CN107991414A - 一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法 - Google Patents
一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。该方法利用舒洛地特中各组分电泳淌度的差异，通过琼脂糖凝胶电泳进行组分的分离，再使用离子交换离心柱进行提取，然后利用酶的特异性将各组分酶解成组成单元，最后通过亲水相互作用色谱质谱联用方法检测舒洛地特的各个组分，从而实现对舒洛地特快速移动肝素(FMH)、慢速移动肝素(SMH)和硫酸皮肤素(DS)的定性及相对定量分析，并对各组分精细结构及末端结构进行鉴定与分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法，具体涉及一种将舒洛地特进行电泳分离后，再分别使用离子交换离心柱和酶对药物进行提取降解，最后通过亲水相互作用色谱与质谱联用对结构进行定性和相对定量分析的方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。
背景技术
舒洛地特是从猪小肠粘膜中提取精制的，一种在临床用作治疗各种心血管疾病的抗血栓药物。舒洛地特具有抗凝血、抗血栓、抗心血管疾病及降血脂等多种生物学功能。与临床常用的抗凝血药物肝素相比，舒洛地特具有更强的抗血栓作用、更长的半衰期、更高的脂解活性以及更低的凝血作用和出血参数。此外，不论静脉注射、肌肉注射甚至口服，舒洛地特均可被完全吸收，且具有较高的生物利用率和良好的耐受性。与临床常用的抗凝血药物肝素不同，舒洛地特主要由两种不同的糖胺聚糖组成，包括天然混合的含量约占80％的快速移动肝素(FMH)和含量占约20％硫酸皮肤素(DS)组成，此外，还存在含量不超过2％的慢速移动肝素(SMH)，这也使得对舒洛地特进行分析十分困难。
使用常见的分析方法分析舒洛地特，凝胶渗透色谱(GPC)只能将舒洛地特分为硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸皮肤素(DS)两个组分，且不能实现完全基线分离；核磁共振波谱法(NMR)可以提供组成信息，包括结构特征及单糖取代，但不能提供更多的精细结构信息；由于HS和DS的分子量大和异质性高，使得利用色谱质谱联用(LC-MS)分析时，色谱的分离效果较差，质谱谱图极为复杂，只能实现对极少部分的糖链结构进行解析。另外中国专利文献CN105891343A(申请号2014107589144)公开了一种舒洛地特组分精细结构的分析方法，该方法只针对肝素和硫酸皮肤素两种组分进行分析，对两种组分的组成单元并没有进行结构及定量分析，硫酸皮肤素采用的强阴离子交换色谱分析，由于流动相中含大量氯化钠等不可挥发性的盐，无法与质谱联用分析。此外，上述方法均无法区分快速移动肝素和慢速移动肝素两种组分。由于其组成组分复杂、结构多样、分子量大等特征，对其进行结构表征有较大难度，目前，还没有对舒洛地特各组分结构分析鉴定的研究报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法。该方法利用舒洛地特中各组分电泳淌度的差异，通过琼脂糖凝胶电泳进行组分的分离，再使用离子交换离心柱进行提取，然后利用酶的特异性将各组分酶解成组成单元，最后通过亲水相互作用色谱质谱联用方法检测舒洛地特的各个组分，从而实现对舒洛地特FMH、SMH和DS的定性及相对定量分析，并对各组分精细结构及末端结构进行鉴定与分析。
本发明的技术方案如下：
一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法，步骤如下：
a、将5μL8-12μg/μL的舒洛地特溶液与40-60％蔗糖溶液等体积混合后加于0.4-0.6％的琼脂糖凝胶的上样孔，在缓冲液A和缓冲液B中进行电泳，电泳结束后将凝胶按上样孔切胶，经固定、染色、脱色后根据条带位置切胶，将SMH与FMH和DS分离，分别装入EP管内加热融化，将融胶分别加入离子交换离心柱洗脱收集，然后利用10KDa的平底超滤膜进行超滤脱盐；
b、向步骤a脱盐后的超滤膜上加入70-100μL肝素酶酶解缓冲液，并加入肝素酶I、II和III各25-45mIU，放置于36-38℃酶解20-28小时，每个超滤管中加入1μL 0.7-0.9μg/μL的△IP溶液，离心收集膜下样品，冻干，分别得到SMH和FMH的组成单元；
c、向步骤b含有DS的超滤膜上加入70-100μL CS ABC酶酶解缓冲液，并加入CS ABC酶90-110mIU，放置于36-38℃酶解20-28小时，超滤管中加入1μL 0.7-0.9μg/μL的△IP溶液，离心收集膜下样品，冻干，得到DS的组成单元；
d、将步骤b和c得到的SMH、FMH和DS的冻干样品复溶后，采用亲水相互作用色谱质谱联用检测舒洛地特的各个组分。
根据本发明优选的，步骤a中的缓冲液A为0.03-0.05M乙酸钡，pH 5-6；缓冲液B为0.04-0.06M 1,2-二氨基丙烷，pH 2-3；固定液为0.1％-0.2％十六烷基三甲基溴化铵溶液；染色液为0.1％-0.3％甲苯胺蓝；脱色液为40％-50％乙醇、1％-2％乙酸水溶液。
根据本发明优选的，步骤a电泳的过程为：在缓冲液A中，110-130V、低温下电泳50-70min，电泳方向为负极到正极；再将凝胶转入缓冲液B中，110-130V、低温下继续电泳50-70min。
根据本发明优选的，步骤a固定、染色、脱色的过程为：将凝胶条带使用固定液0-4℃固定4-8小时，然后在染色液中0-4℃染色4-8小时，最后在脱色液中0-4℃下脱色。
根据本发明优选的，步骤a中可将所有凝胶进行固定、染色和脱色处理后切胶；也可将其中一条凝胶条带进行固定、染色和脱色处理，其他未处理条带按照处理条带切胶。
根据本发明优选的，步骤a中离子交换离心柱的洗脱收集方法为：首先使用0.1-0.2M NaCl溶液活化离子交换离心柱，将融化后的凝胶加入到离子交换离心柱，离心弃液体，再使用16-20％NaCl溶液洗脱并收集液体。
根据本发明优选的，步骤b或c中的△IP为一种合成肝素二糖(ΔUA2S-GlcNCOEt6S)。
根据本发明优选的，步骤d中亲水相互作用色谱的条件如下：Click Xion HILIC色谱柱(5μm，2.1×150mm，Acchrom Technologies)；流动相A为3-10mM醋酸铵水溶液，B为3-10mM醋酸铵，90-98％乙腈/水溶液；流速为0.1-0.4mL/min；将酶解冻干的样品使用5μL流动相A溶解，再加入5μL流动相B，混匀，进样量8μL；
亲水相互作用色谱的洗脱梯度如下，均为体积百分比：
0-5min，85％B；5-20min，85-80％B；20-80min，80-70％B；80-95min，70-65％B；95-105min，65-20％B；105-110min，20％B；110-110.01min，20-85％B；110.01-130min，85％B。
根据本发明优选的，步骤d中的质谱采用三重四极杆质谱仪(TSQ)，负离子模式下用多反应监测模式进行检测，设定参数为：喷雾电压：-3.7kV；鞘流气：20-30arb；管状透镜电压：-75V；碰撞能：35。
本发明的有益效果：
1、本发明可以实现SMH、FMH及DS的完全分离，并对各组分进行分别检测，解决了现有技术中无法对舒洛地特各组分结构分析鉴定的问题，使得对舒洛地特的检测分析更加全面，对于保障药品安全具有重要意义。
2、本发明可以使用液质联用技术，使得检测的灵敏度更高，可以对组分进行相对定量分析，结构表征更加完善准确。
附图说明
图1为舒洛地特的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为舒洛地特的FMH的组成单元的提取离子流色谱图；
图3为舒洛地特的SMH的组成单元的提取离子流色谱图；
图4为舒洛地特的DS的组成单元的提取离子流色谱图；
图5为舒洛地特FMH、SMH、DS的部分二级质谱图；
图6为舒洛地特的FMH各组成单元相对含量的柱状图；
图7为舒洛地特的SMH各组成单元相对含量的柱状图；
图8为舒洛地特的DS各组成单元相对含量的柱状图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步限定，但不限于此。
本发明所用药品及制剂均为市售产品。
实施例1
一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法，步骤如下：
(1)配制缓冲液A：0.04M乙酸钡，调pH至5.8；
(2)配制缓冲液B：0.05M 1,2-二氨基丙烷，调pH至3.0；
(3)配制固定液：0.1％十六烷基三甲基溴化铵溶液；
(4)配制染色液：0.2％甲苯胺蓝；
(5)配制脱色液：50％乙醇，1％乙酸水溶液；
(6)取5μL 10μg/μL的舒洛地特溶液与50％蔗糖溶液等体积混合后加于0.5％的琼脂糖凝胶上样孔中，在缓冲液A中，120V、低温下进行电泳60min，电泳方向为负极到正极；再将凝胶转入缓冲液B中，120V、低温下继续电泳60min；
(7)将凝胶按上样孔切胶，选择一条凝胶条带使用固定液4℃固定6小时，染色液4℃染色6小时，脱色液中4℃下脱色，电泳图如图1所示；
(8)将(7)中未进行处理的一条凝胶条带，按照染色后出现的条带位置将凝胶条带切分为两个部分，一部分含SMH，另一部分含FMH和DS，分别装入EP管内；
(9)将步骤(8)切分的条带加热使其融化，离子交换离心柱使用0.2M NaCl溶液活化后上样，使用16％NaCl溶液洗脱并收集，10KDa平底超滤膜进行超滤脱盐；
(10)向步骤(9)脱盐后的超滤膜上加入80μL肝素酶酶解缓冲液，并加入肝素酶I、II和III各30mIU，放置于37℃酶解24小时，每个超滤管中加入1μL 0.8μg/μL的△IP溶液(不饱和肝素二糖标准品溶液)，离心收集膜下样品，冻干，分别得到SMH和FMH的组成单元；
(11)向步骤(10)含有DS的超滤膜上加入加入80μL CS ABC酶酶解缓冲液，并加入CS ABC酶(硫酸软骨素ABC酶)100mIU，放置于37℃酶解24小时，每个超滤管中加入1μL 0.8μg/μL的△IP溶液，离心收集膜下样品，冻干，得到DS的组成单元；
(12)将步骤(10)和(11)得到的SMH、FMH和DS的冻干样品进行亲水相互作用色谱，亲水相互作用色谱分离条件如下：Click Xion HILIC色谱柱(5μm，2.1×150mm，AcchromTechnologies)；流动相A为5mM醋酸铵水溶液，B为5mM醋酸铵，98％乙腈/水溶液；流速为0.25mL/min，将酶解冻干的样品使用5μL流动相A溶解，再加入5μL流动相B，混匀，进样量8μL；
亲水相互作用色谱的洗脱梯度如下，均为体积百分比：
0-5min，85％B；5-20min，85-80％B；20-80min，80-70％B；80-95min，70-65％B；95-105min，65-20％B；105-110min，20％B；110-110.01min，20-85％B；110.01-130min，85％B。
(13)质谱采用三重四极杆质谱仪(TSQ)，负离子模式下用多反应监测模式进行检测，设定参数为：喷雾电压：-3.7kV；鞘流气：30arb；管状透镜电压：-75V；碰撞能：35；SMH、FMH和DS的组成单元的提取离子流色谱图如图2～4所示，FMH、SMH、DS的部分二级质谱图如图5所示。
(14)根据步骤(13)中获得的各组分提取离子流图中获得的峰面积A以及已知浓度c△IP的内标的峰面积A△IP，按如下公式计算该组分的相对浓度c：(SMH、FMH和DS的组成单元的相对含量如图6～8所示)
c＝c△IP×(A/A△IP)
(15)用步骤(14)中得到的对舒洛地特基本组成单元进行组成成分分析，酶解基本组成单元各组分结构信息如表1-表3所示。
表1FMH组成单元
表2SMH组成单元
表3DS组成单元
注：“△UA”表示不饱和糖醛酸，“GlcA”表示葡萄糖醛酸，“IdoA”表示艾杜糖醛酸，“△IdoA”表示不饱和艾杜糖醛酸“GlcN”表示葡萄糖胺，“Ac”表示乙酰基团，“S”表示硫酸基团，“NS”表示N-硫酸基团，“linkage”表示糖与蛋白连接结构域，“Gal”表示半乳糖，“Xyl”表示木糖，“Ser”表示丝氨酸，“-ox1”表示1型氧化，“-ox2”表示2型氧化。
Claims (10)
1.一种舒洛地特的电泳亲水相互作用色谱质谱联用检测方法，步骤如下：
a、将5μL 8-12μg/μL的舒洛地特溶液与40-60％蔗糖溶液等体积混合后加于0.4-0.6％的琼脂糖凝胶的上样孔，在缓冲液A和缓冲液B中进行电泳，电泳结束后将凝胶按上样孔切胶，经固定、染色、脱色后根据条带位置切胶，将SMH与FMH和DS分离，分别装入EP管内加热融化，将融胶分别加入离子交换离心柱洗脱收集，然后利用10KDa的平底超滤膜进行超滤脱盐；
b、向步骤a脱盐后的超滤膜上加入70-100μL肝素酶酶解缓冲液，并加入肝素酶I、II和III各25-45mIU，放置于36-38℃酶解20-28小时，每个超滤管中加入1μL 0.7-0.9μg/μL的ΔIP溶液，离心收集膜下样品，冻干，分别得到SMH和FMH的组成单元；
c、向步骤b含有DS的超滤膜上加入70-100μL CS ABC酶酶解缓冲液，并加入CS ABC酶90-110mIU，放置于36-38℃酶解20-28小时，超滤管中加入1μL 0.7-0.9μg/μL的ΔIP溶液，离心收集膜下样品，冻干，得到DS的组成单元；
d、将步骤b和c得到的SMH、FMH和DS的冻干样品复溶后，采用亲水相互作用色谱质谱联用检测舒洛地特的各个组分。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a中的缓冲液A为0.03-0.05M乙酸钡，pH 5-6；缓冲液B为0.04-0.06M 1,2-二氨基丙烷，pH 2-3；固定液为0.1％-0.2％十六烷基三甲基溴化铵溶液；染色液为0.1％-0.3％甲苯胺蓝；脱色液为40％-50％乙醇、1％-2％乙酸水溶液。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a电泳的过程为：在缓冲液A中，110-130V、低温下电泳50-70min，电泳方向为负极到正极；再将凝胶转入缓冲液B中，110-130V、低温下继续电泳50-70min。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a固定、染色、脱色的过程为：将凝胶条带使用固定液0-4℃固定4-8小时，然后在染色液中0-4℃染色4-8小时，最后在脱色液中0-4℃下脱色。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a中将所有凝胶进行固定、染色和脱色处理后切胶。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a中将其中一条凝胶条带进行固定、染色和脱色处理，其他未处理条带按照处理条带切胶。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a中离子交换离心柱的洗脱收集方法为：首先使用0.1-0.2M NaCl溶液活化离子交换离心柱，将融化后的凝胶加入到离子交换离心柱，离心弃液体，再使用16-20％NaCl溶液洗脱并收集液体。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤b或c中的ΔIP为一种合成肝素二糖(ΔUA2S-GlcNCOEt6S)。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤d中亲水相互作用色谱的条件如下：Click Xion HILIC色谱柱(5μm，2.1×150mm，Acchrom Technologies)；流动相A为3-10mM醋酸铵水溶液，B为3-10mM醋酸铵，90-98％乙腈/水溶液；流速为0.1-0.4mL/min；将酶解冻干的样品使用5μL流动相A溶解，再加入5μL流动相B，混匀，进样量8μL；
亲水相互作用色谱的洗脱梯度如下，均为体积百分比：
0-5min，85％B；5-20min，85-80％B；20-80min，80-70％B；80-95min，70-65％B；95-105min，65-20％B；105-110min，20％B；110-110.01min，20-85％B；110.01-130min，85％B。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤d中的质谱采用三重四极杆质谱仪(TSQ)，负离子模式下用多反应监测模式进行检测，设定参数为：喷雾电压：-3.7kV；鞘流气：20-30arb；管状透镜电压：-75V；碰撞能：35。
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| CN (1) | CN107991414A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102603924A (zh) * | 2012-03-12 | 2012-07-25 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法 |
| CN103454372A (zh) * | 2013-09-10 | 2013-12-18 | 山东大学 | 一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法 |
| CN105203647A (zh) * | 2014-05-29 | 2015-12-30 | 东营天东制药有限公司 | 肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法 |
| CN104017102B (zh) * | 2014-06-19 | 2016-02-24 | 深圳市海普瑞药业股份有限公司 | 乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法 |
| CN105461831A (zh) * | 2016-01-08 | 2016-04-06 | 东营天东制药有限公司 | 一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法 |
| CN105891343A (zh) * | 2014-12-06 | 2016-08-24 | 烟台东诚药业集团股份有限公司 | 一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法 |
| CN106018597A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-10-12 | 山东大学 | 一种低分子肝素基本组成单元的亲水相互作用色谱多反应监测二级质谱联用检测方法 |
| CN107003324A (zh) * | 2014-11-14 | 2017-08-01 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 通过质谱测定糖胺聚糖水平 |
-
2017
- 2017-12-28 CN CN201711465866.XA patent/CN107991414A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102603924A (zh) * | 2012-03-12 | 2012-07-25 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法 |
| CN103454372A (zh) * | 2013-09-10 | 2013-12-18 | 山东大学 | 一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法 |
| CN105203647A (zh) * | 2014-05-29 | 2015-12-30 | 东营天东制药有限公司 | 肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法 |
| CN104017102B (zh) * | 2014-06-19 | 2016-02-24 | 深圳市海普瑞药业股份有限公司 | 乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法 |
| CN107003324A (zh) * | 2014-11-14 | 2017-08-01 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 通过质谱测定糖胺聚糖水平 |
| CN105891343A (zh) * | 2014-12-06 | 2016-08-24 | 烟台东诚药业集团股份有限公司 | 一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法 |
| CN105461831A (zh) * | 2016-01-08 | 2016-04-06 | 东营天东制药有限公司 | 一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法 |
| CN106018597A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-10-12 | 山东大学 | 一种低分子肝素基本组成单元的亲水相互作用色谱多反应监测二级质谱联用检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| NICOLA VOLPI: ""Fast moving" and "slow moving" heparins, dermatan sulfate, and chondroitin sulfate: qualitative and quantitative analysis by agarose-gel electrophoresis", 《CARBOHYDRATE RESEARCH》 * |
| NICOLA VOLPI: "Disaccharide Analysis and Molecular Mass Determination to Microgram Level of Single Sulfated Glycosaminoglycan Species in Mixtures Following Agarose-Gel Electrophoresis", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
| VANESSA LEAH GILL 等: "Disaccharide Analysis of Glycosaminoglycans Using Hydrophilic Interaction Chromatography and Mass Spectrometry", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
| 于源华: "《生物工程与技术专业基础实验教程》", 30 June 2016, 北京理工大学出版社 * |
| 宋菲: "多糖类抗血栓药物舒洛地特质量控制研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
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