CN105891343A - 一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法 - Google Patents
一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公布了一种舒洛地特组分精细结构检测方法，包括：(1)肝素组分结构解析：硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素后进行肝素组分完整糖链分析，再经肝素酶I部分酶解后进行肝素糖链分析，或经肝素酶I、II、III全酶解后进行肝素二糖分析；(2)肝素组分特征基团结构解析：肝素酶I酶解肝素后经P10柱进行寡糖分离收集，然后用凝胶G25脱盐柱脱盐后用质谱进行肝素特征基团结构解析；(3)硫酸皮肤素组分结构解析：用亚硝酸钠降解肝素组分后，再用硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素，进行硫酸皮肤素二糖分析。本发明分析准确、重现性好，可改进现有理化检测分析手段的不足。
Description
一.技术领域
本发明涉及一种多组分产品舒洛地特各组分精细结构分析方法，属于多组分生化原料药分析技术领域。
二.背景技术
舒洛地特是一种新型天然糖胺聚糖，从猪肠黏膜提取精制。含有两个主成分，其作用原理不同而协同增效，具有抗凝、溶栓、抗心血管疾病、降血脂、保护肾脏、治疗糖尿病并发症等作用。与同类药肝素相比，舒洛地特可口服，生物利用度高，副作用小，具有更长的半衰期以及较低的凝血作用和出血参数，因而近年来备受关注，国内许多厂家也处于积极的研发仿制阶段。
糖胺聚糖为长链不分支的杂多糖，具有羧基与硫酸酯基，其基本单位是由己糖醛酸和氨基己糖组成的二糖，再重复聚合为糖胺聚糖。舒洛地特主要由肝素钠和硫酸皮肤素两种糖胺聚糖组分组成。由于糖胺聚糖具有多分散性、结构不均一性、硫酸化程度不一致性、残基数量多变性、糖链长度不同等特点使得糖胺聚糖的结构解析非常复杂。糖胺聚糖自身组成复杂，舒洛地特为两种糖胺聚糖的混合物，且其中的肝素组分经过了一系列的加工处理，使得舒洛地特的结构更加错综复杂，为舒洛地特的结构分析及其仿制药的研制开发带来了巨大挑战。
目前报道的舒洛地特各组分检测方法主要为琼脂糖凝胶电泳法，此方法为理化检测法，精密度不够理想，无法通过此方法确定舒洛地特具体的组分及精细结构。
三.发明内容
本发明的目的在于改进现有分析技术手段的不足，从而提供一种较为先进的舒洛地特组分精细结构的分析方法，采用高效液相色谱及质谱的检测方法进行。本发明具有分析准确，重现性好的特点。
本发明的目的可以通过下述技术方案实现：1)针对舒洛地特含有肝素和硫酸皮肤素两种组分，首先选择性的降解其中一种组分，使其转化为单一组分，然后通过多种手段对该单一组分进行详细解析，从而确定其精细结构。2)，肝素组分解析：用硫酸软骨素ABC酶降解硫酸皮肤素，对肝素组分进行结构解析，包括完整糖链分析(见附图1)、肝素酶I部分酶解后糖链分析(见附图2)、肝素酶I、II、III全酶解后二糖分析(见附图3)。肝素组分特征基团解析步骤如下：首先用肝素酶I适度降解肝素组分，再用Bio-Gel P10自装凝胶柱进行寡糖分离并依次收集各组分(见附图4)，最后用交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱分别脱盐后(见附图5)，用质谱对各组分精细结构进行解析(见附图6)。硫酸皮肤素组分解析：先用亚硝酸钠 降解肝素组分，然后用硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素，进行硫酸皮肤素二糖分析(见附图7)。
本发明的测定方法如下步骤所示：
1.1硫酸软骨素ABC酶酶解步骤
100μl样品+100μl软骨素ABC酶+800μl Tris，混匀，置于37℃水浴中反应4h，灭活，过滤后进样。
1.2酶解后肝素组分完整糖链分析条件
色谱柱：TSK 3000SWxl(7.8mm*30cm)
流动相：0.77％乙酸铵+0.02％叠氮钠
流速：0.4ml/min
柱温：30℃
进样体积：20μl
检测器：示差折光检测器
1.3肝素酶I部分酶解步骤
20μl样品+70μl乙酸钙溶液(pH＝7.0)+100μl肝素酶I溶液(pH 7.0磷酸二氢钠溶液溶解)，混匀，置于25℃水浴中反应24h，灭活，过滤后进样。
部分酶解糖链分析条件
色谱柱：Waters Spherisorb S5 SAX(4.0*250mm)
流动相：A---NaH2PO4(0.04％)；B---NaH2PO4(0.04％)+NaClO4(14％)
流速：0.45ml/min
柱温：35℃
进样体积：10μl
检测器：紫外检测器
波长：234nm
流动相梯度如下：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 97 | 3 |
| 20 | 65 | 35 |
| 50 | 0 | 100 |
| 60 | 0 | 100 |
| 60.1 | 97 | 3 |
| 80 | 97 | 3 |
1.4肝素酶I、II、III完全酶解步骤
20μl样品+70μl乙酸钙溶液(pH＝7.0)+100μl肝素酶I、II、III混合溶液(pH 7.0磷酸二氢钠溶液溶解)，混匀，置于25℃水浴中反应48h，灭活，过滤后进样。
肝素基本二糖单位分析条件同1.3部分酶解糖链分析条件
1.5部分酶解步骤同1.3肝素酶I部分酶解步骤
1.6Bio-Gel P10自装凝胶柱分离寡糖条件
色谱柱：Bio-Gel P10自装凝胶柱
流动相：1.0mol.L-1氯化钠
流速：0.4ml/min
进样体积：1ml
检测器：紫外检测器
波长：232nm
1.7交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱脱盐条件
色谱柱：交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱
流动相：超纯水
流速：0.9ml/min
进样体积：1ml
检测器：紫外检测器
波长：215nm
1.8质谱解析条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C 18(5μm，0.5×250mm)毛细柱
流动相A：15mmol.L-1三丁胺水溶液(pH＝7.0)
流动相B：15mmol.L-1三丁胺，75％乙腈溶液(pH＝7.0)；
流速：10μl/min
洗脱梯度：0～5min，20％B；5～65min，20～60％B。
质谱条件为：喷雾电压：+3.6kV；喷雾气流速：0.5L/min；扫描质量范围：900～3000。
2.1亚硝酸钠降解步骤
取样品溶液500μl，加1mol.L-1盐酸溶液250μl混合，加入250mg/ml的亚硝酸钠溶液50μl，
轻轻混匀，并在室温放置40min，加入1mol.L-1氢氧化钠溶液200μl终止反应。
2.2DS二糖单位分析条件
色谱柱：Waters Spherisorb S5 SAX(4.0*250mm)
流动相：A---超纯水(盐酸调pH至3.5)；B---1mol.L-1氯化钠(盐酸调pH至3.5)
流速：1.0ml/min柱温：35℃进样体积：20μl
检测器：紫外检测器 波长：240nm流动相梯度如下：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 4 | 100 | 0 |
| 45 | 50 | 50 |
| 45.1 | 100 | 0 |
| 55 | 100 | 0 |
四
.
附图说明
图1：舒洛地特肝素组分完整糖链色谱图
图2：舒洛地特肝素组分部分酶解糖链色谱图
图3：舒洛地特肝素组分全酶解二糖色谱图
图4：舒洛地特肝素组分部分酶解P10分析寡糖色谱图
图5：舒洛地特肝素寡糖脱盐色谱图
图6：舒洛地特肝素寡糖总离子流色谱图
图7：舒洛地特硫酸皮肤素组分全酶解二糖色谱图。
Claims (5)
1.一种进行舒洛地特组分精细结构确定的分析方法，包含对硫酸皮肤素及肝素组分的酶解、分离，最后采用高效液相色谱或液质联用检测方法进行肝素组分及硫酸皮肤素组分结构分析，其特征在于：
肝素组分结构分析：先用硫酸软骨素ABC酶对硫酸皮肤素组分进行特异性酶解得到肝素组分，其次用肝素酶I进行部分酶解，得到肝素寡糖及部分二糖；或用肝素酶I、II、III进行完全酶解得到二糖后进行肝素组分结构分析；
肝素组分特征基团结构解析：首先用肝素酶I轻度降解肝素组分，再用Bio-Gel P10自装凝胶柱进行寡糖分离并依次收集各组分，最后用交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱分别脱盐后，用质谱对肝素各组分精细结构进行解析；
硫酸皮肤素组分解析：先用亚硝酸钠降解肝素，得到硫酸皮肤素组分，然后用硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素，进行其二糖结构分析。
2.根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法，其特征在于：
(1)前处理方式：硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素组分，酶解温度37℃，酶解时间为4h；肝素酶部分酶解(单独用肝素酶I或III酶解)的酶解温度为25℃，酶解时间为24h；肝素酶全酶解(肝素酶I、II、III混合酶解)的酶解温度为25℃，酶解时间为48h；
亚硝酸钠降解肝素组分：取浓度为10mg/ml的样品溶液500μl，加1mol.L-1盐酸溶液250μl混合，加入250mg/ml的亚硝酸钠溶液50μl，轻轻混匀，并在室温放置40min，加入1mol.L-1氢氧化钠溶液200μl终止反应；
(2)Bio-Gel P10自装凝胶柱分离寡糖条件：色谱柱：Bio-Gel P10自装凝胶柱；流动相：1.0mol.L-1氯化钠溶液；流速：0.4ml/min；进样体积：1ml；检测器：紫外检测器；检测波长：232nm；
(3)交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱脱盐条件：色谱柱：交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱；流动相：超纯水；流速：0.9ml/min；进样体积：1ml；检测器：紫外检测器；检测波长：215nm。
3.根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法，其特征在于：
酶解后肝素组分结构分析高效液相色谱检测条件：
(1)完整糖链分析检测条件：色谱柱为TSK 3000SWxl(7.8mm*30cm)；流动相为0.77％乙酸铵溶液(含0.02％叠氮钠溶液)；流速为0.4ml/min；柱温为30℃；进样体积为20μl；检测器为示差折光检测器；检测依据为以酶解标样的保留时间为定性依据来检测待测样品的酶解产物；
(2)肝素酶I部分酶解后糖链分析检测条件：色谱柱为Waters Spherisorb S5SAX(4.0*250mm)；流动相A为0.04％的NaH2PO4溶液，流动相B为0.04％的NaH2PO4-14％的NaClO4溶液；流速为0.45ml/min；柱温为35℃；进样体积为10μl；检测器为紫外检测器，检测波长为234nm；采用梯度洗脱方式；
(3)肝素酶I、II、III全酶解后二糖分析检测条件同(3)-②检测条件。
4.根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法，其特征在于：
肝素组分特征基团结构质谱解析条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，0.5×250mm)毛细柱；流动相A：15mmol.L-1三丁胺水溶液(pH＝7.0)，流动相B：15mmol.L-1三丁胺，75％乙腈溶液(pH＝7.0)；流速：10μl/min；洗脱梯度：0～5min，20％B；5～65min，20～60％B；质谱条件为：喷雾电压：+3.6kV；喷雾气流速：0.5L/min；扫描质量范围：900～3000。
5.根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法，其特征在于：硫酸皮肤素二糖结构高效液相色谱检测条件：色谱柱：Waters Spherisorb S5SAX(4.0*250mm)；流动相A：超纯水(盐酸调pH至3.5)，流动相B：1mmol.L-1氯化钠(盐酸调pH至3.5)；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样体积：20μl；检测器：紫外检测器；检测波长：240nm；采用梯度洗脱方式。
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