes de acetona. Por tanto, se obtienen 8
g de K5-N-sulfato. Su espectro de
^{1}H-RMN muestra una
N-sulfatación del 100% (ausencia de señales debida a
NH_{2} y grupos acetilo).
- (i)
- Epimerización. Se disuelven los 8 g de K5 N-sulfato así obtenido en 200 ml de tampón Hepes 0,25 M pH 7 que contiene CaCl_{2} 50 mM y se tratan en disolución con 9,6 x 10^{10} cpm de C5-epimerasa recombinante a 30ºC durante 24 horas a pH 7. Al final de la reacción, se purifica la muestra mediante la eliminación de la sales mediante ultrafiltración en membrana Prepscale TFF de punto de corte de 1000 D de Millipore y, entonces, se precipita con 3 volúmenes de acetona. Por tanto, se obtienen 7,5 g de epiK5-N-sulfato. Su porcentaje de epimerización, en la práctica la cantidad de unidades idurónicas con respecto a las glucurónicas, calculado mediante ^{1}H-RMN según los métodos descritos en el documento WO 96/4425, es del 52%.
- (ii)
- Despolimerización. Se disuelven los 7,5 g de epiK5-N-sulfato así obtenido en 150 ml de agua y se termostatiza la disolución a 4ºC, entonces se lleva el pH hasta 2,2 mediante HCl 1 M previamente enfriado. Se le añaden a la disolución 431,2 mg de nitrito de sodio, correspondientes a 21,56 ml de una disolución al 2% de nitrito de sodio en agua. Se lleva el pH hasta 2,2 de nuevo y se mantiene la mezcla de reacción a 4ºC durante 20 minutos con agitación. Tras la neutralización hasta pH 7,0 con HCl 6 N, se añaden 1,35 g de borohidruro de sodio a la disolución. Se lleva a cabo la reducción manteniendo la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 4 horas, entonces se elimina el exceso de agente de reducción llevando el pH hasta 5 con HCl 1 N, agitando hasta que desaparece la efervescencia. Se lleva el pH hasta 7-7,2 de nuevo con NaOH 1 M. Se recupera el producto despolimerizado mediante ultrafiltración con membrana TFF de punto de corte de 1000 D de Millipore y posterior precipitación con 3 volúmenes de acetona. Por tanto, se obtienen 7 g de LMW-K5-N-sulfato despolimerizado. El peso molecular medio de este producto, calculado por medio de HPLC, es de 6.000 D.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hace pasar a través de una columna de
IR-120 H^{+} una disolución de 7 g de
LMW-K5-N-sulfato
despolimerizado obtenido en la preparación V en 350 ml de agua. El
pH del eluato es de 2,91. Se lleva la disolución percolada hasta pH
7 con una disolución al 15% de hidróxido de tetrabutilamonio (42,2
ml) y se mantiene una hora a temperatura ambiente con controles
para mantener el pH a un valor de 7. Tras la concentración en
rotavapor de la sal de tetrabutilamonio, se congela y se liofiliza
la muestra. Por tanto, se obtienen 10,9 g de sal de tetrabutilamonio
del
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado de partida.
Se disuelve la sal de tetrabutilamonio así
obtenida en 158 ml de dimetilformamida, entonces se añaden 28,8 g
de piridina.SO_{3} disueltos en 158 ml de DMF y se mantiene la
mezcla de reacción a 45ºC durante 18 horas. Se añade un volumen de
316 ml de agua para parar la reacción y se lleva el pH hasta 7 con
NaOH al 30%. Se recupera el
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado mediante precipitación con 3 volúmenes de acetona
saturada con NaCl (1,896 litros) y posterior diafiltración en una
membrana TFF de 1000 D de Millipore hasta la eliminación de la
sales.
Se hace pasar la disolución que contiene el
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado obtenido en (a) sobre una resina de intercambio
iónico IR 120 H^{+} a temperatura ambiente y se lleva el pH hasta
6,7 con piridina. Se congela entonces la disolución y se somete a
liofilización. Se disuelve la sal de piridina (10,73 g) así
obtenida en una disolución que contiene 97 ml de dimetilsulfóxido y
11 ml de metanol. Se añade la sal de piridina del
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
despolimerizado cuando el disolvente se termostatiza a 65º. Se
considera el comienzo de la reacción cuando el disolvente está a
65ºC y, partiendo de este momento, se mantiene la mezcla de
reacción a esta temperatura durante 2 horas y media (en una
preparación el pH al final era de 2,24). Se enfría la mezcla de
reacción mediante el uso de agua con hielo hasta alcanzar
aproximadamente los 30ºC, entonces se añaden 4,5 ml de agua. Se
recupera la muestra mediante percolación de 5 volúmenes de acetona
en la disolución y se recupera el precipitado que forma mediante
filtración en un dispositivo guch G4. Se lava entonces la torta con
acetona y se disuelve entonces en agua de nuevo. El pH se lleva
hasta 7,5 con NaOH 2 N. En la figura 1, se muestra el espectro de
^{13}C-RMN a 300 MHz del
LMW-K5-amino-O-sulfato
despolimerizado así obtenido.
Se hace pasar la disolución sobre una resina IR
120 H^{+} y se neutraliza con una disolución al 15% de hidróxido
de tetrabutilamonio. Se liofiliza la sal así obtenida para dar 12,34
g de producto parcialmente O-desulfatado que
consiste en la sal de tetrabutilamonio del
LMW-K5-amino-O-sulfato
despolimerizado anterior. Se disuelve la sal de tetrabutilamonio
así obtenida en 150 ml de DMF y se añaden a la disolución 14 g de
aducto de piridina.SO_{3} disueltos en 75 ml de DMF. Se mantiene
la mezcla de reacción a 0ºC durante 90 minutos, se añaden entonces
110 ml de agua a la misma para parar la reacción. Se lleva el pH de
la mezcla al final de la reacción (3,4 en una preparación) hasta
7,2 mediante NaOH 2 N. Se recupera la muestra mediante precipitación
con 3 volúmenes de acetona saturada con NaCl. Se añaden algunas
gotas de acetona saturada con NaCl para favorecer la precipitación.
Se forma un precipitado blanco. En una preparación, se repite la
operación dos veces para obtener 6,8 g de
LMW-epiK5-amino-O-sulfato
despolimerizado con un contenido del 80% en glucosamina
6-O-sulfatada, del 50% en
glucosamina 3-O-sulfatada, del 40%
en ácido glucurónico 3-O-sulfatado y
del 20% en ácido idurónico
2-O-sulfatado. En la figura 2, se
muestra el espectro de ^{13}C-RMN.
Se disuelve el
LMW-epiK5-amino-O-sulfato
despolimerizado obtenido al final de la etapa (c) en 500 ml de agua
y se añaden entonces a la disolución 12,8 g de carbonato de sodio
disueltos en 500 ml de agua. El pH de la disolución tras la adición
del carbonato es de 10,51. Tras termostatizar la disolución en 40ºC,
se añaden a la misma 12,8 g de piridina.SO_{3} sólido, en
porciones y en 4 horas. En una preparación, el pH final de la
disolución era de 7,2. Se somete la muestra a diafiltración en
presencia de NaCl y entonces con agua. Se obtiene una cantidad de
8,0 g de
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado con un grado de sulfatación de 2,83 y un contenido
del 95-100% en glucosamina
N-sulfatada, del 80% en glucosamina
6-O-sulfatada, del 50% en
glucosamina 3-O-sulfatada, del 40%
en ácido glucurónico 3-O-sulfatado y
del 20% en ácido idurónico
2-O-sulfatado. En la figura 3, se
muestra el espectro de ^{13}C-RMN del
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado así obtenido. En la zona entre 80 y 90 ppm están
presentes las señales atribuibles a los carbonos 2, 3 y 4, típicas
del 2,5-anhidromanitol (Casu B., Nouv. Rev. Fr.
Hematol., 1984 vol. 26 págs. 211-19). El espectro
muestra un desplazamiento de las señales en la zona entre 80 y 90
ppm que indica la sulfatación del átomo de carbono en las posiciones
1, 3 y 6 de dicho 2,5-anhidromanitol.
\vskip1.000000\baselineskip
Operando tal como se describe en el ejemplo 1,
sometiendo el
LMW-K5-N-sulfato
despolimerizado con un peso molecular medio de 5.000 obtenido en la
preparación II a una O-sobresulfatación tal como en
(a), tratando la sal de piridina del
LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato
así obtenido con una mezcla de DMSO/metanol de aproximadamente 9/1
a 70ºC durante 150 minutos tal como en (b), tratando la sal de
tetrabutilamonio del producto parcialmente
O-desulfatado así obtenido con piridina.SO_{3} a
0ºC durante 90 minutos tal como en (c), y finalmente tratando el
producto 6-O-resulfatado primero con
carbonato de sodio y entonces con piridina.SO_{3} tal como en (d),
se obtiene un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que tiene un peso molecular medio de 5.000, un grado
de sulfatación de 2,8 y un contenido del 95-100% en
glucosamina N-sulfatada, del 85% en glucosamina
6-O-sulfatada, del 48% en
glucosamina 3-O-sulfatada, del 38%
en ácido glucurónico 3-O-sulfatado y
del 20% en ácido idurónico
2-O-sulfatado.
Claims (22)
1. Procedimiento para la preparación de un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que contiene el 40%-60% de unidades idurónicas y que
tiene un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta 2,9 y
caracterizado por la estructura (a')
en la que R representa hidrógeno o
SO_{3}^{-}, en el extremo reductor de la mayoría de sus cadenas,
que
comprende
- (a)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-N-sulfato despolimerizado que contiene el 40%-60% de unidades idurónicas, obtenido sometiendo un epiK5-N-sulfato a una despolimerización nitrosa seguida de reducción, con un agente de sulfatación en condiciones de O-sobresulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado;
- (b)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sobresulfato despolimerizado así obtenido a una O-desulfatación selectiva para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado;
- (c)
- tratar una sal de base orgánica terciaria o cuaternaria del LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado así obtenido con un agente de O-sulfatación para obtener un LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato;
- (d)
- someter el LMW-epiK5-amino-O-sulfato despolimerizado que contiene al menos el 80% de 6-O-sulfato así obtenido a una reacción de N-sulfatación y aislar el LMW-epiK5-N,O-sulfato despolimerizado así obtenido.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado así obtenido se aísla como la sal de sodio del mismo
que se transforma opcionalmente en otra sal farmacéuticamente
aceptable del mismo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicha otra sal es aquella con otro metal alcalino, un metal
alcalinotérreo, aluminio o zinc.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado de partida se obtiene sometiendo un
K5-N-sulfato, en cualquier
orden,
- (i)
- a epimerización en C5 con una D-glucuronilo C5-epimerasa aislada, purificada y o bien en disolución o bien inmovilizada en un soporte sólido, a un pH de aproximadamente 7, a una temperatura de aproximadamente 30ºC y durante un periodo de tiempo de 12-24 horas en presencia de al menos un ión bivalente seleccionado entre calcio, magnesio, bario y manganeso; y
- (ii)
- a una despolimerización nitrosa seguida de reducción, normalmente con borohidruro de sodio.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado de partida de la etapa (a) se obtiene según la
secuencia (i)-(ii) y tiene un peso molecular medio de desde 1.500
hasta 12.000.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que; dicho peso molecular medio es desde 1.500 hasta 7.500.
7. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado de partida se obtiene según la secuencia (ii)-(i) y
tiene un peso molecular medio de desde 4.000 hasta 12.000.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que dicho peso molecular es de desde 5.000 hasta 7.500.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado de partida de la etapa (a) consiste en una mezcla de
cadenas en las que al menos el 90% de dichas cadenas tiene la
fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
en la que el 40%-60% de las
unidades urónicas son las de ácido idurónico, n es un número entero
desde 2 hasta 20, presenta una unidad de
2,5-anhidromanitol de estructura
(a)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X representa un grupo
hidroximetilo, en el extremo reductor de la mayoría de las cadenas
en dicha mezcla de cadenas, y el catión correspondiente es
farmacéutica o químicamente
aceptable.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado de partida consiste en una mezcla de cadenas en la
que la especie predominante tiene la fórmula I'a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que del 40% al 60% de las
unidades urónicas son las de ácido idurónico, presenta una unidad de
2,5-anhidromanitol de estructura
(a)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X representa un grupo
hidroximetilo, en el extremo reductor de la mayoría de las cadenas
en dicha mezcla de cadenas, y p es un número entero desde 4 hasta
8.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 y 10, en el que dicho
LMW-epiK5-N-sulfato
despolimerizado de partida de la etapa (a) consiste en una mezcla de
cadenas en la que la especie predominante tiene la fórmula I'b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es hidroximetilo, m es
4, 5 ó 6, el catión correspondiente es un ión farmacéutica o
químicamente aceptable y las unidades glucurónicas e idurónicas
están presentes de manera alternante, siendo la extremidad no
reductora una unidad glucurónica o idurónica, con una razón
glucurónicas/idurónicas desde 45/55 hasta
55/45.
12.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que puede obtenerse según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
13.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado que tiene un grado de sulfatación de desde 2,3 hasta
2,9, un peso molecular medio de desde 1.500 hasta 12.000 y, en el
extremo reductor de la mayoría de sus cadenas, la estructura
(a')
en la que R representa hidrógeno o
SO_{3}^{-}, o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
14.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según la reivindicación 13, que tiene un peso
molecular medio de desde 1.500 hasta 8.000 y un grado de sulfatación
desde 2,5 hasta 2,9.
15.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según la reivindicación 14, que tiene un grado de
sulfatación de desde 2,7 hasta 2,9.
16.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según la reivindicación 20, que tiene un peso
molecular medio de 6.000 \pm el peso teórico de una unidad
disacárida.
17.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16,
que tiene un peso molecular medio de 6.000 \pm el peso teórico de
una unidad disacárida, un grado de sulfatación de desde 2,7 hasta
2,9, un contenido del 80%-95% en
6-O-sulfato de glucosamina, del
95%-100% en N-sulfato de glucosamina, del 45%-55% en
3-O-sulfato de glucosamina, del
35%-45% en 3-O-sulfato de ácido
glucurónico, del 15%-25% en
2-O-sulfato de ácido idurónico y que
presenta una unidad (a') en el extremo reductor de la mayoría de sus
cadenas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
18.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según la reivindicación 13, que consiste en una
mezcla de cadenas en la que al menos el 80% de dichas cadenas tiene
la fórmula III
en la que el 40%-60% de las
unidades urónicas son las de ácido idurónico, q es un número entero
desde 2 hasta 17, R, R' y R'' son hidrógeno o SO_{3}^{-} para un
grado de sulfatación de desde 2,3 hasta 2,9 y el extremo reductor de
la mayoría de las cadenas en dicha mezcla de cadenas presenta una
unidad de 2,5-anhidromanitol sulfatada de estructura
(a')
en la que R representa hidrógeno o
SO_{3}^{-} y el catión correspondiente es farmacéutica o
químicamente
aceptable.
19.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según la reivindicación 18, que consiste en una
mezcla de cadenas en la que al menos el 80% de dichas cadenas tiene
la fórmula III en la que q es un número entero desde 2 hasta 14.
20.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según la reivindicación 18, que consiste en una
mezcla de cadenas en la que al menos el 80% de dichas cadenas tiene
la fórmula III en la que q es un número entero desde 2 hasta 11.
21.
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según la reivindicación 18, que consiste en una
mezcla de cadenas en la que la especie predominante es un compuesto
de fórmula III en la que q es 8 ó 9, R es el 45%-55% de
SO_{3}^{-}, R' es el 35%-45% de SO_{3}^{-} en ácido
glucurónico, R'' es el 15%-25% de SO_{3}^{-} en ácido idurónico,
para un grado de sulfatación de desde 2,7 hasta 2,9.
22. Composición farmacéutica que comprende, como
principio activo, una cantidad farmacológicamente activa de un
LMW-epiK5-N,O-sulfato
despolimerizado según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, o
de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en mezcla con un
excipiente farmacéutico.
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