ITMI20012200A1 - Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti - Google Patents
Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti Download PDFInfo
- Publication number
- ITMI20012200A1 ITMI20012200A1 IT2001MI002200A ITMI20012200A ITMI20012200A1 IT MI20012200 A1 ITMI20012200 A1 IT MI20012200A1 IT 2001MI002200 A IT2001MI002200 A IT 2001MI002200A IT MI20012200 A ITMI20012200 A IT MI20012200A IT MI20012200 A1 ITMI20012200 A1 IT MI20012200A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- chondroitin
- product
- hours
- process according
- carried out
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 23
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 13
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims description 13
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 title description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title 1
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 88
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 71
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 69
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 26
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical class CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 claims description 23
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 claims description 21
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 claims description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 12
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 claims description 12
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 claims description 8
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 claims description 8
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229940094517 chondroitin 4-sulfate Drugs 0.000 claims description 7
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 claims description 7
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims description 7
- SPEUIVXLLWOEMJ-UHFFFAOYSA-N 1,1-dimethoxyethane Chemical compound COC(C)OC SPEUIVXLLWOEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 3
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 claims 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 32
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical group CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 6
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 6
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940107200 chondroitin sulfates Drugs 0.000 description 4
- 230000001180 sulfating effect Effects 0.000 description 4
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical group O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 3
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 101710106625 Chondroitinase-AC Proteins 0.000 description 2
- 102000011413 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108010023736 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Proteins 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 2
- VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L disulfate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OS([O-])(=O)=O VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- LZTRCELOJRDYMQ-UHFFFAOYSA-N triphenylmethanol Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(O)C1=CC=CC=C1 LZTRCELOJRDYMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N triphenylmethyl chloride Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(Cl)C1=CC=CC=C1 JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEVMDQBCAHEHDY-UHFFFAOYSA-N (Dimethoxymethyl)benzene Chemical compound COC(OC)C1=CC=CC=C1 HEVMDQBCAHEHDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000819 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Proteins 0.000 description 1
- 102000037716 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Human genes 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000009066 Hyaluronoglucosaminidase Human genes 0.000 description 1
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- NHZWETQZLORZIR-OSMVPFSASA-N N-Acetylgalactosamine 6-sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)COS(O)(=O)=O NHZWETQZLORZIR-OSMVPFSASA-N 0.000 description 1
- 241000933336 Ziziphus rignonii Species 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229940006423 chondroitin sulfate sodium Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229960001193 diclofenac sodium Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012153 long-term therapy Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- KWDXXNWKTRGMDM-IYWGXSQHSA-N n-acetylgalactosamine 4,6-disulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KWDXXNWKTRGMDM-IYWGXSQHSA-N 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(I) nitrate Inorganic materials [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGMJQSFLQWGYMQ-UHFFFAOYSA-M sodium;2,6-dichloro-n-phenylaniline;acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O.ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=CC=CC=C1 JGMJQSFLQWGYMQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: “Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride K4 e prodotti ottenuti”
Tecnica anteriore
I condoitrin solfati sono prodotti naturali presenti nei tessuti animali con funzioni strutturali e fisiologiche.
I condroitin solfati hanno attività antiinfiammatoria, sono stati classificati come SYSADOA (Symptomatic Slow Acting Drug Osteoarthritis) ed utilizzati nella terapia a medio lungo termine nel trattamento di pazienti artrosici (Morreale P., Manopulo R., Galati M., Boccanera L, Saponati G. and Bocchi L. Comparison of thè antiinflammatory efficacy of chondroitin sulfate and diclofenac sodium in patients with knee osteoarthritis. J. Rheumatol., 23, 1385-1391 , 1996).
I condroitin solfati commerciali sono ottenuti tramite metodi di estrazione da tessuti animali e sono costituiti da disaccaridi regolari formati da acido glucuronico e N-acetilgalattosammina solfatata in posizione 4 e/o 6 (YOSHIDA , K. et Al - Analytical Biochemistry, 177 pp 327 332 (1989). Il peso molecolare medio dei prodotti commerciali è di circa 18.000-20.000 D. Il condroitin solfato con gruppo solfato in posizione 4 (Ch4S) non è mai presente da solo nei prodotti naturali, ma normalmente è accompagnato nella stessa catena al condroitin solfato con gruppo solfato in posizione 6 (Ch6S) in percentuali che vanno da 10 a 73% circa e quindi queste sequenze sono difficilmente separabili. In genere un condroitin solfato commerciale contiene circa il 40% di Ch4S e il 60% di Ch6S.
Il polisaccaride K4 può essere ottenuto tramite metodologie di fermentazione come descritto nel brevetto WO 01/02597.
Sommario
E’ stato ora trovato che mediante una serie di reazioni sul polisaccaride K4 da Escherichia coli è possibile ottenere condroitin solfati aventi la struttura rappresentata per almeno il 70% in peso dalla formula (I), il rimanente a 100% essendo costituito da prodotto non solfatato.
(l)
Nella formula (I), R e R1 uguali o diversi, rappresentano H oppure SO3Na con la condizione che R ed R1 non possono essere entrambi H ed n è un numero intero da 5 a 50.
In particolare quando R = R1 = SO3Na il prodotto è il 4,6-disolfato, quando R = H e Ri = SOaNa il prodotto è il 6-solfato e quando R = S03Na e R1 = H il prodotto è il 4-solfato. Il rapporto solfati/carbossili varia da 0,7 a 2.
(la) corrisponde alla struttura dell’acido glucuronico e (Ib) corrisponde alla struttura della N-acetil galattosamina.
I tre prodotti sopradescritti vengono preparati da un prodotto intermedio comune ottenuto dal polisaccaride K4 mediante un processo che comprende i seguenti stadi:
a) defruttosilazione del polisaccaride K4 mediante trattamento con HCI; b) passaggio su colonna a scambio ionico per ottenere il polisaccaride acido oppure
b1) protezione selettiva del carbossile tramite formazione del metilestere; c) protezione selettiva delle posizioni 4 e 6 della galattosammina tramite dibenzilidenazione;
d) protezione delle posizioni 2 e 3 dell’acido glucuronico tramite O-acetilazione;
e) deprotezione in posizione 4 e 6 della galattosammina tramite allontanamento del dibenzilidene mediante trattamento con acido acetico ottenendo il prodotto intermedio comune avente struttura rappresentata per almeno l’80% dalla formula (II).
dove R2=acetile
Allo scopo di ottenere i condroitin solfati di formula (I) secondo la presente invenzione, il prodotto di formula (II) viene solfatato selettivamente e deprotetto, operando nelle seguenti condizioni:
f) Per ottenere il condroitin 4,6-disolfato (R = Ri = S03Na)
i.) Si tratta l’intermedio (Il con agente solfatante costituito da piridinasolfotriossido in condizioni di temperatura superiore a 20°C e con un rapporto molare agente solfatante/ OH da 1:1 a 3:1;
ii.) Si libera il prodotto ottenuto dagli acetili dell’acido glucuronico tramite trattamento basico;
iii.) Si recupera il prodotto tramite diafiltrazione su membrana ed essiccamento.
g) Per ottenere il condroitin 4-solfato
i.) Si tratta l’intermedio (II) con trifenilmetil cloruro per proteggere selettivamente la posizione 6 della galattosam mina;
ii) Si tratta con agente solfatante costituito da piridina-solfotriossido in condizioni di temperatura superiore a 20°C e con un rapporto molare agente solfatante/OH da 1 :1 a 3:1 ;
iii.) Si libera il prodotto ottenuto dal trifenilmetile tramite trattamento acido;
iv.) Si libera il prodotto ottenuto dagli acetili dell’acido glucuronico tramite trattamento basico;
v.) Si recupera il prodotto tramite diafiltrazione su membrana ed essiccamento.
h) Per ottenere il condroitin 6-solfato
i.) Si tratta l'intermedio (II) con agente solfatante costituito da piridina-solfotriossido in condizioni di temperatura non superiore a 5°C e con un rapporto molare agente solfatante/OH da 1 :1 a 3:1 ; ii.) Si libera il prodotto ottenuto dagli acetili dell'acido glucuronico tramite trattamento basico;
iii.) Si recupera il prodotto tramite diafiltrazione su membrana ed essiccamento.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Viene descritto un nuovo metodo per ottenere condroitin solfato selettivamente solfatato nella galattosammina a partire dal polisaccaride K4 da E. coli. I prodotti ottenuti corrispondono per almeno il 70% alla formula generale (I). Il metodo consente di ottenere:
- il condroitin 4,6-disolfato;
- il condroitin 4-solfato, ed
- il condroitin 6-solfato.
Il metodo per ottenere i diversi prodotti prevede la preparazione di un intermedio comune ottenuto partendo dal polisaccaride K4 da E.coli ottenuto ad esempio come descritto in WO 01/02597 che:
a) viene defruttosilato acidificando con HCI fino a pH 2,8 una soluzione acquosa contenente 10 g. di K4 (soluzione allo 0,5-5%) e mantenendo la soluzione acidificata, a 20-25°C per 24-72 ore. Alla fine della reazione si porta a neutralità con NaOH, se necessario si centrifuga a 15.000 giri/min per rendere la soluzione limpida e si diafiltra su membrana da dialisi da 1.000 D fino a scomparsa dei cloruri e del fruttosio libero misurati secondo i metodi descritti sotto. Il prodotto viene mantenuto in soluzione per proseguire con lo stadio b) (forma acida) oppure essiccato sotto vuoto a 45°C per proseguire con lo stadio b1 ) (forma metilestere).
Controllo dei cloruri nel permeato
Si prelevano 2ml di soluzione del permeato, si aggiungono 0,1 mi di HN03 e 1 mi di AgN03, la soluzione deve risultare perfettamente limpida.
Controllo del fruttosio nel permeato tramite metodo HPLC Strumenti:
HPLC PU 4100 (Philips)
Rheodyne 7125 con loop da 20 mi
Colonna: Polispher OAKC 300x7,8 mm
Temperatura: 40°C
Fase mobile: H2SO45-10<-3 >N
Flusso: 0,4 ml/min
Pressione: 60 Bars
Detector: indice di rifrazione (Perkin Helmer) LC30
Tempo di ritenzione: 18.7 min
In tali condizioni il fruttosio deve risultare non determinabile. b) La soluzione ottenuta nello stadio a) viene passata su 15-50 mi di resina a scambio cationico (IR-120 H+). La resina viene lavata con acqua demineralizzata fino a scomparsa dell’acido nell'eluato, quindi la soluzione acida viene essiccata sotto vuoto.
b1 ) In alternativa allo stadio b) si prepara il metilestere del polisaccaride K4 defruttosilato. Si prepara dapprima una miscela di 1500-2500 mi di metanolo e 10-15 mi di acetile cloruro che viene mantenuta sotto agitazione per 1-3 ore, e quindi si aggiungono 10 g del prodotto essiccato ottenuto nello stadio a). Si mantiene sotto agitazione per 24 ore a temperatura ambiente. Si filtra e si lava il precipitato con 10-30 mi di metanolo. Il solido ottenuto viene trattato una seconda volta con metanolo e acetile cloruro per 24 ore e lavato con metanolo come descritto sopra. Alla fine il prodotto viene essiccato a 45°C sotto vuoto.
c) Il prodotto ottenuto nello stadio b) o b1) viene disciolto in 50-150 mi di DMF, quindi addizionato con 30-40 g di benzaldeide dimetilacetale e con 0,5-2 g di acido p-toluensolfonico fuso. Si porta la temperatura a 60-80°C per 4-10 h, si raffredda a temperatura ambiente e si precipita il prodotto mediante gocciolamento di 300-700 mi di acetone, si filtra sotto vuoto, si lava con 50-100 mi di acetone e si essicca sotto vuoto in stufa a 45°C.
d) Il prodotto ottenuto nello stadio c) viene disciolto in 30-60 mi di acetonitrile e quindi viene addizionato con 40-50 mi di trietilammina, 15-25 mi di anidride acetica e 50-200 mg di 4-dimetilamminopiridina (DMAP). Si tiene sotto agitazione per 1-3 ore, si filtra l’eventuale precipitato e poi si precipita il prodotto con 35-50 mi di etere isopropilico. Si filtra sotto vuoto, si lava con 20-40 mi di etere isopropilico e si essicca sotto vuoto a 40°C.
e) Il prodotto ottenuto nello stadio d) viene addizionato con 40-60 mi di acido acetico e 30-40 mi di acqua. Si porta la temperatura a 60-80°C e si mantiene sotto agitazione per 2-5 ore, si evapora il solvente a secchezza e si solubilizza il prodotto in 40-60 mi di acqua, si evapora a secchezza, si tratta ancora con 40-60 mi di acqua e infine il prodotto viene essiccato.
Il prodotto ottenuto costituisce l’intermedio comune corrispondente per almeno 80% alla formula (II).
Questo intermedio viene solfatato in tre differenti condizioni per ottenere rispettivamente il condroitin 4,6-disolfato (f), il condroitin 4-solfato (g) e il condroitin 6-solfato (h).
f) Per ottenere il condroitin 4,6-disolfato:
i.) 4-6 g dell'intermedio comune ottenuto nello stadio e) vengono solubilizzati in 60-90 mi di DMF anidra e addizionati in un tempo di 10-20 minuti con 5-15 g di piridina-solfotriossido disciolta in 40-90 mi di DMF anidra. La soluzione è mantenuta sotto agitazione a 40-60°C per 14-24 ore. La soluzione viene portata a temperatura ambiente e precipitata con 400-800 mi di acetone saturato con NaCI. Si filtra e il solido viene solubilizzato con 200-400 mi di acqua demineralizzata e si neutralizza con NaOH 1 N. ii.) La soluzione ottenuta nello stadio f/i) viene riscaldata a 30-50°C e addizionata con 60-90 mi di NaOH 0,2-0, 3 N. Si mantiene la temperatura di 30-50°C per 1-3 ore, quindi la soluzione viene raffreddata a temperatura ambiente e neutralizzata con acido cloridrico 1 N. La soluzione è diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibiltà del permeato < di 10 μS. Il concentrato viene portato a piccolo volume per concentrazione sotto vuoto e liofilizzato.
g) Per ottenere il condroitin 4-solfato:
i.) L'intermedio comune ottenuto nello stadio e) viene solubilizzato in 40-60 mi di piridina anidra, si riscalda la soluzione a 40-60°C e si aggiungono in un intervallo di 10-30 minuti 10-20 g di trifenilmetil cloruro disciolti in 30-50 ml di piridina anidra. La soluzione viene mantenuta a 40-60°C per 6-15 ore e poi viene raffreddata a temperatura ambiente. Il prodotto viene precipitato mediante aggiunta di 300-900 ml di isopropanolo. Il prodotto viene filtrato, lavato con 100-200 ml di isopropanolo ed essiccato in stufa a vuoto a 45°C.
ii.) Il prodotto ottenuto nello stadio g/i) viene solubilizzato in 60-90 mi di DMF anidra e addizionato in un tempo di 10-20 minuti con 5-15 g di piridina-solfotriossido disciolti in 40-90 ml di DMF anidra. La soluzione si lascia sotto agitazione a 20-25°C per 14-24 ore.
iii.) La soluzione ottenuta nello stadio g/ii) viene addizionata con 100-200 ml di acqua demineralizzata, viene acidificata a pH 2,7 con acido cloridrico concentrato e mantenuta sotto agitazione per 3-5 ore ottenendo la precipitazione del trifenilcarbinolo. Il precipitato viene separato dalla soluzione tramite centrifugazione a 15,000 giri per minuto e la soluzione viene neutralizzata con NaOH 1 N.
iv.) La soluzione ottenuta nello stadio g/iii) viene riscaldata a 30-50°C e addizionata con 60-90 mi di NaOH 0,2-0, 3 N. Si mantiene questa temperatura per 1-3 ore, e poi la soluzione è raffreddata a temperatura ambiente e neutralizzata con acido cloridrico 1 N. La soluzione è diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 μS. La soluzione viene poi concentrata a piccolo volume sotto vuoto e liofilizzata.
h) Per ottenere il condroitin 6-solfato:
i) 4-6 g dell'intermedio comune ottenuto nello stadio e) vengono solubilizzati in 80-120 mi di DMF anidra e la soluzione viene raffreddata a 0-5°C. Si addizionano quindi 12-15 g di piridinasolfotriossido disciolti in 80-120 ml di DMF anidra in un tempo di 10-20 minuti. La soluzione viene mantenuta sotto agitazione a 0-5°C per 1-3 ore. La soluzione viene poi raffreddata a temperatura ambiente e precipitata con 400-800 mi di acetone saturato con NaCI. La miscela viene filtrata e il solido viene solubilizzato con 200-400 mi di acqua demineralizzata e la soluzione ottenuta viene neutralizzata con NaOH 1N.
ii.) La soluzione ottenuta nello stadio h/i) viene riscaldata a 30-50°C e addizionata con 60-90 mi di NaOH 0,2-0, 3 N. Si mantiene questa temperatura per 1-3 ore, e poi si raffredda a temperatura ambiente e si neutralizza con acido clorìdrico 1 N. La soluzione è diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 μS. La soluzione viene poi concentrata a piccolo volume sotto vuoto e liofilizzata.
Analisi dei prodotti finali:
La struttura dei composti ottenuti è stata definita tramite tecnica di risonanza magnetica nucleare (NMR) al protone e al carbonio tredici in soluzioni di acqua pesante al 5% a 80°C e a temperatura ambiente, utilizzando uno strumento Varian a 300 MHz equipaggiato con multiprobe a 5mm e temperatura variabile. Le assegnazioni dei segnali fanno riferimento a Holme et al “Nuclear magnetic resonance spectra of heparin in admixture with dermatan sulfate and other glycosaminoglycans. 2D spectra of chondroitin sulfates” Carbohydr. Res. 186, 301-312, 1989) Inoltre la struttura è stata definita tramite metodo HPLC a scambio anionico forte per la determinazione dei disaccaridi costituitivi insaturi (Volpi N., Sandri I. and Venturelli T. Activity of chondroitin ABC lyase and hyaluronidase on free-radical degraded chondroitin sulfate. Carbohydr. Res., 279, 193-200, 1995).
Il contenuto di solfati per unità disaccaridica (S03/C00) è stato determinato tramite metodo conduttimetrico secondo Casu et al. (A conductimetric method for thè determination of sulphate and carboxyl groups in heparin and other mucopolysaccharides”. Carbohydr. Res., 39,168-176, 1975), Il peso molecolare (MW) è stato determinato secondo Harenber et al. (Characterization of heparins by high-performance size exclusion liquid chromatography, J. Chromatogr. 261 , 287-292, 1983) e l’attività di degradazione enzimatica mediante determinazione UV della formazione del doppio legame nel terminale non riducente (Suzuki, S. Methods in enzymology 28, 911-917, 1972)
In particolare noi abbiamo trovato che, con il processo secondo la presente invenzione è possibile ottenere:
- un prodotto di formula (I) in cui R è SO3 Na compreso fra il 70% e il 90% ed R1 è SO3 Na compreso fra 10 e 25%, la percentuale rimanente essendo H;
- un prodotto di formula (I) in cui R è SO3 Na compreso fra 20 e 35% ed R1 e SO3 Na compreso fra 80 e 95%, la percentuale rimanente essendo H;
- un prodotto di formula (I) in cui R è SO3 Na compreso fra 80 e 95% ed R1 è SO3 Na compreso fra 80 e 95%, la percentuale rimanente essendo H.
Inoltre l’invenzione comprende i prodotti di formula (I) in cui Na è sostituito da K, Li, Ca, Mg ed Mn.
Con il processo della presente invenzione si possono ottenere condroitinsolfati aventi peso molecolare medio compreso fra 10.000 e 25.000 D oppure fra 12.000 e 15.000 D oppure fra 5.000 e 10.000 D oppure fra 6.000 e 8000 D.
A scopo illustrativo dell’invenzione vengono riportati i seguenti esempi. Le caratteristiche chimico fisiche dei prodotti ottenuti sono riportate nella tabella 1 , e l’attività condroitinasi AC è riportata nella tabella 2.
ESEMPIO 1 Preparazione dell'intermedio comune (via acido) Defruttosilazione del polisaccaride K4
100 g di polisaccaride K4 ottenuto come descritto in WO 01/02597 e avente lo spettro <13>C-NMR mostrato in Figura 1 vengono disciolti in 10 litri di acqua demineralizzata.
La soluzione viene quindi acidificata a pH 2,8 tramite aggiunta di HCI (sol. 10%) e mantenuta sotto agitazione a 20-25°C per 48 ore. Alla fine della reazione la soluzione viene neutralizzata con NaOH (sol. 5%). La soluzione non si presenta limpida, quindi viene centrifugata a 15.000 giri/min su centrifuga Sorvai RC-5B per 15 minuti a 10°C. La soluzione risultante, limpida, è diafiltrata su membrana da 1.000 D fino a scomparsa dei cloruri e dei fruttosio misurati nel permeato. Si ottengono circa 15 litri di permeato. Il concentrato viene portato a piccolo volume su rotavapor sotto vuoto a temperatura di 45-50°C e liofilizzato.
Si ottengono 70 g di K4 defruttosilato con lo spettro <13>C-NMR mostrato in figura 2.
Preparazione del K4 defruttosilato acido
10 g di K4 defruttosilato vengono disciolti in 400 mi di acqua demineraiizzata. La soluzione ottenuta viene passata su 25 mi di resina a scambio cationico (IR-120 H<+>). La resina viene lavata con acqua demineralizzata fino a scomparsa dell'acido nell’eluato, quindi la soluzione acida viene essiccata sotto vuoto.
Si ottengono 9,23 g di prodotto.
Preparazione dell’acido Glucuronil-B1 -3-4.6 O- dibenziliden-N-acetilqalattosammina
11 prodotto ottenuto nello stadio precedente viene disciolto in 93 mi di DMF, e poi viene addizionato con 37 g di benzaldeide dimetilacetale e con 1 g di acido p-toluensolfonico fuso. La miscela viene riscaldata a 70°C per 6h e poi raffreddata a temperatura ambiente.
Il prodotto viene precipitato mediante gocciolamento di 560 mi di acetone, filtrato sotto vuoto, lavato con 70 mi di acetone ed essiccato sotto vuoto in stufa a 45°C.
Si ottengono 8,93 g di prodotto.
Preparazione dell’acido 2.3-O-diacetil glucuronil-β1 -3-4.6 O-dibenziliden-N-acetilgalattosammina
Il prodotto ottenuto nello stadio precedente viene disciolto in 43 mi di acetonitrile, quindi addizionato con 46 mi di trietilammina, 19 mi di anidride acetica e 100 mg di 4-dimetilamminopiridina (DMAP). Si mantiene la miscela sotto agitazione a temperatura ambiente per 1 ora, si filtra il precipitato che si è formato e quindi si precipita il prodotto con 43 mi di etere isopropilico. Il prodotto viene filtrato sotto vuoto, lavato con 20 mi di etere isopropilico ed essiccato sotto vuoto a 40°C.
Si ottengono 8,93 g di prodotto.
Preparazione dell’acido 2.3-O-diacetil glucuronil-β1-3-N-acetilgalattosammina
Il prodotto ottenuto nello stadio precedente viene addizionato con 54 mi di acido acetico e 36 ml di acqua. La miscela viene riscaldata a 75°C e mantenuta sotto agitazione per 3 ore, si evapora il solvente a secchezza ed il prodotto solido in 50 mi di acqua.
Le operazioni di evaporare a secchezza, di ridisciogliere in 50 mi d’acqua ed evaporare a secchezza vengono ripetute ancora una volta.
Si ottengono 5,8 g di intermedio comune.
ESEMPIO 2 Preparazione dell'intermedio comune (via metilestere)
Preparazione del metil estere dell’acido Glucuronil-β1-3-N-acetilgalattosammina
Una miscela costituita da 2000 ml di metanolo e 13 mi di acetil cloruro viene mantenuta sotto agitazione per 2 ore quindi addizionata con 10 g del prodotto defruttosilato ottenuto come descritto nell’esempio 1. La miscela ottenuta viene mantenuta sotto agitazione per 24 ore a temperatura ambiente (20-25°C). Il prodotto solido viene filtrato e lavato con 20 mi di metanolo. Il prodotto solido si tratta un’altra volta con 2000 mi di metanolo e 13 mi di acetil cloruro e si lava con 20 mi di metanolo come descritto sopra e si essicca sotto vuoto in stufa a 45°C.
Si ottengono 6,63 g di prodotto avente lo spettro <13>C-NMR mostrato in figura 3.
Preparazione del metil estere dell’acido Glucuronil-β1 -3-4.6 O-dibenziliden-N-acetilgalattosammina
Il prodotto ottenuto nello stadio precedente viene disciolto in 66 ml di DMF e poi addizionato con 27 g di benzaldeide dimetilacetale e con 0,7 g di acido p-toluensolfonico fuso. Si porta la temperatura a 70°C per 6h, si raffredda a temperatura ambiente e si precipita il prodotto per gocciolamento di 270 mi di acetone, si filtra sotto vuoto, si lava con 70 mi di acetone e si essicca sotto vuoto in stufa a 45°C.
Si ottengono 6,67 g di prodotto.
Preparazione del metil estere dell’acido 2.3 - O diacetil alucuronilβ1 -3-4.6 O-dibenziliden-N-acetilgalattosammina
Il prodotto ottenuto nello stadio precedente viene disciolto in 32 ml di acetonitrile e poi addizionato con 35 mi di trietilammina, 14 ml di anidride acetica e 90 mg di 4-dimetilamminopiridina (DMAP). La miscela viene mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 1 ora, si filtra il precipitato che si è formato e quindi si precipita il prodotto con 32 ml di etere isopropilico. Il prodotto viene filtrato sotto vuoto, lavato con 20 mi di etere isopropilico e essiccato sotto vuoto a 40°C.
Si ottengono 6,67 g di prodotto.
Preparazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronilβ1 -3-N-acetilgalattosammina
Il prodotto ottenuto nello stadio precedente viene addizionato con 40 mi di acido acetico e 27 mi di acqua. La miscela viene riscaldata a 100°C e mantenuta sotto agitazione per 3 ore, si evapora il solvente a secchezza ed il prodotto secco viene solubilizzato in 50 mi di acqua, si riporta a secco, si riprende ancora con 50 mi di acqua e infine si porta ancora una volta a secco.
Si ottengono 5,17 g di intermedio comune.
ESEMPIO 3 - Preparazione del condroitin 4-solfato (via acida) Preparazione dell'acido 2.3-0 diacetil alucuronil-B1-3-6-0 tritil-N-acetilgalattosammina
In questo esempio e nei successivi, con l’espressione “tritil” si intende “trifenilmetil". 5,8 g dell’intermedio comune ottenuto come descrìtto nell'esempio 1 vengono solubilizzati in 49 mi di piridina anidra, la soluzione viene riscaldata a 50°C e vengono aggiunti in un tempo di 15 minuti 13 g di tritilcloruro disciolti in 38 ml di piridina anidra. La miscela viene mantenuta a 50°C per 9 ore e poi raffreddata a temperatura ambiente. Il prodotto viene precipitato mediante aggiunta di 600 mi di isopropanolo, filtrato, lavato con 100 ml di isopropanolo ed essiccato in stufa a vuoto a 45°C. Si ottengono 4,15 g di prodotto.
Solfatazione dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-β1 -3-6-0 tritil-N-acetilgalattosammina
Il prodotto ottenuto nello stadio precedente viene solubilizzato in 74 ml di DMFA anidra e addizionato in un tempo di 10 minuti con 9,2 g di piridina-solfotriossido disciolti in 54 mi di DMF anidra. La soluzione è mantenuta sotto agitazione a 20-25°C per 8 ore.
Detritilazione dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-B1 -3-6-0 tritil-N-acetilgalattosammina 4-0 solfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene addizionata con 140 mi di acqua demineralizzata, acidificata a pH 2,7 con acido cloridrico concentrato e mantenuto sotto agitazione per 4 ore ottenendo la precipitazione del trifenilcarbinolo. Il precipitato viene separato dalla soluzione tramite centrifugazione a 15.000 giri per minuto e la soluzione viene neutralizzata con NaOH 1 N. Deacetilazione dell’acido 2.3-0 diacetil qlucuronil-β1-3 N-acetilgalattosammina 4-0 solfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene riscaldata a 40°C e addizionata con 95 mi di NaOH 0,2 N. La soluzione ottenuta viene mantenuta a 40°C per 2 ore, quindi viene raffreddata a temperatura ambiente e neutralizzata con acido cloridrico 1 N. La soluzione è diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 μS. La soluzione ottenuta viene concentrata a piccolo volume per concentrazione sotto vuoto e liofilizzata. Si ottengono 1 ,86 g di prodotto avente le caratteristiche chimico-fisiche descritte in tabella 1 e lo spettro <1>H-NMR mostrato in figura 4. In particolare il prodotto ottenuto ha un titolo di condroitin 4-solfato pari a 71% ed inoltre contiene il 7% di prodotto non solfatato ed il 18% di condroitin 4,6-disolfato.
ESEMPIO 4 - Preparazione del condroitin 6-solfato (via acida) Solfatazione dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-β1-3 N-acetilgalattosammina
5,8 g di intermedio comune ottenuto come descritto nell’esempio 1 vengono solubilizzati in 116 mi di DMF anidra. La soluzione viene raffreddata a 0-5°C e addizionata con 19,3 g di piridinasolfotriossido sotto agitazione a 0-5°C per 1 ora. Il prodotto viene precipitato con 580 mi di acetone saturato con NaCI. Il prodotto solido viene solubilizzato con 280 mi di acqua demineralizzata e quindi neutralizzato con NaOH 1 N.
Deacetilazione dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-β1-3 N-acetilgalattosammina 6 solfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene addizionata con 200 mi di NaOH 0,2 N, mantenuta a temperatura ambiente per 2 ore e poi neutralizzata con acido cloridrico 1 N. La soluzione è diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 pS. Il concentrato viene portato a piccolo volume per concentrazione sotto vuoto e liofilizzato. Si ottengono 4,41 g di prodotto avente le caratteristiche chimicofisiche descritte in tabella 1 e lo spettro <1>H-NMR mostrato in figura 5. In particolare il prodotto ottenuto ha un titolo di condroitin 6-solfato pari a 60% ed inoltre contiene il 30 % di condroitin 4,6 disolfato.
ESEMPIO 5- Preparazione del condroitin 4,6-disolfato (via acida)
Solfatazione dell’acido 2,3-0 diacetil alucuronil-β1-3 N-acetilgalattosammina
5,8 g di intermedio comune ottenuto come descritto nell’esempio 1 vengono solubilizzati in 116 mi di DMF anidra. La soluzione viene addizionata con 19,3 g di piridina-solfotriossido disciolti in 111 ml di DMF anidra in un intervallo di 10 minuti. La soluzione viene mantenuta sotto agitazione a 50°C per 18 ore. Il prodotto viene precipitato con 580 mi di acetone saturato con NaCI.II prodotto solido ottenuto viene solubilizzato con 280 ml di acqua demineralizzata e quindi neutralizzato con NaOH 1 N.
Deacetilazione dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-β1-3 N-acetilaalattosammina 4.6 disolfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene addizionata con 200 mi di NaOH 0,2 N, mantenuta a temperatura ambiente per 2 ore e neutralizzata con acido cloridrico 1N. La soluzione è diafìltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 μS. Il concentrato viene portato a piccolo volume per concentrazione sotto vuoto e liofilizzato. Si ottengono 4,41 g di prodotto avente le caratteristiche chimicofìsiche descritte in tabella 1 e lo spettro <1>H-NMR mostrato in figura 6. In particolare il prodotto ottenuto ha un titolo in condroitin 4,6-disolfato del 90%, la differenza a 100% essendo costituita da condroitino non solfatato.
ESEMPIO 6 - Preparazione del condroitin 4-solfato (via metilestere)
Preparazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronilβ1 -3-6-0 tritil-N-acetilgalattosammina
5,2 g dell'intermedio comune ottenuto come descritto nell’esempio 2 vengono solubilizzati in 44 mi di piridina anidra, si riscalda la soluzione a 50°C e si aggiungono 13 g di tritiicloruro disciolti in 38 mi di piridina anidra in un tempo di 15 minuti. Si mantiene la miscela a 50°C per 9 ore e poi si raffredda a temperatura ambiente e si precipita il prodotto con 80 mi di isopropanolo. Il prodotto viene filtrato, lavato con 100 mi di isopropanolo ed essiccato in stufa a vuoto a 45°C. Si ottengono 5,49 g di prodotto. Solfatazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil qlucuronilβ1 -3-6-0 tritil-N-acetilgalattosammina
Il prodotto ottenuto nello stadio precedente viene solubilizzato in 97 mi di DMF anidra e addizionato in un tempo di 10 minuti con 13 g di piridina-solfotriossido disciolti in 71 ml di DMF anidra. La soluzione è mantenuta sotto agitazione a 20-25°C per 8 ore.
Detritilazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-B1 -3-6-0 tritil-N-acetilgalattosammina 4-0 solfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene addizionata con 180 ml di acqua demineralizzata, acidificata a pH 2,7 con acido cloridrico concentrato e mantenuta sotto agitazione per 4 ore ottenendo la precipitazione del trifenilcabinolo.Il precipitato viene separato dalla soluzione tramite centrifugazione a 15.000 giri per minuto e la soluzione viene neutralizzata con NaOH 1N. Deacetilazione del metil estere dell'acido 2.3-0 diacetil alucuronil-B1-3 N-acetilgalattosammina 4-0 solfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene riscaldata a 40°C addizionata con 127 ml di NaOH 0,2 N. e mantenuta a 40°C per 2 ore, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si neutralizza con acido cloridrico 1 N. La soluzione viene diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1 .000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 μS. Il concentrato viene portato a piccolo volume per concentrazione sotto vuoto e liofilizzato. Si ottengono 1 ,5 g di prodotto avente le caratteristiche chimico-fisiche descritte in tabella 1 e lo spettro <1>H-NMR simile a quello dell'esempio 3 . In particolare il prodotto ha un titolo di condroitin 6-solfato pari a 71% ed inoltre contiene il 7% di prodotto non solfatato ed il 18% di condroitin 4,6-disolfato.
ESEMPIO 7 - Preparazione del condroitin 6-solfato (via metilestere)
Preparazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-B1 -3-N-acetilgalatosammina
5,2 g dell’intermedio comune ottenuto come descritto nell’esempio 2 vengono solubilizzati in 104 mi di DMF anidra. La soluzione viene raffreddata a 0-5°C e addizionata con 17,3 g di piridinasolfotriossido disciolti in 100 mi di DMF anidra in un tempo di 10 minuti. La soluzione viene mantenuta sotto agitazione a 0-5°C per 1 ora. Il prodotto viene precipitato con 520 mi di acetone saturato con NaCI. Il solido viene solubilizzato con 105 mi di acqua demineralizzata e neutralizzato con NaOH 1 N.
Deacetilazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-B1 -3-N-acetilgalattosammina 6-solfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene addizionata con 178 mi di NaOH 0,2 N, mantenuta a temperatura ambiente per 2 ore e neutralizzata con acido cloridrico 1N. La soluzione è diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 μS. Il concentrato viene portato a piccolo volume per concentrazione sotto vuoto e liofilizzato. Si ottengono 3,23 g di prodotto avente le caratteristiche chimicofisiche descritte in tabella 1 e lo spettro <1>H-NMR mostrato in figura 7. In particolare il prodotto ha un titolo di condroitin 6-solfato del 44% e contiene il 14 % di condroitin 4,6-disolfato e il restante a 100 di condroitino non solfatato.
ESEMPIO 8 - Preparazione del condroitin 4,6-disolfato (via metilestere)
Solfatazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronil-B1 -3-N-acetilgalattosammina
5,17 g di intermedio comune ottenuto come descritto nell’esempio 2 vengono solubilizzati in 104 mi di DMF anidra. La soluzione viene addizionata con 17,3 g di piridina-solfotriossido disciolto in 100 mi di DMF anidra in un tempo di 10 minuti. La soluzione viene mantenuta sotto agitazione a 50°C per 18 ore. Il prodotto viene precipitato con 580 ml di acetone saturato con NaCI ed il solido ottenuto viene solubilizzato con 105 mi di acqua demineralizzata e quindi neutralizzato con NaOH 1 N.
Deacetilazione del metil estere dell’acido 2.3-0 diacetil alucuronilβ1-3 N-acetilgalattosammina 4,6 disolfato
La soluzione ottenuta nello stadio precedente viene addizionata con 178 mi di NaOH 0,2 N, mantenuta a temperatura ambiente per 2 ore e neutralizzata con acido cloridrico 1 N. La soluzione è diafiltrata su membrana a spirale avvolta da 1.000 D fino a conducibilità del permeato < di 10 μS. Il concentrato viene portato a piccolo volume per concentrazione sotto vuoto e liofilizzato. Si ottengono 3,23 g di prodotto avente le caratteristiche chimicofisiche descritte in tabella 1 e lo spettro <1>H-NMR simile a quello dell’esempio 5. In particolare il prodotto ottenuto ha un titolo di condroitin 4,6-disolfato pari all’85 % e contiene il 15% di condroitino non solfatato.
Caratteristiche dei prodotti ottenuti negli esempi soprariportati
TABELLA 1 - caratteristiche chimico fisiche dei prodotti ottenuti:
Per il riconoscimento dei condroitinsolfati è stato impiegato anche il seguente metodo, basato sull’attività condroitinasi AC.
0,025 unità di condroitinasi AC (Seikagaku Corporation) sciolte in 100 μl di tampone TRIS-HCI 0,02 M pH 7,3, vengono aggiunte ad una soluzione di substrato contenente 1 ,8 mg in 500 μl di tampone TRIS-HCI 0,4 M pH 7,3 termostatata a 37°C. Ad intervalli definiti, 120 μΙ della soluzione in incubazione vengono prelevati e la reazione viene fermata per aggiunta di 1 mi di KCI 50 mM pH 1,8. Dopo centrifugazione su centrifuga Eppendorf con provette Eppendorf per 5’, la soluzione viene letta a 232 μm contro un bianco di tampone. I risultati sono riportati nella tabella 2.
TABELLA 2 - attività condroitinasi AC
Claims (22)
- RIVENDICAZIONI 1 . Processo per la preparazione di condroitin solfati aventi per almeno il 70% la formula (I), il rimanente a 100% essendo costituito da condroitino non solfatato,dove R ed R1, uguali o diversi, rappresentano H oppure SO3Na, con la condizione che R ed Ri non possono essere entrambi H, ed n è un numero intero da 5 a 50, caratterizzato dal fatto che detto processo impiega come materiale di partenza il polisaccaride K4 da Escherichia coli e comprende i seguenti stadi: a) defruttosilazione del polisaccaride K4 mediante trattamento con HCI; b) passaggio su colonna a scambio ionico per ottenere il polisaccaride acido oppure b1) protezione selettiva del carbossile tramite formazione del metilestere; c) protezione selettiva delle posizioni 4 e 6 della galattosammina tramite dibenzilidenazione; d) protezione delle posizioni 2 e 3 dell’acido glucuronico tramite O-acetilazione; e) deprotezione in posizione 4 e 6 della galattosammina tramite allontanamento del dibenzilidene mediante trattamento con acido acetico ottenendo il prodotto intermedio avente struttura rappresentata per almeno l’80% in peso dalla formula (II)(II) dove R2 rappresenta un’acetile, R3 rappresenta Na oppure CH3 ed n è un numero intero da 5 a 100, e dal fatto che detto intermedio (II) viene sottoposto a soifatazione selettiva e a deprotezione del prodotto solfatato ottenuto per ottenere il condroitin 4,6-disolfato oppure il condroitin 4-solfato oppure il condroitin 6-solfato.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta defruttosilazione dello stadio a) è condotta acidificando con HCI fino a pH 2,8 una soluzione acquosa di K4 avente concentrazione da 0,5 a 5% e mantenendo la soluzione acidificata a 20-25°C per 24-72 ore.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta colonna a scambio ionico dello stadio b) è una colonna con resina a scambio cationico IR-120 H<+>.
- 4. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detto metilestere dello stadio b1 è ottenuto mediante reazione del prodotto dello stadio a) con una miscela di metanolo ed acetile cloruro a temperatura ambiente sotto agitazione per 24 ore.
- 5. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta protezione selettiva dello stadio c) è condotta trattando il prodotto ottenuto nello stadio b) oppure nello stadio b1) disciolto in DMF con benzaldeide dimetilacetale ed acido p-toluensolfonico fuso, a 60-80°C per 4-10 ore.
- 6. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta protezione della stadio d) viene condotta sciogliendo il prodotto dello stadio c) in acetonitrile, addizionando trietilammina, anidride acetica e dimetilamminopiridina e mantenendo sotto agitazione per 1-3 ore.
- 7. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta deprotezione dello stadio e) viene condotta trattando il prodotto dello stadio d) con una soluzione acquosa di acido acetico a temperatura di 60-80°C sotto agitazione per 2-5 ore.
- 8. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta solfatazione selettiva dell'intermedio (II) per ottenere il condroitin 4,6-disolfato è condotta in DMF anidra trattando con piridina-solfotriossido a 40-60°C per 14-24 ore.
- 9. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta deprotezione dell'intermedio (II) 4,6-disolfato è condotta con NaOH 0.2-0.3N a 30-50°C.
- 10. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta solfatazione selettiva dell'intermedio (II) per ottenere il condroitin 4-solfato è condotta in DMF anidra trattando con piridinasolfotriossido a 20-25°C per 14-24 ore.
- 11. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta deprotezione dell'intermedio (II) 4-solfato è condotta con NaOH 0,2- 0,3 N a 30-50°C.
- 12. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta solfatazione selettiva dell'intermedio (II) per ottenere il condroitin 6-solfato è condotta in DMF anidra con piridinasolfotriossido a 0-5°C per 1 -3 ore.
- 13. Processo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta deprotezione dell'intermedio (II) 6-solfato è condotta con NaOH 0,2-0, 3 N a 30-50°C.
- 14. Condroitin solfato avente per almeno il 70% la formula (I)(I) il rimanente a 100% essendo costituito da condroitino non solfatato, dove R ed Ri, uguali o diversi, rappresentano H oppure SO3Na, con la condizione che R ed R1 non possono essere entrambi H, ed n è un numero intero da 5 a 50, avente un rapporto solfati/carbossili compreso fra 0,7 e 2.
- 15. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che nella formula (I), R è S03 Na compreso fra 70 e 90% ed Ri è SO3 Na compreso fra 10 e 25%, la percentuale rimanente essendo H.
- 16. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che nella formula (I), R è SO3 Na compreso fra 20 e 35% ed Ri è S03 Na compreso fra 80 e 95%, la percentuale rimanente essendo H.
- 17. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che nella formula (I), R è SO3 Na compreso fra 80 e 95% ed Ri è SO3 Na compreso fra 80 e 95%, la percentuale rimanente essendo H.
- 18. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che nella formula (I), il Na è sostituito da un altro catione scelto dal gruppo costituito da K, Li, Ca, Mg ed Mn.
- 19. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, avente peso molecolare medio compreso fra 10.000 e 25.000 D.
- 20. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, avente peso molecolare medio compreso fra 12.000 e 15.000 D.
- 21. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, avente peso molecolare medio compreso fra 5.000 e 10.000 D.
- 22. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 14, avente peso molecolare medio compreso fra 6.000 e 8.000 D.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2001MI002200A ITMI20012200A1 (it) | 2001-10-22 | 2001-10-22 | Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti |
| CA002408681A CA2408681A1 (en) | 2001-10-22 | 2002-10-17 | Process for the preparation of chondroitin sulfates from k4 polysaccharide and obtained products |
| DE60228184T DE60228184D1 (de) | 2001-10-22 | 2002-10-18 | Verfahren zur Herstellung von Chondroitinsulfaten aus K4-Polysaccharid und so hergestellte Produkte |
| ES02023351T ES2312519T3 (es) | 2001-10-22 | 2002-10-18 | Procedimiento para la preparacion de condritin sulfatos a partir de polisacarido k4 y productos obtenidos. |
| AT02023351T ATE404588T1 (de) | 2001-10-22 | 2002-10-18 | Verfahren zur herstellung von chondroitinsulfaten aus k4-polysaccharid und so hergestellte produkte |
| EP02023351A EP1304338B1 (en) | 2001-10-22 | 2002-10-18 | Process for the preparation of Chondroitin sulfates from K4 Polysaccharide and obtained products |
| US10/274,706 US6777398B2 (en) | 2001-10-22 | 2002-10-21 | Process for the preparation of chondroitin sulfates from K4 polysaccharide and obtained products |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2001MI002200A ITMI20012200A1 (it) | 2001-10-22 | 2001-10-22 | Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI20012200A1 true ITMI20012200A1 (it) | 2003-04-22 |
Family
ID=11448534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT2001MI002200A ITMI20012200A1 (it) | 2001-10-22 | 2001-10-22 | Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6777398B2 (it) |
| EP (1) | EP1304338B1 (it) |
| AT (1) | ATE404588T1 (it) |
| CA (1) | CA2408681A1 (it) |
| DE (1) | DE60228184D1 (it) |
| ES (1) | ES2312519T3 (it) |
| IT (1) | ITMI20012200A1 (it) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115353574A (zh) * | 2022-09-06 | 2022-11-18 | 福建省深蓝生物科技有限公司 | 高硫酸化度的硫酸软骨素cs-e及其提取方法 |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060188966A1 (en) | 1998-04-02 | 2006-08-24 | Deangelis Paul L | Natural, chimeric and hybrid glycosaminoglycan polymers and methods of making and using same |
| US20030104601A1 (en) * | 1999-04-01 | 2003-06-05 | Deangelis Paul L. | Chondroitin synthase gene and methods of making and using same |
| US20080108110A1 (en) * | 1998-04-02 | 2008-05-08 | Deangelis Paul L | Targeted glycosaminoglycan polymers by polymer grafting and methods of making and using same |
| US7223571B2 (en) | 1998-04-02 | 2007-05-29 | The Board Of Regents Of The Universtiy Of Oklahoma | Targeted glycosaminoglycan polymers by polymer grafting and methods of making and using same |
| US7642071B2 (en) | 1999-04-01 | 2010-01-05 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Methods of expressing gram-negative glycosaminoglycan synthase genes in gram-positive hosts |
| ITMI20032498A1 (it) | 2003-12-17 | 2005-06-18 | Pasqua Anna Oreste | Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e |
| ITMI20010397A1 (it) * | 2001-02-27 | 2002-08-27 | Giorgio Zoppetti | Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione |
| CN1675250B (zh) * | 2002-06-18 | 2012-11-14 | 格利考斯2000有限公司 | 硫酸盐化程度非常高的k5多糖的差向异构衍生物 |
| US8513407B2 (en) * | 2002-06-18 | 2013-08-20 | Glycores 2000 S.R.L. | Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained |
| PT2296670E (pt) | 2008-05-13 | 2013-03-25 | Apharm Srl | Utilização oral de glicosaminoglicana e composições |
| US9109243B2 (en) | 2008-06-04 | 2015-08-18 | Amano Enzyme Usa, Ltd. | Microbial-derived chondroitin sulfate |
| IT1394311B1 (it) * | 2009-05-25 | 2012-06-06 | Altergon Sa | Produzione biotecnologica di condroitina |
| ITMI20110505A1 (it) * | 2011-03-29 | 2012-09-30 | Altergon Sa | Processo per la preparazione di condroitine solfatate in posizione 3 sull'acido glucuronico |
| DK2707396T3 (en) * | 2011-05-12 | 2019-01-28 | Gnosis Spa | Biotechnological sulfated chondroitin sulfate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain and process for its preparation |
| ITMI20110829A1 (it) * | 2011-05-12 | 2012-11-13 | Gnosis Spa | Condroitin solfato biotecnologico solfatato in posizione 4 o 6 sulla stessa catena polisaccaridica e procedimento per la sua preparazione |
| ITMI20120136A1 (it) * | 2012-02-02 | 2013-08-03 | Gnosis Spa | Condroitin solfato biotecnologico a basso peso molecolare solfatato in posizione 4 o 6 sulla stessa catena polisaccaridica dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e procedimento per la sua preparazione |
| US8664196B2 (en) | 2011-05-20 | 2014-03-04 | Gnosis S.P.A. | Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof |
| AU2011369262B2 (en) * | 2011-05-20 | 2017-02-02 | Lesaffre Et Compagnie | Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof |
| CN102618597A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-01 | 江南大学 | 大肠杆菌工程菌及其生产软骨素的方法 |
| ITMI20120880A1 (it) * | 2012-05-22 | 2013-11-23 | Gnosis Spa | Condroitin 6-solfato biotecnologico a basso peso molecolare dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e suo uso nel trattamento e nella prevenzione dell'osteoartrite |
| ITMI20120896A1 (it) | 2012-05-23 | 2013-11-24 | Bongulielmi Reto | Condroitina per uso in medicina |
| ITMI20121316A1 (it) | 2012-07-27 | 2014-01-28 | Altergon Sa | Complessi di condroitina ad assorbimento transcutaneo |
| ITMI20130117A1 (it) | 2013-01-25 | 2014-07-26 | Gnosis Spa | Composizioni comprendenti condroitin solfato, enzimi proteolitici e composti sulfidrilati capaci di migliorare la biodisponibilita' del condroitin solfato |
| CN104163877B (zh) * | 2014-08-26 | 2016-05-18 | 淮安麦德森制药有限公司 | 硫酸软骨素的制备方法 |
| WO2017055909A1 (en) | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Apharm S.R.L. | Combination of glycosaminoglycans and an antacid agent and compositions thereof |
| CN108484795B (zh) * | 2018-04-28 | 2021-02-09 | 山东第一医科大学第二附属医院 | 硫酸软骨素锂及其制备方法和应用 |
| IT202000013633A1 (it) * | 2020-06-08 | 2021-12-08 | Vivatis Pharma Gmbh | Processo di estrazione di una condroitina solfato da un fungo, una condroitina solfato di origine vegetale e suo uso |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3895107A (en) * | 1970-04-15 | 1975-07-15 | Morrison L M | CSA and CSC in man and mammals to inhibit atherosclerosis and the recurrence of cardiovascular incidents in atherosclerotic mammals |
| US4302577A (en) * | 1979-10-05 | 1981-11-24 | Biomed Research Inc. | Process for preparing CSA or CSC |
| IT1289613B1 (it) * | 1997-02-07 | 1998-10-15 | Inalco Spa | Polisaccaridi batterici o-solfatati |
| ITMI991465A1 (it) | 1999-07-02 | 2001-01-02 | Inalco Spa | Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli |
-
2001
- 2001-10-22 IT IT2001MI002200A patent/ITMI20012200A1/it unknown
-
2002
- 2002-10-17 CA CA002408681A patent/CA2408681A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-18 AT AT02023351T patent/ATE404588T1/de active
- 2002-10-18 EP EP02023351A patent/EP1304338B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-18 DE DE60228184T patent/DE60228184D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-18 ES ES02023351T patent/ES2312519T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-21 US US10/274,706 patent/US6777398B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115353574A (zh) * | 2022-09-06 | 2022-11-18 | 福建省深蓝生物科技有限公司 | 高硫酸化度的硫酸软骨素cs-e及其提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030100534A1 (en) | 2003-05-29 |
| CA2408681A1 (en) | 2003-04-22 |
| ES2312519T3 (es) | 2009-03-01 |
| EP1304338A1 (en) | 2003-04-23 |
| ATE404588T1 (de) | 2008-08-15 |
| EP1304338B1 (en) | 2008-08-13 |
| DE60228184D1 (de) | 2008-09-25 |
| US6777398B2 (en) | 2004-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ITMI20012200A1 (it) | Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti | |
| FI88046C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av hepariner med laog molekylvikt | |
| JPS59133201A (ja) | 多糖類の解重合およびスルフエ−ト化法 | |
| KR860001394B1 (ko) | 황산 크실란의 제조 방법 | |
| CN101735336B (zh) | 低聚岩藻糖化糖胺聚糖及其制备方法 | |
| CS366891A3 (en) | N,o-sulfated heparosanes, process of their preparation and pharmaceuticalcompositions containing said n,o-sulfated heparosanes | |
| AU639427B2 (en) | Novel dermatan sulfate and heparin oligosaccharides having antiatherosclerotic activity | |
| FR2584728A1 (fr) | Procede de sulfatation de glycosaminoglycanes et de leurs fragments | |
| US4948881A (en) | Process for the depolymerization and sulfation of polysaccharides | |
| CA2285383C (en) | Glycosaminoglycans having high antithrombotic activity | |
| AU620632B2 (en) | Selectively o-acylated glycosaminoglycans, their preparation and pharmaceutical compositions containing them | |
| JP4267916B2 (ja) | 多糖体ｋ５から誘導された高度のアンチトロンビン活性を有するグリコサミノグリカン及びその製法 | |
| US6388060B1 (en) | Process for the sulfation of uronic acid-containing polysaccharides | |
| ITMI20000665A1 (it) | Glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride k5 aventi elevata attivita' anticoagulante ed antitrombotica e processo per la loro preparazio | |
| ITMI20010397A1 (it) | Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione | |
| KR920003692B1 (ko) | 다당류의 해중합 및 황산염화 방법 | |
| AU2002327578B2 (en) | Saccharide sulfation methods | |
| CZ431699A3 (cs) | Směsi oligosacharidů s antitrombotickou účinností | |
| AU2002327578A1 (en) | Saccharide sulfation methods | |
| AU2003240191A1 (en) | Process for the manufacture of n-acyl-(epi)k5-amine-o-sulfate-derivatives and products thus obtained | |
| Raman et al. | Chemical modification of heparin and heparosan | |
| Raman et al. | Chemical Approaches to Prepare Modified Heparin and Heparosan Polymers for Biological Studies | |
| KR0155166B1 (ko) | 헤파린상 구조를 지닌 물질 및 이의 제조방법 | |
| JP5002937B2 (ja) | 硫酸化多糖及びその製造法 | |
| CN103298837A (zh) | 获得在n-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位硫酸化的软骨素的方法 |