WO2012100733A1 - 一种基于毛细管电泳的依诺肝素钠精细结构测定方法 - Google Patents

一种基于毛细管电泳的依诺肝素钠精细结构测定方法 Download PDF

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康经武
展学强
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Definitions

  • the present invention relates to the field of analytical chemistry and pharmaceutical analysis, and in particular to a capillary electrophoresis method for determining the fine structure of enoxaparin sodium, that is, determining disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides and having constituents of enoxaparin sodium structure. 1, 6 kinds of ring structure oligosaccharide types and content. Background technique
  • Heparin is a disaccharide unit composed of uronic acid (L-iduronic acid IdoA; D-glucuronic acid, GlcA) and glucosamine ( ⁇ -D glucosamine, GlcN)
  • uronic acid Liduronic acid IdoA
  • GlcA D-glucuronic acid
  • GlcN glucosamine
  • Enoxaparin sodium is a low-molecular weight heparin produced by esterification of heparin extracted from pig intestinal mucosa with a sodium heparin derivative obtained by esterification under alkaline conditions.
  • the weight average molecular weight of enoxaparin sodium is between 3800 and 5000, and the molecular weight distribution range is: less than 2000 Da does not exceed 20%; between 2000 and 8000 Da should be greater than 68%; molecular weight exceeds 8000 Da and does not exceed 18%.
  • enoxaparin sodium In the production of enoxaparin sodium, the alkaline degradation process involves two competitive chemical reactions: beta-elimination and benzyl ester hydrolysis. After degradation, a low molecular weight heparin oligosaccharide chain JS5389618) with an average molecular weight of about 4500 was obtained. The pentasaccharide structure reflecting the anticoagulant activity in the original heparin sugar chain remains in the enoxaparin sodium oligosaccharide chain, and the pentasaccharide structure in enoxaparin sodium The unit accounts for about 15% to 25%.
  • the 1,6-ring structure of the oligosaccharide chain reducing end is a hallmark structural feature of enoxaparin sodium.
  • the 1,6-ring formation ratio means that the oligosaccharide chain having a 1,6-ring structure at the reducing end should account for the percentage of the entire sugar chain.
  • the 1,6-ring rate was used as an indicator of quality control of enoxaparin sodium by the United States and the European Pharmacopoeia.
  • the United States and European Pharmacopoeia stipulate that the oligosaccharide chain having a 1,6-ring structure at the reducing end should account for 15%-25% of the total sugar chain.
  • Strong anion exchange (SAX) chromatography in liquid chromatography is the preferred method for the analysis of constituent components of enoxaparin sodium sulfated oligosaccharides.
  • high performance liquid chromatography or low pressure chromatography gel permeation chromatography (GPC) is an effective tool for separating polysaccharides and desalting by molecular weight.
  • High performance liquid chromatography for the analysis of complete enzymatic hydrolysate products has been reported in a large number of literatures (refer to CN03822562. X and CN200580009444. 0, etc.).
  • MALDI-TOF-MS matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry
  • the method is used to analyze heparin polysaccharides and can be used as a tool for the determination of polysaccharide sequences (H. Sakaguchi et al., J. Biochem. 129 (2001) 107-118; AJ Rhomberg,. et al., Proc. Nalt. Acad. Sci USA 95 (1998) 4176-4181; L. Sturiale, et al., Semin. Thromb. Hemost. 27 (2001) 465-472).
  • MALDI-TOF-MS does not solve the complex mixture analysis and is not suitable for quality control of the product due to its high price. Summary of the invention
  • An object of the present invention is to provide a new analytical method for determining the fine structure of enoxaparin sodium based on capillary electrophoresis technology, and to determine disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides and four kinds of hexoses constituting enoxaparin structure.
  • the type and content of cyclooligosaccharides are examples of cyclooligosaccharides.
  • Another object of the present invention is to provide a novel capillary electrophoresis-based method for determining the percentage of oligosaccharide chains having a 1,6-ring structure in the enoxaparin sodium component (generally referred to as 1,6 ring-forming ratio: ) method and quality control for the production process of enoxaparin sodium.
  • This method is completely different from the method based on high performance liquid chromatography SAX ion chromatography to determine the 1,6 ring formation rate.
  • the capillary electrophoresis method of the invention can be used for the separation and quantitative determination of disaccharide, trisaccharide and tetrasaccharide components in the complete enzymatic hydrolysation product of enoxaparin sodium, in particular, the structure characteristic of enoxaparin sodium can be determined with 1,6 - Percentage of oligosaccharide chains in a ring-forming structure.
  • the method for detecting the fine structure of enoxaparin sodium comprises the following steps:
  • the heparinase mixture comprises at least two of heparinase I (EC 4.2.2.7.), heparinase ⁇ (no EC number:) and heparinase III (EC 4.2.2.8.), preferably three
  • the enzyme is mixed, and it is most preferred that the three enzymes are mixed in a ratio of 1: 1:1.
  • There is no 2-0-sulfation group on the disaccharide uronic acid which will be present as a disaccharide after complete enzymatic hydrolysis by heparinase, when on the disaccharide linked to the 1,6-cyclodisaccharide
  • the uronic acid contains a 2-0-sulfated group, and when it is in the form of mannosamine, the 1,6-ring structure is tetrasaccharide (this form prevents enzymatic hydrolysis of heparinase: ) form produced.
  • Trisaccharides are also present in the enzymatic hydrolysate. Trisaccharide 1 is formed in other degradation processes and has the following structure:
  • the other components of the complete enzymatic product mixture are not characterized by enoxaparin sodium, including 8 heparin disaccharides.
  • the structure is as follows: a +
  • the method provided by the present invention may also detect other disaccharide components in the fully digested product: AIIS gal and AISS gal , which are 2- from IdoA(2S)-GlcNS(6S)- and IdoA(2S)-GlcNS- 0-Desulfation produces two galacturonic acid forms. These two disaccharides are usually not present in the initial structure of heparin (UM Desai et al., Arch. Biochem. Bio hys., 306(2) 461-468 (1993)).
  • the main tetrasaccharides contained in most of the low molecular weight heparin are shown below. These tetrasaccharide chains are resistant to degradation by enzymes and can reflect sequence fragments of anti-thrombin III affinity.
  • the two tetrasaccharides are represented by the following symbols: ⁇ -IISglu and AIIa-IVSglu (S. Yamada, et al., J. Biol. Chem.; 270(7), 4780-4787 (1993)).
  • the present invention separates disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides and 1,6-ring-forming oligosaccharides in the complete enzymatic hydrolysate of enoxaparin sodium by capillary electrophoresis.
  • the capillary capillary length used in the present invention ranges from 50 to 100 cm, and the column inner diameter ranges from 25 to 75 ⁇ m.
  • the effective length of the quartz capillary column is generally 10 cm minus the total length of the column. Depending on the actual capillary electrophoresis model used, there may be slight deviations.
  • the total length of the quartz capillary is in the range of 70 to 100 cm, and the inner diameter of the column is in the range of 40 to 60 ⁇ .
  • the buffer solution used for capillary electrophoresis may be selected from NaH 2 P0 4 -H 3 P0 4 , Tris-H 3 P0 4 or LiH 2 P04-H 3 P0 4 , with a concentration ranging from 150 to 300 mM, and a pH range of 1.5 to 4.0. .
  • a preferred buffer solution may be selected from NaH 2 P0 4 -H 3 P0 4 , Tris-H 3 P0 4 or LiH 2 P0 4 -H 3 P04 at a concentration ranging from 200 to 250 mM.
  • the pH ranges from 2.0 to 4.0.
  • MgCl 2 or ZnCl 2 in another embodiment of the present invention, it is preferred to add MgCl 2 or ZnCl 2 in a concentration range of 1 to 5 mM, 0.1% to 5% by mass (m/v) of polyethylene glycol in the above buffer solution.
  • the purpose of adding 0.1% to 5% of MgCl 2 or ZnCl 2 and PEG to the buffer solution is to fine tune the oligosaccharide with similar electrophoretic mobility, for example: electrophoretic migration time of AIS, Trisaccharide and 1,6-AnhydroAIS-IS, thereby Their resolution is significantly improved.
  • MgCl 2 or ZnCl 2 in a concentration range of 2 to 4 mM, 1% to 3% by mass (m/v) of polyethylene glycol in the above buffer solution.
  • Alcohol molecule PEG, molecular weight range 10000 ⁇ 50000).
  • the capillary electrophoresis voltage is -15 ⁇ - 30 kV, preferably -20 ⁇ - 25 kV, which can be adjusted according to the capillary electrophoresis model.
  • Capillary electrophoresis of the method of the invention employs pressure injection.
  • Injection pressure range is 1-100 mbar, injection time range is 1 ⁇ 60 seconds (s); preferred injection pressure range is 30-60 mbar, injection time range is 5 ⁇ 30 s; more preferred injection pressure range For 40-50 mbar, the injection time range is 10 ⁇ 20 s.
  • a certain air pressure is applied to the sample end to push ⁇ to the detection window for detection.
  • the pressure may range from 5 to 150 mbar, preferably from 5 to 30 mbar, from 10 to 20 mbar or from 30 to 150 mbar, etc., and may be suitably adjusted depending on the capillary electrophoresis used.
  • the capillary column temperature used in the present invention ranges from 10 40 V, preferably 20 30 V.
  • the detection wavelength used in the present invention is ultraviolet 230-235 nm, preferably 230-232 nm, and the capillary electrophoresis separation range is 50 capillary total length range 50.
  • column inner diameter range is 25 75 ⁇ ; buffer solution contains 150 300mM NaH 2 P0 4 -H 3 P0 4 , Tris-H 3 P0 4 or LiH 2 P0 4 -H 3 P04 1 5 mM MgCl 2 or ZnCl 2 H
  • the range is 1.5-4.0, adding 0.1% 5.0% mass concentration (m/v) of polyethylene glycol molecules before use, the molecular weight range is 5000 100000; the capillary electrophoresis voltage is -15 - 30 kV; using pressure injection, The pressure range is l 100 mbar, the time range is 1 60 s; after the last monosulfated disaccharide ( ⁇ ) peak, a pressure of 5 150 mbar is applied, and the AIVA is pushed to the detection window for detection; the capillary column temperature range during electrophoresis is 10-40 V, detection wavelength is Zixi 230-235
  • the capillary electrophoresis separation conditions range from a total capillary capillary length of 50 100 cm, a column inner diameter range of 25 75 ⁇ m; a buffer solution containing 150 300 mM of NaH 2 P0 4 -H 3 P0 4 , Tris-H 3 P0 4 or LiH 2 P0 4 -H 3 P04 1 5 mM MgCl 2 or ZnCl 2 pH range 1.5-4.0, 0.1% 5.0% by mass (m/v) of polyethylene glycol molecule before use, molecular weight range of 5000 100000; capillary The voltage used during electrophoresis is -15 - 30 kV; pressure injection is used, the pressure range is 30 60 mbar, the time range is 5 30 s; after the last monosulfated disaccharide ( ⁇ ) peak, a pressure of 5 150 mbar is applied, Push ⁇ to the detection window for detection; capillary column temperature during electrophoresis The circumference is 10-40 °C, and the
  • preferred capillary electrophoresis separation conditions range from a total length of the quartz capillary of 70 100 cm to a column inner diameter of 40 60 ⁇ m ; and a buffer solution containing 200 250 mM of NaH 2 P04-H 3 P0 4 Tris-H 3 P0 4 Or LiH 2 P0 4 -H 3 P04 2 ⁇ 4 mM MgCl 2 pH range is 2 4, before use, adding 3% mass concentration (m / v) of polyethylene glycol, molecular weight range of 10000 50000; separation voltage is -15 - 25 kV; with pressure injection, the injection pressure range is 40 50 mbar, the time range is 10 20 s; pressurize 10 20 mbar after the monosulfated oligosaccharide ⁇ peak, push ⁇ / ⁇ to the detection Window detection; column temperature 20 30 °C; detection wavelength UV 230-232nm
  • the present invention provides a preferred condition for capillary electrophoresis separation:
  • the quartz capillary column has an inner diameter of 50 ⁇ m and a total length of 80 cm.
  • the buffer solution is 200 mM Tris-H 3 P0 4 and 2 mM MgCl 2 pH is 2.7. 1.3% by mass (m/v) of polyethylene glycol is added before use. 10000; injection pressure 55 mbar, time 10 s; separation voltage -22 kv; pressurization 138 mbar after monosulfated oligosaccharide ⁇ peak, will AIVA pushes the detection window to achieve detection; the column temperature is 25 °C ; the detection wavelength is 230 nm.
  • the electrophoretic separation of the completely hydrolyzed product of heparin sodium is shown in Fig. 3-A
  • the electrophoretic separation of the complete enzymatic hydrolysate of enoxaparin sodium is shown in Fig. 3-B
  • the capillary electrophoresis apparatus used is Agilent CE.
  • the electrophoretic separation of the complete enzymatic hydrolysate of enoxaparin sodium is shown in Figure 4, wherein the capillary electrophoresis apparatus used is the MDQ of BECKMAN.
  • the present invention uses seven disaccharide standards (AIVA, AIS, AIIIS, AIIS, ⁇ , ⁇ , ⁇ ) to characterize disaccharides in the complete enzymatic hydrolysate of enoxaparin sodium, and for oligosaccharides that do not have access to standards.
  • Electrophoretic mobility is used as a qualitative indicator. Electrophoretic mobility is the physicochemical constant of a substance. At a specific temperature and a fixed pH buffer solution, a specific substance has a fixed electrophoretic mobility, and thus can be used as a qualitative basis for a charged substance (or ion). According to the calculation formula 1 of the electrophoretic mobility, the electrophoretic mobility of each component can be calculated from the experimental conditions.
  • L T and L D are the total length and effective length of the capillary, respectively, V is the separation voltage, and t is the peak time.
  • Equation 2 is a linear relationship between the electrophoretic mobility and the charge/mass ratio of the substance.
  • Z is the effective charge of the ion
  • ⁇ is the viscosity of the solution
  • r is the ionic radius
  • the structure of the 17 fully enzymatic hydrolysates of enoxaparin sodium is as described above.
  • the standard of at least 5 oligosaccharides was separated by capillary electrophoresis, and the electrophoresis mobility ( ⁇ ) was measured.
  • the swimming ⁇ is plotted against the charge-to-mass ratio ⁇ / ⁇ .
  • Linear regression analysis can obtain a linear equation describing the relationship between the electrophoretic mobility ⁇ and the charge-mass ratio ⁇ / ⁇ , and the electrophoretic mobility of other oligosaccharides is estimated based on the linear equation. And as a qualitative basis.
  • the present invention performs capillary electrophoresis separation on six S0 3 -disaccharide standards AIS, AIIIS, AIIS, ⁇ , ⁇ , ⁇ , and measures its electrophoretic mobility ( ⁇ ), which is measured by electrophoretic mobility ⁇
  • ⁇ electrophoretic mobility
  • the charge mass ratio ⁇ / ⁇ is plotted.
  • Linear regression analysis is used to obtain a linear equation describing the relationship between the electrophoretic mobility ⁇ and the charge-mass ratio ⁇ / ⁇ .
  • the electrophoretic mobility of other oligosaccharides is calculated based on the linear equation as a qualitative basis.
  • a preferred embodiment of the present invention measures the electrophoretic mobility of six S0 3 -disaccharide standards, and the charge-to-mass ratio of the corresponding disaccharide (at pH 2.5, only the sol in the oligosaccharide) 3 _ dissociation, so the number of so 3 _ carried by the oligosaccharide is taken as the total number of charges
  • the corresponding electrophoretic mobility (theoretical value:) can be calculated from Equation 3 and is listed in Table 1.
  • Table 1 also shows other physicochemical constants of oligosaccharides in the complete enzymatic hydrolysate of enoxaparin sodium, including molecular weight, S0 3 _ number per saccharide unit, charge mass ratio, and measured electrophoretic mobility.
  • the correlation between the theoretical calculated values and the measured values of each oligosaccharide electrophoresis by calculation is shown in Fig. 2.
  • Oligosaccharides are characterized.
  • the present invention uses seven disaccharide standards to characterize the disaccharide in the complete enzymatic hydrolysate of enoxaparin sodium.
  • the peak 17 is a disaccharide peak with S0 3 -, followed by AIS, AIIIS, AIIS. , ⁇ , AIVS, ⁇ , ⁇ . Since the pH of the buffer used is lower than the ionization constant of the carboxylate, in the buffer of about ⁇ 2.5, the disaccharide AIVA with carboxylate in the structure but without S0 3 _ is difficult to ionize, so the peak so late.
  • a certain air pressure must be applied to the injection end, and ⁇ is pushed to the detection window to be detected (peak 8 in Fig. 3).
  • the peak 9 is characterized as disaccharide galactose AIIS gal
  • the peak 10 is determined to be disaccharide galactose AISS gal . Since the AISS gal content is very low, under the conditions of pressure, and the peaks adjacent to it form a peak, it is not obvious on the electrophoresis spectrum. It can be clearly seen that the peak 10 is AIVS gal under no pressure.
  • the so 3 _ number of each sugar unit is the number of so 3 _ carried by each disaccharide unit in the oligosaccharide, calculated as the SO 3 _ total oligosaccharide unit carried by the oligosaccharide.
  • the number (one sugar unit represents a disaccharide unit composed of Dp-gluconic acid (or L- ⁇ -iduronic acid) and N-acetylglucosamine).
  • peaks 11 and 12 are tetrasaccharide peaks. According to the electrophoresis theory in which the relationship between the medium charge mass ratio and the electrophoretic mobility is linear, the peak 11 is characterized as ⁇ -IISglu, and the peak 12 is determined as AIIA-IVSglu.
  • the peak 13 overlaps with the disaccharide IS peak, and the peak 14 and the IS also partially overlap.
  • the buffer solution may also be added with a certain amount of (1 2 or 21 (1 2 to further improve the separation, and preferably, Mg 2+ may form a weak ion pair with S0 3 in the oligosaccharide structure), thereby adjusting The electrophoretic mobility of positive oligosaccharides improves the separation.
  • Mw n represents the molecular weight of the component to be determined
  • Area represents the area of the peak of the component
  • Mw x represents the molecular weight of each component in the complete enzymatic product and on the capillary electrophoresis spectrum Peak area.
  • the present invention provides a method for determining the content of an oligosaccharide chain having a 1,6-ring structure in an enoxaparin sodium component, comprising the following steps:
  • the 1,6-ringed oligosaccharide was quantitatively determined based on the peak area, and the content of the oligosaccharide chain having a 1,6-ring structure in the enoxaparin sodium component was finally determined based on the content thereof.
  • Area 14 , Area 15 , Area 16 and Area 17 correspond to the peak areas of peaks 14, 15, 16 and 17, respectively.
  • the molecular weights of these four compounds were 545, 1210, 443 and 443, respectively.
  • Mw x , Area x represent the molecular weight of each component in the complete enzymatic product and on the capillary electrophoresis spectrum, respectively Peak area.
  • the percentage of the oligosaccharide chain having a 1,6-ring structure in the enoxaparin sodium component can be calculated by the following formula (7) or (8):
  • the capillary electrophoresis method provided by the invention can be applied to the detection of fine structure identification and quantitative analysis of other kinds of polysaccharides, including heparin, low molecular weight heparin and ultra low molecular weight heparin.
  • Figure 1 is a diagram showing the charge-to-mass ratio and electrophoretic mobility of six disaccharide standards with S0 3 _;
  • Figure 2 is a correlation diagram between theoretical and measured values of oligosaccharide electrophoresis
  • Fig. 3 is a capillary electrophoresis separation of enoxaparin sodium and heparin sodium complete enzymatic hydrolysate.
  • the 3-A is the complete enzymatic hydrolysis product of heparin sodium
  • 3-B is the electrophoresis separation diagram of the complete decomposed product of USP enoxaparin sodium.
  • the instrument used therein is a capillary electrophoresis separation diagram of the complete enzymatic hydrolysis product of enoxaparin sodium of Agilent CE capillary electrophoresis apparatus, wherein the capillary electrophoresis apparatus is MDQ of BECKMAN. detailed description
  • heparin sodium sample solution 20 mg of heparin sodium sample was weighed and dissolved in 1 mL of water to prepare a 20 mg/mL solution.
  • Z/M is the oligosaccharide charge mass ratio
  • ⁇ is the corresponding electrophoretic mobility
  • the capillary electrophoresis system used was an Agilent capillary electrophoresis apparatus (Agilent CE). Quartz capillary column inner diameter 50 ⁇ , outer diameter 370 ⁇ , total length 85 cm, effective length 75 cm; buffer solution containing 200 mM Tris-3 ⁇ 4P0 4 and 2 mM MgCl 2 , H is 2.5, before adding 1% mass concentration (m/) v) polyethylene glycol (molecular weight 10000); injection pressure 50 mbar, time 15 s ; separation voltage -25 kV; application of 20 mbar pressure after the monosulfated oligosaccharide ⁇ peak (about 34 min), AIVA Pushed to the detection window for detection; column temperature 25 ° C ; detection wavelength UV 232 nm.
  • Agilent capillary electrophoresis apparatus Agilent capillary electrophoresis apparatus
  • W n % and formulas (4), (5), (6) can be used to calculate the production of each oligosaccharide
  • the percentage of the substance (as shown in Table 3), wherein 1,6-membered cyclo-oligosaccharides 14, 15, 16+17 accounted for 1.80%, 1.26% and 0.38%, respectively. It is known that the weight average molecular weight of USP enoxaparin sodium is 4432, and the ringing ratio of USP enoxaparin sodium to 1,6 is calculated by formula (7) or (8) to be 20.58%.

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Abstract

本发明提供一种用于定量分析依诺肝素钠特征性寡糖结构的毛细管电泳方法。本方法用于定量测定经肝素酶I、II、III混合溶液完全降解依诺肝素钠后产生的二糖、三糖、四糖，以及具有依诺肝素特有的标志性结构的1，6成环寡糖的含量，从而定量测定出依诺肝素钠1，6成环率。本方法可以用于依诺肝素钠药物生产过程中的质量控制。

Description

一种基于毛细管电泳的依诺肝素钠精细结构测定方法
技术领域
本发明涉及分析化学和药物分析领域， 具体地说， 涉及一种毛 细管电泳方法用于测定依诺肝素钠的精细结构，即确定构成依诺肝素 钠结构的二糖、 三糖、 四糖和具有 1， 6成环结构寡糖的种类和含量。 背景技术
肝素是由糖醛酸 (L-艾杜糖醛酸 IdoA; D-葡萄糖醛酸， GlcA)和葡 萄糖胺 (α-D葡萄糖胺， GlcN)所构成的二糖单元组成的具有不同链长 的一类硫酸化粘多糖， 具有良好的抗血凝和抗血栓的特性， 用于治疗 手术后所引发的静脉血栓。依诺肝素钠是由猪肠黏膜提取的肝素先经 酯化得到的肝素钠苄基酯衍生物，再通过碱性条件下裂解生成的低分 子量肝素。 由于硫酸化位点和数量差异， 加上碱性条件的降解， 使依 诺肝素钠结构更为复杂。 依诺肝素钠重均分子量在 3800-5000之间， 分子量分布范围要求： 小于 2000 Da不超过 20 %; 2000到 8000 Da之 间的应大于 68 %； 分子量超过 8000 Da不超过 18 %。
在依诺肝素钠生产过程中，碱性降解过程包括两个竞争性的化学 反应： β-消除和苄基酯水解。 降解后得到平均分子量在 4500左右的 低分子肝素寡糖链 JS5389618)。 依诺肝素钠寡糖链中依然保留了原 来肝素糖链中反映抗凝血活性的五糖结构，在依诺肝素钠中五糖结构 单元约占 15 %〜25 %。
在限制性降解肝素过程中，会发生脱硫酸化作用 (desulfatkm 脱 氨基作用 (deamination), 以及在寡糖链还原端的葡聚糖胺部分发生如 下的特征性的转变：（1 )葡萄糖胺与甘露糖胺之间的转化 (T. Toida et al, J Carbohydrate Chemistry, 15(13), 351-360(1996))； (2)寡糖结构末端含 有 6-0-硫酸化的葡萄糖胺的 6-0-脱硫酸化， 形成一种称为 1,6-成环的 结构。这些反应使得依诺肝素在结构上更为复杂多变， 结构改变还包 括糖链长度、 链序列以及糖结构单元精细结构上的差异。
寡糖链还原端的 1,6-成环结构是依诺肝素钠的标志性的结构特 征。 1,6-成环率是指还原末端具有 1,6-成环结构的寡糖链应占全部糖 链的百分比。 1,6-成环率被美国和欧洲药典用作依诺肝素钠质量控制 的指标。美国和欧洲药典规定还原末端具有 1,6-成环结构的寡糖链应 占全部糖链的 15 %-25 %。
由于依诺肝素钠高度的非均一性和二糖单元硫酸化程度的差异， 这使得对依诺肝素精细结构的分析任务非常艰巨。
液相色谱中的强阴离子交换 (SAX)色谱是依诺肝素钠硫酸化寡糖 组成成份分析首选的方法。另外， 高效液相色谱法或者低压色谱的凝 胶渗透色谱 (GPC)是按分子量分离多糖和脱盐的有效工具。 高效液相 色谱法用于依诺肝素完全酶解产物的分析己经有大量的文献报道 (可 参考 CN03822562. X和 CN200580009444. 0等）。 但是用强阴离子交换 (SAX)色谱测定时某些二糖结构的分辨率较差， 需要通过硼氢化钠还 原来消除^、 β端基异构现象。 毛细管电泳也被越来越多地用于硫酸化多糖分析 （参考文献 US
7,575,886 B2， Ampofo, S. et al., Anal. Biochem. 199:249-255 (1991); Malsch et al, J. Chromatogr. A. 716:258-268 (1995) 。 但是， 用毛细管 电泳分离和测定 1， 6-成环率的方法还未见报道。
it匕 夕卜 ， MALDI-TOF-MS(matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometric, 基质辅助激光角军析电离化 / 飞行时间质谱：)不需要色谱分离， 它也可作为一种主要的方法用来分 析肝素多糖， 并可作为多糖序列测定的工具 (H. Sakaguchi et al., J.Biochem.129(2001)107-118; A. J. Rhomberg,. et al., Proc.Nalt. Acad. Sci. USA 95 (1998)4176-4181; L. Sturiale, et al., Semin. Thromb. Hemost. 27(2001)465-472)。 然而 MALDI-TOF-MS不能解决复杂的混 合物的分析， 而且由于价格昂贵， 不适合做产品的质量控制。 发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的基于毛细管电泳技术测定 依诺肝素钠多成分精细结构的分析方法，确定构成依诺肝素结构的二 糖、 三糖、 四糖和四种 1， 6成环寡糖的种类和含量。
本发明的另一个目的在于提供一种新的基于毛细管电泳技术的 测定依诺肝素钠成分中带有 1,6-成环结构的寡糖链的百分数含量 (通 常称 1,6 成环率:)的方法， 并用于依诺肝素钠药物生产过程的质量控 制。 该方法完全有别于基于高效液相色谱 SAX离子色谱测定 1,6成 环率的方法。 本发明涉及的毛细管电泳方法可用于依诺肝素钠完全酶解产物 中二糖， 三糖及四糖成分的分离与定量测定， 特别是可以测定标志依 诺肝素钠结构特征的带有 1,6-成环结构的寡糖链的百分数含量。
本发明提供的依诺肝素钠精细结构的检测方法包括如下步骤：
( 1 ) 用混合肝素酶将依诺肝素钠样品完全酶解；
(2) 通过毛细管电泳对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖、 三 糖、 四糖以及具有 1， 6成环结构的寡糖进行分离；
(3 ) 根据完全酶解后所得到的寡糖的电荷质量比与其电泳淌度 之间的线性关系对分离峰所对应的酶解产物进行鉴定；
(4) 根据色谱峰峰面积对酶解产物含量进行定量测定。
本发明涉及的毛细管电泳分析方法，首先需要将依诺肝素钠样品 通过混合肝素酶完全酶解， 然后通过毛细管电泳进行分离分析。肝素 酶混合物包括肝素酶 I(EC 4.2.2.7.)， 肝素酶 Π(无 EC 号：)和肝素酶 III(EC 4.2.2.8.)中的至少两种， 优选的是三种酶混合， 最优选三种酶 以 1 : 1： 1的比例混合。
依诺肝素钠经完全酶解后的产物中， 存在以下 4种具有 1,6-成环 结构的寡糖：
Figure imgf000007_0001
,6-An hydro AIS or 1,6-Anhydro AIS glucose 1,6-Anhydro AIIS or 1,6-Anhydro AIIS glucose
Figure imgf000007_0002
1,6-Anhydro AIIS epi or 1,6-Anhydro AIIS mannose 1,6-Anhydro AIS-IS epi or 1,6-Anhydro AIS-IS mannose 如果与末端 1,6-成环的二糖单元相邻的二糖的糖醛酸上没有 2-0- 硫酸化基团， 经肝素酶完全酶解后将以二糖的形式存在， 当与 1,6-成 环二糖相连接的二糖上的糖醛酸上含有一个 2-0-硫酸化基团，并且当 它是以甘露糖胺形式存在时， 1,6-成环结构以四糖的 (该形式能够阻止 肝素酶的酶解：)形式产生。
酶解产物中也存在三糖。三糖 1形成于其他的降解过程， 结构如 下：
Figure imgf000007_0003
三糖 l(Trisaccharide)
完全酶解产物混合物中其他成分不具有依诺肝素钠特征性，其中 包括 8个肝素二糖。 结构如下: a+
Figure imgf000008_0001
本发明提供的方法也可能检测到完全酶解产物中的其他二糖成 分 ： AIISgal 和 AIVSgal ， 它们 是 由 IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和 IdoA(2S)-GlcNS-的 2-0-去硫酸化生成 2种半乳糖醛酸形式。 这两种 二糖通常不会存在于肝素的初始结构中 (U. M. Desai et al., Arch. Biochem. Bio hys., 306(2)461-468(1993))。
Figure imgf000008_0002
对于大部分低分子量肝素中含有的主要四糖如下所示。这些四糖 链能够抵抗酶的降解作用，并能反映抗凝血酶 III亲和力的序列片段。 两种四糖使用下列符号表示： ΔΙΙΑ-IISglu和 AIIa-IVSglu(S. Yamada, et al.， J. Biol. Chem.; 270(7), 4780-4787(1993))。
Figure imgf000009_0001
ΔΙΙΑ-IVSglu
上述的二糖、三糖、四糖和 1， 6成环寡糖结构鉴定亦可参见美国 药典 (Second Supplement, USP-NF, Chemical Tests/<207> 1,6- Anhydro Derivative for Enoxaparin Sodium)。
本发明通过毛细管电泳方法对依诺肝素钠完全酶解产物中的二 糖、三糖和四糖以及 1， 6成环结构的寡糖进行分离。本发明所使用石 英毛细管总长范围为 50〜100 cm，柱内径范围为 25〜75 μιη。石英毛细 管柱的有效长度一般为柱总长减去 10 cm, 根据实际使用毛细管电泳 仪型号不同可能略有偏差。
在本发明的另一实施方案中，石英毛细管总长范围为 70〜100cm， 柱内径范围为 40-60 μηΐο 毛细管电泳所使用的缓冲溶液可选为 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04， 浓度范围为 150〜300 mM， pH范围为 1.5〜4.0。
在本发明的另一实施方案中， 优选的缓冲溶液可选为 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04， 浓度范围为 200〜250 mM, pH范围为 2.0〜4.0。
在本发明的另一实施方案中，优选可在上述的缓冲溶液中可加入 浓度范围为 1〜5 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， 0.1 %〜5 %质量浓度 (m/v) 的聚乙二醇（PEG, 分子量范围为 5000〜100000)。 向缓冲溶液中加入 0.1 %〜5 %的 MgCl2或 ZnCl2以及 PEG的目的是微调具有相近电泳淌 度的寡糖， 例如： AIS, Trisaccharide和 1,6-AnhydroAIS-IS的电泳迁移 时间， 从而使它们的分离度得到显著地改善。
在本发明的另一实施方案中，优选可在上述的缓冲溶液中可加入 浓度范围为 2〜4 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， 1%〜3 % 质量浓度 (m/v)的聚 乙二醇分子 （PEG, 分子量范围为 10000〜50000)。
毛细管电泳时使用电压为 -15〜- 30 kV， 优选为 -20〜- 25 kV， 可根 据毛细管电泳仪型号做适当调整。
本发明所述方法的毛细管电泳采用压力进样。 进样压力范围为 1-100 mbar，进样时间范围为 1〜60秒（s);优选进样压力范围为 30-60 mbar， 进样时间范围为 5〜30 s; 更优选进样压力范围为 40-50 mbar， 进样时间范围为 10〜20 s。
毛细管电泳过程中， 在最后一个硫酸化二糖 ΔΠΑ出峰之后向进 样端施加一定的气压将 ΔΐνΑ推向检测窗口进行检测。 压力范围可为 5 150mbar， 优选可为 5-30mbar 10-20mbar或 30-150mbar等， 可根 据使用的毛细管电泳仪做适当调整。
本发明所使用毛细管柱温范围为 10 40 V， 优选 20 30 V 本发明所使用检测波长为紫外 230-235 nm,优选 230-232nm 作为优选，毛细管电泳分离的条件范围为石英毛细管总长范围为 50 100cm， 柱内径范围为 25 75μιη; 缓冲溶液含 150 300mM 的 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04 1 5 mM 的 MgCl2 或 ZnCl2 H范围为 1.5-4.0,使用前加入 0.1% 5.0% 质量浓度（m/v) 的聚乙二醇分子， 分子量范围为 5000 100000； 毛细管电泳时使用电 压为 -15 - 30 kV; 采用压力进样， 压力范围为 l 100mbar， 时间范围 为 1 60 s; 在最后一个单硫酸化二糖 (ΔΠΑ)出峰之后施加 5 150 mbar的压力，将 AIVA推向检测窗口实现检测； 电泳时毛细管柱温范 围为 10-40 V， 检测波长为紫夕卜 230-235
作为优选，毛细管电泳分离的条件范围为石英毛细管总长范围为 50 100cm， 柱内径范围为 25 75μιη; 缓冲溶液含 150 300mM 的 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04 1 5 mM 的 MgCl2 或 ZnCl2 pH范围为 1.5-4.0,使用前加入 0.1% 5.0% 质量浓度（m/v) 的聚乙二醇分子， 分子量范围为 5000 100000； 毛细管电泳时使用电 压为 -15 - 30 kV; 采用压力进样， 压力范围为 30 60mbar， 时间范围 为 5 30 s; 在最后一个单硫酸化二糖 (ΔΠΑ)出峰之后施加 5 150 mbar的压力，将 ΔΙΥΑ推向检测窗口实现检测； 电泳时毛细管柱温范 围为 10-40 °C， 检测波长为紫夕卜 230-235
在本发明的另一实施方案中，优选的毛细管电泳分离条件范围为 石英毛细管总长 70 100 cm, 柱内径 40 60μιη; 缓冲溶液含 200 250mM的 NaH2P04-H3P04 Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04 2〜4 mM的 MgCl2 pH范围为 2 4， 使用前加入 1 3%质量浓度 (m/v)的聚 乙二醇， 分子量范围为 10000 50000； 分离电压为 -15 - 25 kV; 采用 压力进样， 进样压力范围为 40 50 mbar， 时间范围为 10 20 s; 在单 硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后加压 10 20 mbar， 将 ΔΓ/Α推向检测窗口 实现检测； 柱温 20 30 °C; 检测波长紫外 230-232nm
作为优选的实施例， 本发明给出毛细管电泳分离的一个优选条 件：
石英毛细管内径 50 μιη, 总长 85 cm; 缓冲溶液含 200 mM的 Tris-H3P04 和 2mM的 MgCl2 pH为 2.5， 使用前加入 1%质量浓度 (m/v) 的聚乙二醇， 分子量为 10000; 进样压力为 50 mbar， 时间为 15 s; 分离电压 -25 kV; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后加压 20 mbar 将 AIVA推向检测窗口实现检测； 柱温 25 °C; 检测波长紫外 232nm 作为优选的实施例，本发明给出毛细管电泳分离的另一个优选条 件：
石英毛细管柱内径 50 μιη, 总长 80 cm; 缓冲溶液为 200 mM Tris-H3P04和 2 mM MgCl2 pH为 2.7，使用前加入 1.3%质量浓度 （m/v) 的聚乙二醇， 分子量为 10000; 进样压力为 55 mbar， 时间为 10 s; 分离电压 -22 kv; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后加压 138 mbar， 将 AIVA推向检测窗口实现检测； 柱温 25 °C ; 检测波长紫外 230 nm。 作为一个优选的实施例， 肝素钠完全酶解产物电泳分离图见图 3-A， 依诺肝素钠完全酶解产物电泳分离图见图 3-B， 所使用毛细管 电泳仪为 Agilent CE。
作为另一个优选的实施例，依诺肝素钠完全酶解产物电泳分离图 见图 4， 其中使用的毛细电泳仪为 BECKMAN的 MDQ。
本发明使用 7个二糖标准品 (AIVA， AIS， AIIIS, AIIS， ΔΙΑ， ΔΙΙΑ, ΔΙΠΑ)对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖进行定性， 而对于无法获 取标准品的寡糖采用电泳淌度作为定性指标。电泳淌度是物质的物理 化学常数， 在特定温度下和固定 pH值的缓冲溶液中， 特定的物质具 备固定的电泳淌度， 因此可以作为带电物质（或离子）的定性的依据。 根据电泳淌度的计算公式 1， 由实验条件可以计算出各个成份的电泳 淌度。
Figure imgf000013_0001
公式中 LT和 LD分别是毛细管的总长和有效长度， V为分离电压， t 为出峰时间。
公式 2为电泳淌度与物质的电荷 /质量比呈线性关系方程。
Z
μ = - (2)
π · η - r 公式中 Z为离子的有效电荷， η为溶液的粘度， r为离子半径。
依诺肝素钠 17个完全酶解产物的结构如前所述。 对其中至少 5 个寡糖的标准品进行毛细管电泳分离， 测出其电泳淌度 （ μ )， 用电 泳淌度 μ对其电荷质量比 Ζ/Μ作图， 线性回归分析可以得到描述电 泳淌度 μ和电荷质量比 Ζ/Μ之间关系的线性方程， 根据线性方程推 算其他寡糖的电泳淌度并作为定性依据。
优选的， 本发明对 6个带有 S03-二糖标准品 AIS， AIIIS, AIIS， ΔΙΑ， ΔΙΙΑ, ΔΠΙΑ进行毛细管电泳分离， 测出其电泳淌度 （ μ )， 用 电泳淌度 μ对其电荷质量比 ζ/Μ作图， 用线性回归分析得到描述电 泳淌度 μ与电荷质量比 ζ/Μ之间关系的线性方程， 根据线性方程推 算其他寡糖的电泳淌度作为定性依据。
本发明一个优选的实施例测量得到 6个带有 S03—二糖标准品的电 泳淌度， 对相应的二糖的电荷质量比 (在 pH 2.5的条件下， 寡糖中只 有所带的 so 3_解离， 因此将寡糖所带的 so 3_个数作为总电荷数 M乍图
(如图 1所示）， 得到一个线性方程 (R2= 0.9995)。
Figure imgf000014_0001
方程中 Z/M为寡糖电荷质量比； μ为对应的电泳淌度。
根据完全酶解产物中各个寡糖的电荷质量比， 由方程 3可以计算 出相应的电泳淌度 (理论值：)列于表 1中。 此外， 表 1还给出了依诺肝 素钠完全酶解产物中寡糖的其他物理化学常数， 包括分子量、每个糖 单元所带的 S03_数、 电荷质量比和实测的电泳淌度。通过计算得到的 各个寡糖电泳淌度理论计算值与实测值之间的相关性图如图 2所示。 各个组份电泳计算值与实测值基本上都分布在 y = X的直线线上， 相 关系数为 0.98。 表明两者之间具有良好的相关性。 因此， 我们可以依 据电泳淌度与电荷质量比的线性关系对依诺肝素钠完全酶解产物中 寡糖进行定性。
本发明用 7 个二糖标准品对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖 进行定性，图 3中，峰 1 7为带有 S03—的二糖峰，依次为 AIS、 AIIIS, AIIS, ΔΙΑ、 AIVS、 ΔΠΙΑ、 ΔΠΑ。 由于使用的缓冲液的 ρΗ低于羧酸 根的电离常数， 在 ρΗ2.5左右的缓冲液中， 结构中带有羧酸根但不带 有 S03_的二糖 AIVA很难发生电离， 因此出峰很晚。 在运行过程中必 须在进样端施加一定的气压力， 将 ΔΐνΑ推向检测窗口从而得到检测 (图 3中的色谱峰 8)。
本发明中依据电荷质量比与电泳淌度之间呈线性关系的电泳理 论， 峰 9定性为二糖半乳糖 AIISgal， 峰 10定为二糖半乳糖 AIVSgal。 由于 AIVSgal含量很低， 在加压的条件下， 和旁边的峰形成包峰， 所 以在电泳谱图上不明显。 在不加压的条件下可以清楚地看到峰 10为 AIVSgal。
表 1. 依诺肝素钠完全酶解产物中寡糖的物理化学常数
Figure imgf000015_0001
10 AIVSgal 461 1 2.17 1.574
11 ΔΙΙΑ-IISg 1168 2 3.48 2.429 2.432
lu
12 ΔΙΙΑ-IVS 1066 1.5 2.81 1.991 2.057
glu
13 Trisaccha 965 2.67 4.15 2.867 2.923
ride
14 1,6-Anhy 1210 2.5 4.13 2.854 2.903
droAIS-IS
15 1,6-Anhy 545 2 3.67 2.553 2.612
dro AIS
16/17 1,6-Anhy 443 1 2.26 1.632 1.693
dro AIIS
注释： 每个糖单元 so 3_数为寡糖中平均每个二糖单元所带有的 so 3_的个数， 计算方法为寡 糖所带有的 SO 3_总数比寡糖二糖单元的个数 (一个糖单元代表由 D-p-葡糖酸酸 (或 L-α-艾杜 糖酸酸)和 N-乙酰氨基葡糖组成的二糖单元)。 图 3中峰 11和 12为四糖峰，本发明依据中电荷质量比与电泳淌 度之间呈线性关系的电泳理论， 将峰 11 定性为 ΔΠΑ-IISglu, 峰 12 定为 AIIA-IVSglu。 本发明中， 用基本缓冲溶液条件分离样品时， 在电泳图中， 峰 13会与二糖 IS峰重叠， 峰 14与 IS也会发生部分重叠现象。 我们可 在缓冲溶液中加入一定浓度的 PEG,峰 1与峰 13得到了良好的分离。 这是因为在缓冲溶液加入 PEG后， 不同分子量大小的寡糖出峰时间 将改变， 使得分离结果得到显著地改善。
本发明中缓冲溶液还可加入一定量的 ^¾( 12或21 ( 12进一步改进 分离，作为优选， Mg2+可以与寡糖结构中的 S03—形成弱的离子对结合， 从而调正寡糖的电泳淌度， 使分离得到改善。
在依诺肝素钠化学酶降解过程中会产生三糖，根据电荷质量比与 电泳淌度的关系所建立的方程可以确定峰 13为三糖。 同样依据电荷质量比与电泳淌度的线性关系对 4种 1,6成环寡糖 定性。 l,6-AnhydroAIS-IS的电荷质量比与三糖的电荷质量比非常接近 (少 0.02)， 在分离过程中会紧随三糖出峰， 因此峰 14 为 l,6-AnhydroAIS-IS。 用 SAX-HPLC对同一完全酶解的伊诺肝素进行 分离， 对比三糖和 1， 6-成环的四糖的峰面积之比， 也能帮助色谱峰 的归属。 1,6-Anhydro AIS的电荷质量比为 3.67，在电泳谱图中可以确 定峰 15为 1,6-Anhydro AIS。 1,6-Anhydro AIIS以 1,6-Anhydro AIIS和 1,6-Anhydro AIIS epi (互为差象异构） 体形式出现， 因此在电泳谱图 中出现两组峰。 图 3中 16,17为 1,6-Anhydro AIIS , 与文献报道的高 效液相色谱方法分离结果完全一致。
图 3中各峰的归属列于表 1中。
电泳图中各组份峰面积与寡糖的摩尔浓度成正比， 因此本发明 根据各组分的峰面积， 可采用面积百分数归一化方法， 对上述各个组 份实现定量测定。 其公式如下所示： „o/o = 100 x Mwn , Arean
∑ w x Areax 式中 Mwn代表待测定组分的分子量， Area 表该组分分离峰的面 积， Mwx, Areax分别代表完全酶解产物中各个组分的分子量和在毛细 管电泳谱图上的峰面积。
作为一个具体的应用，本发明提供了一种依诺肝素钠组分中具有 1,6-成环结构的寡糖链含量的测定方法， 包括如下步骤：
( 1 ) 用混合肝素酶将依诺肝素钠样品完全酶解；
(2) 通过毛细管电泳对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖、 三 糖、 四糖以及具有 1， 6成环结构的寡糖进行分离；
(3 ) 根据完全酶解后所得到的寡糖的电荷质量比与其电泳淌 度之间的线性关系对分离峰所对应的酶解产物进行鉴定， 确定具有
1,6-成环结构的寡糖的分离峰；
(4) 根据峰面积对具有 1,6-成环的寡糖进行定量测定， 根据其 含量最终确定依诺肝素钠组分中具有 1,6-成环结构的寡糖链的含量。
上述方法步骤中， 各项参数范围如前所述。
本发明所述的方法中， 采纳一种己经被普遍接受的假设： 在完全 酶解产物中的所有不饱和寡糖在紫外 230-235 nm波长下检测时， 具 有相同的吸光度， §Ρ 5500
Figure imgf000018_0001
因此，依诺肝素钠完全酶解产物中的所有成分都可以使用归一化 法确定百分含量。 例如， 1,6成环二糖 1 ( l,6-Anhydro AIIS)， 二糖 2 ( 1,6-Anhydro AIIS )， 二糖 3 ( 1,6-Anhydro AIS ) 和四糖 1 ( 1,6-AnhydroAIS-IS) 分别对应峰 16,17, 15和 14， 可以使用如下公 式计算：
Figure imgf000018_0002
2^ Mwx x Areax
Figure imgf000018_0003
2_l (Mwx x Area
0/ 1 ΛΛ 1210 x Areal5 Λ
wl5 % = 100 x ~ (6)
2_l (Mwx x Areax )
Area14, Area15, Area16和 Area17分别对应峰 14, 15, 16和 17的峰面 积。这四种化合物的分子量分别为 545， 1210, 443和 443。 Mwx， Areax 分别代表完全酶解产物中各个组分的分子量和在毛细管电泳谱图上 的峰面积。
如果所研宄的依诺肝素钠的重均分子量为 Wx， 则依诺肝素钠组 分中含 1,6成环结构的寡糖链的百分数可以由如下公式 (7)或 (8)计算：
\,6Anhydro% = Wx x + ^ + (7)
443 545 1210
(Areal4 + Areal5 + Areal6 + Areal7 ) ί ϋ Λ
\,6Anhydro% = 100 x x ^—— ― (8；
2_l (Mwx X Areax) 依诺肝素钠结构中其他成分的百分含量也可以用同样的方法计 算得出。
本发明所提供的毛细管电泳方法能够应用于检测其他种类多糖 的精细结构鉴定和定量分析， 其中包括肝素， 低分子量肝素和超低分 子量肝素等。 附图说明
图 1 为 6个带有 S03_的二糖标准品的电荷质量比与电泳淌度 系图；
图 2 寡糖电泳淌度理论值与实测值相关性图；
图 3依诺肝素钠和肝素钠完全酶解产物的毛细管电泳分离图， 中 3-A为肝素钠完全酶解产物分离图， 3-B为 USP依诺肝素钠完全 解产物的电泳分离图， 其中使用的仪器为 Agilent CE毛细管电泳仪 图 4 依诺肝素钠完全酶解产物的毛细管电泳分离图， 其中使 的毛细电泳仪为 BECKMAN的 MDQ。 具体实施方式
实施例 1 样品溶液配制
(1) pH 7.0的醋酸钠 /醋酸钙溶液的配制：分别称取 10 mg牛血清白蛋 白， 32 mg醋酸钙溶解于 60 mL水中，加入 580 μ 冰醋酸，用 2 M 的 NaOH溶液调至 pH 7.0后， 将溶液转至 100 mL容量瓶中， 定 容至刻度。 使用前， 用孔径为 0.45 μιη的过滤膜过滤。
(2) 磷酸钾 pH 7.0缓冲液的配置： 68 mg磷酸二氢钾和 10 mg牛血清 白蛋白溶于 30 毫升水中。 用氢氧化钾将溶液调至 pH7.0， 然后将溶 液移至 50毫升容量瓶中， 加水定容。
(3) 依诺肝素酶溶液的配制：三种肝素酶分别用磷酸钾 pH 7.0缓冲液 溶解， 得到的酶溶液浓度的为 0.4 IU/mL。 溶液放置 -20°C保存待用。
(4) 肝素酶 I， II， III混合酶溶液的配置： 将上述方法配置的肝素酶溶 液按体积比为 1 :1:1的比例混合。
(5) 肝素钠样品溶液的配制：称取肝素钠样品 20 mg,用 1 mL水溶解， 配制成 20 mg/mL的溶液。
( 6)依诺肝素钠样品完全酶解反应： 分别量取 20 依诺肝素钠样品 溶液， 70 μ 的醋酸钠—醋酸钙溶液 (pH 7.0),和 100 μ 肝素酶 (Ι,Π,ΠΙ) 混合溶液， 缓慢地混合均匀， 置于 25 °C的水浴中反应 48 h。待酶解完 全后， 进样分析。
(7) 肝素钠样品完全酶解反应： 分别量取 20 肝素钠样品溶液， 70 的醋酸钠—醋酸钙溶液 (pH 7.0), 和 100 肝素酶 (Ι,Π,ΠΙ)混合溶 液， 缓慢地混合均匀， 置于 25 °C的水浴中反应 48 h。 待酶解完全之 后， 进样分析。
(8) 取 7个二糖标准品 (AIVA， AIS， AIIIS, AIIS， ΔΙΑ， ΔΙΙΑ, ΔΙΙΙΑ) 溶液各 20 L， 混合后， 按实施例 2所述的电泳条件进行分离。 测量 其中 6个带有 S03—二糖标准品的电泳淌度，对相应的二糖的电荷质量 比作图（图 1), 得到一个线性方程 (R2= 0.9995)。
Figure imgf000021_0001
方程中 Z/M为寡糖电荷质量比； μ为对应的电泳淌度。
(9) 通过计算得到的各个寡糖电泳淌度理论计算值与实测值之间的 相关性如图 2所示。 各个组份电泳计算值与实测值基本上都分布在 y = x的直线上， 相关系数为 0.98， 表明两者之间具有良好的相关性。 实施例 2 毛细管电泳条件
所用毛细管电泳仪为安捷伦毛细管电泳仪 （Agilent CE)。 石英 毛细管柱内径 50 μιη， 外径 370 μιη， 总长 85 cm， 有效长度 75 cm; 缓冲溶液含 200 mM Tris-¾P04和 2 mM MgCl2， H为 2.5， 使用前 加入 1 %质量浓度 （m/v) 聚乙二醇 （分子量为 10000); 进样压力 50 mbar，时间 15 s;分离电压 -25 kV;在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后 (约 34 min)施加 20 mbar压力， 将 AIVA推向检测窗口从而得到检测； 柱 温 25 °C ; 检测波长紫外 232 nm。
肝素钠和依诺肝素钠完全酶解产物电泳分离图如图 3所示， 其 中图 A为肝素钠完全酶解产物电泳分离图， B为依诺肝素钠完全酶解 产物电泳分离图。 实施例 3 样品分析 1
从图 3中可以看出， 只有依诺肝素钠完全酶解产物中含有 1,6成 环寡糖 ， 根据 电泳 图 中 各寡糖峰 的 峰面积和 公式
Wn % = \00 x w" x Area" 及公式 (4)、 （5)、 （6)可计算各寡糖在酶解产
∑Mwx X Areax 物中百分含量 (如下表 2所示: )， 其中 1,6成环寡糖 14, 15, 16+17分别 占 1.61 %、0.95 %和 0.64 %。己知 USP依诺肝素钠重均分子量为 4432， 通过公式 (7)或 （8) 计算得 USP依诺肝素钠 1,6成环率为 19.99 %。
表 2 依诺肝素钠完全酶解产物中各寡糖峰面积及百分含量
Figure imgf000022_0001
注： 峰 10因峰面积太小无法准确积分， 对成环率计算的影响可忽略不计。 实施例 4样品分析 2
所用的毛细管电泳仪为 Beckman MDQ。 石英毛细管柱内径 50μιη, 总长 80 cm; 缓冲溶液含 200 mM Tris-H3P04和 2 mM MgCl2， pH 为 2.7， 使用前加入 1.3% 质量浓度 (m/v) 聚乙二醇 （分子量为 10000)； 进样压力 55mbar， 时间为 10 s; 分离电压 -22 kv; 在单硫酸 化寡糖 ΔΠΑ出峰之后加压 138mbar，将 AIVA推向检测窗口从而得到 检测； 柱温 25 °C ; 检测波长紫外 230 nm。
依诺肝素钠完全酶解产物电泳分离图见图 4， 完全酶解产物中各 寡糖峰面积及百分含量见表 3。
表 3 依诺肝素钠完全酶解产物中各寡糖峰面积及百分含量
Figure imgf000023_0001
注： 峰 10因峰面积太小无法准确积分， 对成环率计算的影响可忽略不计。 根 据 电 泳 图 4 中 各 寡 糖 峰 的 峰 面 积 和 公 式
Wn % = 及公式 (4)、 （5)、 （6)可计算各寡糖在酶解产
Figure imgf000024_0001
物中百分含量 (如表 3所示：)， 其中 1,6成环寡糖 14, 15, 16+17分别占 1.80 %、 1.26%和 0.38 %。 己知 USP依诺肝素钠重均分子量为 4432， 通过公式 (7)或 （8) 计算得 USP依诺肝素钠 1,6成环率为 20.58 %。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种依诺肝素钠精细结构的检测方法， 包括如下步骤：
( 1 ) 用混合肝素酶将依诺肝素钠样品完全酶解；
(2) 通过毛细管电泳对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖、 三 糖、 四糖以及具有 1， 6成环结构的寡糖进行分离；
(3 ) 根据完全酶解后所得到的寡糖的电荷质量比与其电泳淌度 之间的线性关系对分离峰所对应的酶解产物进行鉴定；
(4) 根据色谱峰峰面积对酶解产物含量进行定量测定。
2、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (1)中肝 素酶混合溶液包括肝素酶 I(EC 4.2.2.7.)'肝素酶 Π(无 EC号：)和肝素酶 III(EC 4.2.2.8.)中的至少两种。
3、 根据权利要求 2所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (1)中混 合肝素酶为包含肝素酶 I、 肝素酶 II和肝素酶 III的混合溶液。
4、 根据权利要求 3所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (1)中混 合肝素酶中肝素酶 I、 肝素酶 II和肝素酶 III以 1： 1： 1的比例混合。
5、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 完全酶解产物中具有 1,6-成环结构的寡糖的结构如下： Na+
Figure imgf000026_0001
1,6-Anhydro AIS or 1 ,6-Anhydro AIS glucose -Anhydro AIIS or 1,6-Anhydro AIIS glucose
Figure imgf000026_0002
1 ,6-Anhydro AIIS epi or 1 ,6-Anhydro AIIS mannose ,6-Anhydro AIS-IS epi or 1 ,6-Anhydro AIS-IS mannose
6、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 完全酶解产物中三糖具有如下的结构：
7、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 完全酶解产物中的 8个二糖具有如下结构：
Figure imgf000027_0001
8、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中 完全酶解产物中其他二糖成分 AIISgal和 AIVSgal具有如下结构：
+
Figure imgf000027_0002
9、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 完全酶解产物中两种四糖 ΔΠΑ-IISglu和 Alla-IVSglu具有如下结构:
Figure imgf000028_0001
10、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 石英毛细管总长范围为 50〜100 cm, 柱内径为 25〜75 μιη。
11、根据权利要求 10所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 石英毛细管总长范围为 70〜100 cm, 柱内径范围为 40〜60 μιη。
12、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液可选为 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04 或 LiH2P04-H3P04, 浓度范围为 150〜300 mM， pH范围为 1.5〜4.0。
13、根据权利要求 12所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液可选为 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04 或 LiH2P04-H3P04, 浓度范围为 200〜250 mM， pH范围为 2.0〜4.0。
14、 根据权利要求 12或 13所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液中还包括 l〜5 mM的 MgCl2或 ZnCl2， 0.1 %〜5%质量浓度 (m/v)的聚乙二醇分子，其分子量范围为 5000〜100000。
15、根据权利要求 14所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液中还包括 2〜4 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， l%〜3% 质 量浓度 (m/v)的聚乙二醇分子， 其分子量为 10000〜50000。
16、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳所使用分离电压为 -15〜- 30 kV。
17、根据权利要求 16所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳所使用分离电压为 -20〜- 25 kV。
18、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 进样压力范围为 1〜100 mbar， 进样时间范围为 1〜60 s。
19、根据权利要求 18所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 进样压力范围为 30-60 mbar、进样时间范围为 5〜30 s或进样压力范围 为 40-50 mbar、 进样时间范围为 10〜20 s。
20、 根据权利要求 18或 19所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 在最后一个硫酸化二糖 ΔΠΑ出峰之后向进样端施加一定的气 压将 AIVA推向检测窗口进行检测。
21、根据权利要求 20所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 施加的压力范围可为 5〜150 mbar。
22、根据权利要求 21所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 施加的压力范围可为 5-30mbar， 10-20mbar或 30-150mbar等，可根据 使用的毛细管电泳仪做适当调整。
23、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳使用的柱温范围为 10〜40 °C。
24、根据权利要求 23所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管柱温范围为 20〜30 V。
25、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳使用的检测波长为紫外 230-235 nm。
26、根据权利要求 25所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳使用的检测波长为紫外 230-232 nm。
27、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管总长范围为 50〜100cm， 柱内径 范围为 25〜75μιη; 缓冲溶液含 150〜300mM 的 NaH2P04-H3P04 , Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04， 1〜5 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， pH范围 为 1.5〜4.0，使用前加入 0.1%〜5.0%质量浓度（m/v)的聚乙二醇分子， 分子量范围为 5000〜100000； 毛细管电泳时使用电压为 -15〜- 30 kV; 采用压力进样， 压力范围为 l〜100 mbar， 时间范围为 l〜60 s; 在最后 一个单硫酸化二糖 (ΔΠΑ)出峰之后施加 5〜150 mbar的压力， 将 AIVA 推向检测窗口实现检测； 电泳时毛细管柱温范围为 10〜40 °C， 检测波 长为紫外 230-235 nm。
28、根据权利要求 27所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管总长范围为 50〜100cm， 柱内径 范围为 25〜75μιη; 缓冲溶液含 150〜300mM 的 NaH2P04-H3P04 , Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04， 1〜5 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， pH范围 为 1.5〜4.0，使用前加入 0.1%〜5.0%质量浓度（m/v)的聚乙二醇分子， 分子量范围为 5000〜100000； 毛细管电泳时使用电压为 -15〜- 30 kV; 采用压力进样， 压力范围为 30 60mbar， 时间范围为 5 30s; 在最后 一个单硫酸化二糖 (ΔΠΑ)出峰之后施加 5 150 mbar的压力， 将 AIVA 推向检测窗口实现检测； 电泳时毛细管柱温范围为 10 40 °C， 检测波 长为紫外 230-235 nm
29、根据权利要求 27所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管总长 70 100 cm, 柱内径 40 60μηι; 缓冲溶液含 200 250mM的 NaH2P04-H3P04 Tris-H3P04 或 LiH2P04-H3P04 2 4mM的 MgCl2 pH范围为 2 4， 使用前加入 1 3%质量浓度 (m/v)的聚乙二醇， 分子量范围为 10000 50000； 分离 电压为 -15 - 25 kV; 采用压力进样， 进样压力范围为 40 50mbar， 时 间范围为 10 20 s; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后加压 10 20 mbar, 将 ΔΐνΑ 推向检测窗口实现检测； 柱温 20 30 °C; 检测波长紫外 230-232
30、根据权利要求 27所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管内径 50 μηι， 总长 85 cm; 缓冲 溶液含 200 mM的 Tris-¾P04和 2 mM的 MgCl2 pH为 2.5， 使用 前加入 1%质量浓度 (m/v) 的聚乙二醇， 分子量为 10000; 进样压力为 50 mbar, 时间为 15 s; 分离电压 -25 kV; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰 之后加压 20mbar， 将 AIVA推向检测窗口实现检测； 柱温 25 °C; 检 测波长紫外 232 nm
31、根据权利要求 27所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管柱内径 50 μηι， 总长 80 cm; 缓 冲溶液为 200 mM Tris-H3PO4和 2 mM MgCl2， pH为 2.7，使用前加入 1.3%质量浓度 （m/v)的聚乙二醇， 分子量为 10000; 进样压力为 55 mbar， 时间为 10 s; 分离电压 -22 kv; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后 加压 138 mbar， 将 ΔΐνΑ推向检测窗口实现检测； 柱温 25 °C ; 检测 波长紫外 230 nm。
32、 根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (3)中， 对依诺肝素钠完全酶解产物中至少 5个寡糖的标准品进行毛细管电 泳分离， 测出其电泳淌度 （ μ )， 用电泳淌度 μ对其电荷质量比 Ζ/Μ 作图， 用线性回归分析可以得到描述电泳淌度 μ与电荷质量比 Ζ/Μ 之间关系的线性方程，根据线性方程再推算其他寡糖的电泳淌度并作 为定性依据。
33、根据权利要求 32所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (3)中， 对依诺肝素钠完全酶解产物中 6个带有 S03_的二糖标准品 AIS，AIIIS， AIIS， ΔΙΑ， ΔΙΙΑ和 ΔΠΙΑ进行毛细管电泳分离，测出其电泳淌度（ μ )， 用电泳淌度 μ对其电荷质量比 Ζ/Μ作图， 用线性回归可以得到描述 电泳淌度 μ与电荷质量比 Ζ/Μ之间关系的线性方程， 根据线性方程 推算其他寡糖的电泳淌度并作为定性依据。
34、根据权利要求 33所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (3)中， 酶解产物中的寡糖的电荷质量比与其电泳淌度之间存在如下的线性 关系：
Figure imgf000032_0001
方程中 Ζ/Μ为寡糖电荷质量比； μ为对应的电泳淌度。
35、根据权利要求 1所述的检测方法， 其特征在于： 根据步骤 (4)， 由 峰面积可以计算出各组分的含量， 其公式如下所示：
Mw X Area
^ % = 100 x—— n- n—
∑ Mwx x Areax 式中 MwJ 表所要测定的寡糖成份的分子量， Arean代表该寡糖 在电泳图中的峰面积， Mwx， Areax分别代表完全酶解产物中各个寡 糖成份的分子量和在电泳谱图上相应的峰面积。
36、 一种测定依诺肝素钠组分中具有特征性的 1,6-成环结构的寡糖含 量的方法， 包括如下步骤：
( 1 ) 用混合肝素酶将依诺肝素钠样品完全酶解；
(2) 通过毛细管电泳对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖、 三 糖、 四糖以及具有 1， 6成环结构的寡糖进行分离；
(3 ) 根据完全酶解后所得到的寡糖的电荷质量比与其电泳淌 度之间的线性关系对分离峰所对应的酶解产物进行鉴定， 确定具有 1,6-成环结构的寡糖的分离峰；
(4) 根据峰面积对具有 1,6-成环的寡糖进行定量测定， 根据其 含量最终确定依诺肝素钠组分中具有 1,6-成环结构的寡糖链的含量。
37、 根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (1)中 肝素酶混合溶液包括肝素酶 I(EC 4.2.2.7.)'肝素酶 Π(无 EC号:)和肝素 酶 III(EC 4.2.2.8.)中的至少两种。
38、 根据权利要求 37所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (1)中 混合肝素酶为包含肝素酶 I、 肝素酶 II和肝素酶 III的混合溶液。
39、 根据权利要求 38所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (1)中 混合肝素酶中肝素酶 I、 肝素酶 II和肝素酶 III以 1 : 1： 1的比例混 合。
40、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 完全酶解产物中具有 1,6-成环结构的寡糖的结构如下：
Figure imgf000034_0001
1,6-Anhydro AIS or 1 ,6-Anhydro AIS glucose 1,6-Anhydro AIIS or 1,6-Anhydro AIIS glucose
Figure imgf000034_0002
1 ,6-An hydro AIIS epi or 1 ,6-An hydro AIIS mannose 1 ,6-Anhydro AIS-IS epi or 1 ,6-Anhydro AIS-IS mannose
41、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中 完全酶解产物中三糖具有如下的结构：
Figure imgf000034_0003
42、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中: 完全酶解产物中的 8个二糖具有如下结构：
Figure imgf000035_0001
43、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中 完全酶解产物中其他二糖成分 AIISgal和 AIVSgal具有如下结构：
Figure imgf000035_0002
44、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中 完全酶解产物中两种四糖 ΔΠΑ-IISglu和 Alla-IVSglu具有如下结构:
Figure imgf000036_0001
45、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 石英毛细管总长范围为 50〜100 cm, 柱内径为 25〜75 μιη。
46、根据权利要求 45所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 石英毛细管总长范围为 70〜100 cm, 柱内径范围为 40〜60 μιη。
47、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液可选为 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04 或 LiH2P04-H3P04, 浓度范围为 150〜300 mM， pH范围为 1.5〜4.0。
48、根据权利要求 47所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液可选为 NaH2P04-H3P04, Tris-H3P04 或 LiH2P04-H3P04, 浓度范围为 200〜250 mM， pH范围为 2.0〜4.0。
49、 根据权利要求 47或 48所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液中还包括 l〜5 mM的 MgCl2或 ZnCl2， 0.1 %〜5%质量浓度 (m/v)的聚乙二醇分子，其分子量范围为 5000〜100000。
50、根据权利要求 49所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳缓冲溶液中还包括 2〜4 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， l%〜3% 质 量浓度 (m/v)的聚乙二醇分子， 其分子量为 10000〜50000。
51、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳所使用分离电压为 -15〜- 30 kV。
52、根据权利要求 51所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳所使用分离电压为 -20〜- 25 kV。
53、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 进样压力范围为 1〜100 mbar， 进样时间范围为 1〜60 s。
54、根据权利要求 53所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 进样压力范围为 30-60 mbar、进样时间范围为 5〜30 s或进样压力范围 为 40-50 mbar、 进样时间范围为 10〜20 s。
55、 根据权利要求 53或 54所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 在最后一个硫酸化二糖 ΔΠΑ出峰之后向进样端施加一定的气 压将 AIVA推向检测窗口进行检测。
56、根据权利要求 55所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 施加的压力范围可为 5〜150 mbar。
57、根据权利要求 56所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 施加的压力范围可为 5-30mbar， 10-20mbar或 30-150mbar等，可根据 使用的毛细管电泳仪做适当调整。
58、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳使用的柱温范围为 10〜40 °C。
59、根据权利要求 58所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管柱温范围为 20〜30 V。
60、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳使用的检测波长为紫外 230-235 nm。
61、根据权利要求 60所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳使用的检测波长为紫外 230-232 nm。
62、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管总长范围为 50〜100cm， 柱内径 范围为 25〜75μιη; 缓冲溶液含 150〜300mM 的 NaH2P04-H3P04 , Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04， 1〜5 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， pH范围 为 1.5〜4.0，使用前加入 0.1%〜5.0%质量浓度（m/v)的聚乙二醇分子， 分子量范围为 5000〜100000； 毛细管电泳时使用电压为 -15〜- 30 kV; 采用压力进样， 压力范围为 l〜100 mbar， 时间范围为 l〜60 s; 在最后 一个单硫酸化二糖 (ΔΠΑ)出峰之后施加 5〜150 mbar的压力， 将 AIVA 推向检测窗口实现检测； 电泳时毛细管柱温范围为 10〜40 °C， 检测波 长为紫外 230-235 nm。
63、根据权利要求 62所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管总长范围为 50〜100cm， 柱内径 范围为 25〜75μιη; 缓冲溶液含 150〜300mM 的 NaH2P04-H3P04 , Tris-H3P04或 LiH2P04-H3P04， 1〜5 mM 的 MgCl2或 ZnCl2， pH范围 为 1.5〜4.0，使用前加入 0.1%〜5.0%质量浓度（m/v)的聚乙二醇分子， 分子量范围为 5000〜100000； 毛细管电泳时使用电压为 -15〜- 30 kV; 采用压力进样， 压力范围为 30 60mbar， 时间范围为 5 30s; 在最后 一个单硫酸化二糖 (ΔΠΑ)出峰之后施加 5 150 mbar的压力， 将 AIVA 推向检测窗口实现检测； 电泳时毛细管柱温范围为 10 40 °C， 检测波 长为紫外 230-235 nm
64、根据权利要求 62所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管总长 70 100 cm, 柱内径 40 60μηι; 缓冲溶液含 200 250mM的 NaH2P04-H3P04 Tris-H3P04 或 LiH2P04-H3P04 2 4mM的 MgCl2 pH范围为 2 4， 使用前加入 1 3%质量浓度 (m/v)的聚乙二醇， 分子量范围为 10000 50000； 分离 电压为 -15 - 25 kV; 采用压力进样， 进样压力范围为 40 50mbar， 时 间范围为 10 20 s; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后加压 10 20 mbar, 将 ΔΐνΑ 推向检测窗口实现检测； 柱温 20 30 °C; 检测波长紫外 230-232
65、根据权利要求 62所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管内径 50 μηι， 总长 85 cm; 缓冲 溶液含 200 mM的 Tris-¾P04和 2 mM的 MgCl2 pH为 2.5， 使用 前加入 1%质量浓度 (m/v) 的聚乙二醇， 分子量为 10000; 进样压力为 50 mbar, 时间为 15 s; 分离电压 -25 kV; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰 之后加压 20mbar， 将 AIVA推向检测窗口实现检测； 柱温 25 °C; 检 测波长紫外 232 nm
66、根据权利要求 62所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中， 毛细管电泳分离的条件为石英毛细管柱内径 50 μηι， 总长 80 cm; 缓 冲溶液为 200 mM Tris-H3PO4和 2 mM MgCl2， pH为 2.7，使用前加入 1.3%质量浓度 （m/v)的聚乙二醇， 分子量为 10000; 进样压力为 55 mbar， 时间为 10 s; 分离电压 -22 kv; 在单硫酸化寡糖 ΔΠΑ出峰之后 加压 138 mbar， 将 ΔΐνΑ推向检测窗口实现检测； 柱温 25 °C ; 检测 波长紫外 230 nm。
67、根据权利要求 36所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (3)中， 对依诺肝素钠完全酶解产物中至少 5个寡糖的标准品进行毛细管电 泳分离， 测出其电泳淌度 （ μ )， 用电泳淌度 μ对其电荷质量比 Ζ/Μ 作图， 用线性回归分析可以得到描述电泳淌度 μ和电荷质量比 Ζ/Μ 之间关系的线性方程，用线性方程可以推算其他寡糖的电泳淌度并作 为定性依据，确定具有 1,6-成环结构的寡糖二糖 l( l,6-Anhydro AIIS)， 二糖 2 ( 1,6-Anhydro AIIS ) , 二糖 3 ( 1,6-Anhydro AIS ) 和四糖 1
( 1 ,6-AnhydroAIS-IS ) 对应的分离峰。
68、根据权利要求 67所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (3)中， 对依诺肝素钠完全酶解产物中 6个带有 S03_二糖标准品 AIS， AIIIS, AIIS， ΔΙΑ， ΔΙΙΑ和 ΔΠΙΑ进行毛细管电泳分离，测出其电泳淌度（ μ )， 用电泳淌度 μ对其电荷质量比 Ζ/Μ作图， 用线性回归分析可以得到 描述电泳淌度 μ和电荷质量比 Ζ/Μ之间关系的线性方程， 根据线性 方程推算其他寡糖的电泳淌度并作为定性依据， 确定具有 1,6-成环结 构的寡糖二糖 1 ( 1 ,6-Anhydro AIIS )， 二糖 2 ( 1 ,6-Anhydro AIIS )， 二 糖 3 ( 1,6-Anhydro AIS) 和四糖 1 ( l,6-AnhydroAIS-IS) 对应的分离 峰。
69、根据权利要求 68所述的检测方法， 其特征在于： 所述步骤 (3)中， 酶解产物中的寡糖的电荷质量比与其电泳淌度之间存在如下的线性
Figure imgf000041_0001
方程中 Z/M为寡糖电荷质量比； μ为对应的电泳淌度；
根据电荷质量比与电泳淌度的线性关系， 确定具有 1,6-成环结构的寡 糖二糖 1 (1,6-Anhydro AIIS), 二糖 2 (1,6-Anhydro AIIS), 二糖 3 (l,6-AnhydroAIS)和四糖 1 ( l,6-AnhydroAIS-IS)分别对应峰 16,17, 15和 14。
70、 根据权利要求 36所述的方法， 其特征在于： 所述步骤 (4)中， 1,6 成环的寡糖二糖 1 ( 1 ,6-Anhydro AIIS )， 二糖 2 ( 1 ,6-Anhydro AIIS )， 二糖 3 (1,6-Anhydro AIS) 和四糖 1 ( 1 ,6-AnhydroAIS-IS ) 分别对应 峰 16,17, 15和 14， 含量可以使用如下公式计算：
433 χ (Areal6 + Areal7 )
w16+17% = 100x
^(Mwx x Areax)
545 x Area,
w14% = 100x
^(Mwx x Areax) niOxArea,,
w15% = 100x
^(Mwx x Areax) 式中 Mwx， Areax分别代表完全酶解产物中各个组分的分子量和 在毛细管电泳谱图上的峰面积；
依诺肝素钠组分中含 1,6成环结构的寡糖链的百分数可以由如下 公式计; \,6Anhydro % = W x ( 16+1 ~ +― ~ +― ~ )
443 545 1210
(Areal4 + Areal5 + Areal6 + Areal7 )
\,6Anhydro% = \QQ x Wx x
^ Mwx x Areax ) 式中 ^代表依诺肝素钠的重均分子量。
71、 权利要求 1-35任一项所述的方法在肝素、 低分子量肝素或超低 分子量肝素等多糖组分的精细结构鉴定或定量分析中的应用。
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