CN107727762A - 一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法 - Google Patents

一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，本发明将低分子肝素经亚硝酸降解后，进行多孔石墨化碳色谱与高分辨率质谱联用分析肝素二糖组成单元中糖醛酸的同分异构体。通过亚硝酸将低分子肝素降解成二糖单元，并通过多孔石墨化碳色谱法分离各同分异构体，再通过高分辨率质谱获取精确分子量，从而对低分子肝素完全降解的二糖单元进行分析。

Description

一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法
技术领域
本发明涉及一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，具体涉及一种将低分子肝素经亚硝酸降解后，通过多孔石墨化碳色谱与高分辨率质谱联用分析低分子肝素二糖组成单元的方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。
背景技术
肝素是糖胺聚糖家族中的一类，被应用于临床抗血栓治疗。但长期以来，肝素类药物在临床治疗过程中一直存在一定的治疗风险。而肝素经物理方法、化学方法或者酶法降解制备而成的低分子肝素不仅具有肝素的抗血栓特点，并且降低了出血的风险，从而被广泛应用，这也使得对低分子肝素进行结构表征变得更加迫切。
由于低分子肝素结构组成的不均一性，硫酸化、乙酰化程度的不稳定性、糖醛酸差向异构等的复杂性，对其进行结构表征有较大难度。对低分子肝素二糖组成单元进行分析是对其结构表征的重要方面，通常分析低分子肝素二糖单元的方法有：将肝素经肝素酶完全降解后采用亲水相互作用色谱法，具体参见Li G,et al.Journal of AnalyticalChemistry,2014,86(13):6626-6632。但低分子肝素经肝素酶完全降解后会破坏糖醛酸差向异构等信息，且以上常用的色谱法均无法分离肝素二糖组成单元中糖醛酸的同分异构体。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，通过亚硝酸降解低分子肝素后采用多孔石墨化碳色谱法，对低分子肝素二糖结构中糖醛酸的同分异构体有极高的分辨能力，从而对其进行定性分析。
发明概述
本发明将低分子肝素经亚硝酸降解后，进行多孔石墨化碳色谱与高分辨率质谱联用分析肝素二糖组成单元中糖醛酸的同分异构体。通过亚硝酸将低分子肝素降解成二糖单元，并通过多孔石墨化碳色谱法分离各同分异构体，再通过高分辨率质谱获取精确分子量，从而对低分子肝素完全降解的二糖单元进行分析。
发明详述
一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，包括步骤如下：
(1)配制肼解溶液：配制硫酸肼浓度为0.5-2％(w/w)、肼浓度为40-80％(v/v)的肼解溶液；
(2)称量一定量的低分子肝素样品，将其溶解在步骤(1)配制的肼解溶液中，低分子肝素的浓度为0.5～1mg/mL；在90-98℃下加热3-5h后，停止加热并冷却到0℃以下；在20-40℃下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，获取转干的肼解过的低分子肝素样品；
(3)配制pH值为1.5-2的HNO2试剂；
(4)将步骤(2)获取的低分子肝素样品溶解于步骤(3)获取的HNO2试剂中，低分子肝素样品的浓度为0.5～1mg/mL，冰浴振荡15～20min后，将pH值调至3.5-4.5；
(5)配制pH值为3.5-4.5的HNO2试剂；
(6)加入与步骤(4)最终获取的溶液等体积的步骤(5)配制的HNO2试剂于步骤(4)最终获取的溶液中，冰浴振荡30～40min后，将pH值调至8-10；
(7)加入与步骤(2)中称量的低分子肝素样品1-2倍质量的硼氢化物溶液于步骤(6)最终获取的溶液中；25-50℃下还原8～12h；
(8)将步骤(7)最终获取的溶液的pH值调至3-5后，反应15～20min后，再将溶液的pH调至中性，获得HNO2降解后的低分子肝素样品；
(9)采用G-10色谱法进行一次脱盐，一次脱盐完成后进入步骤(10)或步骤(11)；
(10)通过GPC色谱法进行二次脱盐，二次脱盐完成后进入步骤(12)；
(11)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(9)脱盐后的经过HNO2降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；
配制流动相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5-6；
配制流动相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水调pH至5-6；
用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100-200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：
0～30min，100％流动相A；30-34min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；34～90min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～115min，100％流动相A；进入步骤(13)；
(12)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(10)脱盐后的经过HNO2降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；
配制流动相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5-6；
配制流动相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水调pH至5-6；
用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100-200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：
0～4min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；4～60min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；60～70min，100％流动相B；70～85min，100％流动相A；进入步骤(13)；
(13)在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；
(14)根据步骤(13)中获得的高分辨质谱图，并按照不同结构形式的质荷比，得到提取离子流图；
(15)通过质荷比的数值确定组分分子式，解析该组分的质谱MS/MS信息对不同组分的硫酸基团进行位置归属，确定各峰结构。
以往亚硝酸降解法只应用于分析肝素或者硫酸乙酰肝素，本发明将亚硝酸降解法与PGC色谱与质谱联用技术结合，应用于分析低分子肝素，使得对低分子肝素药物的分析检测更加全面。
根据本发明优选的，所述步骤(1)，配制肼解溶液，包括步骤如下：将硫酸肼溶解于去离子水中，再加入无水肼，配制硫酸肼浓度为1％(w/w)，肼浓度为60％(v/v)的肼解溶液。
硫酸肼浓度、肼浓度的选取，可以使反应在尽可能短的时间内反应完全，节约试剂用量。
根据本发明优选的，所述步骤(2)，在室温下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，包括步骤如下：通风橱中通过空气流使肼蒸发后，反复蒸发转干，彻底除去残留肼。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，配制pH值为1.5的HNO2试剂，步骤包括：用浓度为0.5～1.0M H2SO4溶液将等浓度的Ba(NO)2溶液的pH调至1.5。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，调pH值的碱性pH调节剂为0.5～1M NaOH；所述步骤(6)中，调pH值的碱性pH调节剂为2MNaOH；所述步骤(8)中，调pH值的酸性pH调节剂为醋酸；调pH值的碱性pH调节剂为2MNaOH。
根据本发明优选的，所述硼氢化物溶液为NaBH4溶液。
根据本发明优选的，所述步骤(9)中，采用G-10色谱法进行一次脱盐，包括步骤如下：
100％的去离子水作为流动相；
将步骤(8)获取的HNO2降解后的低分子肝素样品溶于水配成1～2mg/mL的待测溶液，用G-10色谱柱，流速为0.8-1.2mL/min，使用紫外检测器，利用HNO2降解后的低分子肝素样品在232nm处的特征吸收来检测其保留时间，使用示差检测器检测盐的保留时间；以便更准确的对样品进行脱盐。
用0.4～1.0mg/mL的肝素二糖标准品的色谱图确定肝素二糖出峰时间，按照二糖保留时间及盐峰时间对1～2mg/mL的待测溶液进行脱盐、转干。
通过对样品进行脱盐，可以在后续用质谱对亚硝酸降解的低分子肝素进行分析时，信噪比更高，检测灵敏度更好。
根据本发明优选的，所述步骤(10)中，通过GPC色谱法进行二次脱盐，包括步骤如下：
0.2M的NH4HCO3作为流动相：
将步骤(9)获取的经过一次脱盐后的溶液作为待测溶液，用GPC色谱柱，流速0.4mL/min，使用紫外检测器，利用HNO2降解后的低分子肝素样品在232nm处的特征吸收来检测其保留时间，使用示差检测器检测盐的保留时间；以便更准确的对样品进行脱盐，减少样品损失。
用0.4～1.0mg/mL的肝素二糖标准品的色谱图确定肝素二糖出峰时间，按照二糖保留时间及盐峰时间对1～2mg/mL的待测溶液进行脱盐、转干，进入步骤(12)；
通过GPC二次脱盐，尽可能的除去了产物中的盐杂质，保护仪器，提高了质谱检测的灵敏度。
根据本发明优选的，所述步骤(13)中，所述高分辨质谱仪为线性离子阱轨道阱高分辨质谱仪，型号为LTQ-Obitrap-XL，设定参数如下：负离子模式喷雾电压：4.2KV；鞘流气流速：20arb；辅助气流速：5arb；毛细管电压：-40V；镜筒透镜电压：-50V；毛细管温度：275℃；扫描质量范围：240～800。
本发明的有益效果为：
1、本发明可以检测低分子肝素二糖单元中糖醛酸的同分异构体、硫酸基取代情况，解决了现有技术中无法检测低分子肝素二糖单元中糖醛酸同分异构体的问题，使得对低分子肝素的检测分析更加全面，对于保障药品安全具有重要意义。
2、本发明可以使用液质联用技术，使得检测的灵敏度更高，可以对组分进行相对定量，结构表征更加完善准确。
3、相较于其他常规检测方法，本发明使用微量样品即可完成相关检测。
附图说明
图1(a)为实施例1中分子量为340.1006的GlcA/IdoA-aManR的质谱图；
图1(b)为实施例1中分子量为420.0574的GlcA/IdoA-aMan(6S)R/GlcA/IdoA(2S)-aManR的质谱图；
图1(c)为实施例1中分子量为500.0142的GlcA/IdoA(2S)-aMan(6S)R的质谱图；
图1(d)为实施例1中分子量为402.0468的ΔUA-aMan(6S)R/ΔUA(6S)-aManR的质谱图；
图1(e)为实施例1中分子量为482.0036的ΔUA(2S)-aMan(6S)R的质谱图；
图2为实施例1中欧洲市售药依诺肝素钠经亚硝酸降解后产物的提取离子流图；
图3(a)为实施例2中分子量为340.1006的GlcA/IdoA-aManR的质谱图；
图3(b)为实施例2中分子量为420.0574的GlcA/IdoA-aMan(6S)R/GlcA/IdoA(2S)-aManR的质谱图；
图3(c)为实施例2中分子量为500.0142的GlcA/IdoA(2S)-aMan(6S)R的质谱图；
图3(d)为实施例2中分子量为402.0468的ΔUA-aMan(6S)R/ΔUA(6S)-aManR的质谱图；
图3(e)为实施例2中分子量为482.0036的ΔUA(2S)-aMan(6S)R的质谱图；
图4为实施例2中美国市售药依诺肝素钠经亚硝酸降解后产物的提取离子流图
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步限定，但不限于此。
实施例1
一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，包括步骤如下：
(1)配制肼解溶液：将硫酸肼溶解于去离子水中，再加入无水肼，配制硫酸肼浓度为1％(w/w)，肼浓度为70％(v/v)的肼解溶液；
(2)将100μg低分子肝素依诺肝素钠(欧洲市售药)溶解在200μL步骤(1)配制的肼解溶液中，使其浓度为0.5mg/mL；在95℃下加热5h后，在冰水浴中使反应冷却停止；在25℃下，通风橱中通过空气流使肼蒸发后，反复蒸发转干，彻底除去残留肼。
(3)配制pH值为1.5的HNO2试剂：用浓度为0.5M H2SO4溶液将0.5M的Ba(NO)2溶液的pH调至1.5；
(4)将步骤(2)获取的低分子肝素样品溶解于200μL步骤(3)获取的HNO2试剂，冰浴振荡15min后，用1M NaOH将pH调至4；
(5)配制pH值为4.0的HNO2试剂：用0.5M H2SO4溶液将5.5M NaNO2溶液的pH调至4.0；将200μLHNO2(pH 4.0)试剂加入步骤(4)的溶液中，冰浴振荡，反应30min后，用2M NaOH将pH调至10以终止反应；
(6)再加入4μL的50mg/mL NaBH4溶液，25℃下还原12h；
(7)使用醋酸将溶液pH调至4.0，反应15min，再使用2M NaOH将pH调至7.0；
欧洲市售药依诺肝素钠经亚硝酸降解之后形成的主要结构的化学结构如下所示：
(8)用G-10色谱法进行脱盐：100％的去离子水作为流动相，
将经HNO2降解后的依诺肝素钠样品溶于水配成1mg/mL的待测溶液，用G-10色谱柱，流速为1mL/min，使用紫外检测器，利用降解后的依诺肝素钠样品在232nm处的特征吸收来检测其保留时间，使用示差检测器检测盐的保留时间；以便更准确的对样品进行脱盐。
用0.4mg/mL的肝素二糖标准品的色谱图确定肝素二糖出峰时间，按照二糖标准品出峰时间及盐峰时间对待测溶液进行接样、冻干。
通过对样品进行脱盐，可以在后续用质谱对降解的低分子肝素进行分析时，信噪比更高，检测灵敏度更好。
(9)用GPC色谱法进行二次脱盐：
0.2M的NH4HCO3作为流动相：
将步骤(8)获取的经过一次脱盐后的溶液作为待测溶液，用GPC色谱柱，流速0.4mL/min，使用紫外检测器，利用经亚硝酸降解后的依诺肝素钠样品在232nm处的特征吸收来检测其保留时间，使用示差检测器检测盐的保留时间；以便更准确的对样品进行脱盐，减少样品损失。
用0.4mg/mL的肝素二糖标准品的色谱图确定肝素二糖出峰时间，按照二糖保留时间及盐峰时间对待测溶液进行脱盐、转干；
(10)PGC色谱与质谱联用分析：将冻干的经亚硝酸降解的依诺肝素钠样品溶于去离子水，配制成浓度为1mg/mL的待测溶液。
配制流动相A：配制0.1％的甲酸，并用氨水调pH至5.5；
配制流动相B：配制0.1％的甲酸，90％的乙腈，用氨水调pH至5.5。用多孔石墨化碳色谱柱，流速为100μL/min。
洗脱梯度为：0～4min，100-85％流动相A，0-15％流动相B；4～60min，85％流动相A，15％流动相B；60～70min，100％流动相B；70～85min，100％流动相A；
(11)在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；高分辨质谱如采用线性离子阱轨道阱高分辨质谱仪(LTQ-Obitrap-XL)，设定参数为：负离子模式喷雾电压：4.2KV；鞘流气流速：20arb；辅助气流速：5arb；毛细管电压：-40V；镜筒透镜电压：-50V；毛细管温度：275℃；扫描质量范围：240～800；
根据步骤(11)中获得的高分辨质谱图，按照表1中不同结构形式的质荷比，得到各高分辨质谱图图1(a)-图1(e)及提取离子流图图2。图1(a)-图1(e)中，横坐标为质荷比m/z，纵坐标为相对强度Relative abundance。
表1
(12)通过质荷比的数值确定组分分子式，解析该组分的质谱MS/MS信息对不同组分的硫酸基团进行位置归属，确定各峰结构中部分峰进行归属(图2)。图2中1为IdoA(2S)-ManR，2为GlcA-Man(6S)R，3为IdoA-Man(6S)R，4为IdoA(2S)-Man(6S)R。
实施例2
一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，步骤如下：
(1)配制肼解溶液：将硫酸肼溶解于去离子水中，再加入无水肼，配制硫酸肼浓度为1％(w/w)，肼浓度为70％(v/v)的肼解溶液；
(2)将100μg低分子肝素依诺肝素钠(美国市售药)溶解在200μL肼解溶液中，使其浓度为0.5mg/mL，在95℃下加热5h后，在冰水浴中使反应冷却停止。在25℃下，通风橱中通过空气流使肼蒸发后，反复蒸发转干以彻底除去残留肼；
(3)配制HNO2(pH 1.5)试剂：用0.5M H2SO4溶液将0.5M Ba(NO)2溶液的pH调至1.5；
(4)将转干的经亚硝酸降解的低分子肝素样品溶解于200μL pH 1.5的HNO2试剂中，冰浴振荡，反应15min后，用1M NaOH将pH调至4；
(5)配制HNO2(pH 4.0)试剂：用0.5M H2SO4溶液将5.5M NaNO2溶液的pH调至4.0。将200μLHNO2(pH 4.0)试剂加入(4)的溶液中，冰浴振荡，反应30min后，用2M NaOH将pH调至10以终止反应；
(6)再加入4μL的50mg/mL NaBH4溶液，25℃下还原12h；
(7)使用醋酸将溶液pH调至4.0，反应15min。再使用2M NaOH将pH调至7.0；
(8)用G-10色谱法进行脱盐：100％的去离子水作为流动相，用G-10色谱柱，流速为1mL/min，使用紫外检测器，可以利用亚硝酸降解的低分子肝素在232nm处的特征吸收来检测样品的保留时间，使用示差检测器，可以检测盐的保留时间，以便更准确的对样品进行脱盐。
用0.4mg/mL的肝素二糖标准品的色谱图确定肝素二糖出峰时间，将HNO2降解后的依诺肝素钠样品溶于水配成1mg/mL的溶液，进样100μL，按照二糖出峰时间及盐峰时间对HNO2降解后的依诺肝素钠样品进行接样，冻干。
(9)PGC色谱与质谱联用分析：将冻干的亚硝酸降解的依诺肝素钠品溶于去离子水，配制成浓度为1mg/mL的待测溶液。
配制流动相A：配制0.1％的甲酸，并用氨水调pH至5.5；
配制流动相B：配制0.1％的甲酸，90％的乙腈，用氨水调pH至5.5。用多孔石墨化碳色谱柱，流速为100μL/min。
洗脱梯度为：0～30min，100％流动相A，30-34min,100-85％流动相A，0-15％流动相B；34～90min，85％流动相A，15％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～115min，100％流动相A；
(10)在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；
所述步骤(11)中的高分辨质谱如采用线性离子阱轨道阱高分辨质谱仪(LTQ-Obitrap-XL)，设定参数为：负离子模式喷雾电压：4.2KV；鞘流气流速：20arb；辅助气流速：5arb；毛细管电压：-40V；镜筒透镜电压：-50V；毛细管温度：275℃；扫描质量范围：240～800；
(11)根据步骤2.10中获得的高分辨质谱图，按照表2中不同结构形式的质荷比，得到各高分辨质谱图图3(a)-(e)及提取离子流图图4。图3(a)-图3(e)中，横坐标为质荷比m/z，纵坐标为相对强度Relative abundance。
表2
(12)通过质荷比的数值确定组分分子式，解析该组分的质谱MS/MS信息对不同组分的硫酸基团进行位置归属，确定各峰结构(图4)。
图4中，1为IdoA(2S)-ManR，2为GlcA-Man(6S)R，3为IdoA-Man(6S)R，4为IdoA(2S)-Man(6S)R。

Claims (9)

1.一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)配制肼解溶液：配制硫酸肼浓度为0.5-2％(w/w)、肼浓度为40-80％(v/v)的肼解溶液；
(2)称量一定量的低分子肝素样品，将其溶解在步骤(1)配制的肼解溶液中，低分子肝素的浓度为0.5～1mg/mL；在90-98℃下加热3-5h后，停止加热并冷却到0℃以下；在20-40℃下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，获取转干的肼解过的低分子肝素样品；
(3)配制pH值为1.5-2的HNO2试剂；
(4)将步骤(2)获取的低分子肝素样品溶解于步骤(3)获取的HNO2试剂中，低分子肝素样品的浓度为0.5～1mg/mL，冰浴振荡15～20min后，将pH值调至3.5-4.5；
(5)配制pH值为3.5-4.5的HNO2试剂；
(6)加入与步骤(4)最终获取的溶液等体积的步骤(5)配制的HNO2试剂于步骤(4)最终获取的溶液中，冰浴振荡30～40min后，将pH值调至8-10；
(7)加入与步骤(2)中称量的低分子肝素样品1-2倍质量的硼氢化物溶液于步骤(6)最终获取的溶液中；25-50℃下还原8～12h；
(8)将步骤(7)最终获取的溶液的pH值调至3-5后，反应15～20min后，再将溶液的pH调至中性，获得HNO2降解后的低分子肝素样品；
(9)采用G-10色谱法进行一次脱盐，一次脱盐完成后进入步骤(10)或步骤(11)；
(10)通过GPC色谱法进行二次脱盐，二次脱盐完成后进入步骤(12)；
(11)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(9)脱盐后的经过HNO2降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；
配制流动相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5-6；
配制流动相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水调pH至5-6；
用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100-200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：
0～30min，100％流动相A；30-34min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；34～90min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～115min，100％流动相A；进入步骤(13)；
(12)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(10)脱盐后的经过HNO2降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；
配制流动相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5-6；
配制流动相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水调pH至5-6；
用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100-200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：
0～4min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；4～60min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；60～70min，100％流动相B；70～85min，100％流动相A；进入步骤(13)；
(13)在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；
(14)根据步骤(13)中获得的高分辨质谱图，并按照不同结构形式的质荷比，得到提取离子流图；
(15)通过质荷比的数值确定组分分子式，解析该组分的质谱MS/MS信息对不同组分的硫酸基团进行位置归属，确定各峰结构。
2.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(1)，配制肼解溶液，包括步骤如下：将硫酸肼溶解于去离子水中，再加入无水肼，配制硫酸肼浓度为1％(w/w)，肼浓度为60％(v/v)的肼解溶液。
3.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(2)，在室温下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，包括步骤如下：通风橱中通过空气流使肼蒸发后，反复蒸发转干，彻底除去残留肼。
4.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，配制pH值为1.5的HNO2试剂，步骤包括：用浓度为0.5～1.0M H2SO4溶液将等浓度的Ba(NO)2溶液的pH调至1.5。
5.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，调pH值的碱性pH调节剂为0.5～1M NaOH；所述步骤(6)中，调pH值的碱性pH调节剂为2MNaOH；所述步骤(8)中，调pH值的酸性pH调节剂为醋酸；调pH值的碱性pH调节剂为2MNaOH。
6.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述硼氢化物溶液为NaBH4溶液。
7.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(9)中，采用G-10色谱法进行一次脱盐，包括步骤如下：
100％的去离子水作为流动相；
将步骤(8)获取的HNO2降解后的低分子肝素样品溶于水配成1～2mg/mL的待测溶液，用G-10色谱柱，流速为0.8-1.2mL/min，使用紫外检测器，利用HNO2降解后的低分子肝素样品在232nm处的特征吸收来检测其保留时间，使用示差检测器检测盐的保留时间；
用0.4～1.0mg/mL的肝素二糖标准品的色谱图确定肝素二糖出峰时间，按照二糖保留时间及盐峰时间对1～2mg/mL的待测溶液进行脱盐、转干。
8.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(10)中，通过GPC色谱法进行二次脱盐，包括步骤如下：
0.2M的NH4HCO3作为流动相：
将步骤(9)获取的经过一次脱盐后的溶液作为待测溶液，用GPC色谱柱，流速0.4mL/min，使用紫外检测器，利用HNO2降解后的低分子肝素样品在232nm处的特征吸收来检测其保留时间，使用示差检测器检测盐的保留时间；
用0.4～1.0mg/mL的肝素二糖标准品的色谱图确定肝素二糖出峰时间，按照二糖保留时间及盐峰时间对1～2mg/mL的待测溶液进行脱盐、转干，进入步骤(12)。
9.根据权利要求1-8任一所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(13)中，所述高分辨质谱仪为线性离子阱轨道阱高分辨质谱仪，型号为LTQ-Obitrap-XL，设定参数如下：负离子模式喷雾电压：4.2KV；鞘流气流速：20arb；辅助气流速：5arb；毛细管电压：-40V；镜筒透镜电压：-50V；毛细管温度：275℃；扫描质量范围：240～800。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020020152A1 (zh) * 2018-07-24 2020-01-30 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04135496A (ja) * 1990-09-28 1992-05-08 Seikagaku Kogyo Co Ltd グリコサミノグリカンの分析方法
WO2002050125A2 (en) * 2000-12-18 2002-06-27 Pasqua Oreste Glycosaminoglycans derived from k5 polysaccharide having high antithrombin activity and process for their preparation
CN1450076A (zh) * 2003-04-18 2003-10-22 山东大学 一种多硫酸寡糖及其制备方法
US20090023171A1 (en) * 2004-02-24 2009-01-22 Christian Viskov Method for determining specific groups constituting heparins or low molecular weight heparins
CN102676613A (zh) * 2012-05-22 2012-09-19 江南大学 一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法
CN103675144A (zh) * 2013-12-12 2014-03-26 中国海洋大学 一种化学降解肝素及检测肝素二糖组成的方法
CN103713057A (zh) * 2013-12-12 2014-04-09 中国海洋大学 一种降解硫酸乙酰肝素及检测其二糖组成的方法
CN105891343A (zh) * 2014-12-06 2016-08-24 烟台东诚药业集团股份有限公司 一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法
CN107033252A (zh) * 2017-03-14 2017-08-11 中国海洋大学 一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04135496A (ja) * 1990-09-28 1992-05-08 Seikagaku Kogyo Co Ltd グリコサミノグリカンの分析方法
WO2002050125A2 (en) * 2000-12-18 2002-06-27 Pasqua Oreste Glycosaminoglycans derived from k5 polysaccharide having high antithrombin activity and process for their preparation
CN1450076A (zh) * 2003-04-18 2003-10-22 山东大学 一种多硫酸寡糖及其制备方法
US20090023171A1 (en) * 2004-02-24 2009-01-22 Christian Viskov Method for determining specific groups constituting heparins or low molecular weight heparins
CN102676613A (zh) * 2012-05-22 2012-09-19 江南大学 一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法
CN103675144A (zh) * 2013-12-12 2014-03-26 中国海洋大学 一种化学降解肝素及检测肝素二糖组成的方法
CN103713057A (zh) * 2013-12-12 2014-04-09 中国海洋大学 一种降解硫酸乙酰肝素及检测其二糖组成的方法
CN105891343A (zh) * 2014-12-06 2016-08-24 烟台东诚药业集团股份有限公司 一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法
CN107033252A (zh) * 2017-03-14 2017-08-11 中国海洋大学 一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DALLAS L. RABENSTEIN: "Heparin and heparan sulfate: structure and function", 《NATURAL PRODUCT REPORTS》 *
MICHAEL J. BIENKOWSKI ET AL.: "Structural Characterization of the Oligosaccharides Formed by Depolymerization of Heparin with Nitrous Acid", 《THE JOURNOAFL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
REBECCA L. MILLER ET AL.: "Versatile Separation and Analysis of Heparan Sulfate Oligosaccharides Using Graphitized Carbon Liquid Chromatography and Electrospray Mass Spectrometry", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
RUBY P. ESTRELLA ET AL.: "Graphitized Carbon LC-MS Characterization of the Chondroitin Sulfate Oligosaccharides of Aggrecan", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
VANESSA LEAH GILL ET AL.: "Mass spectrometric method for determining the uronic acid epimerization in heparan sulfate disaccharides generated using nitrous acid", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
WEI WEI ET AL.: "A Comprehensive Compositional Analysis of Heparin/Heparan Sulfate-Derived Disaccharides from Human Serum", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
于广利 等: "《糖药物学》", 31 October 2012 *
傅青 等: "寡糖色谱分离研究进展", 《生命科学》 *
杜旭召 等: "低分子肝素分析及结构表征方法的研究进展", 《食品与药品》 *
田继康: "肝素寡糖与血管活性肠肽抗菌活性结构域相互作用的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020020152A1 (zh) * 2018-07-24 2020-01-30 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用
CN112005110A (zh) * 2018-07-24 2020-11-27 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用
CN112005110B (zh) * 2018-07-24 2022-11-29 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用

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