CN103675144A - 一种化学降解肝素及检测肝素二糖组成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域涉及一种化学降解肝素及检测肝素二糖组成的方法，包括如下步骤：(1)将肝素脱乙酰化，得脱乙酰肝素；(2)将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；(3)将肝素二糖用衍生试剂衍生；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。本发明化学降解法可将肝素完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且完全地得到肝素二糖的结构信息；降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低，适用范围广，适合多种肝素；检测耗时短，样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好。
Description
技术领域
本发明属于医药领域涉及一种化学降解肝素及检测肝素二糖组成的方法。
背景技术
肝素(Heparin)是一种由葡萄糖胺(GlcN)和糖醛酸((D-葡萄糖醛酸(GlcA)或L-艾杜糖醛酸(IdoA))为二糖重复单元组成的线性多糖硫酸脂，肝素分子量范围一般在3-30kDa，平均分子量15kDa。它作为一种抗凝血、抗血栓生成的药物在临床上已经使用了70多年，迄今为止还没有一种能够完全代替肝素的抗凝血和抗血栓生成药物。肝素还具有如抗炎、抗过敏、降血脂及抗动脉粥样硬化、扩张冠脉、缓解支气管筋挛、降低痰液的粘稠性、促进组织呼吸、抑制病毒活性、抗肿瘤转移以及诱导干扰素的产生等许多新的用途与功效。经研究发现，肝素抗凝血机理是通过催化抗凝血因子III(ATIII)、肝素辅助因子II等与多个凝血因子形成共价复合物以消除凝血酶活性来实现的。将肝素通过化学法、物理法或酶解法进一步降解可得到低分子肝素。低分子肝素具可皮下注射、出血可能性低、安全系数高等优点，所以目前低分子肝素是占主导地位的肝素类药物。肝素五糖——磺达肝癸钠，是第一个人工合成的肝素五糖，是目前临床使用的选择性Xa凝血因子抑制剂。
我国是肝素的生产大国，提供全世界70％的肝素原料药。2008年发生的污染肝素事件是由肝素钠中混有过硫酸化的类肝素导致的过敏反应引起，因此开发出简单可靠、引领世界的肝素二糖组成分析方法具有重大的理论与实际意义。
肝素的结构一般用二糖组成来描叙，其种IdoA2S-GlcNS6S是主要二糖，在猪肠粘膜肝素中这种二糖大约占60-70％，其他二糖有IdoA2S-GlcNS，IdoA-GlcNS6S，GlcA-GlcNS6S，GlcA-GlcNS3S，GlcA-GlcNS3S6S，GlcA-GlcNAc等。现分析肝素二糖的传统方法为酶法降解或亚硝酸降解，然后用液相色谱法(LC)或液相色谱质谱联用法(LC-MS)分析，如专利CN201110241617公开了一种用肝素酶I、II、III降解并用LC法分析依诺肝素。这三种酶具有不同的生物活性，可以切断肝素类样品中不同的糖苷键，将三者联合使用，通过强阴离子交换柱分离酶解得到的各种二糖，与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质量的标准曲线进行定量。专利CN200580009444公开了用肝素酶将肝素解聚后用LC分析。但是用酶降解肝素时，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脱水后形成结构相同的脱水的糖醛酸，从而失去了肝素中葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)的含量与结构信息，且肝素酶不能将肝素完全降解为二糖。肝素酶、强阴离子交换柱和二糖标准品都非常昂贵，并且酶容易失活，性质不稳定，检测步骤繁琐，样品消耗量大，检测时间长，分析结果的重复性差。用这种方法检测污染肝素，其中的过硫酸软骨素或硫酸皮肤素不仅不能被相应的酶降解，还会抑制肝素酶活性。专利CN200910256076公开了亚硝酸钠降解肝素的方法，亚硝酸降解法只能降解肝素中带有N-硫酸基的葡萄糖胺，不能降解肝素中带有N-乙酰基的葡萄糖胺或过硫酸软骨素或硫酸皮肤素中带有N-乙酰基半乳糖胺，因此只能得到部分二糖的结构信息。因此传统的二糖分析方法已经不能满足现在的需要，因此亟需一种能同时检测肝素及类肝素污染物的二糖组成分析方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种全面、高效、简单、稳定且成本低的化学降解肝素及类肝素污染物并检测其二糖组成的方法。
实现上述发明的技术方案是：
1.一种检测肝素二糖组成的方法，包括如下步骤：
(1)将肝素脱乙酰化，得脱乙酰肝素；
(2)将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；
(3)将肝素二糖用衍生试剂衍生；
取步骤(2)所得肝素二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。
2如权利要求1所述的一种检测肝素二糖组成的方法，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将肝素溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到93-105℃，反应2-16h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素。
3.如权利要求1所述的一种检测肝素二糖组成的方法，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将肝素溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应4h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素。
4.如权利要求1所述的一种检测肝素二糖组成的方法，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤包括：
将脱乙酰肝素浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得肝素二糖。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明方法可将肝素完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息。
(2)化学降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低。
(3)适用范围广，适合肝素、原料肝素、低分子量肝素、肝素寡糖以及污染肝素等多种肝素的检测分析。
(4)检测耗时短，可以同时对多种样品进行定量。
(5)样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好，检测限为ng级别。
附图说明
图1为肝素五糖化学降解所得二糖D8PMP衍生的LC图谱。
图2为低分子量肝素化学降解所得二糖PMP、D3PMP、D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图(B)。
图3为肝素化学降解所得二糖PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图(B)。
图4为肝素五糖化学降解所得二糖D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图(B)。
图5为肝素和污染肝素化学降解所得二糖的D3PMP和D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图(B)。
图6为肝素五糖化学降解所得二糖PMP、D3PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图(B)。
图7为原料肝素化学降解所得二糖D3NMP衍生的LC图谱。
图8为肝素五糖化学降解所得二糖NMP和D3NMP衍生的总离子流图(A)和质谱图(B)。
具体实施方式
实施例1-3肝素购自Sigma-Aldrich公司，产品编号H5515。
实例1 肝素的化学降解
(1)将1mg肝素溶于500uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应4小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰肝素溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实例2 肝素的化学降解
(1)将1mg肝素溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到93℃，反应16小时，反应完成后，冻干，除N2H4得脱乙酰肝素；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰肝素溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实例3 肝素的化学降解
(1)将1mg肝素溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到105℃，反应2小时，反应完成后，冻干，除N2H4得脱乙酰肝素；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰肝素溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uLpH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
对以上实施例的降解产物进行检测，结果见表1。
表1化学降解产物分析
结果表明，实施例1和实施例2可以将肝素完全化学降解，且实施例1比实施例3节省了75％的时间。实施例3仍有2％的聚合度大于2的寡糖产物存在。
实施例4-14中所涉及的化学降解产物的结构及简称：
实施例4-14中不同肝素二糖在质谱中检测到的质量数：
表2不同肝素二糖在质谱中检测到的质量数
实施例4-14涉及的反应机理如下：
当R＝苯环，Y＝H，Z＝H时，为PMP；Y＝D，Z＝H时，为D3PMP；Y＝H，Z＝D时，为D5PMP；Y＝D，Z＝D时，为D8PMP。当R＝萘环，Y＝H，Z＝H时，为NMP；Y＝D，Z＝H时，为D3NMP。反应式中的二糖为表2中的任意二糖。
实例4 肝素五糖化学降解所得二糖的D8PMP衍生及LC检测
肝素五糖为磺达肝癸钠(安卓)，0.5mL注射液中含磺达肝癸钠2.5mg，葛兰素史克生产，产品批号6060。
(1)取100ug肝素五糖溶于50uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应4小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素五糖。将脱乙酰肝素五糖溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应；
(2)取步骤(1)所得二糖浓缩至干并完全溶解于50uL水中，调节pH值为9，然后加入70uL0.5mol/LD8PMP于70℃条件下密封反应60min，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(3)LC分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。结果见图1。
结果显示，肝素五糖化学降解一共得到三种产物，分别是G0M9，I2M6和M6，与理论一致，且三种产物都在液相中得到了很好的分离。
实例5 低分子量肝素化学降解所得二糖的PMP、D3PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
低分子量肝素为依诺肝素(克塞)注射液，购自赛诺菲安万特公司，批号分别为514947，914699，514823。
(1)取三种不同来源的低分子量肝素1，2，3各100ug，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对三种低分子量肝素进行衍生，其中低分子量肝素1用7uL0.5mol/L PMP衍生，低分子量肝素2用7uL0.5mol/L D3PMP衍生，低分子量肝素3用7uL0.5mol/L D8PMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将三种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图2。
从图2A的总离子流图中可知，总共得到了11种降解产物。从图2B的各个二糖的质谱图可知，低分子量肝素1，2，3在二糖组成含量不同，每一个质谱图中都有三组峰，从左到右分别代表低分子量肝素1，低分子量肝素2，低分子量肝素3，计算相对丰度可知，以低分子量肝素1的所有二糖为100％，低分子量肝素2中D2M6含量为75％，G0M9含量为81％，I2M6含量为99％，G0M3含量为98％，D0M6含量为82％，G0M6含量为82％，I0M6含量为82％，I2M0含量为82％，G0M0含量为80％，I0M0含量为99％，M6含量为80％；低分子量肝素3中D2M6含量为60％，G0M9含量为62％，I2M6含量为82％，G0M3含量为63％，D0M6含量为79％，G0M6含量为65％，I0M6含量为80％，I2M0含量为61％，G0M0含量为85％，I0M0含量为78％，M6含量为80％。
实例6 低分子量肝素化学降解所得二糖的PMP衍生及LC-MS检测
低分子量肝素为速碧林注射液，购自葛兰素史克公司。
(1)取2uL速碧林注射液(102IU抗Xa因子)，含低分子量肝素100ug，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对低分子量肝素用50uL0.5mol/LPMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表3。
表3低分子量肝素化学降解所得二糖检测结果
如表3所示，速碧林是一类由化学降解得到的低分子量肝素，由9种二糖组成，在制备该低分子量肝素的过程中，富集了抗Xa因子的3-O硫酸根等二糖，如G0M9。还发现速碧林中含有一种四硫酸根的二糖I2M9(N-硫酸根在亚硝酸降解时脱去)，与用不同方法得到的依诺肝素结构不同，说明本发明方法可对不同低分子量肝素进行结构对比。根据紫外图的峰面积，可以算出各种二糖占总糖的比例，I2M9占1.3％，G0M9占1.3％，I2M6占7.5％，G0M3占0.5％，G0M6占5.5％，I0M6占3％，I2M0占10％，G0M0占0.7％，I0M0占0.1％，M6占3％。
实施例7低分子量肝素化学降解所得二糖的PMP衍生及LC-MS检测
低分子量肝素为低分子量肝素钠注射液(齐征)0.4mL/5000IU，购自齐鲁制药厂。
(1)取低分子量肝素钠注射液(齐征)2uL，含低分子量肝素100ug，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对低分子量肝素用50uL0.5mol/L PMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表4。
表4低分子量肝素钠注射液化学降解所得二糖检测结果
如表4所示，低分子肝素钠注射液(齐征)是一种国产的低分子量肝素，其二糖组成类似于速碧林，其中含有一种四硫酸根的二糖I2M9，G0M9含量也比猪肠粘膜来源的原料肝素高，说明本发明方法可对低分子量肝素和原料肝素进行结构对比。根据紫外图的峰面积，可以算出各种二糖占总糖的比例，I2M9占1.8％，G0M9占2.5％，I2M6占67％，G0M3占2.5％，G0M6占7％，I0M6占2.5％，I2M0占11％，G0M0占0.7％，I0M0占1％，M6占4％。各种二糖的比例与速碧林不同。
实例8 肝素化学降解所得二糖的PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测方法
肝素1，2，3，4均购自Sigma-Aldrich公司。
(1)取肝素1，3各100ug，取肝素2，4各80ug按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对四种肝素进行衍生，其中肝素1用50uL0.5mol/L PMP衍生，肝素2用50uL0.5mol/L D3PMP衍生，肝素3用50uL0.5mol/L D5PMP衍生，肝素4用50uL0.5mol/L D8PMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将四种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图3。
从图3A的总离子流图中可知，总共得到了8种降解产物。肝素1，3为两个平行，肝素2，4为两个平行，从图3B的各个二糖的质谱图可知，肝素1，3的平行性和重复性很好，肝素2，4的平行性和重复性很好，每一个质谱图中都有四组峰，从左到右分别代表肝素1，肝素2，肝素3，肝素4。计算相对丰度可知，肝素2，4的二糖含量为肝素1，3的80％，与加入量一致。说明该方法重复性好，并且可同时分析四种样品。
实例9肝素五糖化学降解所得二糖的D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
肝素五糖1为磺达肝癸钠(安卓)，0.5mL注射液中含磺达肝癸钠2.5mg，购自葛兰素史克，产品批号6060。
肝素五糖2为Arixtra磺达肝癸钠注射液，购自葛兰素史克，产品批号95717。
肝素五糖3为Arixtra磺达肝癸钠注射液，购自葛兰素史克，产品批号95708。
(1)取三种不同质量的肝素五糖样品1，2，3，其中已知样品2为100ug，样品1，3质量未知，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对三种肝素五糖进行衍生，其中肝素五糖1用50uL0.5mol/L D3PMP衍生，肝素五糖2用50uL0.5mol/L D5PMP衍生，肝素五糖3用50uL0.5mol/L D8PMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mmSB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将三种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图4。
从图4A的总离子流图中可知，总共得到了3种降解产物。样品2是已知含量(100ug)的肝素五糖，所以他的各个组成单元的含量都可以通过分子式计算出来，G0M9约39ug，I2M6约39ug，M6约22ug。从图4B的各个二糖的质谱图可知，肝素五糖1，2，3的二糖组成含量不同，每一个质谱图中都有三组峰，从左到右分别代表肝素五糖1，肝素五糖2，肝素五糖3，计算相对丰度可知，以肝素五糖2的所有二糖为100％，肝素五糖1中G0M9只有样品2中G0M9含量(39ug)的10％，即样品1中G0M9有3.9ug。I2M6含量为11％，是4.3ug，M6含量为12％，是2.6ug；肝素五糖3中G0M9是样品2中G0M9含量的70％，是27ug，I2M6含量为71％，是28ug，M6含量为68％，是15ug。
实例10肝素和污染肝素化学降解所得二糖的D3PMP和D8PMP衍生及LC-MS检测
污染肝素来源于2008年污染肝素事件后美国药监局提供的污染肝素。
肝素购自Sigma-Aldrich公司。
(1)取污染肝素和肝素各100ug，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对两种肝素进行衍生，其中污染肝素用50uL0.5mol/L D3PMP衍生，肝素用50uL0.5mol/L D8PMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图5。
从图5A的总离子流图中可知，总共得到了8种降解产物。从图5B的各个二糖的质谱图可知，肝素和污染肝素的二糖组成含量不同，每一个质谱图中都有两组峰，从左到右分别代表污染肝素和肝素，计算相对丰度可知，以肝素所有二糖为100％，污染肝素中I2M6含量为38％，G0M3含量为81％，G0M6含量为57％，I0M6含量为21％，I2M0含量为69％，G0M0含量为5％，I0M0含量为10000％，M6含量为208％。说明这种污染肝素中几乎不含有G0M0，而I0M0的含量很高，这与对照的肝素有很大的差别。
实施例11肝素八糖(聚合度为8的肝素寡糖)化学降解所得二糖的PMP衍生及LC-MS检测
肝素八糖购自Neoparin公司。
(1)取100ug肝素八糖，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对肝素八糖用50uL0.5mol/L PMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表5。
表5
如表5所示，肝素八糖的二糖组成类似于肝素，纯化的商品肝素八糖中并不是只有一种聚合度为8的肝素寡糖，也是一系列不同含硫酸根的八糖混合物。根据紫外图的峰面积，可以算出各种二糖占总糖的比例，I2M9占1％，G0M9占5％，I2M6占79％，G0M3占1％，G0M6占6％，I0M6占5％，I2M0占10％，各种二糖的比例与速碧林、齐征不同。
实例12肝素五糖化学降解所得二糖的PMP、D3PMP衍生及LC-MS检测
肝素五糖来源磺达肝癸钠(安卓)0.5mL注射液中含磺达肝癸钠2.5mg，购自葛兰素史克，产品批号6060，7515。
(1)取两种不同来源的肝素五糖各100ug，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例4中步骤(2)的方法对两种肝素五糖进行衍生，其中肝素五糖1用50uL0.5mol/L PMP衍生，肝素五糖2用50uL0.5mol/L D3PMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图6。
从图6A的总离子流图中可知，总共得到了3种降解产物。从图6B的各个二糖的质谱图可知，肝素五糖1，2的二糖组成含量不同，每一个质谱图中都有两组峰，从左到右分别代表肝素1和肝素2，计算相对丰度可知，以肝素五糖1的所有二糖为100％，肝素五糖2中G0M9含量为15％，I2M6含量为45％，M6含量为40％。
实例13原料肝素化学降解所得二糖的D3NMP衍生及LC检测
原料肝素取自本实验室从猪肠粘膜中提取的肝素。
(1)取100ug原料肝素，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)取步骤(1)所得二糖浓缩至干并完全溶解于50uL水中，调节pH值至8，然后加入，50uL0.5mol/LD3NMP于70℃条件下密封反应60min，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(3)LC分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液，上样量为0.02uL，流动相25％A15min，25％A30min线性增加到35％A，35％A15min，245nm检测。结果见图7。
原料肝素化学降解一共得到8种产物，分别是I2M6，G0M3，G0M6，I0M6，I2M0，G0M0，I0M0和M6，与理论一致，且8种产物都在液相中得到了很好的分离。
实例14肝素五糖化学降解所得二糖的NMP和D3NMP衍生及LC-MS检测
肝素五糖1为磺达肝癸钠(安卓)，0.5mL注射液中含磺达肝癸钠2.5mg，购自葛兰素史克。
肝素五糖2为Arixtra(Made in France)，货号95708，购自GlaxoSmithKline公司。
(1)取两种不同来源的肝素五糖1，2各100ug，按实施例4步骤(1)的方法进行反应得到化学降解产物；
(2)按实施例13中步骤(2)对两种肝素五糖进行衍生，其中肝素五糖1用50uL0.5mol/LD3NMP衍生，肝素五糖2用50uL0.5mol/LNMP衍生；
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液，上样量为0.02uL，流动相25％A15min，25％A30min线性增加到35％A，35％A15min，245nm检测。上样时将两种衍生产物量混合上样，上样量为0.02uL。色谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图8。
从图8A的总离子流图中可知，总共得到了3种降解产物。从图8B的各个二糖的质谱图可知，肝素五糖1，2的二糖组成含量不同，每一个质谱图中都有两组峰，从左到右分别代表肝素五糖2和肝素五糖1，计算相对丰度可知，以肝素五糖2的所有二糖为100％，肝素五糖1中G0M9含量为85％，I2M6含量为75％，M6含量为76％。
Claims (10)
1.一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将肝素脱乙酰化，得脱乙酰肝素；
(2)将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；
(3)将肝素二糖用衍生试剂衍生
取步骤(2)所得肝素二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。
2.如权利要求1所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将肝素溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到93-105℃，反应2-16h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素。
3.如权利要求1所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将肝素溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应4h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素。
4.如权利要求1所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤包括：
将脱乙酰肝素浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得肝素二糖。
5.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰反应步骤中肝素与N2H4·H2O溶液的质量体积比(mg/mL)为1∶0.5-1，N2H4·H2O溶液中含10％N2H4·H2SO4。
6.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤中脱乙酰肝素水溶液与亚硝酸钠水溶液、亚硝酸、氨水的体积比为1∶1∶1∶0.6。
7.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的肝素二糖与吡唑啉酮类衍生试剂的质量比为1∶6-60。
8.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)，1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)或1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)。
9.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP中的一种或任意几种联用，D3NMP、NMP中的一种或两种联用。
10.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，所述肝素包括从动物组织中提取的可用于临床抗血凝的肝素多糖或肝素原料，经降解后平均分子量低于肝素的低分子量肝素，肝素含量低于99％的污染肝素或聚合度为5-8的肝素寡糖。
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