CN103630647B

CN103630647B - 一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱质谱联用检测方法

Info

Publication number: CN103630647B
Application number: CN201310711455.XA
Authority: CN
Inventors: 迟连利; 王章杰
Original assignee: Shandong University
Current assignee: HEBEI CHANGSHAN BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: CN103630647A

Abstract

本发明涉及一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱与高分辨质谱联用检测方法。它利用反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素完全降解产物的各个组分，通过反相色谱分离样品中各组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，检测除8种常见肝素二糖以外的末端修饰结构和特殊结构例如与抗凝血相关的3-O-硫酸四糖和由剥离反应得到的三糖，从而对各低分子肝素完全降解产物的结构进行比较精细的表征。本发明解决了现有技术中仅能检测8种常见肝素二糖的问题，对于低分子肝素仿制药的研发、生产控制和保障药品安全具有极大的实用价值。

Description

一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱质谱联用检测方法

技术领域

本发明涉及一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。

背景技术

肝素是一种异质性的糖胺聚糖，具有抗凝血作用，可作为临床抗凝药物用于预防和治疗血栓性疾病。但是肝素作为抗凝血药物容易引起出血，骨质疏松症及血小板减少等副作用，因此限制了其临床应用。低分子肝素是肝素通过控制酶降解和化学降解方法制备的新型抗凝血药物，由于生产工艺不同，每种低分子肝素存在不同的末端修饰结构使其结构较肝素结构复杂。依诺肝素钠是通过碱降解肝素的苄酯衍生物制备的一类低分子肝素，对于15%-25%的糖链结构，其还原端是一个1，6-内醚结构，对于大部分糖链结构，其非还原端是一个不饱和的己糖醛酸结构；达肝素钠是通过亚硝酸降解制备的低分子肝素，对于大部分糖链结构，其还原端是一个6-O-硫酸的甘露醇结构，非还原端是一个2-O-硫酸的艾杜糖醛酸结构。目前分析低分子肝素常用的方法有毛细管电泳法，高效液相色谱法以及液质联用方法。分析低分子量肝素的常规方法首先是用肝素酶降解低分子量肝素得到肝素二糖，然后用上面的方法进行结构表征。但是通过上述方法仅能获得肝素8种常见二糖的结构分析，不能同时鉴定末端修饰结构以及特殊组成结构。而鉴定低分子肝素的末端修饰结构和特殊组成结构对其结构表征是必不可少的。

低分子肝素完全降解产物中除8种肝素二糖外，还存在特征的末端修饰结构，与抗凝血活性相关的3-O-硫酸四糖和由还原端剥离反应得到的三糖。传统的分析方法只局限于分析鉴定低分子肝素完全降解产物中8种常见肝素二糖，而末端修饰结构和特殊结构的分析鉴定对低分子肝素仿制药的研发、生产控制和保障药品安全是必不可少的。达肝素钠的非还原端是一个饱和的糖醛酸，不存在特征的UV吸收，不能用传统的分析方法进行检测，但可以通过柱前衍生方法使其结合衍生试剂从而带上荧光基团或者具有特征的UV吸收；而达肝素钠和依诺肝素钠的还原端结构都不具有还原性的半缩醛羟基，所以不能通过柱前衍生方法与衍生试剂结合，但还原端结构用肝素酶降解后在其非还原端存在不饱和双键使还原端结构在232nm处有特征吸收；因此只用UV检测或者荧光检测不能同时对低分子肝素完全酶解的所有组分进行定性分析。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱与高分辨质谱联用方法，并采用二极管阵列检测器（DAD）进行双波长检测。

发明概述

本发明利用反相色谱与高分辨质谱联用并结合柱前衍生检测低分子肝素完全降解产物的各个组分，通过反相色谱分离和高分辨质谱对样品各组分定性和定量，从而对各低分子肝素完全降解产物的结构进行精细的表征。

发明详述

一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：

（1）将醋酸铵试剂溶解于去离子水，并将pH调至3～6，制得醋酸铵浓度为20～80mM的流动相A；

（2）甲醇作为流动相B；

（3）向10～50μg含有内标的低分子肝素完全酶解样品中加入5～10μL浓度为0.1M的2-氨基吖啶酮（AMAC）溶液中，室温放置10～20min，然后再加入5～10μL浓度为1M的氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）溶液，45℃孵育2～4h，制得衍生后的样品；

（4）将步骤（3）制得的衍生后的样品用质量浓度为50%的二甲基亚砜（DMSO）溶液稀释成衍生后的样品浓度为1～5μg/μL的待测溶液，经离心后，使用C18反相色谱柱进行分离；流速0.5～1mL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

0～55min，80～98%流动相A，2～20%流动相B；55～100min，80%流动相A，20%流动相B；100～120min，50～80%流动相A，20～50%流动相B；

（5）在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

所述步骤（5）中的高分辨质谱采用离子阱时间飞行串联质谱仪（IT-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+3.6kV；负离子模式喷雾电压：-3.5kV；喷雾气流速：0.5L/min或者1.5L/min；扫描质量范围：100～1000。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的含有内标的低分子肝素完全酶解样品在30～60℃条件下真空减压干燥0.5～1h。

根据本发明优选的，所述步骤（4）中的离心，条件为室温8000～14000rpm离心5～15min。

有益效果

本发明可以同时检测低分子肝素完全降解产物中除8种常见肝素二糖外的两端修饰结构和特殊结构，例如与抗凝血活性相关的3-O-硫酸四糖和由剥离反应得到的三糖，并且可以通过内标同时对所有低分子肝素完全降解产物组分进行相对定量，解决了现有技术中仅能检测8种常见肝素二糖的问题，对于低分子肝素仿制药的研发、生产控制和保障药品安全具有极大的实用价值。

附图说明

图1、实施例1中依诺肝素钠标准品完全降解产物的总离子流图；

图2、实施例1中依诺肝素钠标准品完全降解产物组分1的高分辨质谱图；

图3、实施例1中依诺肝素钠标准品完全降解产物组分16的高分辨质谱图；

图4、实施例2中达肝素钠标准品完全降解产物的总离子流图；

图5、实施例2中达肝素钠标准品完全降解产物组分1的高分辨质谱图；

图6、实施例2中达肝素钠标准品完全降解产物组分6的高分辨质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

液相色谱仪为LC-20A液相色谱仪，检测器为二极管阵列检测器，工作站为LC solution；质谱为岛津IT-TOF型高分辨质谱，工作站为LCMS solution。

实施例1

1.1将醋酸铵溶解于去离子水，并用醋酸将pH调至5.6，制得醋酸铵浓度为40mM的流动相A；

1.2甲醇溶液作为流动相B；

1.3将依诺肝素钠标准品用肝素酶I、II和III（均购自北京艾德豪克国际技术有限公司）在25℃条件下降解48h，将含有内标的降解产物用Millipore30KDa的超滤膜过滤后真空减压干燥；

1.4向10μg真空减压干燥的依诺肝素钠完全酶解样品中加入5μL浓度为0.1M的2-氨基吖啶酮（AMAC，购自sigma公司）溶液，室温放置15min，然后再向溶液中加入5μL浓度为1M的氰基硼氢化钠（NaBH₃CN，购自sigma公司）溶液，45℃孵育4h，制得衍生后的样品；

1.5衍生后的样品用质量浓度为50%的二甲基亚砜（DMSO，购自sigma公司）稀释成衍生后的样品浓度为1μg/μL的待测溶液；

1.6使用填料粒径为5μm、色谱柱内径为4.6mm、色谱柱长度为250mm的C18反相色谱柱进行分离；流速0.6ml/min，进样量为50μL，洗脱梯度为：0～55min，80～98%流动相A，2～20%流动相B；55～100min，80%流动相A，20%流动相B；100～120min，50～80%流动相A，20～50%流动相B；

1.7使用岛津IT-TOF高分辨质谱在负离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图，设定参数为：喷雾电压：-3.5kV；喷雾气流速：1.5L/min；扫描质量范围：100～800。

1.8根据步骤1.7中获得的高分辨质谱图中获得的主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：

m=zM+zY

其中：z表示电荷数，Y表示质子氢的分子量。

1.9用步骤1.8中得到的精确分子量与理论分子量进行逐一比对，通过理论分子量的信息即可获知各寡糖组分的结构信息。总离子流图（TIC）中所标依诺肝素钠样品各组分的结构信息如表1所示。

表1

注：“n.r.”表示组分不能被AMAC标记，“ΔUA”表示不饱和糖醛酸，“GlcA”表示葡萄糖醛酸，“IdoA”表示艾杜糖醛酸，“GlcN”表示葡萄糖胺，“ManN”表示甘露糖胺，“Ac”表示乙酰基团，“S”表示硫酸基团，“NS”表示N-硫酸基团，“COEt”表示乙酯基。

依诺肝素钠完全降解组分的质谱分析总离子流图如图1，通过本方法成功检测到依诺肝素钠标准品完全降解产物中除8种常见二糖以外的末端修饰结构、3-O-硫酸四糖和三糖。

实施例2

2.1将醋酸铵溶解于去离子水，并用醋酸将pH调至5.6，制得醋酸铵浓度为40mM的流动相A；

2.2甲醇溶液作为流动相B；

2.3将达肝素钠标准品用肝素酶I、II和III（均购自北京艾德豪克国际技术有限公司）在25℃条件下降解48h，将含有内标的降解产物用Millipore30KDa的超滤膜过滤后真空减压干燥；

2.4向10μg真空减压干燥的达肝素钠完全酶解样品中加入5μL浓度为0.1M的2-氨基吖啶酮（AMAC）溶液，室温放置15min，然后再向溶液中加入5μL浓度为1M氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）溶液，45℃孵育4h，制得衍生后的样品；

2.5衍生后的样品用质量浓度为50%的二甲基亚砜（DMSO）稀释成衍生后的样品浓度为1μg/μL的待测溶液；

2.6使用填料粒径为5μm、色谱柱内径为4.6mm、色谱柱长度为250mm的C₁₈反相色谱柱进行分离；流速0.6ml/min，进样量为50μL，洗脱梯度为：0～55min，80～98%流动相A，2～20%流动相B；55～100min，80%流动相A，20%流动相B；100～120min,50～80%流动相A，20～50%流动相B；

2.7使用岛津IT-TOF高分辨质谱在负离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图，设定参数为：喷雾电压：-3.5kV；喷雾气流速：1.5L/min；扫描质量范围：100～800。

2.8根据步骤2.7中获得的高分辨质谱图中获得的主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：

m=zM+zY

其中：z表示电荷数，Y表示质子氢的分子量。

2.9用步骤2.8中得到的精确分子量与理论分子量进行逐一比对，通过理论分子量的信息即可获知各寡糖组分的结构信息。总离子流图（TIC）中所标达肝素钠样品各组分的结构信息如表2所示。

表2

注：“n.r.”表示组分不能被AMAC标记，“ΔUA”表示不饱和糖醛酸，“GlcA”表示葡萄糖醛酸，“IdoA”表示艾杜糖醛酸，“GlcN”表示葡萄糖胺，“ManN”表示甘露糖胺，“Ac”表示乙酰基团，“S”表示硫酸基团，“NS”表示N-硫酸基团，“COEt”表示乙酯基，“Mnt”表示甘露醇。

达肝素钠标准品完全降解产物的质谱分析的总离子流图如图4，通过本方法成功检测到达肝素钠标准品完全降解产物中除8种常见二糖以外的末端修饰结构、3-O-硫酸四糖和三糖。

Claims

1.一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：

（1）将醋酸铵试剂溶解于去离子水，并将pH调至5.6，制得醋酸铵浓度为40mM 的流动相A；

（2）甲醇作为流动相B；

（3）向10μg含有内标的低分子肝素完全酶解样品中加入5μL浓度为0.1M的 2-氨基吖啶酮（AMAC）溶液中，室温放置15min，然后再加入5μL浓度为1M的氰基硼氢化钠（NaBH3CN）溶液，45℃孵育4h，制得衍生后的样品；

（4）将步骤（3）制得的衍生后的样品用质量浓度为50%的二甲基亚砜（DMSO）溶液稀释成衍生后的样品浓度为1μg/μL的待测溶液，经离心后，使用C18反相色谱柱进行分离；流速0.6mL/min，检测器为二极管阵列检测器，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

0～55min，80～98%流动相A，2～20%流动相B；55～100min，80%流动相A，20% 流动相B；100～120min，50～80%流动相A，20～50%流动相B；

所述步骤（5）中的高分辨质谱采用离子阱时间飞行串联质谱仪（IT-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+3.6kV；负离子模式喷雾电压：-3.5kV；喷雾气流速：0.5L/min 或者1.5L/min；扫描质量范围：100～1000。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的含有内标的低分子肝素完全酶解样品在30～60℃条件下真空减压干燥0.5～1h。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的离心，条件为室温8000～ 14000rpm离心5～15min。