CN101936944A - 一种玻载电泳法分析粘多糖的方法 - Google Patents

一种玻载电泳法分析粘多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玻载电泳法分析粘多糖的方法，操作步骤，将琼脂糖凝胶在玻璃板上铺成电泳用胶板，把这个玻载胶板放置在适当的电泳槽中，经点样、电泳后，取出玻载胶板，先在60-80℃烘干，然后用甲苯胺蓝染色，用自来水脱色，最后再在60-80℃烘干，得到最终电泳结果。该方法使得电泳胶板可长期保存；单次上样量从一般平板电泳的12-24个提高到72个，便于大规模分析；能有效的将肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸类肝素等粘多糖物质分离开，有助于对粘多糖准确地定性定量。

Description

一种玻载电泳法分析粘多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种分析粘多糖的方法，尤其涉及一种玻载电泳分析粘多糖的方法。
背景技术
粘多糖类(Mucopolysaccharides)是一类胞外生物高分子，是动物体内蛋白多糖(Proteoglycan)分子中的糖链部分。粘多糖类是重要的生物高分子化合物，已证实此类成分具有多种药理活性，包括抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤及抗放射等作用。粘多糖中具有代表性的有肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素等几种，为硫酸化、乙酰化的糖胺和糖醛酸二糖重复单位相连而成的长链。
这些粘多糖结构类似，且都是离散分布的糖链的组合，增加了分析方面的难度。目前主要分析方法有电泳法、HPLC法、毛细管电泳法、核磁共振法、质谱法等。其中Volpi N等建立的琼脂糖凝胶电泳法因为方法简单、结果稳定、设备要求低等原因而广为使用。
但目前的电泳方法存在一定缺陷，首先，多糖在电泳后染色和脱色时容易从胶板内逸出，严重影响分析结果；其次，电泳结果不易保存，胶板保存在水中1-2天后，粘多糖斑点就会因为多糖扩散出去而造成斑点退色；最后，琼脂糖凝胶电泳上样量有限，难以满足药厂大规模分析的需要。
发明内容
为了克服目前电泳分析粘多糖方法所存在的缺陷，本发明提供了一种玻载电泳分析粘多糖的方法，最终得到一个紧密附着在玻璃板上的干燥的凝胶电泳结果。
本发明包括下述顺序的步骤：
(1)制胶
准备一块洁净干燥的玻璃板，其宽度与所使用电泳槽宽度相吻合，其长度略短于所用电泳槽。用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周使形成一个可容纳5mm深液体的方形容器，取格式梳架于相应上样位置，然后放置在水平的桌面。将琼脂糖在沸水中溶于pH值5.8、浓度为0.04mol/L乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0.5-1％，待冷却至约50℃时倒在准备好的玻璃板上，厚度为1-5mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。
(2)电泳
将1-5μL的浓度为1mg/mL的粘多糖溶液上样于点样孔，先在pH值为5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以5-7mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9.0、浓度为0.05mol/L的1、2-二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以5-7mA/cm胶宽稳流电泳1小时。
(3)染色和脱色
电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中60-80℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。最后将凝胶板放入装有水的容器中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中60-80℃烘干。得到的最终结果为一个紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。
在上述电泳方法中，步骤(1)中所述电泳用凝胶板是在普通的、无色玻璃板上制成的，所述凝胶优选为高强度琼脂、琼脂糖IV，所述凝胶浓度优选为0.6％，所述凝胶厚度优选为2mm。步骤(2)所述粘多糖上样量优选为3μL(1mg/ml)，所述电泳时电流强度优选为6.4mA/cm胶宽。步骤(3)所述凝胶烘干温度优选为80℃，所述染色和脱色都是在凝胶烘干状态下完成的。
本发明所述的玻载电泳法，最终的电泳结果为附着在玻璃上的干燥的膜，利于标记、观察、分析，并能长久保存。采用适当的电泳仪，该方法将单次上样量从一般平板电泳的12-24个可提高到72个，便于大规模分析。本发明所述的玻载电泳法还具有操作简单、对生产环境和设备要求不高等特点，极利于药厂或科研机构建立实施。本发明所述的玻载电泳法能将肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸类肝素等粘多糖物质进行有效分离，有助于对粘多糖进行准确地定性定量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明所述内容作进一步阐述。
实施例一
准备若干块洁净干燥的玻璃板(7.8cm×6.0cm，1.5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在沸水中溶于pH5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0.5％，冷却至约50℃时倒在玻璃板上，厚度为2mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。
将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度1mg/ml的粘多糖溶液3μL上样于点样孔，先在pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以6.4mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9.0、0.05mol/L的1、2-二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以6.4mA/cm胶宽稳流电泳1小时。
电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中80℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中80℃烘干。得到的最终结果为一个紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。
实施例二
准备若干块洁净干燥的玻璃板(7.8cm×6.0cm，1.5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在沸水中溶于pH值5.8、0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0.5％，冷却至约50℃时倒在玻璃板上，厚度为3mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。
将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度为1mg/ml的粘多糖溶液4μL上样于点样孔，先在pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以5mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9.0、0.05mol/L的1、2-二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以5mA/cm胶宽稳流电泳1小时。
电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中60℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中60℃烘干。得到的最终结果为一个紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。
实施例三
准备若干块洁净干燥的玻璃板(7.8cm×6.0cm，1.5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在沸水中溶于pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0.8％，冷却至约50℃时倒在玻璃板上，厚度为1mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。
将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度为1mg/ml的粘多糖溶液5μL上样于点样孔，先在pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以6mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9.0、浓度0.05mol/L 1、2-二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以6mA/cm胶宽稳流电泳1小时。
电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中65℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中65℃烘干。得到的最终结果为一个紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。
实施例四
准备若干块洁净干燥的玻璃板(7.8cm×6.0cm，1.5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在沸水中溶于pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为1％，冷却至约50℃时倒在玻璃板上，厚度为4mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。
将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度为1mg/ml的粘多糖溶液1μL上样于点样孔，先在pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以6.5mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9.0、浓度0.05mol/L的1、2-二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以6.5mA/cm胶宽稳流电泳1小时。
电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中70℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中70℃烘干。得到的最终结果为一个紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。
实施例五
准备若干块洁净干燥的玻璃板(7.8cm×6.0cm，1.5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在沸水中溶于pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0.6％，冷却至约50℃时倒在玻璃板上，厚度为5mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。
将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度1mg/ml的粘多糖溶液2μL上样于点样孔，先在pH值5.8、浓度0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以7mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9.0、浓度0.05mol/L的1、2-二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以7mA/cm胶宽稳流电泳1小时。
电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中75℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中75℃烘干。得到的最终结果为一个紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。
以上仅为本发明若干实施列之一，但并不局限于上述实施列的组合方式。

Claims (7)

1.一种玻载电泳法分析粘多糖的方法，其特征在于：所述方法包括下述顺序步骤，
a、准备一块洁净干燥的玻璃板，其宽度与所使用电泳槽宽度相吻合，其长度略短于所用电泳槽，用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周使形成一个可容纳5mm深液体的方形容器，取格式梳架于相应上样位置，然后放置在水平的桌面，将琼脂糖在沸水中溶于pH值为5.8、浓度为0.04mol/L乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0.5-1％，待冷却至约50℃时倒在准备好的玻璃板上，厚度为1-5mm，凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板；
b、将1-5μL的浓度为1mg/mL的粘多糖溶液上样于点样孔；
c、于pH5.8、浓度为0.04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中，以5-7mA/cm胶宽稳流电泳1小时；
d、再放入pH9.0、浓度为0.05mol/L的1、2-二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中，以5-7mA/cm胶宽稳流电泳1小时；
e、将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中60-80℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟；
f、将凝胶板放入装有水的容器中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中60-80℃烘干。
2.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于：步骤a中所述的琼脂为高强度琼脂或琼脂糖IV。
3.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于：步骤a中所述的琼脂浓度为0.6％。
4.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于：步骤a中所述的制备的胶板中琼脂厚度为2mm。
5.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于：步骤b中所述的粘多糖上样量为3μL。
6.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于：步骤c、步骤d中所述电泳的电流强度为6.4mA/cm胶宽。
7.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于：步骤e、步骤f中所述的凝胶烘干温度为80℃。
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