CN102787111A - 一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，该制备工艺包括产品粗提纯、溶液配制、亲和柱层析、超滤脱盐、无菌过滤、冻干、包装等工序，所得到的产品纯度高达95%以上，效价增加70单位/mg以上，比活达到600单位/mg蛋白以上，可以做为注射剂的原料药进行应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺。
背景技术
胰激肽原酶是一种具有扩张血管改善微循环作用的周围血管扩张药，胰激肽原酶在体内作用于激肽原释放出激肽，直接作用于小血管和毛细血管，从而产生一系列的药理效应，如舒张毛细血管、扩张小动脉等，在扩张血管的同时改善血管的通透性和血液流量；有调节血压作用，降低心肌耗氧量；还可促进前列腺的分泌，改善各器官血流。胰激肽原酶作为一种国际公认的微循环改善剂，是一种疗效确切、不良反应轻微的酶类药物，适宜于长期服用，适用于各种微血管循环障碍疾病的治疗。胰激肽原酶对早期肾病的治疗效果显著，能有效地改善肾脏的微循环，与其它药物配合治疗，能降低肾小球入球动脉压，具有促使肾小球基底膜早期损伤修复等作用，该产品的市场前景十分广阔。
胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中经提取纯化而得到的，即从胰脏本身、胰酶粉以及胰激肽原酶粗品（中间体）中提取，并通过纯化而制得。现有胰激肽原酶的纯化方法包括使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离（见日本专利发行No.11697/62）；或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖（Sephadex）上，并分离之（见日本公开专利发行No.56886/73）；另一种已知的纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之（见日本公开专利No.103715/73）。然而，利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备。而离子交换树脂法不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。因此，上述方法得到产品的纯度还有待于进一步提高。
公开号为CN101073666的中国发明专利公开了一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其采用QAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析纯化制得胰激肽原酶的原料药，其纯度高达75%以上，效价增加55单位/mg以上，比活达到350单位/mg蛋白以上。但其存在以下缺陷：比活达不到600单位/mg蛋白，纯度达不到90%，不能做为注射剂的原料药进行应用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，该制备工艺包括产品粗提纯、溶液配制、亲和柱层析、超滤脱盐、无菌过滤、冻干、包装等工序，产品经过HS-Sepharose亲和柱层析分离纯化后，成品的纯度高达95%以上，效价增加70单位/mg以上，比活达到600单位/mg蛋白以上。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，步骤如下：
（1）粗提纯：
①取胰脏粉或胰脏，加10～30倍量（重量倍数）纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为5～8%（g/ml），调整pH为6.0～8.0，冷冻静置沉淀，离心收集沉淀；
②将上述沉淀加入到事先配制好的2～4%（g/ml）的草酸盐溶液（沉淀g与草酸盐溶液ml的比例为1g：4～8ml）中，充分搅拌25～35分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液。
上述步骤①中，pH调整采用氨水调节，冷冻静置沉淀温度为零下20℃以下，离心转速为大于3000转/分。
上述步骤②中，2～4%（g/ml）的草酸盐溶液的组成为：每100ml草酸盐溶液中含1～2g的草酸铵，1～2g的草酸钾。
（2）溶液配制：配制浓度为20～40%（g/ml）的无机盐平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20～40%（g/ml）的无机盐洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值。
所述无机盐选自硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾，硫酸镁、氯化钠或氯化铵中的一种或多种。
（3）亲和柱层析：
①平衡：将装有HS-Sepharose亲和层析填料的层析柱，用上述配制的pH4.0、浓度20～40%（g/ml）的无机盐平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
②进样：调整上述制备的含胰激肽原酶的粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
③洗涤：用上述配制的pH4.0、浓度20～40%（g/ml）的无机盐平衡液冲洗一个柱体积；
④洗脱：用上述配制的pH6.0、浓度20～40%（g/ml）的无机盐洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液。
上述步骤（2）（3）中调整pH均采用6mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整。
上述亲和柱层析步骤中，所用层析柱直径为
体积为50L；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集峰液体积约为30～50L。
（4）超滤脱盐：将上述收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，当溶液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水，继续浓缩，得浓缩液。
所述超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当浓缩至液体体积为1/3～1/5时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液，取样检测效价。
（5）除菌：上述浓缩液用微孔滤膜进行除菌过滤，得无菌滤液。
所述微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
（6）冻干：加入辅料进行冻干，即得胰激肽原酶，纯度95%以上，效价65单位/mg以上，比活600单位/mg蛋白以上。
所述加辅料冻干的具体步骤如下：辅料用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，控制无菌滤液的效价在70单位/mg以上，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
所述冻干的工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻3～5小时（视盘中液量而定），将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华，当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。
所述辅料选自乳糖、甘露醇、明胶或右旋糖苷中的一种或多种。
（7）包装：将所得胰激肽原酶粉碎后，过80目筛，装入密闭容器中，加盖密封。
本发明的高纯度胰激肽原酶的制备工艺制备得到的胰激肽原酶，纯度高达95%以上，效价增加65单位/mg以上，比活达到600单位/mg蛋白以上，可以做为注射剂的原料药进行应用。
具体实施方式
实施例1
1、粗提纯：
（1）胰脏粉或胰脏加10倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为8%（g/ml），用氨水调整pH为6.0~8.0，零下20℃以下冷冻静置沉淀，转速3000转/分以上离心收集沉淀。
（2）将上述沉淀加入到配制好的2%（g/ml）的草酸盐溶液（每100ml中含1g的草酸铵，1g的草酸钾，胰脏粉或胰脏与草酸盐溶液的比例为1：6）中，充分搅拌30分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脱液：配制25%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液，调整pH为4.0和20%（g/ml）浓度的氯化铵的洗脱液，调整pH6.0，并检测溶液的电导值。
3、层析：
（1）平衡：将HS-Sepharose装入直径为
体积为50L的层析柱中，用pH4.0、25%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕。
（2）进样：调整胰激肽原酶粗品的pH值与硫酸铵平衡液一致，粗品液电导值略低于硫酸铵平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位计算上样量，将样品液进行上柱。
（3）洗涤：用pH4.0、25%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液冲洗一个柱体积。
（4）洗脱：用pH6.0、20%（g/ml）浓度的氯化铵洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液。以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30~50L。
上述步骤（2）（3）中调整pH均采用6mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整。
4、超滤脱盐：将收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当超出液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水继续浓缩，浓缩至液体体积至10L时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液，取样检测效价。
5、除菌：将浓缩液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤，得无菌滤液。
6、冻干：根据浓缩液的效价加入辅料明胶，控制成品的效价在70单位/mg以上，计算辅料明胶的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20~50℃温度下预冻3~5小时（视盘中液量），将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度94.78%，效价78单位/mg以上，比活621单位/mg蛋白。
7、包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
实施例2
1、粗提纯：
（1）胰脏粉或胰脏加30倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为7%（g/ml），用氨水调整pH为6.0~8.0，零下20℃以下冷冻静置沉淀，转速3000转/分以上离心收集沉淀。
（2）将上述沉淀加入到配制好的2%（g/ml）的草酸盐溶液（每100ml中含1g的草酸铵，1g的草酸钾，胰脏粉或胰脏与草酸盐溶液的比例为1：5）中，充分搅拌30分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脱液：配制30%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液，调整pH为4.0和20%（g/ml）浓度的氯化钠的洗脱液，调整pH6.0，并检测溶液的电导值。
3、层析：
（1）平衡：将HS-Sepharose装入直径为
体积为50L的层析柱中，用pH4.0、30%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕。
（2）进样：调整胰激肽原酶粗品的pH值与硫酸铵平衡液一致，粗品液电导值略低于硫酸铵平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位计算上样量，将样品液进行上柱。
（3）洗涤：用pH4.0、30%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液冲洗一个柱体积。
（4）洗脱：用pH6.0、20%（g/ml）浓度的氯化钠洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液。以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30~50L。
上述步骤（2）（3）中调整pH均采用6mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整。
4、超滤脱盐：将收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当超出液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水继续浓缩，浓缩至液体体积至10L时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液，取样检测效价。
5、除菌：将浓缩液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤，得无菌滤液。
6、冻干：根据浓缩液的效价加入辅料乳糖，控制成品的效价在70单位/mg以上，计算辅料乳糖的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20~50℃温度下预冻3~5小时（视盘中液量），将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.73%，效价70单位/mg，比活630单位/mg蛋白。
7、包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
实施例3
1、粗提纯：
（1）胰脏粉或胰脏加28倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为6.5%（g/ml），用氨水调整pH为6.0~8.0，零下20℃以下冷冻静置沉淀，转速3000转/分以上离心收集沉淀。
（2）将上述沉淀加入到配制好的2%（g/ml）的草酸盐溶液（每100ml中含1g的草酸铵，1g的草酸钾，胰脏粉或胰脏与草酸盐溶液的比例为1：8）中，充分搅拌30分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脱液：配制20%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液，调整pH为4.0和30%浓度的氯化钠的洗脱液，调整pH6.0，并检测溶液的电导值。
3、层析：
（1）平衡：将HS-Sepharose装入直径为
体积为50L的层析柱中，用pH4.0、20%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕。
（2）进样：调整胰激肽原酶粗品的pH值与硫酸铵平衡液一致，粗品液电导值略低于硫酸铵平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位计算上样量，将样品液进行上柱。
（3）洗涤：用pH4.0、20%（g/ml）浓度的硫酸铵平衡液冲洗一个柱体积。
（4）洗脱：用pH6.0、30%（g/ml）浓度的氯化钠洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液。以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30~50L。
上述步骤（2）（3）中调整pH均采用6mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整。
4、超滤脱盐：将收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当超出液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水继续浓缩，浓缩至液体体积至10L时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液，取样检测效价。
5、除菌：将浓缩液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤，得无菌滤液。
6、冻干：根据浓缩液的效价加入辅料乳糖，控制成品的效价在70单位/mg以上，计算辅料乳糖的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20~50℃温度下预冻3~5小时（视盘中液量），将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.62%，效价75单位/mg，比活677单位/mg蛋白。
7、包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
实施例4
1、粗提纯：
（1）胰脏粉或胰脏加20倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为5%（g/ml），用氨水调整pH为6.0~8.0，零下20℃以下冷冻静置沉淀，转速3000转/分以上离心收集沉淀。
（2）将上述沉淀加入到配制好的4%（g/ml）的草酸盐溶液（每100ml中含2g的草酸铵，2g的草酸钾，胰脏粉或胰脏与草酸盐溶液的比例为1：4）中，充分搅拌30分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脱液：配制20%（g/ml）浓度的硫酸钠平衡液，调整pH为4.0和30%（g/ml）浓度的氯化钠的洗脱液，调整pH6.0，并检测溶液的电导值。
3、层析：
（1）平衡：将HS-Sepharose装入直径为
体积为50L的层析柱中，用pH4.0、20%（g/ml）浓度的硫酸钠平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕。
（2）进样：调整胰激肽原酶粗品的pH值与硫酸钠平衡液一致，粗品液电导值略低于硫酸钠平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位计算上样量，将样品液进行上柱。
（3）洗涤：用pH4.0、20%（g/ml）浓度的硫酸钠平衡液冲洗一个柱体积。
（4）洗脱：用pH6.0、30%（g/ml）浓度的氯化钠洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液。以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30~50L。
上述步骤（2）（3）中调整pH均采用6mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整。
4、超滤脱盐：将收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当超出液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水继续浓缩，浓缩至液体体积至10L时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液，取样检测效价。
5、除菌：将浓缩液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤，得无菌滤液。
6、冻干：根据浓缩液的效价加入辅料甘露醇，控制成品的效价在70单位/mg以上，计算辅料甘露醇的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20~50℃温度下预冻3~5小时（视盘中液量），将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.0%，效价70单位/mg，比活600单位/mg蛋白。
7、包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
实施例5
1、粗提纯：
（1）胰脏粉或胰脏加15倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为6%（g/ml），用氨水调整pH为6.0~8.0，零下20℃以下冷冻静置沉淀，转速3000转/分以上离心收集沉淀。
（2）将上述沉淀加入到配制好的4%（g/ml）的草酸盐溶液（每100ml中含2g的草酸铵，2g的草酸钾，胰脏粉或胰脏与草酸盐溶液的比例为1：7）中，充分搅拌30分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脱液：配制30%（g/ml）浓度的硫酸钠平衡液，调整pH为4.0和40%（g/ml）浓度的氯化铵的洗脱液，调整pH6.0，并检测溶液的电导值。
3、层析：
（1）平衡：将HS-Sepharose装入直径为
体积为50L的层析柱中，用pH4.0、30%（g/ml）浓度的硫酸钠平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕。
（2）进样：调整胰激肽原酶粗品的pH值与硫酸钠平衡液一致，粗品液电导值略低于硫酸钠平衡液电导值（以无机盐或水调整电导值），根据每升填料最大亲和量3000万单位计算上样量，将样品液进行上柱。
（3）洗涤：用pH4.0、30%（g/ml）浓度的硫酸钠平衡液冲洗一个柱体积。
（4）洗脱：用pH6.0、40%（g/ml）浓度的氯化铵洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液。以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30~50L。
上述步骤（2）（3）中调整pH均采用6mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调整。
4、超滤脱盐：将收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当超出液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水继续浓缩，浓缩至液体体积至10L时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液，取样检测效价。
5、除菌：将浓缩液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤，得无菌滤液。
6、冻干：根据浓缩液的效价加入辅料甘露醇，控制成品的效价在70单位/mg以上，计算辅料甘露醇的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20~50℃温度下预冻3~5小时（视盘中液量），将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.01%，效价70单位/mg，比活602单位/mg蛋白。
7、包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
上述实施例制备得到的胰激肽原酶，与公开号为CN101073666的中国发明专利中公开的方法制备得到的胰激肽原酶，进行比较，结果如表1、表2所示。
表1
表2
结论：本发明的工艺制备得到的胰激肽原酶纯度非常高，且各项指标均优于CN101073666的各项指标。
Claims (10)
1.一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：步骤如下：
（1）粗提纯：
①取胰脏粉或胰脏，加10～30倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后加入氯化钙至浓度为5～8%，调整pH为6.0～8.0，冷冻静置沉淀，离心收集沉淀；
②将上述沉淀加入到事先配制好的2～4%的草酸盐溶液中，充分搅拌25～35分钟溶解，静置沉淀进行粗提纯，虹吸上清液得粗品液；
（2）溶液配制：配制浓度为20～40%的无机盐平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20～40%的无机盐洗脱液，调整pH为6.0；
（3）亲和柱层析：
①平衡：将装有HS-Sepharose亲和层析填料的层析柱，用上述配制的pH4.0、浓度20～40%的无机盐平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
②进样：调整上述制备的含胰激肽原酶的粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
③洗涤：用上述配制的pH4.0、浓度20～40%的无机盐平衡液冲洗一个柱体积；
④洗脱：用上述配制的pH6.0、浓度20～40%的无机盐洗脱液冲洗柱子，同时用754分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；
（4）超滤脱盐：将上述收集液加注射用水超滤脱盐浓缩，当溶液电导值小于1000μs/cm时，停止加注射用水，继续浓缩，得浓缩液；
（5）除菌：上述浓缩液用微孔滤膜进行除菌过滤，得无菌滤液；
（6）冻干：加入辅料进行冻干，即得胰激肽原酶。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（1）①中，pH调整采用氨水调节，冷冻静置沉淀温度为零下20℃以下，离心转速为大于3000转/分。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（1）②中，2～4%的草酸盐溶液的组成为：每100ml草酸盐溶液中含1～2g的草酸铵，1～2g的草酸钾。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（2）中，无机盐选自硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾，硫酸镁、氯化钠或氯化铵中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（3）中，所用层析柱直径为
体积为50L；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（4）中，超滤脱盐的截留分子量为1万道尔顿，当浓缩至液体体积为1/3～1/5时，关闭超滤机，用注射用水冲洗，至超滤机回管中效价低于30单位/ml时，得浓缩液。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（5）中，微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述步骤（6）中，加入辅料进行冻干的具体步骤如下：辅料用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，控制无菌滤液的效价在70单位/mg以上，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
9.根据权利要求8所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述冻干的工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻3～5小时，将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华，当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。
10.根据权利要求8所述的一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于：所述辅料选自乳糖、甘露醇、明胶或右旋糖苷中的一种或多种。
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