CN102603924A

CN102603924A - 一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法

Info

Publication number: CN102603924A
Application number: CN2012100640028A
Authority: CN
Inventors: 王春华; 王玎玮
Original assignee: NANJING KING-FRIEND BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: NANJING KING-FRIEND BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明公开了一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法，将肝素副产物溶解为溶液，加入醋酸钾使质量分数增加，再用醋酸调节溶液的pH值，然后沉淀，收集上清液；再加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，搅拌后沉淀，分离出上清液；向上清液中加入氯化钠，溶解后再加入乙醇进行沉淀，分离出沉淀物，将其用水稀释，加入EDTA，搅拌溶解后继续加入阴离子交换树脂进行搅拌吸附；吸附后先氯化钠溶液搅拌洗涤树脂，然后用氯化钠溶液搅拌洗脱树脂，收集洗脱液并用无水乙醇沉淀，得到舒洛地特原料。本方法有效解决了存储或丢弃大量肝素副产物所需财力和物力，并变废为宝，将副产物再次利用，既节约了大量成本，又创造了价值。

Description

一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法

技术领域

本发明涉及一种舒洛地特原料的制备方法，尤其涉及一种从肝素副产物中分离舒洛地特原料的方法。

背景技术

舒洛地特，商品名为“伟素”，是1973年意大利的Alfa Wassermann公司上市的一种低分子肝素类药物，与肝素同属糖胺聚糖类药物。药物中同时含有的硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素可以协同发挥作用，使该药具有与肝素不同的特征。与肝素相比，舒洛地特的抗血栓作用强，而引起出血的可能性小。舒洛地特可以口服的特点尤使其适合抗血栓的长期治疗。舒洛地特是通过抗凝作用、纤溶作用、血液流变学作用、抗增殖作用及维持膜通透选择性作用发挥其药理作用。这使得舒洛地特能够用于防治血栓性疾病；而其血液流变学作用、抗增殖作用和维持膜通透选择性作用是舒洛地特能够阻遏动脉粥样硬化进展的基础。舒洛地特对于糖尿病肾病的治疗作用源于其抗增殖作用和维持膜通透选择性作用。

舒洛地特中硫酸乙酰肝素的含量为：≥70.00％，硫酸皮肤素的含量为：≤20.00％，传统的生产方式是将硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素按照一定比例混合，使得最终符合规定要求即可。但是由于单纯的硫酸乙酰肝素很难分离并且储量相对较少，使得舒洛地特的原料很难获得，价格也很高；并且简单的将两种原料混合，工艺很难控制，使得最终得到的原料不符合要求规定。

从猪小肠粘膜经过离子交换以及分级沉淀生产肝素的过程中产生了大量的副产物，其中主要组成是硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和少量残留肝素。但是由于其中的有效物质分离困难，故生产肝素后一般将这些副产物丢弃或存储，目前为止没有可继续利用的报道。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法，其包括如下步骤：

(1)将肝素副产物溶解为5％～20％质量分数的溶液，向其中加入醋酸钾使质量分数增加至10％～60％，再用醋酸调节溶液的pH值至5～7，然后沉淀1～5天，收集上清液；

(2)向步骤(1)收集的上清液中加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，搅拌后沉淀，分离出上清液；

(3)向步骤(2)得到的上清液中加入氯化钠，溶解后再加入乙醇进行沉淀，分离出沉淀物，将其用水稀释为质量分数10％～15％的沉淀物溶液，再加入EDTA，搅拌溶解后继续加入阴离子交换树脂进行搅拌吸附；吸附后先用0.1～0.6M的氯化钠溶液搅拌洗涤树脂，然后采用2～4M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂，收集洗脱液并用无水乙醇沉淀，得到舒洛地特原料。

本发明中的肝素副产物是从猪小肠粘膜经过离子交换至分级沉淀生产肝素的过程中产生的副产物，其中主要含有硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和少量残留肝素。

步骤(1)中，肝素副产物优选先溶解为6％～10％质量分数的溶液(水溶液)，进一步优选溶解至8％；浓度过高则会导致沉淀不单是残留肝素，也可能混有硫酸皮肤素。

步骤(1)中，加入醋酸钾后优选使溶液的质量分数增加至30％～50％。加入醋酸钾后可进一步搅拌使溶解。

步骤(1)中，用醋酸调节溶液的pH值时优选调节至6。调节pH值之后的沉淀进一步在温度5～25℃下进行。沉淀后可采用常规的固液分离方式，如离子心分离的方式，收集上清液。该上清液为清除肝素后的硫酸多糖溶液。

步骤(2)中，班氏试剂的体积优选为上清液体积的0.5～2倍，进一步优选为0.8倍；饱和氢氧化钠溶液的体积优选为上清液体积的0.05～0.3倍，进一步优选为0.1倍。班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液的用量变化均会影响最终产品中两物质的比例。

步骤(2)中，搅拌后的沉淀在常温下进行，进一步在20～25℃下进行，沉淀时间优选为10～60分钟。沉淀后的分离方法可采用现有常规固液分离方式，如离心分离等。

步骤(3)中，所述氯化钠的加入量优选为上清液质量的1％～3％；加入氯化钠并溶解后，采用上清液体积1～2倍的无水乙醇进行沉淀。

步骤(3)中，所述EDTA的加入量优选为沉淀物溶液质量的1％～3％；所述阴离子交换树脂体积与沉淀物溶液的体积相同；用阴离子交换树脂体积进行搅拌吸附的时间为6～24小时。所述阴离子交换树脂优选为丙烯酸类强碱性阴离子交换树脂，如FPA98CL丙烯酸类强碱性阴离子交换树脂(以下简称FPA98型阴离子交换树脂)。

步骤(3)中，用0.1～0.6M的氯化钠溶液搅拌洗涤树脂的时间优选为2～4小时；采用2～4M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂的时间优选为3～12小时；收集得到的洗脱液用洗脱液体积1～2倍的无水乙醇进行沉淀。吸附和洗脱时间减少会在一定程度上影响吸附和洗脱效果，最终产率降低。

本发明建立了一种新的分离纯化工艺，从肝素副产物中分离舒洛地特原料，即硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的混合物，本方法利用肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的溶解度差异，以及和班氏试剂的特殊反应最终成功得到舒洛地特原料。所得到的舒洛地特原料经检测各项指标均符合舒洛地特原料的要求，下表为实施例1得到的硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的混合物的具体测试结果：

本方法有效解决了存储或丢弃大量肝素副产物所需财力和物力，并变废为宝，将副产物再次利用，即节约了大量成本，又创造了价值。本工艺从副产物中直接分离得到符合规定的舒洛地特原料，原料的各个指标项目易控制，避免了传统生产方式中混合后原料指标不好控制的缺陷。传统生产方式中的要分离获得硫酸乙酰肝素相当困难，最终导致舒洛地原料的价格升高，而本方法获得舒洛地特原料工艺简单，成本低廉，适合工业化生产。

具体实施方式

下面结合实例对本发明所述的内容作进一步阐述。

实施例1

将肝素副产物溶解为质量分数为8％的溶液，向其中加入醋酸钾使得质量分数至37％，搅拌溶解，以醋酸调节PH至6，在20℃下沉淀1天。离心收集上清，得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向硫酸多糖溶液中加入0.8倍体积的班氏试剂和0.1倍体积的饱和氢氧化钠溶液，搅拌后室温20℃下沉淀30分钟，离心分离上清液和沉淀。向上清液中加入3％氯化钠，溶解后加入2倍立体的无水乙醇沉淀，将沉淀用纯化水稀释为质量分数为10％的溶液，加入1％EDTA，搅拌溶解后加入相同体积的FPA98型阴离子交换树脂，搅拌吸附20小时。用0.3M氯化钠溶液搅拌洗涤树脂2小时，然后以2.5M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂6小时，收集洗脱液以2倍体积的无水乙醇沉淀，得到硫酸乙酰肝素(70％以上)和硫酸皮肤素(20％以下)的混合物，所得混合物的旋光值为32.5°。

实施例2

将肝素副产物溶解为质量分数为10％的溶液，向其中加入醋酸钾使得质量分数至26％，搅拌溶解，以醋酸调节PH至5，在5℃下沉淀3天。离心收集上清，得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向硫酸多糖溶液中加入0.5倍体积的班氏试剂和0.05倍体积的饱和氢氧化钠溶液，搅拌后室温20℃下沉淀10分钟，离心分离上清液和沉淀。向上清液中加入3％氯化钠，溶解后加入2倍立体的无水乙醇沉淀，将沉淀用纯化水稀释为质量分数为15％的溶液，加入2％EDTA，搅拌溶解后加入相同体积的FPA98型阴离子交换树脂，搅拌吸附24小时。用0.1M氯化钠溶液搅拌洗涤树脂3小时，然后以2M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂3小时，收集洗脱液以2倍体积的无水乙醇沉淀，得到硫酸乙酰肝素(70％以上)和硫酸皮肤素(20％以下)的混合物，所得混合物的旋光值为30.6°。

实施例3

将肝素副产物溶解为质量分数为12％的溶液，向其中加入醋酸钾使得质量分数至45％，搅拌溶解，以醋酸调节PH至7，在20℃下沉淀3天。离心收集上清，得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向硫酸多糖溶液中加入1.5倍体积的班氏试剂和0.15倍体积的饱和氢氧化钠溶液，搅拌后室温20℃下沉淀60分钟，离心分离上清液和沉淀。向上清液中加入2％氯化钠，溶解后加入1倍立体的无水乙醇沉淀，将沉淀用纯化水稀释为质量分数为10％的溶液，加入3％EDTA，搅拌溶解后加入相同体积的FPA98型阴离子交换树脂，搅拌吸附12小时。用0.6M氯化钠溶液搅拌洗涤树脂2小时，然后以3M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂8小时，收集洗脱液以1倍体积的无水乙醇沉淀，得到硫酸乙酰肝素(70％以上)和硫酸皮肤素(20％以下)的混合物，所得混合物的旋光值为28.5°。

实施例4

将肝素副产物溶解为质量分数为15％的溶液，向其中加入醋酸钾使得质量分数至60％，搅拌溶解，以醋酸调节PH至7，在5℃下沉淀5天。离心收集上清，得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向硫酸多糖溶液中加入1.5倍体积的班氏试剂和0.3倍体积的饱和氢氧化钠溶液，搅拌后室温20℃下沉淀30分钟，离心分离上清液和沉淀。向上清液中加入2％氯化钠，溶解后加入2倍立体的无水乙醇沉淀，将沉淀用纯化水稀释为质量分数为10％的溶液，加入3％EDTA，搅拌溶解后加入相同体积的FPA98型阴离子交换树脂，搅拌吸附12小时。用0.3M氯化钠溶液搅拌洗涤树脂4小时，然后以4M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂6小时，收集洗脱液以2倍体积的无水乙醇沉淀，得到硫酸乙酰肝素(70％以上)和硫酸皮肤素(20％以下)的混合物，所得混合物的旋光值为29.0°。

实施例5

将肝素副产物溶解为质量分数为20％的溶液，向其中加入醋酸钾使得质量分数至50％，搅拌溶解，以醋酸调节PH至6，在20℃下沉淀5天。离心收集上清，得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向硫酸多糖溶液中加入1倍体积的班氏试剂和0.2倍体积的饱和氢氧化钠溶液，搅拌后室温25℃下沉淀10分钟，离心分离上清液和沉淀。向上清液中加入1％氯化钠，溶解后加入1倍立体的无水乙醇沉淀，将沉淀用纯化水稀释为质量分数为15％的溶液，加入1％EDTA，搅拌溶解后加入相同体积的FPA98型阴离子交换树脂，搅拌吸附6小时。用0.3M氯化钠溶液搅拌洗涤树脂4小时，然后以2.5M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂8小时，收集洗脱液以1倍体积的无水乙醇沉淀，得到硫酸乙酰肝素(70％以上)和硫酸皮肤素(20％以下)的混合物，所得混合物的旋光值为30.0°。

实施例6

将肝素副产物溶解为质量分数为10％的溶液，向其中加入醋酸钾使得质量分数至45％，搅拌溶解，以醋酸调节PH至5.5，在20℃下沉淀1天。离心收集上清，得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向硫酸多糖溶液中加入0.8倍体积的班氏试剂和0.1倍体积的饱和氢氧化钠溶液，搅拌后室温20℃下沉淀20分钟，离心分离上清液和沉淀。向上清液中加入2％氯化钠，溶解后加入2倍立体的无水乙醇沉淀，将沉淀用纯化水稀释为质量分数为10％的溶液，加入1％EDTA，搅拌溶解后加入相同体积的FPA98型阴离子交换树脂，搅拌吸附18小时。用0.3M氯化钠溶液搅拌洗涤树脂2小时，然后以3M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂8小时，收集洗脱液以2倍体积的无水乙醇沉淀，得到硫酸乙酰肝素(70％以上)和硫酸皮肤素(20％以下)的混合物，所得混合物的旋光值为28.6°。

Claims

1.一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述肝素副产物是从猪小肠粘膜经过离子交换至分级沉淀生产肝素的过程中产生的副产物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，肝素副产物先溶解为6％～10％质量分数的溶液；加入醋酸钾后使溶液的质量分数增加至30％～50％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，用醋酸调节溶液的pH值至6；调节pH值之后的沉淀在5～25℃下进行；沉淀后采用离子心分离的方式收集上清液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述班氏试剂的体积为上清液体积的0.5～2倍，所述饱和氢氧化钠溶液的体积为上清液体积的0.05～0.3倍。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述班氏试剂的体积为上清液体积的0.8倍，所述饱和氢氧化钠溶液的体积为上清液体积的0.1倍；搅拌后的沉淀在20～25℃下进行，沉淀时间为10～60分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述氯化钠的加入量为上清液质量的1％～3％；加入氯化钠并溶解后，采用上清液体积1～2倍的无水乙醇进行沉淀。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述EDTA的加入量为沉淀物溶液质量的1％～3％；所述阴离子交换树脂体积与沉淀物溶液的体积相同；用阴离子交换树脂体积进行搅拌吸附的时间为6～24小时。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述阴离子交换树脂为丙烯酸类强碱性阴离子交换树脂。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，用0.1～0.6M的氯化钠溶液搅拌洗涤树脂的时间为2～4小时；采用2～4M氯化钠溶液搅拌洗脱树脂的时间为3～12小时；收集得到的洗脱液用洗脱液体积1～2倍的无水乙醇进行沉淀。