JP4267916B2 - 多糖体k5から誘導された高度のアンチトロンビン活性を有するグリコサミノグリカン及びその製法 - Google Patents
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Description
ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の如きグリコサミノグリカンは、各種の動物の臓器から産業的に抽出される生体高分子である。
【0002】
特に、主にブタの腸粘膜又はウシの肺からの抽出によって得られるヘパリンは、α-1→4又はβ-1→4結合によって結合されたウロン酸(L-イズロン酸又はD-グルクロン酸)及びアミノ糖(グルコサミン)により形成された繰り返し二糖体単位でなる鎖混合体である。ウロン酸単位は、2位において硫酸化されていてもよく、グルコサミンは、N-アセチル化又はN-硫酸化及び6-O硫酸化されていてもよい。さらに、グルコサミン単位は、3位において約0.5%の量で硫酸基を含有できる。ヘパリンは、分子量約3,000〜約30,000Dをもつ多分散コポリマーである。
【0003】
哺乳動物におけるヘパリンの自然の生合成及びこの生成物の特性は、Lindahlらにより、1986年に、Lane D. 及びLindahal U. (編集), ヘパリン−化学的及び生物学的特性;Clinical Applications, Edward Arnold, London, p.159-190 及びLindahal U., Feingold, D.S. 及びRoden L. (1986) TIBS, 11, 221-225 に記載されている。
【0004】
活性五糖体と名付けられたアンチトロンビンIII(ATIII)用の結合の五糖体領域によって形成される配列(ATIIIへのヘパリンの高親和性結合に必要な構造体である)は、ヘパリン活性にとって必須である。この配列は、3位で硫酸化された1つのグルコサミン単位(ヘパリン鎖の他の部分には存在しない)を含有する。ATIIIを介する活性以外に、ヘパリンは、ヘパリン共同因子II(HCII)の活性化を介する抗凝固及び抗血栓活性及びトロンビンの選択的阻害性を発揮する。HCIIの活性化に必要な最少の糖配列は、少なくとも24個の単糖を含有する鎖であることが知られている(Tollefson D.M., 1990, 血栓症及止血に関するセミナー 16, 66-70)。
【0005】
大腸菌(Escherichia Coli)の菌株から単離されたきょう膜多糖体K5(Vann W.F., Schmidt M.A., Jann B., Jann K. によってEupopean Journal of Biochemistry 116, (1981) 359-364に開示されている)は、ヘパリン及びヘパラン硫酸前駆体(N-アセチルヘパロサン)の同じ配列、すなわち、二糖体グルコロニル-β-1→4-グルコサミン構造体を繰り返すことによって構成される鎖混合体を示すことが知られている。この化合物は、Lormeauらによって米国特許第5,550,116号に、及びCasuらによってCarbohydrate Research, 1994, 263, 271-284に開示されているように化学的に変性され、あるいは、動物の臓器から抽出されたものと同じタイプのヘパリンの凝固に関するインビトロ生物学的活性を示す生成物を得るために化学的及び酵素的に変性されている。
【0006】
多糖体K5の化学的及び酵素的変性は、初めて、イタリー国特許第1,230,785号に開示されており、この変性法は、多糖体K5(以後、単に「K5」と表示する)を、(a)N-脱アセチル化及びN-硫酸化;(b)グルクロン酸単位の酵素的C5エピマー化;(c)2-O及び/又は6-O硫酸化;及び(d)任意の酵素的3-O硫酸化するものであるが、この方法は、動物の臓器から抽出されたヘパリン(以後、「市販ヘパリン」又は「標準ヘパリン」と称する:後者の表現は、ヘパリンの第4の国際基準を表示する)のものに対して満足できる活性を有する生成物を提供することができない。
【0007】
WO 92/17507は、(a)N-脱アセチル化及びN-硫酸化、(b)C5エピマー化、及び(c)O-硫酸化(工程(c)に続いて、任意に、N-再硫酸化が行われる)による、K5を原料とするヘパリン様生成物の製造方法を開示している。この製法によれば、得られる生成物のイズロン酸含量が少ない(ウロン酸の全含量の約20%)。
WO 96/14425及び米国特許第5,958,899号は、(a)N-脱アセチル化及びN-硫酸化、(b)C5エピメラーゼによるエピマー化(工程(b)は、制御された条件下で行われる)、及び(c)少なくともいくつかの遊離ヒドロキシ基の硫酸化による、K5を原料とする高イズロン酸含量を有するヘパリン様生成物の製法を開示している。この方法に従って得られた生成物は、N-硫酸基がかなりの量欠乏している(O-硫酸化の間に失われるため)。
【0008】
WO 97/43317及び米国特許第6,162,797号は、高い抗凝固活性を有するK5の誘導体を開示しており、この誘導体は、K5を、(a)N-脱アセチル化及びN-硫酸化、(b)C5エピマー化、(c)予め有機酸との塩に変換したエピマー化生成物のO-過硫酸化及び透析、及び(d)N-再硫酸化に供することによって調製される。この方法に従って得られた生成物は、非常に高い全体的抗凝固活性を発揮する。
【0009】
WO 98/42754は、高い抗血栓活性を有するグルコサミノグリカン(K5の誘導体を含む)の製法を開示しており、この方法は、K5の場合、(a)N-脱アセチル化及びN-硫酸化、(b)C5エピメラーゼによるエピマー化、(c)O-過硫酸化、(d)過硫酸化生成物の塩の部分的ソルボリシスO-脱硫酸化、(e)N-再硫酸化、及び、任意に、(f)O-再硫酸化でなる。この任意の6-O再硫酸化(完全な6-O硫酸化を回復する)は、抗-Xa活性をさらに増大させることを期待するものである(A. Naggiら, 血栓症及び止血に関するセミナー, 2001, 27/5, 437-443)。実際には、この方法に従って得られた生成物は、任意の工程(f)が行われない場合には、O-硫酸基が欠乏するか、あるいは、工程(f)を行った場合に失われるN-硫酸基が欠乏するとの欠点を有する。このように、不完全なN-又はO-、特に6-O硫酸化(常に60%以下)は、C5エピマー化K5多糖体の場合、非常に低い抗-Xa値を伴い、不完全なN-硫酸化の場合には、非常に低い抗-Xa/aPPT比を与え、あるいは不完全な6-O硫酸化の場合には、低いアンチトロンビン又はHCIIを与え、このように、低い抗-IIa/aPTT比及び/又はHCII/aPTT比を与える。
【0010】
発明者らは、分子量3,000〜30,000を有し、ATIIIに対する高い親和性をもつ鎖25〜50%を含有し、高い抗凝固及び抗血栓活性を有する、大腸菌からの多糖体K5から誘導された新規なグリコサミノグリカンを見出し、本発明に至った。
【0011】
前記グリコサミノグリカンは、実質的に、次の一連の工程:(i)多糖体K5のN-脱アセチル化/N-硫酸化、(ii)グルクロン酸部のカルボキシル基の、対応するイズロン酸部への部分的C5エピマー化、(iii)過硫酸化、(iv)選択的O-脱硫酸化、(v)任意の6-O硫酸化、及び(vi)N-硫酸化を含む方法を介して合成される。
【0012】
さらに、工程(iii)の終了時に得られた生成物のO-脱硫酸化を135〜165分の時間で行うことによって、最良の抗血栓活性及び他のいずれのヘパリン様グリコサミノグリカンのものよりも低い出血性を示す新規な化合物が得られるとの知見を得た。
【0013】
特に、高いアンチトロンビン活性及びヘパリンのものよりも低い出血性を有する新規なグリコサミノグリカンが、実質的に、(i)多糖体K5のN-脱アセチル化/N-硫酸化、(ii)グルクロン酸部のカルボキシル基の、対応するイズロン酸部への部分的C5エピマー化、(iii)過硫酸化、(iv)時間及び温度を制御した選択的O-脱硫酸化、(v)6-O硫酸化、(vi)N-硫酸化の工程を含み、工程(ii)〜(vi)のいずれかの終了時における任意の低分子化工程を含む方法によって得られるとの知見を得た。この反応の配列のため、これらの新規なグリコサミノグリカンは、ほぼ完全にN-硫酸化され、かつ高度に6-O硫酸化されており、このため、従来の方法によって得られるものとは異なるものである。
【0014】
さらに詳述すれば、驚くべきことには、上記方法の工程(iv)において、工程(iii)の終了時に得られた生成物の選択的O-脱硫酸化を、ジメチルスルホキシド/メタノール混合物中において、時間135〜165分及び温度50〜70℃で行う場合には、ヘパリンタイプの新規なグリコサミノグリカンが得られ、このグリコサミノグリカンは、標準ヘパリンと少なくとも同程度の抗-Xa活性、標準ヘパリンよりも低い全体的抗凝固活性(例えば、aPTTとして表示される)、標準ヘパリンのものと少なくとも同様の高さのヘパリン共同因子II(HCII)活性及び標準ヘパリンよりもかなり高い抗-IIa(アンチトロンビン)活性を有し、さらに、この新規なグリコサミノグリカンは、市販ヘパリンと比べて低減された出血の危険性を有するものであるとの知見が得られた。さらに、工程(iv)を上述の条件下で行うことによって、工程(vi)の終了時に得られる化合物の生物学的活性が、低い出血の危険性と共に、低分子化の後でも保持される(低分子化生成物の活性は、非常に高いアンチトロンビン活性、標準ヘパリンのものと同程度の抗-Xa及びHCII活性及び標準ヘパリンのものよりも低い全体的抗凝固活性によって表される)との知見を得た。このように、工程(iv)をこれらの制御された条件下で行うことによって、公知の方法の上記欠点を解消でき、改善されかつ選択的なアンチトロンビン活性を有し、特殊な凝固制御剤及び抗血栓剤として有用な新規なグリコサミノグリカンが得られる。
【0015】
以下の記載では、多糖体K5の誘導体を、N-脱アセチル化多糖体K5については「脱アセチル化K5」、N-脱アセチル化、N-硫酸化多糖体K5については「N-硫酸K5」、C5エピマー化、N-脱アセチル化、N-硫酸化多糖体K5については「C5エピマー化N-硫酸K5」、上記工程(vi)の終了時に得られるC5エピマー化、N-脱アセチル化、N,O-硫酸化多糖体K5(低分子化を行ったもの又は行っていないもの)については「C5エピマー化N,O-硫酸K5」と表示する。他に表示しない限り、原料のK5及びその誘導体は、そのナトリウム塩の形のものである。
【0016】
本発明は、(i)多糖体K5のN-脱アセチル化/N-硫酸化、(ii)グルクロン酸部のカルボキシル基の、対応するイズロン酸部への部分C5エピマー化、(iii)過硫酸化、(iv)選択的O-脱硫酸化、(v)任意の選択的6-O硫酸化、及び(vi)N-硫酸化の工程を含むK5グリコサミノグリカンを製造する方法であって、工程(iv)が、工程(iii)の終了時に得られた過硫酸化生成物を、メタノール/ジメチルスルホキシド混合物にて、135〜165分間処理することからなることを特徴とするK5グリコサミノグリカンの製法に関する。
【0017】
好ましくは、処理時間は約150分である。
【0018】
工程(ii)〜(vi)で得られた本発明の生成物は、好ましくは工程(vi)後に、WO 82/03627に記載されているように化学的に低分子化される。
【0019】
好適な具体例によれば、工程(iii)の終了時に得られた過硫酸化生成物のメタノール/ジメチルスルホキシド混合物による処理は、温度約60℃において、時間約150分で行われる。この有利な方法によれば、工程(i)〜(iii)に従って調製された過硫酸化生成物から、最良の抗血栓活性及び他の各種のヘパリン様グリコサミノグリカンのものよりも低い出血性を示す新規なグリコサミノグリカンが得られる。
【0020】
さらに、工程(ii)の部分的エピマー化がイズロン酸部少なくとも40%を与えるものであり、工程(iii)の過硫酸化を、非プロトン性溶媒中、温度40〜60℃において、10〜20時間行い、及び工程(v)の選択的6-O硫酸化を実際に行う場合には、この有利な方法に従って、特に興味深いK5グリコサミノグリカンが得られる。
【0021】
このように、本発明の他の目的は、新規なグリコサミノグリカンを製造する方法であって、(i)多糖体K5をN-脱アセチル化剤と反応させ、ついで、N-脱アセチル化生成物をN-硫酸化剤と反応させ;(ii)このようにして得られたN-硫酸K5を、グルクロノシルC5エピメラーゼによってC5エピマー化して、イズロン酸/グルクロン酸の比が60/40〜40/60であるC5エピマー化N-硫酸K5を生成し;(iii)総ウロン酸に対するイズロン酸の含量40〜60%を有するC5エピマー化N-硫酸K5を、その第3級又は第4級塩に変換し、ついで、このようにして得られた塩を、O-硫酸化剤にて、非プロトン性の極性溶媒中、温度40〜60℃において、10〜20時間処理し;(iv)このようにして得られたO-過硫酸化生成物の有機塩基との塩を、ジメチルスルホキシド/メタノール混合物にて、50〜70℃において、135〜165分間処理し;(v)このようにして得られた部分的O-脱硫酸化生成物の有機塩基との塩を、O-硫酸化剤にて、温度0〜5℃において処理し;(vi)このようにして得られた生成物をN-硫酸化剤にて処理し;工程(ii)〜(vi)のいずれかの終了時に得られた生成物を、任意に、低分子化することを含むことを特徴とするグリコサミノグリカンの製法を提供することにある。
【0022】
原料として使用されるK5は、野生又はクローン化されたK5産生大腸菌の菌株の培養によって得られる各種の生成物である。特に、上述のK5の1つを使用でき、有利には、M. Manzoniら, Journal Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311又はWO 01/02597に記載されたものの1つを使用できる(好ましくは、予め精製したもの)。
【0023】
有利なK5原料は、低分子量(特に約1,500〜15,000、有利には約2,000〜約9,000の分布(平均分子量約5,000)をもつ)、又はより大きい分子量(特に約10,000〜約50,000、有利には約20,000〜約40,000の分布(平均分子量約30,000)をもつ)を有する。好ましくは、原料K5は、約1,500〜約50,000の分子量分布(平均分子量20,000〜25,000)を有する。分子量はすべてドルトン(D)で表される。K5及び後述のその誘導体の分子量は、基準として既知の分子量を有するヘパリンフラクションを使用することによって算定されたされたものである。
【0024】
代表的には、大腸菌からの多糖体K5の製造のため、初めに、イタリー国特許出願第MI99A001465号(WO 01/02567)に従い、下記の培地を使用して、フラスコ内での培養を行う。
脱脂大豆 2 (g/L)
K2HPO4 9.7 (g/L)
KH2PO4 2 (g/L)
MgCl2 0.11 (g/L)
クエン酸ナトリウム 1 (g/L)
硫酸アンモニウム 1 (g/L)
グルコース 2 (g/L)
水 1,000 (ml)
pH 7.3
【0025】
培地を120℃において20分間殺菌する。別に、グルコースを溶液として調製し、これを120℃において30分間殺菌し、溶液を無菌的に培地に添加する。フラスコに、トリプティック大豆寒天を含有する斜面培地から採取した大腸菌細胞 Bi 8337/41(O10:K5:H4)の懸濁液を接種し、制御して攪拌しながら(160rpm、ラン6cm)、37℃において24時間培養する。顕微鏡を使用して細胞数を計数することによって、細菌の生育を測定する。さらなる工程では、上記ものと同じ培地を収容するChemap-Braun発酵装置(容積14L)に、上記フラスコの培養物0.1%を接種し、給気1vvm(vvm:液体の容量、分当たりの空気の容量)、撹拌400rpm、温度37℃において、18時間発酵を行う。発酵の間、pH、酸素、残留グルコース、生成した多糖体K5及び細菌の生育を測定する。
【0026】
発酵の終了時、温度を80℃に10分間上昇させる。10,000rpmでの遠心分離によって、細胞を培地から分離し、上澄みを、公称カットオフ800〜10,000DをもつPES膜を具備するSS 316(MST)モジュールを介して限外濾過して、容積を1/5に減少させる。ついで、4℃のアセトン4容を添加して多糖体K5を沈殿させ、沈降させるため、4℃において1夜放置し、最後に、10,000rpmで20分間遠心分離するか、又は濾過する。
【0027】
ついで、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus Orizae)からのタイプIIのプロテアーゼを使用して、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(10mg/濾液1L)を含有するpH8の0.1M NaCl及び0.15M エチレンジジアミン四酢酸(EDTA)中、37℃、90分間で除タンパクを行う。10,000Dの公称カットオフ膜をもつSS 316モジュール上で溶液を限外濾過し、1M NaClにて2回抽出を行い、限外濾液において吸光度が消失するまで、水で洗浄する。ついで、多糖体K5をアセトンにて沈殿させ、850mg/発酵装置1Lの収率を得る。多糖体の純度を、ウロン酸の測定(カルバゾール法)、プロトン及び炭素NMR、UV及びタンパク質含量によって測定する。純度は80%以上である。
【0028】
このようにして得られた多糖体は、異なる分子量、30,000及び5,000D(75 HR Pharmaciaカラムを使用するHPLCによって測定)を有する2つのフラクション、及び直列の2個のBio-sil SEC 250カラム(BioRad)及び可動相としてNa2SO4を使用し、室温及び流速0.5ml/分で測定して保持時間約9分をもつ1つのシングルフラクションからなる。測定を、既知の分子量をもつヘパリンフラクションを使用して得られた曲線に対して行う。プロトンNMRを図2に示す。
【0029】
このような多糖体K5は、その純度が本発明の方法の実施に充分なものであるため、本発明の方法の原料物質として使用される。この原料物質を予め精製することは有利である。
【0030】
多糖体K5の好適な精製は、Triton X-100での処理によって達成される。代表的には、既に充分な純度の上記多糖体K5の1%水溶液に、Triton X-100を濃度5%で添加する。溶液を、55℃において、2時間、撹拌下に維持する。温度を75℃に上昇させ、室温に冷却する間に、2つの相が形成される。上相(有機相)について、2つの相を形成させる熱的処理を2回繰り返し行う。多糖体を含有する水相を、最後に、減圧下で濃縮し、エタノール又はアセトンにて沈殿させる。有機相を廃棄する。サンプルの純度はプロトンNMRによって制御され、95%となる。
【0031】
この処理の収率は90%である。
【0032】
工程(i)では、原料のK5を、N-脱アセチル化及び続いてN-硫酸化(これらは公知の方法によって行われる)に供する。代表的には、精製したK5 10gを2N水酸化ナトリウム100〜2,000mlに溶解し、40〜80℃において、完全なN-脱アセチル化を行うために必要な時間(30時間を超えない)反応させる。この溶液を室温に冷却し、6N塩酸によってpHを中性とする。
【0033】
N-脱アセチル化K5を含有する溶液を20〜65℃に維持し、炭酸ナトリウム10〜40gを、ピリジン・三酸化イオウ付加物、トリメチルアミン・三酸化イオウ付加物等の如き入手可能な試薬から選ばれる硫酸化剤10〜40gと共に添加する。硫酸化剤の添加を、12時間までの変更可能な時間で行う。反応の終了時、必要であれば、溶液を室温とし、5%塩酸溶液にてpHを7.5〜8とする。
【0034】
生成物を、公知の技術、例えば、1,000Dカットオフをもつスパイラル膜(プレプスケールカートリッジ;Millipore)を使用するダイアフィルトレーションによって、塩から精製する。このプロセスは、透過物の伝導度が1,000μS未満、好ましくは100μS未満である時点で終了する。得られる生成物の容積を、濃縮器として同じ濾過システムを使用して、多糖体濃度が10%となるまで濃縮する。必要であれば、濃縮溶液を公知の技術にて乾燥させる。
【0035】
N-硫酸/N-アセチル比は、13炭素NMRによって測定して10/0〜7/3である。
【0036】
本発明によるC5エピマー化の工程(ii)は、溶液中又は不動化した形の酵素グルクロノシルC5エピメラーゼ(C5エピメラーゼと称する)を使用して行われ、例えば、特殊な2価カチオンの存在下において、少なくとも40%のエピマー化を達成する。WO 01/72848に開示されているように、酵素は、組み換えグルクロノシルC5エピメラーゼ、マウス肥満細胞腫からのグルクロノシルC5エピメラーゼ及びウシ肝臓から抽出されたグルクロノシルC5エピメラーゼを含む群から選ばれ、前記2価カチオンは、Ba、Ca、Mg及びMnでなる群から選ばれる。
【0037】
溶液中の酵素によるC5エピマー化
天然又は組み換えC5エピメラーゼ1.2×107〜1.2×1011cpm(1分当たりの個数)(Campbell P.ら, Analytical Biochemistry 131, 146-152 (1983)に記載の方法に従って算定)を、N-硫酸K5 0.001〜10g及びバリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガンの中から選ばれる1以上のイオンを濃度10〜60mMで含有するpH5.5〜7.4の25mM Hepes緩衝液2〜2,000mlに溶解する。反応を、温度30〜40℃、好ましくは37℃において1〜24時間で行う。反応の終了時、100℃において、10分間で酵素を不活性化させる。
生成物を、ジメチルアミノエチル樹脂(DEAE樹脂)又はDEAE装置Sartobind上を通過させ、2M NaClにて結合を開放し、最後にSephadex G-10樹脂上で脱塩することによって精製するか、又はエタノール2容による沈澱及びナトリウム塩を形成させるためのIR 120 H+樹脂上の通過によって精製する。
【0038】
得られた生成物は、WO 96/14425に既に記載されているように、1H-NMRによって算定して、40/60〜60/40のイズロン酸/グルクロン酸の比を示す。
【0039】
不動化酵素によるC5エピマー化
天然又は組み換えの酵素C5エピメラーゼを、酵素の結合に関する最も一般的な技術を使用して、臭化シアン、グルタルアルデヒド、カルボジイミドの如き反応性官能基をもつ樹脂、膜又はガラスビーズを含む各種の不活性支持体上に不動化させるか、又は、酵素をイオン交換樹脂と反応させるか、又は膜上に吸着させることによって不動化させる。本発明によれば、酵素の不活性支持体上への結合反応は、酵素の活性サイトへの結合(活性をロスさせる)を回避するため、基質N-硫酸K5の存在下で行われる。不動化酵素の活性の測定は、不動化酵素のカラムに、25mM Hepes、0.1M KCl、0.01% Triton X-100及び0.15M EDTA緩衝液(pH7.4)の存在下、37℃において、流速0.5ml/分で、不動化酵素の量(cpm)によって理論的にエピマー化される量のN-硫酸K5を再循環させることによって行われる。DEAEクロマトグラフ法及びSephadex G-10での脱塩によって精製した後、生成物を凍結乾燥し、イズロン酸の含量をプロトンNMRによって算定する。
【0040】
イズロン酸/グルクロン酸の比は約30/70であろう。
【0041】
バリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガンの中から選ばれる1以上のイオン(濃度10〜60mM)及びN-硫酸化K5 0.001〜10gを含有する温度30〜40℃に維持したpH6〜7.4の25mM Hepes緩衝液20〜1,000mlを、不活性支持体に不動化させた酵素1.2×107〜3×1011cpm当量を収容し、温度30〜40℃に維持したカラムにおいて、流速30〜160ml/時間で、1〜24時間再循環させる。反応の終了時、溶液中におけるエピマー化に関して記載したものと同じ方法を使用してサンプルを精製する。
【0042】
得られた生成物のイズロン酸/グルクロン酸の比は、40/60〜60/40の範囲である。
【0043】
好適な具体例によれば、前記C5エピマー化は、不動化型の酵素を使用して行われ、N-硫酸K5 0.001〜10g及び濃度10〜60mMの前記カチオンの1つを含有するpH6〜7.4の25mM Hepes溶液20〜1,000mlを、不活性支持体上に不動化させた酵素1.2×107〜3×1011cpmを収容するカラムを通して再循環させることを包含してなり、前記pHは、好ましくは約7であり、前記C5エピマー化は、好ましくは、温度約30℃、流速約200ml/時間で、前記溶液を約24時間循環させることによって行われる。
【0044】
O-過硫酸化でなる工程(iii)は、予め、C5エピマー化N-硫酸K5を、その第3級又は第4級塩に変換し、ついで、この塩を、O-硫酸化剤にて、温度40〜60℃において10〜20時間処理することによって行われる。代表的には、工程(ii)のエピマー化生成物を濃度10%で含有する溶液を10℃に冷却し、IR 120 H+カラム又は均等物(35〜100ml)を通過させる。カラム及び生成物の容器の両方を10℃に維持する。溶液の通過後、樹脂を、貫流液のpHが6より大となるまで脱イオン水で洗浄する(脱イオン水約3容)。酸性溶液を、水酸化テトラブチルアンモニウムの如き第3級又は第4級アミン(15%水溶液)にて中性に維持して、多糖体のアンモニウム塩を得る。溶液を最少容量に濃縮し、凍結乾燥する。得られた生成物を、ジメチルホルムアミド(DMF)又はジメチルスルホキシド(DMSO)20〜500mlに懸濁させ、ピリミジン・SO3付加物の如き固体状又はDMF又はDMSO溶液中の硫酸化剤15〜300gを添加する。溶液を、20〜70℃に2〜24時間、好ましくは、40〜60℃に15〜20時間維持する。反応の終了時、溶液を室温に冷却し、完全な沈澱が生ずるまで、塩化ナトリウム飽和アセトンを添加する。濾過によって、沈殿物を溶媒から分離し、最少量(例えば、100ml)の脱イオン水に溶解させ、塩化ナトリウムを添加して、0.2M溶液を得る。2N水酸化ナトリウムにて、溶液をpH7.5〜8とし、完全な沈澱が生ずるまでアセトンを添加する。濾過によって、沈澱物を溶媒から分離する。得られた固体を脱イオン水100mlに溶解させ、上記工程(i)において記載したように、限外濾過によって残留塩から精製する。
【0045】
得られた生成物の一部を、13C-NMRによる過硫酸化生成物の構造分析のため、凍結乾燥する。得られた生成物の多糖体当たりの硫酸塩の含量は、Casu B.ら, Carbohydrate Research 1975, 39, 168-176に従って算定して2.8〜3.5である。グルコサミンの6位が80〜95%硫酸化されており、2位は全く硫酸化されていない。他の硫酸基は、アミノ糖の3位及びウロン酸の2及び3位に存在する。
【0046】
選択的O-脱硫酸化でなる工程(iv)は、本発明の方法の鍵となる工程である。これは、工程(vi)の終了時に、低分子化の後、実質的に高いアンチトロンビン活性を保持している低分子量生成物を生成するグリコサミノグリカンの調製を可能にするためである。代表的には、工程(iii)の生成物を含有する溶液を、カチオン性交換樹脂IR 120 H+又は均等物(35〜100ml)を通過させる。溶液の通過後、貫流液のpHが6より大となるまで、樹脂を脱イオン水にて洗浄する(脱イオン水約3容)。酸性溶液をピリジンにて中性とする。溶液を最少容量に濃縮し、凍結乾燥する。得られた生成物を、DMSO/メタノールの9/1(V/V)溶液20〜2,000mlにて処理し、溶液を50〜70℃に135〜165分間、好ましくは、約60℃に約150分間維持する。最後に、溶液に、脱イオン水10〜200mlを添加し、塩化ナトリウム飽和アセトンにて処理して、完全な沈澱を達成する。
【0047】
選択的O-脱硫酸化により、グルコサミンの6位の硫酸基が初めに除去され、ついで、ウロン酸の3位及び2位の硫酸基が、最後に、アミノ糖の3位の硫酸基が除去される。得られたサンプルの13C-NMRスペクトル(図8)は、グルコサミン残基の完全なN-脱硫酸化(56ppmにおけるシグナル)及びほぼ完全な6-O脱硫酸化(67.6ppmにおけるシグナルの減少及び62.2ppmにおけるシグナルの出現)を示している。65及び86ppmにおけるシグナルは、それぞれ、2-O硫酸化イズロン酸及び3-O硫酸化グルクロン酸を表している。得られた固体を、公知の方法によるダイアフィルトレーションによって、例えば、1,000Dカットオフをもつスパイラル膜(プレプスケールカートリッジ;Millipore)を使用することによって精製する。このプロセスは、透過物の伝導度が1,000μS未満、好ましくは100μS未満である時点で終了する。得られる生成物の容積を、濃縮器として同じ濾過システムを使用して、多糖体濃度が10%となるまで濃縮する。必要であれば、濃縮溶液を公知の技術にて乾燥させる。
【0048】
6-O硫酸化でなる工程(v)も、後述の工程(vi)に続く低分子化の後、高いアンチトロンビン活性、ヘパリンのものと同様に高い抗-Xa及びHCII活性、及び低いaPTTを有する化合物が望まれる場合には、実施されなければならない。選択的6-O硫酸化は、選択的にO-脱硫酸化された生成物を、その第3級又は第4級塩に変換させ、この塩を、低温、さらに詳しくは0〜5℃において、0.5〜3時間、O-硫酸化剤にて処理することによって行われる。代表的には、6-O硫酸化は、O-硫酸化の工程(iii)に関して説明したようにして行われる。得られた固体を、工程(iv)に記載のようなダイアフィルトレーションによって精製する。13C-NMRによる構造分析のため少量を凍結乾燥する。Casuら, Arzneimittel-Forschung Drug Research, 1983, 33, 135-142に記載の如くNMRによって算定した6-O硫酸基の含量が約85%未満である場合には、工程(v)を繰り返す。
【0049】
工程(vi)は、O-過硫酸化工程の間に、無視できない量のN-硫酸基が失われるため、実施されなければならない。このように、工程(v)において得られた溶液を、本発明のC5エピマー化N,O-硫酸K5を単離するため、N-硫酸化のための工程(i)において記載のように処理する。
【0050】
工程(ii)〜(vi)のいずれか1つの工程の終了時に得られた高分子量生成物について、最終生成物として、高いアンチトロンビン活性、標準ヘパリンのものと同程度の抗-Xa及びHCII活性、及び標準ヘパリンのものよりも低いaPTT活性を有する低分子量グリコサミノグリカンを得るために、化学的に低分子化を行う。
【0051】
一般に、本発明の方法は、工程(i)〜(vi)を連続して行い、工程(vi)の終了時に得られた高分子量のC5エピマー化N,O-硫酸K5を低分子化することによって実施される。もちろん、原料として、任意に予め精製したK5の低分子量フラクションを使用する場合、低分子量C5エピマー化N,O-硫酸K5を調製するためには、このよう低分子化は不要である。
【0052】
低分子化は、最終生成物として、鎖の少なくとも80%が約2,000〜約10,000の分子量分布(平均分子量約4,000〜約8,000)を有するものである鎖混合体でなるグリコサミノグリカンを得るために、ヘパリンの低分子化に関する公知の方法に従って、例えば、亜硝酸及び続く水素化ホウ素ナトリウムでの還元(WO 82/03627, EP 37319)により、過ヨウ素酸ナトリウム(EP 287477)により、フリーラジカル(EP 121067)により又はβ-除去(EP 40144)により行われる。
【0053】
本発明の方法によって得られたグリコサミノグリカンについて、プロトンおよび13炭素NMRによって及び抗-Xa、aPTT、HCII、抗-IIa及びATIIIに関する親和性のような生物学的テストよって、その特性を決定する。既に述べたように、硫酸化度、すなわち、多糖体単位当たりの硫酸基の数(硫酸基/カルボキシル基の比(SO3 -/COO-)として表される)は、Casuら, Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176に記載のようにして決定される。
【0054】
工程(vi)の終了時に得られた生成物を、何ら低分子化を行うことなく、樹脂上でのクロマトグラフィー又は限外濾過によって分画して、2,000〜8,000Dの低分子量フラクション及び25,000〜30,000Dの高分子量フラクションを得る。
【0055】
本発明の方法の終了時に得られる新規なC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカンは、一般に、ナトリウム塩の形で単離される。このナトリウム塩は、他の塩に変換される。このような他の塩は、他のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属、アンモニウム、トリ(C1−C4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛塩である。
【0056】
本発明の方法によって得られた生成物は、抗-Xaテストにおいて、抽出ヘパリンに匹敵する活性及び低減された全体的抗凝固活性(aPTT法)を示すと共に、トロンビンの阻害性、ヘパリン共同因子II(HCII)及び抗-IIa活性を含むテストの値は標準ヘパリンのものと同程度か、又は明らかに高いものである。得られた生成物のこれらの特性は、市販ヘパリン及び他の公知の抗凝固グリコサミノグリカンのものよりも良好な凝固制御特性及び抗血栓特性、及びより小さい副作用(例えば、出血性)を予測させるものである。
【0057】
このように、本発明の他の目的は、(i)K5をN-脱アセチル化剤と反応させ、ついで、N-脱アセチル化生成物をN-硫酸化剤と反応させ;(ii)このようにして得られたN-硫酸K5を、グルクロノシルC5エピメラーゼによってC5エピマー化して、イズロン酸/グルクロン酸の比が60/40〜40/60であるC5エピマー化N-硫酸K5を生成し;(iii)総ウロン酸に対するイズロン酸の含量40〜60%を有するC5エピマー化N-硫酸K5を、その第3級又は第4級塩に変換し、ついで、このようにして得られた塩を、O-硫酸化剤と、非プロトン性の極性溶媒中、温度40〜60℃において、10〜20時間反応させ;(iv)このようにして得られたO-過硫酸化生成物の有機塩基との塩を、ジメチルスルホキシド/メタノール混合物にて、50〜70℃において135〜165分間処理し;(v)このようにして得られた部分的O-脱硫酸化生成物の有機塩基との塩を、O-硫酸化剤にて、0〜5℃において処理し;(vi)このようにして得られた生成物をN-硫酸化剤にて処理し;工程(ii)〜(vi)のいずれかの終了時に得られた生成物を、任意に、低分子化し、最終生成物のナトリウム塩を、任意に、他の塩に変換することを包含してなる方法によって得られる新規なC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカンを提供することにある。
【0058】
特に有利なC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカンは、工程(iv)を、ジメチルスルホキシド/メタノールの9/1(V/V)混合物中、約60℃において約150分間で行う上記方法によって得られるものである。
【0059】
K5から誘導される好ましい種類のグリコサミノグリカンは、予め精製したK5について上記工程(i)〜(vi)を行い(これによって、工程(iv)は、ジメチルスルホキシド/メタノールの9/1混合物中、約60℃において約150分間加熱することによって行われる)、このようにして得られたC5エピマー化N,O-硫酸K5を、任意に、亜硝酸での低分子化及び続く水素化ホウ素ナトリウムでの還元に供することによって得られる。
【0060】
好適には、上記の他の塩は、他のアルカリ金属又はアルカリ土類金属、アンモニウム、トリ(C1〜C4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又亜鉛塩である。
【0061】
上記工程(i)〜(vi)でなり、任意の低分子化及び塩の形成を含む方法に従って得られるC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカンは、下記に示す構造(I)を有する。
【0062】
このように、本発明の他の目的は、鎖混合体によって構成されるグリコサミノグリカンであって、鎖の少なくとも90%が、式I
【化2】
(式中、ウロン酸単位の40〜60%がイズロン酸のものであり;nは3〜100の整数であり;R、R1、R2及びR3は水素原子又はSO3 -基であって、R、R1、R2及びR3の約65〜約50%は水素であり、残りは、次のように分布するSO3 -基であり:R3はSO3 -基約85〜約95%であり:R2はSO3 -基約17〜約21%であり:R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約15〜約35%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜5%であり:Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約20〜約40%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜5%であり:R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計は3〜7%であり;R1及びRは、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の25〜45%において、共に水素であり;硫酸化度は約2.3〜約2.9であり;対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである)で表されるものである新規なグリコサミノグリカンを提供することにある。
【0063】
この明細書において、表現「化学的に許容される」とは、例えば、アンモニウム又はトリ(C1〜C4)アルキルアンモニウムイオンのような化学合成に有用な又は生成物の精製に有用なカチオンをいう。
【0064】
好適には、R、R1、R2及びR3の約60〜約55%が水素であり、残りが、硫酸化度約2.4〜約2.7のためのSO3 -基である。
【0065】
有利な低分子量グリコサミノグリカンは、鎖の少なくとも80%が、式I(式中、nは3〜15である)を有するものである鎖混合体で構成される。
【0066】
これらの低分子量グリコサミノグリカンの中でも、鎖混合体が約2,000〜約10,000の分子量分布(平均分子量約4,000〜約8,000)を有するものであるグリコサミノグリカンが特に好適である。
【0067】
この種の好適なグリコサミノグリカンは、平均分子量約6,000〜約8,000をもつ鎖混合体(ここで、鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり、R3はSO3 -基約85〜約90%であり;R2はSO3 -基約20%であり;R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約25〜約30%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約30〜約35%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計が約5%であり;R1及びR2は、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の約30〜約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約2.5〜約2.7であり;対応するカチオンが化学的又は薬学上許容されるものである)を有するものである)で構成される。
【0068】
この種の特に好適な低分子量グリコサミノグリカンは、平均分子量約7,000をもつ鎖混合体(ここで、鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり、R3はSO3 -基約85%であり;R2はSO3 -基約20%であり;R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約25%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約30%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計が約5%であり;R1及びR2は、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約2.55であり;対応するカチオンが化学的又は薬学上許容されるものである)を有するものである)で構成される。
【0069】
グルクロン酸部の3位及びイズロン酸部の2位における硫酸基の百分率は、工程(iv)後に得られる化合物について13C-NMRを行い、それぞれ、3-O-スルホ-グルクロン酸単位及び2-O-スルホ-イズロン酸単位による83及び62ppmにおけるピークの面積を測定し、硫酸基の総量に関して、工程(vi)において添加されたSO3 -基の百分率が無視できるものであることを考慮することによって決定される。
【0070】
有利な化学的及び薬学上許容されるカチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、トリ(C1〜C4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又亜鉛に由来のものであり、ナトリウム及びカルシウムイオンが特に好適である。
【0071】
有利な高分子量グリコサミノグリカンは、鎖混合体(ここで、鎖の少なくとも80%が、式I(式中、nは20〜100である)を有するものである)で構成される。
【0072】
これらのグリコサミノグリカンの中でも、鎖混合体が分子量分布約9,000〜約60,000(平均分子量約12,000〜約30,000)を有するものあるグリコサミノグリカンが好ましい。
【0073】
この種の特に好適な高分子量グリコサミノグリカンは、平均分子量14,000〜16,000をもつ鎖混合体(ここで、鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり、R3はSO3 -基約85〜約90%であり;R2はSO3 -基約20%であり;R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約25〜約30%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約30〜約35%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計が約5%であり;R1及びR2は、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の約30〜約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約2.5〜2.7であり;対応するカチオンは化学的又は薬学上許容されるものである)を有するものである)で構成される。好適な平均分子量は約15,700である。
【0074】
連続する上記工程(i)〜(vi)を包含してなり、任意の低分子化及び塩の形成を含む方法によって得られる新規なグリコサミノグリカン、特に、鎖混合体(ここで、鎖の少なくとも90%が、式I(式中、R、R1、R2及びR3は、上記に定義したとおりである)を有するものであり、対応するカチオンが、化学的又薬学上許容されるもの、好ましくは、ナトリウム又はカルシウムイオンである)を有するものである)で構成されるグリコサミノグリカンは、凝固パラメーターに関する興味深い生物学的活性を示す。特に、前記の新規なグリコサミノグリカンは、標準ヘパリンと少なくとも同程度の抗-Xa及びHCII活性、標準ヘパリンよりも高い抗-IIa(アンチトロンビン)活性、及び標準ヘパリンよりも低い全体的抗凝固活性(aPTT力価として表示)を発揮する。さらに詳述すれば、新規なグリコサミノグリカンは、1.5〜3の抗-Xa/aPTT比、HCII/aPTT比及び抗-IIa/抗-Xa比及び1〜3のHCII/抗-Xa比を示す。
【0075】
その特性のため、本発明のグリコサミノグリカンは、凝固の制御及び血栓症の治療、特に血栓症の予防又は治療のために、単独で又は許容されるキャリヤー又は稀釈剤と組み合わせて使用される。
【0076】
従って、本発明の他の目的は、有効成分として、上記のように、任意の低分子化及び薬学上許容される塩の生成を含め、上記工程(i)〜(vi)を実行する方法に従って得られるC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカンの薬理的に有効な量を、薬学上許容されるキャリヤー又は稀釈剤と組み合わせて含有してなる医薬組成物を提供することにある。
【0077】
好ましくは、有効成分は、上記工程(i)〜(vi)に従い、予め精製したK5を出発原料として、工程(iv)を、ジメチルスルホキシド/メタノールの9/1(V/V)混合物中、約60℃において約150分間で行い、工程(vi)の終了時に得られるC5エピマー化N,O-硫酸K5を低分子化する共に、薬学上許容される塩を形成することによって得られる。好ましくは、このようにして得られるC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカン有効成分は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は亜鉛塩の形である。
【0078】
特に、本発明は、鎖混合体(ここで、鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の40〜60%がイズロン酸のものであり;nは3〜100の整数であり;R、R1、R2及びR3は水素原子又はSO3 -基であって、R、R1、R2及びR3の約65〜約50%は水素であり、残りは、次のように分布するSO3 -基であり:R3はSO3 -基約85〜約95%であり:R2はSO3 -基約17〜約21%であり:R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約15〜約35%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜5%であり:Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約20〜約40%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜5%であり:R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計は3〜7%であり;R1及びRは、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の25〜45%において共に水素であり;硫酸化度は約2.3〜約2.9であり;対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである)を有するものである)で構成されるグリコサミノグリカンの薬理的に有効な量を有効成分とし、及び薬学上許容されるキャリヤーを含有してなる医薬組成物を提供する。
【0079】
さらに詳述すれば、上記組成物は、凝固の制御又は血栓症の予防又は治療に使用される。
【0080】
上記医薬組成物において、静脈内、皮下又は局所適用のために、グリコサミノグリカン有効成分は、凝固システムの障害によって生ずる疾患、例えば、動脈又は静脈血栓症の予防又は治療、血腫の治療、又は外科手術の間における凝固調節剤として有効な用量で存在する。
【0081】
静脈内又は皮下適用のための調製物では、グリコサミノグリカン有効成分は、必要であれば緩衝剤の存在下、水に溶解され、この溶液は、殺菌条件下、バイアル又は注射器内に導入される。
【0082】
医薬組成物の単位用量は、水0.1〜2mlに溶解した有効成分5〜100mg、有利には20〜50mgを含有する。
【0083】
局所適用のための組成物では、グリコサミノグリカン有効成分は、ゲル、クリーム、軟膏、噴霧されるローション又はスプレー用溶液の調製に関して当分野で公知の薬学上許容されるキャリヤー又は稀釈剤と混合される。この組成物では、グリコサミノグリカン有効成分は、好ましくは、0.01〜15質量%の濃度で存在する。
【0084】
有利な医薬組成物は、有効成分として、既に説明したような式Iで表される鎖混合体(ここで、対イオンが薬学上許容されるもの、有利には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム及び亜鉛イオンでなる群から選ばれるカチオン、好ましくは、ナトリウム又はカルシウムイオンである)で構成されるグリコサミノグリカンの薬理的に有効な量、及び薬学上許容されるキャリヤーを含有してなる。
【0085】
これらの有利なグリコサミノグリカンの中でも、式I(式中、nは3〜15又は20〜100である)を有する鎖少なくとも80%を含有するものが好ましい有効成分であり、特に、鎖混合体が、分子量分布約2,000〜10,000(平均分子量約4,000〜約8,000)、又は分子量分布約9,000〜約60,000(平均分子量約12,000〜約30,000)を有するものであるグリコサミノグリカンが好ましい。
【0086】
特に有利な医薬組成物は、低分子化された鎖混合体で構成され、前記鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の40〜60%がイズロン酸のものであり;nは3〜100の整数であり;R、R1、R2及びR3は水素原子又はSO3 -基であり、R、R1、R2及びR3の約65〜約50%は水素であり、残りは、次のように分布するSO3 -基であり:R3はSO3 -基約85〜約95%、好ましくは約85%であり;R2はSO3 -基約17〜約21%、好ましくは約20%であり;R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約15〜約35%、好ましくは約25%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜5%であり;Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約20〜約40%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜5%であり;R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計は3〜7%であり;R1及びRは、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の25〜45%において共に水素であり;硫酸化度は約2.3〜約2.9、好ましくは約2.4〜約2.7であり;対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである)で表されるものであるグリコサミノグリカンであって、前記低分子化された鎖の混合体が、分子量分布約2,000〜約10,000及び平均分子量約4,000〜約8,000をもつ鎖少なくとも80%を含有するものであるグリコサミノグリカンを有効成分として含有する。
【0087】
有利な医薬組成物は、平均分子量約6,000〜約8,000をもつ鎖混合体で構成され、前記鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり;R3はSO3 -基約85〜約90%であり;R2はSO3 -基約20%であり;R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約25〜約30%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約30〜約35%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計は約5%であり;R1及びRは、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の約30〜約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約2.5〜約2.7であり;対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである)を有するものであるグリコサミノグリカンを有効成分として含有する。
【0088】
この種の好適な低分子量グリコサミノグリカン有効成分は、平均分子量約7,000を有する鎖混合体であって、前記鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり;R3はSO3 -基約85%であり;R2はSO3 -基約20%であり;R1は、イズロン酸単位においてSO3 -基約25%及びグルクロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;Rは、グルクロン酸単位においてSO3 -基約30%及びイズロン酸単位においてSO3 -基0〜約5%であり;R1、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO3 -基の百分率の総計が約5%であり;R1及びRは、同時にSO3 -基であることはなく、ウロン酸単位の約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約2.55であり;対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである)を有するものである鎖混合体で構成される。特に好適なグリコサミノグリカン有効成分は、これら特性を有するものであって、平均分子量約7,400をもつ。
【0089】
最後に、本発明は、凝固の制御及び血栓症の治療のための前記グリコサミノグリカンの有効量に関する。
【0090】
このように、本発明の他の目的は、哺乳動物において凝固を制御する、又は血栓症を予防又は治療する方法において、凝固の制御又は血栓症の予防又は治療が必要な哺乳動物に、任意の低分子化及び薬学上許容される塩の形成を含め、上記工程(i)〜(vi)が行われる方法に従って得られるC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカンの薬理学的に有効な量を投与することを特徴とする哺乳動物における凝固の制御又は血栓症の予防又は治療の方法を提供することにある。
【0091】
さらに詳述すれば、上記方法は、前記哺乳動物に、鎖混合体で構成されるグリコサミノグリカンであって、前記鎖の少なくとも90%が、既に説明し、定義した式Iを有するものであるグリコサミノグリカンの薬理学的に有効な量を投与することを包含する。
【0092】
好ましくは、本発明の方法は、哺乳動物に、上述の医薬組成物の薬理学的に有効な用量を投与することを包含する。
【0093】
下記の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明はこれらに限定されない。
【0094】
実施例において、グリコサミノグリカンの分子量及び生物学的活性の代表的な特性を、分別していないヘパリン(第4の国際基準)及び低分子量ヘパリン(第1の国際基準)と比較して説明する。
【0095】
分子量、特に平均分子量は、Harenberg及びDe Vries, J. Chromatography, 1983, 261, 287-292に従い、シングルカラム(Pharmacia 75HR)又は2個のカラム(BioRad Bio-sil SEC 250)を使用して算定した。最終生成物の分子量は、本発明の方法の反応条件のため、原料の多糖体のものと相違していてもよい。
【0096】
抗-Xa活性については、ヘパリンの第4の国際基準に対して、D.P. Thomasら, Thrombosis and Haemosatasis, 1981, 45, 214に従って測定した。
【0097】
全体的抗凝固活性に関するaPTTテストについては、Anderssonら, Thrombosis Reserach, 1976, 9, 575に従って実施した。
【0098】
HCII活性に関するテストを、水に溶解したHCII(Stago)の0.05PEU(血漿当量単位)/mlの溶液20μlを、異なる濃度の検査サンプルの溶液80μl、及び0.15M HCl及び0.1% PEG-6,000を含有する0.02M tirs緩衝液(pH7.4)におけるトロンビン(0.18 U/ml;Boehringer)50μlと混合することによって実施した。溶液を、37℃において60秒間培養し、ついで、1mM 色素産生基質 Spectrozyme(American Diagnostic)50μlを添加する。自動凝固計 ACL 7000(Instrumentation Laboratory)を使用し、405nmにおいて毎秒毎に測定して、反応を180秒間連続して記録する。
【0099】
抗-IIaテストについては、0.1M tris緩衝液(pH7.4)に溶解したATIII(Chromogenix)0.5U/mlの溶液30μlを、異なる濃度の検査サンプルの溶液30μl、及び0.1M tirs緩衝液(pH7.4)におけるトロンビン60μl(5.3nKat(酵素活性の単位)/ml;Chromogenix)と混合することによって実施した。溶液を、37℃において70秒間培養し、ついで、0.5mM 色素産生基質 S-2238(Chromogenix)水性液60μlを添加する。自動凝固計 ACL 7000(Instrumentation Laboratory)を使用し、405nmにおいて毎秒毎に測定して、反応を90秒間連続して記録する。
【0100】
ATIIIに関する親和性を、Hookら, FEBS Letters, 1976, 66, 90-93に従って測定した。
【0101】
【実施例1】
イタリー国特許出願第 MI 99A001465号(WO 01/02597)に記載の発酵によって得られた純度80%(図2)の多糖体K5 10gを脱イオン水に溶解して、1%溶液を得た。Triton X-100を添加して濃度5%とし、撹拌下、溶液を55℃に2時間に維持した。溶液を75℃とし、均質な濁った系が得られるまで、この温度に維持し、ついで、液を室温に迅速に冷却させた。冷却の間に、2相が形成された。上相(有機相)について、前記熱的処理を2回繰り返し実施した。K5を含有する水性相を、減圧下、最終的に1/10に濃縮し、アセトン又はエタノールによって沈澱処理した。有機相については廃棄した。
【0102】
得られた生成物は、純度90%(基準のスペクトル(図1)と比較してプロトンNMR(図3)によって検出した)及び2個のカラム(BioRad Bio-sil SEC 250)を使用するHPLC分析における保持時間9分をもつK5であった。
【0103】
方法を下記の工程に従って実施した:
【0104】
(i)予め精製したK5を、2N水酸化ナトリウム1,000mlに溶解し、60℃に18時間維持した。溶液を室温に冷却し、ついで、6N塩酸にてpHを中性とした。N-脱アセチル化K5が得られた。
【0105】
N-脱アセチル化K5を含有する溶液を40℃に維持し、炭酸ナトリウム10gを一度に添加し、ピリジン・三酸化イオウ付加物20gを10分間で添加した。反応終了時、溶液を室温に冷却し、ついで、5%塩酸溶液にてpHを7.5〜8とした。
【0106】
得られた生成物(N-硫酸K5)を、1,000Dカットオフスパイラル膜(プレプスケールカートリッジ;Millipore)を使用するダイアフィルトレーションによって塩から精製した。透過物の伝導率が100μS未満となった時点で精製プロセスを停止した。膜によって保持された生成物を、同じダイアフィルトレーションシステムを使用して10%多糖体に濃縮し、ついで、凍結乾燥させた。
【0107】
得られた生成物におけるN-硫酸/N-アセチルの比は、13C-NMRによって測定して9.5/0.5であった(図4)。
【0108】
(ii)1.不動化C5エピメラーゼの調製
WO 98/48006に従って得られた組み換えC5エピメラーゼ5g(0.1M KCl、0.1% Triton X-100及び15mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有する25mM Hepes緩衝液(pH7.4)200mlに溶解した1.2×1011cpm(分当たりの個数)に相当する)に、工程(i)に記載のようにして得られたN-硫酸K5 100mgを添加した。溶液について、透過物においてN-硫酸K5が消失するまで、4℃において、30,000D膜にてダイアフィルトレーションを行った。膜によって保持された溶液について、pH7での200mM NaHCO3に対するダイアフィルトレーションによって緩衝液を交換し、50mlに濃縮した後、CNBr活性化 Sepharose 4B樹脂50mlを添加し、4℃において一夜反応させた。反応終了時、上澄みにおける残留酵素の量を、遠心分離後、Quantigold法(Diversified Biotec)によって測定した。上澄み中には酵素は存在しておらず、これは、上記方法によって、酵素の100%が不動化されたことを示す。なお利用可能なサイトを塞ぐため、樹脂を、100mM tris(pH8)にて洗浄した。不動化酵素の活性を測定するため、理論的に1.2×107cpmに相当する量の不動化酵素をカラムに負荷した。得られたカラムにおいて、0.1M KCl、0.015M EDTA、0.01% Triton X-100を含有する25mM Hepes緩衝液(pH7.4)中に溶解させた上記工程(i)に記載のようにして得られたN-硫酸K5 1mgを、前記カラム内を、37℃において、流速0.5ml/分で一夜再循環させることによって溶解させた。
【0109】
DEAEクロマトグラフィーシステムによる精製及びSephadex G-10上での脱塩の後、サンプルを凍結乾燥し、WO 96/14425に既に記載されているようなプロトンNMRによって、イズロン酸におけるその含量を分析した。
【0110】
イズロン酸/グルクロン酸の比は30/70であった(図5)。
【0111】
2.エピマー化
N-硫酸K5 10gを、50mM CaCl2を含有する25mM Hepes緩衝液(pH7)600ml中に溶解した。得られた溶液を、不動化酵素をもつ樹脂を収容するカラム(50ml)内で再循環させた。
【0112】
この反応を、30℃において、流速200ml/時間で24時間行った。得られた生成物を、限外濾過又は沈殿によって精製した。ペレットを濃度10%で水に溶解させた。
【0113】
イズロン酸/グルクロン酸の比54/46(原料では0/100)をもつエピマー化生成物が得られた。
【0114】
エピマー化の百分率を1H-NMRによって算定した(図6)。
カルバゾール法(Bitter及びMuir, Anal. Biochem., 39, 88-92(1971))によって、基準に対してウロン酸含量を測定して算定した収率は90%であった。
【0115】
(iii)工程(ii)において得られたエピマー化生成物を含有する溶液を、冷却浴によって10℃に冷却し、ついで、IR 120 H+カチオン交換樹脂(50ml)上に負荷した。カラム及び溶離された溶液の容器の両方を10℃に維持した。溶液の通過後、樹脂を脱イオン水3容にて洗浄した。通過流体のpHは6より大である。酸性溶液を、15%水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液にて中性とした。回転エバポレーターにおいて、真空中、溶液を1/10の容積に濃縮し、凍結乾燥させた。生成物を、ジメチルホルムアミド(DMF)200ml中に懸濁化させ、DMF 200ml中に溶解したピリジン・SO3付加物150gを添加した。溶液を45℃に18時間維持した。反応終了時、溶液を室温に冷却し、塩化ナトリウム飽和アセトン1,200mlを添加した。得られたペレットを、濾過によって溶媒から分離し、脱イオン水100mlで溶解させ、塩化ナトリウムを濃度0.2Mとなるように添加した。溶液を、2N水酸化ナトリウムにてpH7.5〜8とし、アセトン300mlを添加した。ペレットを濾過によって分離した。得られた固体を、脱イオン水100mlにて溶解させ、工程(i)において記載のようなダイアフィルトレーションによって残留塩から精製した。
【0116】
乾燥させた少量の過硫酸化生成物に関する13C-NMR分析を図7に示す。
【0117】
(iv)工程(iii)の生成物を含有する溶液を、IR 120 H+カチオン交換樹脂(50ml)上を通過させた。溶液の通過後、樹脂を脱イオン水3容にて洗浄した。通過流体のpHは6より大であった。酸性溶液を、ピリジンにて中性とした。回転エバポレーターにおいて、真空中、40℃で、溶液を1/10の容積に濃縮し、凍結乾燥させた。ピリジン塩として得られた生成物に、DMSO/メタノール(9/1;V/V)溶液500mlを添加した。溶液を60℃に2.5時間維持し、ついで、脱イオン水50mlを添加し、最後に、塩化ナトリウム飽和アセトン1,650mlにて処理した。得られた固体を、工程(i)に記載のようなダイアフィルトレーションによって精製し、濃度10%の溶液を得た。
【0118】
図8に示した乾燥させた少量のサンプルについての13C-NMR分析は、アミノ糖の6位における硫酸基の含量が20%であることを示した。
【0119】
(v)工程(iv)の生成物を含有する溶液を、IR 120 H+カチオン交換樹脂(50ml)上を通過させた。溶液の通過後、樹脂を脱イオン水3容にて洗浄した。通過流体のpHは6より大であった。酸性溶液を、15%水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液にて中性とした。回転エバポレーターにおいて、真空中で、溶液を1/10の容積に濃縮し、凍結乾燥させた。テトラブチルアンモニウム塩として得られた生成物を、DMSO 200ml中に懸濁化させた。懸濁液を0℃に冷却し、DMF 100mlに溶解したピリジン・SO3付加物40gにて処理した。硫酸化剤を一度で添加した。溶液を0℃に1.5時間維持し、ついで、塩化ナトリウム飽和アセトン750mlにて処理した。
【0120】
得られた固体を、工程(i)に記載のようなダイアフィルトレーションによって精製した。
【0121】
(vi)工程(v)の溶液を、N-硫酸化のため、工程(i)に記載のように処理した。得られた生成物の乾燥した少量のサンプルに関する13C-NMRを図9に示す。得られた化合物は、平均分子量(Harenberg及びDe Vries, J. Chromatographyに従い、2個のカラム(BioRad Bio-sil SEC 250)を使用して測定)15,700、硫酸基/カルボキシル基の比2.55、イズロン酸含量54%、N-硫酸含量>90%、6-O硫酸含量85%、3-O硫酸グルコサミン含量20%、イズロン酸2-O硫酸含量25%、グルクロン酸3-O硫酸含量30%、O-二硫酸化ウロン酸単位なし、非硫酸化ウロン酸単位含量約40%を示した。硫酸基/カルボキシル基の比2.55を考慮すると、差によって、2-O硫酸グルクロン酸及び3-Oイズロン酸単位に硫酸基約5%が存在することが算定される。さらに、得られた化合物は、ATIII高親和性フラクション55%を含有し、次のインビトロ抗凝固活性(標準ヘパリンのもの(100として)と比較して):抗-Xa 157;aPTT 78;抗-IIa 373;HCII 161を有する。
【0122】
【実施例2】
実施例1の工程(vi)の終了時に得られたC5エピマー化N,O-硫酸K5を、WO 82/03627に記載のように、制御した条件下、亜硝酸にて低分子化した。さらに詳述すれば、サンプル5gを水250mlに溶解し、恒温浴にて4℃に冷却した。予め4℃に冷却した1N塩酸にてpHを2とし、ついで、1%亜硝酸ナトリウム溶液10mlを添加し、必要であれば、1N塩酸にてpHを2とする。混合物を緩やかな撹拌下に15分間維持し、予め4℃に冷却した1N NaOHにて溶液を中性とし、ついで、脱イオン水13mlに溶解した水素化ホウ素ナトリウム250mgを添加し、緩やかな撹拌を4時間続けた。混合物のpHを1N塩酸にて5とし、ついで、混合物を10分間撹拌下に放置して、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解させ、最後に、1N NaOHにて中和させた。生成物を、エタノール3容での沈澱及び真空オーブンでの乾燥によって回収した。図10に、このようにして得られた化合物の13C-NMRスペクトルを示す。化合物は、平均分子量 7,400、硫酸基/カルボキシル基の比2.55、イズロン酸含量54%、N-硫酸含量>90%、6-O硫酸含量85%、3-O硫酸グルコサミン含量20%、イズロン酸2-O硫酸含量25%、グルクロン酸3-O硫酸含量30%、O-二硫酸化ウロン酸単位なし、非硫酸化ウロン酸単位含量約40%を有する。硫酸基/カルボキシル基の比2.55を考慮すると、差によって、2-O硫酸グルクロン酸及び3-Oイズロン酸単位に硫酸基約5%が存在することが算定される。さらに、このようにして得られたグリコサミノグリカンは、ATIII高親和性フラクション34%を含有し、次のインビトロ抗凝固活性(標準ヘパリンのもの(100として)と比較して):抗-Xa 99;aPTT 52;抗-IIa 203;HCII 108を有する。低分子量ヘパリン(LMWH)の第1の国際基準の活性(100とする)との比較では、このようにして得られた低分子化したC5エピマー化N,O-硫酸K5グリコサミノグリカンは、次の抗凝固活性:抗-Xa 117;aPTT 173;抗-IIa 615(LMWHについては、HCIIは測定されていない)を示した。これらの結果は、このようにして得られたC5エピマー化N,O-硫酸K5に関して、
−抗-IIa/aPTT及び抗-IIa/抗-Xaの比は、標準ヘパリンのものの、それぞれ、約4倍及び約2倍であること;
−抗-IIa/aPTT及び抗-IIa/抗-Xaの比は、標準LMWHのものの、それぞれ、約3.5倍及び約5倍であること;
−HCII/aPTT及びHCII/抗-Xaの比は、標準ヘパリンのものの、それぞれ、約2倍及びほぼ同程度であること;
−抗-Xa及びHCII活性は、標準ヘパリンのものとほぼ同程度であり、aPTT活性は、標準ヘパリンのものの約1/2であることを示している。
【0123】
【実施例3】
工程(ii)において、Jin-Ping L.らによって記載された(ヘパリン及びヘパリン硫酸塩の生合成に関与するD-グルクロノシル-C5エピメラーゼの特徴付け, Journal Biological Chemistry, 2001, Vol. 276, 20069-20077)ようにして得られた組み換え酵素を使用して、実施例1の各工程を再度行った。得られた化合物は、平均分子量(Harenberg及びDe Vries, J. Chromatographyに従い、2個のカラム(BioRad Bio-sil SEC 250)を使用して測定)14,900、硫酸基/カルボキシル基の比2.7、イズロン酸含量54%、N-硫酸含量>90%、6-O硫酸含量90%、3-O硫酸グルコサミン含量20%、イズロン酸2-O硫酸含量30%、グルクロン酸3-O硫酸含量35%、O-二硫酸化ウロン酸単位なし、非硫酸化ウロン酸単位含量約30%を示した。硫酸基/カルボキシル基の比2.7を考慮すると、差によって、2-O硫酸グルクロン酸及び3-Oイズロン酸単位に硫酸基約5%が存在することが算定される。さらに、得られた化合物は、次のインビトロ抗凝固活性(標準ヘパリンのもの(100として)と比較して):抗-Xa 166;aPTT 76;抗-IIa 400;HCII 283を示す。
【0124】
さらに詳細に述べなくとも、上記の記述を使用することによって、当業者であれば、本発明を充分に活用できるものと確信する。上述の好適な具体例は、単なる説明のためのものであって、いずれにしても、発明を限定するものではない。
【0125】
上記の記載から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確信でき、その精神及び範囲を逸脱することなく、各種の利用及び条件に適合するように、本発明の各種の変化及び変更をなすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 Vann W.F.ら, 1981 European Journal of biochemistry 116, 359-364に従って得られたものであって、1H-NMRスペクトルの4.9〜5.2ppm領域にけるピークがほぼ完全に消失するまで繰り返し精製を行った基準として機能する多糖体K5の1H-NMRスペクトルを示す。
【図2】 実施例1の原料多糖体K5の1H-NMRスペクトルを示す。
【図3】 実施例1の(i)において原料として使用する精製多糖体K5の1H-NMRスペクトルを示す。
【図4】 実施例1の(i)において得られたN-硫酸K5の13C-NMRスペクトルを示す。
【図5】 実施例1の(ii-1)における不動化C5エピメラーゼの効率を表す1H-NMRを示す。
【図6】 実施例1の(ii)の終了時に得られたエピマー化生成物の1H-NMRスペクトルを示す。
【図7】 実施例1の(iii)において得られた過硫酸化化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
【図8】 実施例1の(iv)において得られたジスルフィド化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
【図9】 実施例1の(vi)において得られた化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
【図10】 実施例2において得られた低分子量化合物の13C-NMRスペクトルを示す。
Claims (32)
- 鎖混合体によって構成されるC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカンであって、前記鎖の少なくとも90%が、式I
ウロン酸単位の40〜60%がイズロン酸のものであり;
nは3〜 100 の整数であり;
R、R 1 、R 2 及びR 3 は水素原子又はSO 3 - 基であって、R、R 1 、R 2 及びR 3 の約65〜約50%は水素であり、残りは、次のように分布するSO 3 - 基であり:
‐R 3 はSO 3 - 基約85〜約95%であり、
‐R 2 はSO 3 - 基約17〜約21%であり、
‐R 1 は、イズロン酸単位においてSO 3 - 基約15〜約35%及びグルクロン酸単位においてSO 3 - 基0〜5%であり、
‐Rは、グルクロン酸単位においてSO 3 - 基約20〜約40%及びイズロン酸単位においてSO 3 - 基0〜5%であり、
‐R 1 、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO 3 - 基の百分率の総計は3〜7%である;
R 1 及びRは、同時にSO 3 - 基であることはなく、ウロン酸単位の25〜45%において、共に水素であり;
硫酸化度は約2 . 3〜約2 . 9であり;及び
対応するカチオンは、化学的又は薬学上許容されるものである)
で表されるものであることを特徴とするC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。 - 対応するカチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム又は亜鉛イオンである請求項1記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 対応するカチオンが、ナトリウム又はカルシウムイオンである請求項1記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 硫酸化度約2 . 4〜約2 . 7について、R、R 1 、R 2 及R 3 の約60〜約55%が水素であり、残りがSO 3 - 基である請求項1記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体における鎖の少なくとも80%が、式I(式中、nは3〜15である)で表されるものである請求項1記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体における鎖が、分子量分布約 2,000 〜約 10,000 及び平均分子量約 4,000 〜約 8,000 を有するものである請求項5記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体における鎖が、平均分子量約 6,000 〜約 8,000 を有し、鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり;R 3 はSO 3 - 基約85〜約90%であり、R 2 はSO 3 - 基約20%であり、R 1 は、イズロン酸単位においてSO 3 - 基約25〜約30%及びグルクロン酸単位においてSO 3 - 基0〜約50%であり、Rは、グルクロン酸単位においてSO 3 - 基約30〜約35%及びイズロン酸単位においてSO 3 - 基0〜約5%であり、R 1 、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO 3 - 基の百分率の総計が約5%であり;R 1 及びR 2 は、同時にSO 3 - 基であることはなく、ウロン酸単位の約30〜約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約2 . 5〜約2 . 7である)を有するものである請求項6記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体における鎖が、平均分子量約 7,000 を有し、鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり;R 3 はSO 3 - 基約85%であり、R 2 はSO 3 - 基約20%であり、R 1 は、イズロン酸単位においてSO 3 - 基約25%及びグルクロン酸単位においてSO 3 - 基0〜約5%であり、Rは、グルクロン酸単位においてSO 3 - 基約30%及びイズロン酸単位においてSO 3 - 基0〜約5%であり、R 1 、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO 3 - 基の百分率の総計が約5%であり;R 1 及びR 2 は、同時にSO 3 - 基であることはなく、ウロン酸単位の約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約 2.55 である)を有するものである請求項7記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体が平均分子量 7,400 を有するものである請求項8記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体における鎖の少なくとも80%が、式I(ここで、nは20〜 100 である)で表されるものである請求項8記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体が、分子量分布約 9,000 〜約 60,000 、平均分子約 12,000 〜約 30,000 を有するものである請求項10記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体における鎖が、平均分子量 14,000 〜 16,000 を有し;及び鎖の少なくとも90%が、式I(式中、ウロン酸単位の約55%がイズロン酸のものであり、R 3 はSO 3 - 基約85〜約90%であり、R 2 はSO 3 - 基約20%であり、R 1 は、イズロン酸単位においてSO 3 - 基約25〜約30%及びグルクロン酸単位においてSO 3 - 基0〜約5%であり、Rは、グルクロン酸単位においてSO 3 - 基約30〜約35%及びイズロン酸単位においてSO 3 - 基0〜約5%であり、R 1 、グルクロン酸単位における及びR、イズロン酸単位におけるSO 3 - 基の百分率の総計が約5%であり;R 1 及びR 2 は、同時にSO 3 - 基であることはなく、ウロン酸単位の約30〜約40%において、共に水素であり;硫酸化度は約2 . 5〜2 . 7である)を有するものである請求項11記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 鎖混合体が平均分子量 15,700 を有するものである請求項12記載のC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカン。
- 請求項1に記載のC5 - エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカンを製造する方法であって、
( i ) 多糖体K5をN - 脱アセチル化剤と反応させ、ついで、N - 脱アセチル化生成物をN - 硫酸化剤と反応させ;
(ii) このようにして得られたN - 硫酸K5を、グルクロノシルC5エピメラーゼによってC5エピマー化して、イズロン酸/グルクロン酸の比が60/40〜40/60であるC5エピマー化N - 硫酸K5を生成し;
(iii) 総ウロン酸に対するイズロン酸の含量40〜60%を有するC5エピマー化N - 硫酸K5を、その第3級又は第4級塩に変換し、ついで、このようにして得られた塩を、O - 硫酸化剤にて、非プロトン性の極性溶媒中、温度40〜60℃において、10〜20時間処理し;
(iv) このようにして得られたO - 過硫酸化生成物の有機塩基との塩を、ジメチルスルホキシド/メタノール混合物にて、50〜70℃において 135 〜 165 分間処理し;
( v ) このようにして得られた部分的O - 脱硫酸化生成物の有機塩基との塩を、O - 硫酸化剤にて、温度0〜5℃において処理し;
(vi) このようにして得られた生成物をN - 硫酸化剤にて処理し;
工程 (ii) 〜 (vi) のいずれかの終了時に得られた生成物を、任意に、低分子化する
ことを含むC5 - エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカンの製法。 - 原料物質として、予め精製したK5を使用する請求項14記載の製法。
- 工程 ( i ) において、N - 脱アセチル化剤として、ヒドラジン又はその塩又はアルカリ金属水酸化物を使用し、N - 硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ付加物又はトリメチルアミン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項14記載の製法。
- 工程 (ii) において、C5エピマー化を、水溶液中の又は不動化型の酵素グルクロノシルC5エピメラーゼを使用して行い、少なくとも40%のエピマー化を達成する、請求項14記載の製法。
- 工程 (ii) において、C5エピマー化を、2価カチオンの存在下、溶液中の又は不動化型の酵素グルクロノシルC5エピメラーゼを使用して行い、前記酵素が、組み換えグルクロノシルC5エピメラーゼ、マウス肥満細胞腫からのグルクロノシルC5エピメラーゼ及びウシ肝臓から抽出されたグルクロノシルC5エピメラーゼを含む群から選ばれものであり、前記2価カチオンが、Ba、Ca、Mg及びMnでなる群から選ばれるものである請求項14記載の製法。
- 不動化型の酵素によるC5エピマー化を、N - 硫酸K5 0.001 〜10g及びカチオンの1つを10〜60 mM の濃度で含有するpH6〜7 . 4の25 mM Hepes 溶液20〜 1,000ml を、不活性支持体上に不動化させた酵素1 . 2×10 7 〜3×10 11 cpm を収容するカラムを通して再循環させることによって行う請求項14、17又は18記載の製法。
- 酵素が組み換え酵素である請求項14、17〜19のいずれかに記載の製法。
- pHが約7であり、C5エピマー化を、組み換え酵素を使用して、温度約30℃、流速約 200 ml/ 時間で、溶液を約24時間再循環させることによって行う請求項19記載の製法。
- 工程 (iii) において、O - 硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項14記載の製法。
- 工程 (iv) において、反応を、ジメチルスルホキシド/メタノールの9/1 (V/V) 混合物中、約60℃において、約 150 分間行う請求項14記載の製法。
- 原料物質として、予め精製したK5を使用し、工程 (iv) において、反応を、ジメチルス ルホキシド/メタノールの9/1 (V/V) 混合物中、約60℃において、約 150 分間行う請求項14又は23記載の製法。
- 工程 ( v ) において、6 - O - 硫酸化を、O - 硫酸化剤としてピリジン・三酸化イオウ付加物を使用して、0〜5℃において行う請求項14記載の製法。
- 工程 (vi) において、N - 硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ付加物又はトリメチルアミン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項14記載の製法。
- 工程 (vi) の終了時に得られた生成物を、亜硝酸によって低分子化し、続いて、水素化ホウ素ナトリウムによって還元する請求項14記載の製法。
- 原料物質として、予め精製したK5を使用し、工程 (iv) において、反応を、ジメチルスルホキシド/メタノールの9/1 (V/V) 混合物中、約60℃において、約 150 分間行い、工程 (vi) の終了時に得られたC5エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカンを、亜硝酸によって低分子化し、続いて、水素化ホウ素ナトリウムによって還元する請求項14記載の製法。
- 得られたC5 - エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカンを、ナトリウム塩の形で単離する請求項14記載の製法。
- ナトリウム塩を、さらに、他の塩に変換する請求項29記載の製法。
- 他の塩が、他のアルカリ金属又はアルカリ土類金属、アンモニウム、トリ ( C 1 〜C 4 ) アルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛の塩である請求項30記載の製法。
- 薬学上許容されるキャリヤーと共に、有効成分として、請求項1〜13のいずれかに記載のC5 - エピマー化N , O - 硫酸K5グリコサミノグリカンの薬理学的に有効な量を、その薬学上許容される塩の形で含有することを特徴とする医薬組成物。
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