CN104193848A - 一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开子一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其为：肝素钠粗品经纯化水溶解并调节pH值至8.0-9.0，在70-85℃下加入高氯酸盐或其水溶液进行反应，反应结束后降温至20-30℃，加入乙二胺四乙酸搅拌、硅藻土过滤、超滤，加入乙醇沉淀肝素钠，除去上清液，再加入氯化钠﹑纯化水和乙醇再沉淀，得到去除细菌内毒素的肝素钠。本发明在保证肝素钠原料其它质量的前提下，可有效的去除细菌内毒素，使其含量远低于中国药典和欧洲药典的0.01EU/USPU的标准，可达到0.003EU/USPU限度以下，且用高氯酸盐处理这一工艺操作简便，去除细菌内毒素效果好，批次之间产品性能稳定，易工业化生产。

Description

一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及是一种在肝素钠生产过程中去除细菌内毒素的方法。

背景技术

肝素钠(Heparin Sodium)是含有硫酸酯的粘多糖，属于不均一的多糖分子。分子结构用一个四糖重复单位表示如下：

肝素钠的分子量在8000—24000范围内，是从健康生猪小肠黏膜中提取的由两种多糖交替链接而成的多聚体，目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素除具有抗凝血作用外，还具有其它多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶解等作用。

由于肝素钠结构复杂，目前还无法人工合成，中国生猪屠宰量占全球50％以上，拥有全球最丰富的肝素钠原料资源，我国是全球肝素钠粗品和肝素钠原料药的主要生产国，也是全球最大的肝素钠原料药出口国，拥有美国FDA认证或欧盟CEP认证标准的肝素原料药已呈现供不应求的局面。

肝素钠原料药来源于肝素钠粗品，含有大量杂质蛋白、杂质核酸、微生物等杂质，需经过物理和化学提取分离过程，定向获取天然结构基团完整的肝素钠，从而制成肝素钠原料药。从上游企业收购来的肝素钠粗品中普遍都含有大量的细菌内毒素，细菌内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液则会引起不同的疾病，内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害，内毒素大量进入血液就会引起发热反应--“热原反应”，因此注射用药物必须经过细菌内毒素检测合格后才能使用。中国药典2010、欧洲药典8.0、美国药典USP35-NF30均对肝素钠中细菌内毒素给出了要求，分别为≤0.010EU/IU、≤0.01EU/USP U和≤0.03EU/USP U。但是目前还没有相关的专利或文献报道通过有效的方法来控制肝素钠中细菌内毒素这一项指标。

发明内容

本发明的目的是为了克服肝素钠中细菌内毒素超标的问题，提供了一种在将肝素钠粗品制备成肝素钠原料的工艺过程中，采用添加高氯酸盐并辅以其他手段有效的去除肝素钠中的细菌内毒素的方法。本发明通过在制备肝素钠原料过程中加入高氯酸盐、调节适宜的反应温度和时间以及在其他条件的相互配合作用下，达到去除肝素钠中细菌内毒素的目的。该方法具有条件温和、操作简便、成本低、效果好的优点，适于肝素钠原料工业化生产。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其包括如下步骤：

(1)取含有细菌内毒素的肝素钠粗品用纯化水溶解，调节肝素钠水溶液的pH值为8.0-9.0，在70-85℃下加入高氯酸盐或其水溶液并进行反应；

(2)待反应结束后将反应液降温至20-30℃，向其中加入乙二胺四乙酸，搅拌使其反应，然后通过硅藻土过滤，滤液再进行超滤；

(3)超滤得到的肝素钠浓缩液升温至45-55℃，加入乙醇，搅拌后降温至10-15℃进行静置或离心，然后除去上清液；

(4)向步骤(3)得到的下层沉淀物中加入纯化水和氯化钠溶解沉淀物，然后在45-55℃下加入乙醇并搅拌后降温至10-15℃进行静置或离心，除去上清液，得到去除了细菌内毒素的肝素钠。

本发明所指的肝素钠粗品是指含有细菌内毒素的各种纯度的肝素钠，一般其细菌内毒素含量在10EU/USP U以上，抗Ⅱa效价≥110USP U/mg。

在步骤(1)和步骤(4)中测试的细菌内毒素方法为：取细菌内毒素国家标准品(简称RSE)1支，按照说明书复溶，漩涡混匀至少15min后，然后用鲎试剂将细菌内毒素工作标准品稀释成4λ、2λ浓度的内毒素溶液。在进行每一步稀释前，至少混合30s。精密称取供试品200mg，根据样品检测得到的效价，用鲎试剂将样品稀释成6IU/ml(2C)、3IU/ml(C)浓度的供试品溶液，按照欧洲药典的凝胶法进行操作；

步骤(1)肝素钠粗品和纯化水的投料质量比为1.0：10.0-12.0，优选1.0：10.5-11.0；所用的高氯酸盐和肝素钠粗品的质量比为2.5-3.5：100，优选3.0-3.5：100，高氯酸盐水溶液中高氯酸盐和纯化水的投料比(W/W)为1.0：4.5-5.5，优选1.0：5.0-5.5。其中高氯酸盐可以直接以固体方式或高氯酸盐水溶液方式添加到肝素钠粗品水溶液中，用来配制高氯酸盐水溶液中的水取自用来溶解肝素钠粗品中的水。以固体方式需要将高氯酸盐分批加入，以防止因加入高氯酸盐反应剧烈放出热量使反应温度升高，或发生冲料现象，采用高氯酸盐水溶液方式则易使反应混料均匀，避免局部集中反应，起到缓解反应剧烈的作用。其中高氯酸盐为高氯酸镁﹑高氯酸钙或高氯酸铜；

在步骤(1)中调节肝素钠水溶液的pH值用的是1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸，pH值得范围为8.0-9.0。该步骤中加入高氯酸盐或其水溶液并进行反应的温度优选为70-80℃，进一步优选75-80℃，反应时间为25-35min。

在步骤(2)中，加入的乙二胺四乙酸和高氯酸盐投料摩尔比为1.0：0.95-1.0，优选1.0：0.95-0.98，加入乙二胺四乙酸可以用来络合来自高氯酸盐中的金属离子，达到在反应液中去除这些金属离子的目的，本方法采用乙二胺四乙酸可以完全除去重金属离子。该步骤中采用硅藻土过滤，一种具体的硅藻土过滤方法为：称量硅藻土加入纯化水中，硅藻土和纯化水的投料质量比为1.0：1.2-1.8，优选1.0：1.4-1.6，得到硅藻土泥浆，在板框上安装滤布，用硅藻土泥浆铺满板框上滤布为准，压好硅藻土床，硅藻土层厚度为4-8cm为宜。过滤时压力在≤0.15Mpa，压力过小则过滤时间较长，压力过大易冲破硅藻土层，达不到硅藻土吸附除杂作用。

在步骤(3)中，将肝素钠浓缩溶液泵入沉淀罐中将其升温至45-55℃下，加入乙醇，加毕继续搅拌≥30min后将溶液降温至10-15℃，用来沉淀的乙醇和超滤后的肝素钠浓缩溶液的体积比为0.3-0.5：1.0，优选0.35-0.45：1.0，乙醇需缓慢加入沉淀罐内。降温时间需要超30min，最终降至10-15℃，维持此温度静置或离心除去上清液。

在步骤(4)中，先向沉淀物中加入纯化水和氯化钠来溶解沉淀物，得到肝素钠粗品水溶液后将溶液升温至45-55℃，加入乙醇后搅拌≥30min，再将溶液降温至10-15℃，降温时间需要超30min。本步骤中氯化钠和纯化水的投料质量比为1.0：25-30，优选1.0：27-29，氯化钠和步骤(1)的肝素钠粗品投料质量比为1.5-2.0：10，优选1.5-1.8：10；乙醇的加入量与采用纯化水和氯化钠溶解所得溶解液的体积比为0.3-1.5：1.0，优选0.5-1.5：1.0；加入乙醇搅拌后在15-20℃静置或离心除去上清液，得到去除细菌内毒素的肝素钠，用无菌注射器取处理后的肝素钠测试细菌内毒素。本步骤得到的肝素钠中细菌内毒素的含量在0.003EU/USP U以下。

本发明是在一般的从肝素钠粗品制备肝素钠原料药的工艺过程中增加的一个步骤，克服了现有的肝素钠原料中的细菌内毒素超标的问题，实验证明在保证肝素钠原料其它质量的前提下，可以有效的去除掉肝素钠中的细菌内毒素，使细菌内毒素的含量远低于中国药典和欧洲药典的0.01EU/USP U的标准，甚至可以达到0.003EU/USP U以下，且用高氯酸盐处理这一工艺操作简便，去除细菌内毒素效果好，批次之间产品性能稳定，易工业化生产。

具体实施方式

实施例1：

称取批号：50121133肝素钠粗品50kg加入到494.375L纯化水中，搅拌使固体全部溶解，然后转移至不锈钢罐内，取样测试其抗Ⅱa效价为125USP U/mg，细菌内毒素在10EU/USP U以上，pH值为7.5，用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值至8.6，然后将不锈钢内的肝素钠粗品溶液升温至70-85℃，然后称量高氯酸镁1.25kg加入到5.625L纯化水中，搅拌完全溶解后缓慢加入到不锈钢罐内，控制加入时不锈钢罐内液体的温度，使其仍在70-85℃内，维持在此温度反应20-35min，反应结束后通入冷凝水至不锈钢罐夹套中降温至罐内反应后的肝素钠粗品溶液至20-30℃，向反应液中加入1.723kg乙二胺四乙酸，搅拌≥40min。将滤布安装在板框上，称量20kg硅藻土加入24L纯化水中搅拌均匀后加在滤布上，压好硅藻土床，硅藻土层高度为5cm，过滤反应后的肝素钠粗品溶液，过滤压力应≤0.15Mpa，把过滤液转移至超滤罐内超滤，超滤后肝素钠粗品浓缩液为330L。将肝素钠浓缩溶液泵入沉淀罐中并升温至45-55℃，缓慢加入99L乙醇，加毕继续搅拌≥30min并将溶液降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，再向沉淀罐加入188L纯化水和7.5kg氯化钠，溶解沉淀物并将溶液升温至45-55℃，加入99L乙醇，再搅拌≥30min后降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，得到去除了细菌内毒素的肝素钠47.35kg，取样测试其抗Ⅱa效价为134USP U/mg，细菌内毒素在0.003EU/USP U限度下，重金属离子含量≤20ppm。

实施例2：

称取批号：50121134肝素钠粗品55kg加入到660L纯化水中，搅拌使固体全部溶解，然后转移至不锈钢罐内，取样测试其抗Ⅱa效价为120USP U/mg，细菌内毒素在10EU/USPU限度以上，pH值为9.2，用1mol/L盐酸调节溶液pH值至8.8，然后将不锈钢内的肝素钠粗品溶液升温至70-85℃，然后称量高氯酸钙1.925kg加入到649.412L纯化水中，搅拌完全溶解后缓慢加入到不锈钢罐内，控制加入时不锈钢罐内液体的温度，使其仍在70-85℃内，维持在此温度反应20-35min，氧化反应结束后通入冷凝水至不锈钢罐夹套中降温至罐内反应后的肝素钠粗品溶液至20-30℃，向反应液中加入2.354kg乙二胺四乙酸，搅拌≥40min。将滤布安装在板框上，称量25kg硅藻土加入45L纯化水中搅拌均匀后加在滤布上，压好硅藻土床，硅藻土层高度为6.5cm，过滤反应后的肝素钠粗品溶液，过滤压力应≤0.15Mpa，把过滤液转移至超滤罐内超滤，超滤后肝素钠粗品浓缩液为448L。将肝素钠浓缩溶液泵入沉淀罐中并升温至45-55℃，缓慢加入224L乙醇，加毕继续搅拌≥30min并将溶液降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，再向沉淀罐加入330L纯化水和11kg氯化钠，溶解沉淀物并将溶液升温至45-55℃，加入224L乙醇，再搅拌≥30min后降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，得到去除了细菌内毒素的肝素钠51.8kg，取样测试其抗Ⅱa效价为128USP U/mg，细菌内毒素在0.003EU/USP U限度下，重金属离子含量≤20ppm。

实施例3：

称取批号：50121135肝素钠粗品52kg加入到572L纯化水中，搅拌使固体全部溶解，然后转移至不锈钢罐内，取样测试其抗Ⅱa效价为126USP U/mg，细菌内毒素在10EU/USPU限度以上，pH值为7.8，用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值至8.3然后将不锈钢内的肝素钠粗品溶液升温至70-85℃，然后称量高氯酸铜1.56kg加入到564.2L纯化水中，搅拌完全溶解后缓慢加入到不锈钢罐内，控制加入时不锈钢罐内液体的温度，使其仍在70-85℃内，维持在此温度反应20-35min，反应结束后通入冷凝水至不锈钢罐夹套中降温至罐内反应后的肝素钠粗品溶液至20-30℃，向反应液中加入1.773kg乙二胺四乙酸，搅拌≥40min。将滤布安装在板框上，称量22kg硅藻土加入33L纯化水中搅拌均匀后加在滤布上，压好硅藻土床，硅藻土层高度为5.5cm，过滤反应后的肝素钠粗品溶液，过滤压力应≤0.15Mpa，把过滤液转移至超滤罐内超滤，超滤后肝素钠粗品浓缩液为375L，将肝素钠浓缩溶液泵入沉淀罐中并升温至45-55℃，缓慢加入150L乙醇，加毕继续搅拌≥30min并将溶液降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，再向沉淀罐加入188L纯化水和9.36kg氯化钠，溶解沉淀物并将溶液升温至45-55℃，加入262L乙醇，再搅拌≥30min后降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，得到去除了细菌内毒素的肝素钠48.58kg，取样测试其抗Ⅱa效价为132USP U/mg，细菌内毒素在0.003EU/USP U限度下，重金属离子含量≤20ppm。

对比例1：

称取批号：50121133肝素钠粗品35kg加入到385L纯化水中，搅拌使固体全部溶解，然后转移至不锈钢罐内，取样测试其抗Ⅱa效价为125USP U/mg，细菌内毒素在10EU/USPU限度以上，pH值为7.3，用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值至8.5然后将不锈钢内的肝素钠粗品溶液升温至70-85℃，维持在此温度20-35min，后通入冷凝水至不锈钢罐夹套中降温至罐内的肝素钠粗品溶液至20-30℃，将滤布安装在板框上，称量15kg硅藻土加入21L纯化水中搅拌均匀后加在滤布上，压好硅藻土床，硅藻土层高度为5.8cm，过滤肝素钠粗品溶液，过滤压力应≤0.15Mpa，把过滤液转移至超滤罐内超滤，超滤后肝素钠粗品浓缩液为254L，将肝素钠浓缩溶液泵入沉淀罐中并升温至45-55℃，缓慢加入97L乙醇，加毕继续搅拌≥30min并将溶液降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，再向沉淀罐加入156L纯化水和5.6kg氯化钠溶解沉淀物并将溶液升温至45-55℃，加入97L乙醇，再搅拌≥30min后降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，得到肝素钠32.73kg，取样测试其抗Ⅱa效价为133USP U/mg，细菌内毒素仍在7EU/USP U限度上。

对比例2：

称取批号：50121135肝素钠粗品30kg加入到316L纯化水中，搅拌使固体全部溶解，然后转移至不锈钢罐内，取样测试其抗Ⅱa效价为118USP U/mg，细菌内毒素在10EU/USPU限度以上，pH值为7.5，用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值至8.2然后将不锈钢内的肝素钠粗品溶液升温至70-85℃，然后称量30％过氧化氢0.78kg加入到4.0L纯化水中，搅拌完全溶解后缓慢加入到不锈钢罐内，控制加入时不锈钢罐内液体的温度，使其仍在70-85℃内，维持在此温度反应20～35min，反应结束后通入冷凝水至不锈钢罐夹套中降温至罐内反应后的肝素钠粗品溶液至20-30℃，将滤布安装在板框上，称量14kg硅藻土加入18L纯化水中搅拌均匀后加在滤布上，压好硅藻土床，硅藻土层高度为6.2cm，过滤氧化后的肝素钠粗品溶液，过滤压力应≤0.15Mpa，把过滤液转移至超滤罐内超滤，超滤后肝素钠粗品浓缩液为220L，将肝素钠浓缩溶液泵入沉淀罐中并升温至45-55℃，缓慢加入84L乙醇，加毕继续搅拌≥30min并将溶液降温至10-15℃，降温时间需要超30min，维持此温度静置或离心后除去上清液，再向沉淀罐加入145L纯化水和5.4kg氯化钠溶解沉淀物并将溶液升温至45-55℃，加入84L乙醇，再搅拌≥30min后降温至10-15℃，降温时间需要超30min，并维持此温度静置或离心后除去上清液，得到去除了细菌内毒素的肝素钠26.84kg，取样测试其抗Ⅱa效价为122USP U/mg，细菌内毒素仍在2.5EU/USP U限度上。

Claims (10)

1.一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）取含有细菌内毒素的肝素钠粗品用纯化水溶解，调节肝素钠水溶液的pH值为8.0-9.0，在70-85℃下加入高氯酸盐或其水溶液并进行反应；

（2）待反应结束后将反应液降温至20-30℃，向其中加入乙二胺四乙酸，搅拌使其反应，然后通过硅藻土过滤，滤液再进行超滤；

（3）超滤得到的肝素钠浓缩液升温至45-55℃，加入乙醇，搅拌后降温至10-15℃进行静置或离心，然后除去上清液；

（4）向步骤（3）得到的下层沉淀物中加入纯化水和氯化钠溶解沉淀物，然后在45-55℃下加入乙醇并搅拌后降温至10-15℃进行静置或离心，除去上清液，得到去除了细菌内毒素的肝素钠。

2.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于所述肝素钠粗品的抗Ⅱa 效价≥110USP U/mg，其细菌内毒素含量在10EU/USP U以上。

3.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（1）中，肝素钠粗品与溶解用纯化水的质量比为1.0：10.0-12.0；调节肝素钠水溶液的pH值用的是1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸；加入高氯酸盐或其水溶液并进行反应的温度为70-85℃，反应时间为25-35min。

4.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（1）中，所述高氯酸盐选自高氯酸镁﹑高氯酸钙或高氯酸铜。

5.根据权利要求1或4所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（1）中，高氯酸盐和肝素钠粗品质量比为2.5-3.5：100；所述高氯酸盐水溶液中高氯酸盐和纯化水的质量比为1.0：4.5-5.5。

6.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（2）中，乙二胺四乙酸的加入量与高氯酸盐的摩尔比为1.0：0.95-1.0，优选1.0：0.95-0.98。

7.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（3）中，乙醇和肝素钠浓缩液的体积比为：0.3-0.5：1.0，优选0.35-0.45：1.0；该步骤中加入乙醇后在45-55℃搅拌≥30min；该步骤中降温时间≥30min。

8.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（4）中，氯化钠和纯化水的质量比为1.0：25-30，优选1.0：27-29； 氯化钠和步骤（1）的肝素钠粗品的质量比为1.5-2.0：10，优选1.5-1.8：10；该步骤中降温时间≥30min。

9.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（4）中，乙醇的加入量与采用纯化水和氯化钠溶解所得溶解液的体积比为0.3-1.5：1.0；该步骤中加入乙醇并搅拌的时间≥30min。

10.根据权利要求1所述的去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其特征在于步骤（4）中，得到的肝素钠中细菌内毒素的含量在0.003EU/USP U以下。