CN105461831A - 一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法 - Google Patents

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李�荣
陈少鹏
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Abstract

本发明公开一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，该方法包括以浓度为0.04M的醋酸钡溶液为缓冲液，配制琼脂糖凝胶，每个点样孔上样，将凝胶置于0.04M醋酸钡溶液缓冲液中，在缓冲液上层加入少许石油醚，封住气液界面；将整个电泳槽体系置于冷室中电泳，电泳完毕，轻压脱水；将0.2%的甲苯胺蓝溶解在乙醇：水：乙酸形成的溶剂中，配制染色液，将凝胶悬浮在染色液中，然后用乙醇：水：乙酸混合成的溶液洗涤。本发明通过在0.04M醋酸钡缓冲液中进行一次琼脂糖凝胶电泳，通过对电泳液进行降温处理、降低电泳电压、延长电泳时间、石油醚封气液界面等方法，有效地将快速移动肝素与硫酸皮肤素分离。

Description

一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法
技术领域
本发明属于生物医药行业中肝素类抗凝血药物中粘多糖组分的分离领域，尤其涉及一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法。
背景技术
粘多糖类化合物是一类重要的生物大分子，此类大分子化合物具有多种重
要的生物学功能及药理活性，包括：抗凝、抗肿瘤、降血脂、抗血栓等。粘多糖中具有代表性的种类有肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素等，各有不同的生物药理作用。
粘多糖的结构类似，都为不同程度硫酸化、乙酰化的糖胺-糖醛酸二糖单位
重复组成的长链结构，每种粘多糖又是由分子量呈正态离散分布的大小不同的分子组成，增加了分离分析的难度。目前，主要的分离分析方法有：HPLC法，电泳法、毛细管电泳法等。
琼脂糖凝胶电泳作为生物学程领域最常用的技术，兼具“分子筛”与“电泳”双重作用，主要用于核酸的分离、鉴定、提纯。琼脂糖凝胶电泳也能用于分离、鉴定多糖类化合物，有文献显示，通过调整琼脂糖凝胶浓度、缓冲液等参数，可以通过电泳分离鉴定多种多糖类化合物。重复性好，设备要求低，具有较好的应用价值。
发明内容
本发明针对现有琼脂糖凝胶电泳分离粘多糖中存在的电泳时间长，条带弥散，需要两次电泳问题，提供了一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法。
本发明是这样实现的，一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，该快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法包括：
步骤一，以浓度为0.04M的醋酸钡溶液（PH5.8）为缓冲液，配制胶浓度
0.4%-0.8%的琼脂糖凝胶，胶厚度在3-5mm，梳齿之间距离在5mm以上；
步骤二，每个点样孔上样量在5-10微克；
步骤三，将凝胶置于0.04M醋酸钡溶液（PH5.8）缓冲液中，缓冲液顶部稍
稍没过凝胶约1-2mm，然后在缓冲液上层加入少许石油醚，封住气液界面；
步骤四，将整个电泳槽体系置于冷室中，电泳槽两端连接电泳仪电源，施
以120V电压，电泳时间为2小时；
步骤五，电泳完毕，将凝胶板取出，在Cetavlon（0.1%浓度溶液）浸透>3小时，取出后以干燥滤纸铺盖于凝胶上，小心轻压脱水数次；
步骤六，将0.2%的甲苯胺蓝溶解在乙醇：水：乙酸比例为40:9:1形成的溶剂中，配制染色液，将凝胶悬浮在染色液中，放于摇床缓慢振荡染色30-60分钟,然后用乙醇：水：乙酸比例为50:49:1混合成的溶液洗涤。
进一步，步骤一所配制的胶浓度为0.6%。
进一步，所述步骤一所配置的胶厚度为3mm。
进一步，所述步骤二中上样量为10微克。
进一步，所述步骤四中所用冷室温度为4℃。
进一步，所述步骤六中染色时间为1小时。
本发明通过在0.04M醋酸钡缓冲液中进行一次琼脂糖凝胶电泳，通过对电泳液进行降温处理、降低电泳电压、延长电泳时间、石油醚封气液界面等方法，有效地将快速移动肝素与硫酸皮肤素分离。
附图说明
图1是本发明实施例提供的快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1：一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，通过各种方法处理琼脂糖凝胶电泳装置，从而通过一次电泳将快速移动肝素与硫酸皮肤素分离，该快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法包括：
步骤一，S101
以浓度为0.04M的醋酸钡溶液（PH5.8）为缓冲液，配制胶浓度
0.4%-0.8%的琼脂糖凝胶，胶厚度在3-5mm，梳齿之间距离在5mm以上；
S102
每个点样孔上样量在5-10微克；
S103
将凝胶置于0.04M醋酸钡溶液（PH5.8）缓冲液中，缓冲液顶部稍
稍没过凝胶约1-2mm，然后在缓冲液上层加入少许石油醚，封住气液界面；
S104
将整个电泳槽体系置于冷室中，电泳槽两端连接电泳仪电源，施以120V电
压，电泳时间为2小时
S105
电泳完毕，将凝胶板取出，在Cetavlon（0.1%浓度溶液）浸透>3小时，取出后以干燥滤纸铺盖于凝胶上，小心轻压脱水数次；
S106
将0.2%的甲苯胺蓝溶解在乙醇：水：乙酸比例为40:9:1形成的溶剂中，配制染色液，将凝胶悬浮在染色液中，放于摇床缓慢振荡染色30-60分钟,然后用乙醇：水：乙酸比例为50:49:1混合成的溶液洗涤。
所述S101所配制的胶浓度为0.6%。
所述S101所配置的胶厚度为3mm。
所述S102中上样量为10微克。
所述S10中所用冷室温度为4℃。
所述S106中染色时间为1小时。
具体实例：
琼脂糖凝胶的制备：电泳胶规格为100×70，浓度0.6%，缓冲液0.04M醋酸钡（PH5.8），电泳胶厚度3mm，将琼脂糖在缓冲液中融化均一后，冷却至60℃左右，倾倒铺制于胶槽中，待凝固使用；
电泳：将凝固后的凝胶置于电泳槽中，以0.04M醋酸钡（PH5.8）为缓冲液，每个胶孔上样10微克样品，上样完毕后，向缓冲液顶部缓慢加入少量石油醚，将整套电泳设备置于4℃冷室，120V，电泳2小时；
染色与脱色：电泳完毕，将凝胶板取出，在Cetavlon溶液中浸透3小时，取出后以干燥滤纸铺盖于凝胶上，小心轻压脱水数次；用甲苯胺蓝溶液，在摇床上缓慢振荡染色30分钟，然后用50:49:1=乙醇：水：乙酸溶液洗涤多次至背景颜色较浅，条带明显；
最终得到的凝胶，通过凝胶成像系统将电泳结果保存，通过光密度计或者其他软件对粘多糖进行定性定量分析。
所述凝胶优先选择高强度琼脂糖，使用的琼脂糖浓度为0.6%，过低凝胶容易破碎，过高分离效果不佳。
所述甲苯胺蓝有效浓度为0.2%，溶解在乙醇：水：乙酸=40:9:1的溶液中，所述Cetavlon溶液浓度为0.1%。
如图2：快速移动肝素与硫酸皮肤素是新型肝素制剂舒洛地特的主要组成部分，其含量分别为75-85%，15-25%。舒洛地特质量标准中规定，含量需在上述范围内。分离鉴定舒洛地特中快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法主要是通过连续在0.04M醋酸钡缓冲液和0.05M1,2—二氨基丙烷缓冲液中，跑琼脂糖凝胶电泳来分离这两个组分。本发明通过在0.04M醋酸钡缓冲液中进行一次琼脂糖凝胶电泳，通过对电泳液进行降温处理、降低电泳电压、延长电泳时间、石油醚封气液界面等方法，有效地将快速移动肝素与硫酸皮肤素分离。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，其特征在于，该快速分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法包括：
步骤一，以浓度为0.04M的醋酸钡溶液为缓冲液，配制胶浓度0.4%-0.8%
的琼脂糖凝胶，胶厚度在3-5mm，梳齿之间距离在5mm；
步骤二，每个点样孔上样量在5-10微克；
步骤三，将凝胶置于0.04M醋酸钡溶液缓冲液中，缓冲液顶部没过凝胶
1-2mm，然后在缓冲液上层加入石油醚，封住气液界面；
步骤四，将整个电泳槽体系置于冷室中，电泳槽两端连接电泳仪电源，施
以120V电压，电泳时间为2小时；
步骤五，电泳完毕，将凝胶板取出，在Cetavlon浸透大于3小时，取出后以干燥滤纸铺盖于凝胶上，轻压脱水；
步骤六，将0.2%的甲苯胺蓝溶解在乙醇：水：乙酸比例为40:9:1形成的溶剂中，配制染色液，将凝胶悬浮在染色液中，放于摇床缓慢振荡染色30-60分钟,然后用乙醇：水：乙酸比例为50:49:1混合成的溶液洗涤。
2.如权利要求1所述的分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，其特征在于：所述步骤一所配制的胶浓度为0.6%。
3.如权利要求1所述的分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，其特征在于：所述步骤一所配置的胶厚度为3mm。
4.如权利要求1所述的分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，其特征在于：所述步骤二中上样量为10微克。
5.如权利要求1所述的分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，其特征在于：所述步骤一和步骤三的浓度为0.04M的醋酸钡溶液pH为5.8。
6.如权利要求1所述的分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，其特征在于：所述步骤四中所用冷室温度为4℃，所述步骤五Cetavlon为0.1%浓度溶液。
7.如权利要求1所述的分离快速移动肝素与硫酸皮肤素的方法，其特征在于：所述步骤六中染色时间为1小时。
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