CN102304177B - 用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及其生产的石蒜凝集素 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及其生产的石蒜凝集素，是以石蒜鳞茎为原料，经特定的工艺提取并纯化而得到的一种单一蛋白带的石蒜凝集素纯品，表观分子量48KD，是由四个分子量相同的亚基组成的蛋白质，一种无定形粉末，石蒜凝集素含量高达90％，其工艺步骤依次为：(1)原料制备、(2)打浆、(3)第一次离心分离、(4)浸提、(5)第二次离心分离、(6)合并离心分离液1和2、(7)分级沉淀、(8)第三次离心分离、(9)第一次透析除盐、(10)电泳色谱分离、(11)分子筛层析、(12)洗脱、(13)第二次透析除盐、(14)真空浓缩、(15)真空干燥。本发明方法提供了一种既可以提取石蒜凝集素又可以提取石蒜多糖、石蒜胶、还可以提取分离石蒜总生物碱的方法，工艺简单，节能降耗。

Description

用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及其生产的石蒜凝集素

技术领域

本发明涉及用石蒜属植物鳞茎提取并纯化有效成分的方法，具体地说是用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法及用该方法生产的石蒜凝集素。

背景技术

石蒜(分corl s ra dl a to)属于石蒜科植物，别名老鸦蒜、蒜头草、嶂螂花；多年生草本，鳞茎呈椭圆形，内含丰富的凝集素(Lycori s radi atoAgglutinin，简称LRA)石蒜为多年生草本球茎花卉，品种众多，有红花、黄花、白花等多种类型。在植物分类学上属于单子叶植物石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris.herb).石蒜属植物在世界分布约20种，我国就有15种，占绝对优势，分布12省、市、自治区，秦岭以南至长江流域和西南地区均有野生分布，集中分布于长江中下游地区，其中安徽、江苏、浙江三省植物资源分布最为丰富，蕴藏量最大.

石蒜的鳞茎中含有多种生物碱，主要有高石标碱(Homolycorine)、石蒜伦碱(Lycorenine)、多花水仙碱(Tazett ine)、石蒜胺碱(Lycoramine)、石蒜碱(Lycorine)、伪石蒜碱(Pseudolycorine)和雪花莲胺碱(加兰他敏：Galanthamine)等.此外还淀粉约20％-40％；又含有两种有抑制植物生长和抗癌作用的成分石蒜西定醇(Lycoridinol)、石蒜西定(Lycoricidine).叶和花瓣中含有糖类和糖甙.鳞茎中含有胶类物质，可以作为阿拉伯胶的替代品，此外石蒜的鳞茎还有较多的石蒜凝集素(Lycoris radiataagglutinin.LRA).

植物凝集素在免疫学、化学、生物学以及临床医学方面很早就得到了广泛的运用。在植物抗病方面也有较好的运用前景。对凝集素与肿瘤以及机体许多疾病的关系的研究也引人入胜，尤其是近年来凝集素作为特异性导向药物及抗爱滋病病毒的研究结果都为凝集素的研究指出了更广泛的领域。石蒜凝集素属于石蒜科凝集素，这类凝集素虽不及豆科类的种类多，但其日益显著的作用却越来越受到人们的重视.

四川大学生命科学学院硕士学位论文《石蒜凝集素的纯化、性质及构象研究》，对石蒜凝集素的制备纯化有简单的介绍，由于该论文主要是以研究为目的，虽然某些工艺步骤与本发明相同，但其工艺步骤和工艺条件都很简单，石蒜凝集素的含量只有60％左右，产品质量不高。

发明内容

本发明的目的，在于以石蒜属植物的鳞茎为原料，经提取、加工纯化而得石蒜凝集素，含量在90％以上，提取率在80％以上的的提取纯化方法，而且根据本方法提供的工艺，可以将生产石蒜凝集素过程中的废液和废渣用生产乙醇、石蒜多糖、石蒜胶和石蒜生物总碱，达到石蒜鳞茎的综合利用。本发明的另一目的是利用本生产方法生产出一种单一蛋白带的，表观分子量为48KD，亚基分子量为12KD，四个分子量相同的亚基组成的石蒜凝集素(Lycoris chinensis agglutinin，LCA)纯品.是一种不定形粉末，

本发明以石蒜属植物鳞茎为原料，经加工提取而得到的石蒜凝集素，发明产品可作医药研究和医药产品开发，还可应用于保健食品添加剂.

本发明的工艺步骤依次为：(1)原料制备、(2)打浆、(3)第一次离心分离、(4)浸提、(5)第二次离心分离、(6)合并离心分离液1和2、(7)分级沉淀、(8)第三次离心分离、(9)第一次透析除盐、(10)电泳色谱分离、(11)分子筛层析、(12)洗脱、(13)第二次透析除盐、(14)真空浓缩、(15)真空干燥.

本发明与工艺步骤相应的具体操作条件为：

1.具体操作条件为

(1).原料制备：将新鲜石蒜鳞茎去根、除杂、清洗干净、去黑皮，切片得新鲜原料，亦可用鳞茎干粉或干片为制取石蒜凝集素的干原料；

(2).打浆：将新鲜原料片经粉碎机粉碎打浆得浆状原料；

(3).第一次离心分离：浆状原料用离心机经3500转/分离心分离，得离心分离液1和离心固相1；

(4).酶解浸提：离心固相1加入4倍离心固相重的生理盐水分两次浸提，生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，浸提时间为45小时，浸提温度为常温；

(5).第二次离心分离：浸提完成后都用离心机在3500转/分离心分离，得离心分离液2和离心固相2，离心固相2用于生产乙醇；

(6).合并离心分离液1和离心分离液2。

(7).分级沉淀：在合并后的离心液中逐步加入饱和硫酸铵溶液，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0.43倍重至2.4倍重的沉淀，即当饱和硫酸铵溶液加入量为离心液0.43倍重前和饱和硫酸铵溶液加入量为离心液2.4倍重后的沉淀皆不取；

(8).第三次离心分离，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0.43倍重至2.4倍重的沉淀经管式离心机在转速为3500转/分离心分离得离心液3和离心固相3；离心液3用以生产石蒜多糖、石蒜胶、石蒜生物总碱。保留离心固相3

(9).第一次透析除盐：将离心固相3放在透析袋中用纯净水透析除去硫酸铵盐，用氯化钡溶液至检不出硫酸根离子为终点，得石蒜凝集素粗品

透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)

(10).电泳色谱分离：将石蒜凝集素粗品溶于用0.02mol/L的NaAC-HAC，pH4.5的吸附缓冲液中备用；

首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室、冲洗室、和进样室，然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室，开始电泳吸附.电泳吸附过程持续约60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品.

吸附缓冲液：20mM NaAC-HAC，pH4.5，电流强度I＝60Ma.

洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 8.5；洗脱缓冲液，流强度I＝40Ma.

(11).分子筛层析：将石蒜凝集素浓缩样品注入层析柱中，层析柱的填料是Sephacryl S-200分子筛，平衡Sephacryl S-200分子筛层析柱用的是灭菌生理盐水；

(12).洗脱：洗脱时用的洗脱液是灭菌生理盐水，流速是1.0-1.5ml/min，收集活性部分，活性的检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性.

(13).第二次透除盐：将活性部分放在透析袋中用纯净水透析除盐，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为终点，得石蒜凝集素精品溶液

透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)

(14).真空浓缩：将得到石蒜凝集素精品溶液采用真空浓缩，真空度为-0.085MPa，浓缩温度为35-40℃得浓缩样品

(15).真空干燥：将得到的浓缩样品采用真空干燥，真空度为-0.085MPa，干燥温度为常温，得不定形粉末

(16).包装：将得到的不定形粉末经包装得到含石蒜凝集素90％的产品。

当用石蒜鳞茎干粉或干片作为制备石蒜凝集素的干原料时，工艺步骤(3)第一次离心分离和工艺步骤(6)合并第一次离心分离液1和第二次离心分离注液2两步骤去掉，简化为14步.

上述电泳色谱分离所用篮胶亲和介质是指琼脂糖亲和介质，通常简称为蓝胶，它是一种染料亲和介质，其配基(蓝色染料Cibacron Blue F3GA)是一种多芳香环的磺化物，具有与NAD+相似的空间结构，能与各种激酶、脱氢酶、血清白蛋白、DNA聚合酶等产生亲和吸附作用，从而达到分离纯化的目的。琼脂糖亲和介质(蓝胶)以高交联度琼脂糖为基质，具有高机械强度、高流速的特点，非特异性吸附少，配基泄漏低，可广泛用于蛋白纯化生产领域，如用于纯化磷酸激酶、水解酶、DNA和RNA核酸酶或聚合酶、合成酶、羟化酶、糖分解酶、磷酸二酯酶、脱羧酶以及血清白蛋白、血清脂蛋白、铁传递蛋白、干扰素等蛋白分子.

本发明的产品，经SDS-PAGE检测，是一种单一蛋白带的石蒜凝集素(Lycoris chinensis agglutinin，LCA)纯品，表观分子量为48KD，亚基分子量为12KD，表明LCA是由四个分子量相同的亚基组成的蛋白质.是一种不定形粉末，

本发明利用的原理：

1.酶解：

在石蒜属植物鳞茎的细胞有细胞壁保护，单用机械方法很难完全破坏，所以在提取加入植物复合酶以酶解，采用机械方法加上酶解，尽可能的破坏石蒜属植物鳞茎的细胞壁，将细胞中的石蒜凝集素游离出来后再提取，这样就在原有的提取率得以提高，不加植物复合酶的提取率仅达到70％左右，现加入了植物复合酶酶解后提取，提取率能达到80％以上.

2.电泳亲和色谱：

电泳亲和色谱的分离原理如说明书附图2所示。分离过程在由膜隔开的多通道电泳槽中进行，电场方向与各腔室中的溶液流动方向垂直，带不同电荷的蛋白质混合物进入进样室，带电的目标组分在电场的作用下迁移进入介质室，被亲和介质吸附，带电性质与目标组分相近的杂质蛋白在电场的作用下通过介质室继续迁移入冲洗室并被冲洗溶液带出，；而带电性质与目标组分相反的杂质蛋白质在电场的作用下直接迁移入另一侧的冲洗室，然后被冲洗液带出，减少了杂质蛋白质在介质中的非特异性吸附，从而提高了分离过程的选择性。吸附完成后，引入洗脱缓冲液，在电场的作用下，将目标组分从介质上洗脱出来，并迁移入冲洗室冲出，完成分离过程.

本发明经真空干燥得无定形粉末，经SDS-PAGE检测为单一蛋白带，亚基分子量为120，经SephacrylS-100凝胶过滤测得其表观分子量为45KD，表明LRA是由四个相同亚基组成的蛋白石蒜凝集素。发明产品可作医药研究和医药产品开发，还可应用于保健食品添加剂.

本发明以石蒜凝集素产品生产为目的，对石蒜凝集素的提取、纯化的步骤精确详细.

本发明将电泳亲和色谱法应用到提取纯化石蒜凝集素的工艺水平上，缩短了纯的时间，提高了分离效果，使得的提取的收率和产品质量得到飞跃，产品的收率高、质量好。

本发明在提取过程中采用植物复合酶酶解，有助于石蒜凝集素提取率的提高。

本发明在工艺步骤中虽然有些与背景技术相同，但本发明因新增步骤(10)电泳色谱分离，(13)第二次透析除盐，(14)真空浓缩，(15)真空干燥，使石蒜凝集素的含量从60％提高到90％，同时由于各工艺步骤中具体操作和工艺条件不同，使本发明石蒜凝集素提取率达80％。

附图说明

图1.用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法工艺流程图。

本发明的工艺步骤依次为：(1)原料制备、(2)打浆、(3)第一次离心分离、(4)浸提、(5)第二次离心分离、(6)合并离心分离液1和2、(7)分级沉淀、(8)第三次离心分离、(9)第一次透析除盐、(10)电泳色谱分离、(11)分子筛层析、(12)洗脱、(13)第二次透析除盐、(14)真空浓缩、(15)真空干燥。

图2.电泳色谱分离流程原理图。

电泳亲和色谱装置为6腔室结构的电泳槽，进样室、介质室用凝胶膜隔开，其他各腔室间用HT Tuffryn膜(聚砜膜，孔径为0.2μm购于北京金欧亚科技发展有限公司)隔开，各腔室的长度均为12cm，宽度也均为12cm，阳极室、阴极室、阳极冲洗室、阴级冲洗精通、进样室、介质室的厚度分别为4.0、4.0、3.0、4.0、3.0和4.5mm。采用铂丝作为电泳槽的阳极和阴极，检测设备为岛津UV-1800型紫外分光光度计，多功能电泳仪：瑞典LKB公司。

图中，1、阳极室，2、阳极冲洗室，3、进样室，4、介质室，5、阴极冲洗室，6、阴极室。

具体实施方式

本发明采用实例加以详述

实例1：

(1).原料制备：新挖石蒜鳞茎11.2Kg，除去须根、泥沙、杂物1.1Kg，余下石蒜鳞球10.0Kg，经检测石蒜凝集素含量为0.15％，

(2).打浆：将新鲜原料片经粉碎机粉碎打浆得浆状原料10Kg；

(3).第一次离心分离：将浆状原料用离心机经3500转/分离心分离，得离心分离液1和离心固相1，分别为液6.0Kg，固相4.0Kg；

(4).酶解浸提；

(5).第二次离心分离：将离心固相1加入生理盐水8Kg，生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，搅拌转速50rpm、温度常温下浸提2小时，经管式离心机3500rpm离心过滤，得清液和渣，将渣第二次加入生理盐水8Kg，生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，搅拌转速50rpm、温度常温下浸提2小时，经管式离心机3500rpm离心过滤，得清液和渣，合并清液，得离心分离液2和离心固相2(渣)，离心固相2用于生产乙醇，离心液2重16Kg。

(6).合并离心分离液1和离心分离液2得液22Kg，

(7).分级沉淀：在合并后的离心液中加入饱和硫酸铵溶液9.5Kg，沉降分离沉淀，继续缓慢加入饱和硫酸铵溶液52.8Kg，进行充分沉淀。

(8).第三次离心分离：将上述沉淀液经管式离心机3500rpm离心分离，得离心液3和离心固相3；离心液3用以生产石蒜多糖、石蒜胶、石蒜生物总碱，保留离心固相3，

(9).第一次透析除盐：将离心固相3放在透析袋中用纯净水透析除去硫酸铵盐，直至用氯化钡溶液检不出硫酸根离子时为透析终点，得石蒜凝集素粗品

透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)

(10).电泳色谱分离：将石蒜凝集素粗品溶于用0.02mol/L的NaAC-HAC，pH4.5的吸附缓冲液中备用；首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室1、6、冲洗室2、5、和进样室3。然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室3，开始电泳吸附.电泳吸附过程持续约60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱用处理好的鲜兔血红细胞检测活性，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品.

吸附缓冲液：20mM NaAC-HAC，pH4.5，电流强度I＝60Ma.

洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 8.5；洗脱缓冲液，电流强度I＝40Ma.

Tris是三羟甲基氨基甲烷分子式：NH₂C(CH2OH)₃

(11).分子筛层析：将石蒜凝集素浓缩样品注入层析柱中，层析柱的填料是Sephacryl S-200分子筛，平衡Sephacryl S-200分子筛层析柱用的是灭菌生理盐水；

(12).洗脱：洗脱时用的洗脱液是灭菌生理盐水，流速是1.0-1.5ml/min，检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性.收集活性部分；

(13).第二次透析除盐：将活性部分放在透析袋中用纯净水透析除盐，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为终点，得石蒜凝集素精品溶液

透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)

(14).真空浓缩：将得到石蒜凝集素精品溶液采用真空浓缩，真空度为-0.085MPa，浓缩温度为35-40℃得浓缩样品

(15).真空干燥：将得到的浓缩样品采用真空干燥，真空度为-0.085MPa，干燥温度为常温，粉碎后得产品13.3g

石蒜凝集素含量90％，

石蒜凝集素提取率＝62.8g*90.00％/(50*1000*0.14％)*100％

                ＝80.74％

实例2.

取或石蒜干部粉5Kg，经检测石蒜凝集素含量为0.4％，用9倍干粉重量的生理盐水45Kg分三次浸提，三次浸提用生理盐水的比例为5∶3∶1，生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml浸提时间为4-5小时候，浸提转速为50rpm)，每次都经管式离心机3500rpm离心过滤，得清液和渣，合并清液，加入硫酸铵溶液，取硫酸铵的饱合度在30％-70％时通过经管式离心机3500rpm离心过滤，将得到的石蒜凝集素粗品(渣)放入透析袋中，用纯净水透析除盐，直至用氯化钡溶液检不出硫酸根离子时为透析终点，得到样品溶液，将石蒜凝集素粗品溶于用0.02mol/L的NaAC-HAC，pH4.5的吸附缓冲液中备用；首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室1、6、冲洗室2、5、和进样室3。然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室3，开始电泳吸附.电泳吸附过程持续约60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱用处理好的鲜兔血红细胞检测活性，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品.用处理好的鲜兔血红细胞检测活性，收集活性部分，透析除盐，用硝酸银溶液测试透透终点，真空浓缩后注入用灭菌生理盐水平衡的填料是Sephacryl S-200分子筛中层析柱中，用灭菌生理盐水洗脱，流速是1.0-1.5ml/min，检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性，收集活性部分，透析除盐，真空浓缩、冷冻干燥，粉碎后得粉碎后得含量石蒜凝集素91.00％产品17.74g

石蒜凝集素提取率＝17.74g*91.00％/(5.0*1000*0.40％)*100％

                ＝80.72％

实例3：

(1).原料制备：新挖石蒜鳞茎56Kg，除去须根、泥沙、杂物6Kg，余下石蒜鳞球50.0Kg，经检测石蒜凝集素含量为0.14％，

(2).打浆：将新鲜原料片经粉碎机粉碎打浆得浆状原料50Kg；

(3).第一次离心分离：将浆状原料用离心机经3500转/分离心分离，得离心分离液1和离心固相1，分别为液30.0Kg，固相20.0Kg；

(4).酶解浸提；

(5).第二次离心分离：将离心固相1加入生理盐水40Kg，生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，搅拌转速50rpm、温度常温下浸提2小时，经管式离心机3500rpm离心过滤，得清液和渣，将渣第二次加入生理盐水40Kg，生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，搅拌转速50rpm、温度常温下浸提2小时，经管式离心机3500rpm离心过滤，得清液和渣，合并清液，得离心分离液2和离心固相2(渣)，离心固相2用于生产乙醇，离心液2重80Kg。

(6).合并离心分离液1和离心分离液2得液110Kg，

(7).分级沉淀：在合并后的离心液中加入饱和硫酸铵溶液47.3Kg，沉降分离沉淀，继续缓慢加入饱和硫酸铵溶液264Kg，进行充分沉淀。

(8).第三次离心分离：将上述沉淀液经管式离心机3500rpm离心分离，得离心液3和离心固相3；离心液3用以生产石蒜多糖、石蒜胶、石蒜生物总碱，保留离心固相3，

(9).第一次透析除盐：将离心固相3放在透析袋中用纯净水透析除去硫酸铵盐，直至用氯化钡溶液检不出硫酸根离子时为透析终点，得石蒜凝集素粗品

透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)

(10).电泳色谱分离：将石蒜凝集素粗品溶于用0.02mol/L的NaAC-HAC，pH4.5的吸附缓冲液中备用；首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室1、6、冲洗室2、5、和进样室3。然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室3，开始电泳吸附.电泳吸附过程持续约60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱用处理好的鲜兔血红细胞检测活性，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品.

吸附缓冲液：20mM NaAC-HAC，pH4.5，电流强度I＝60Ma.

洗脱缓冲液：20mM Tri s-HCl，pH 8.5；洗脱缓冲液，流强度I＝40Ma.

Tris是三羟甲基氨基甲烷分子式：NH₂C(CH2OH)₃

(11).分子筛层析：将石蒜凝集素浓缩样品注入层析柱中，层析柱的填料是Sephacryl S-200分子筛，平衡Sephacryl S-200分子筛层析柱用的是灭菌生理盐水；

(12).洗脱：洗脱时用的洗脱液是灭菌生理盐水，流速是1.0-1.5ml/min，检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性.收集活性部分；

(13).第二次透析盐：将活性部分放在透析袋中用纯净水透析除盐，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为终点，得石蒜凝集素精品溶液

透析袋截留分子量≥10KD，10KD＝10000D(道尔顿)

(14).真空浓缩：将得到石蒜凝集素精品溶液采用真空浓缩，真空度为-0.085MPa，浓缩温度为35-40℃得浓缩样品

(15).真空干燥：将得到的浓缩样品采用真空干燥，真空度为-0.085MPa，干燥温度为常温，粉碎后得产品62.8g

石蒜凝集素含量90.05％，

石蒜凝集素提取率＝13.3g*90.00％/(50*1000*0.15％)*100％

                ＝80.24％

实例4.

取或石蒜干部粉20Kg，经检测石蒜凝集素含量为0.38％，用9倍干粉重量的生理盐水180Kg分三次浸提，三次浸提用生理盐水的比例为5∶3∶1生理盐水中含植物复合酶0.05ml/l，植物复合酶的浓度为105000u/ml，浸提时间为4-5小时候，浸提转速为50rpm)，每次都经管式离心机3500rpm离心过滤，得清液和渣，合并清液，加入硫酸铵溶液，取硫酸铵的饱合度在30％-70％时通过经管式离心机3500rpm离心过滤，得到石蒜凝集素粗品，将石蒜凝集素粗品溶于用0.02mol/L的NaAC-HAC，pH4.5的吸附缓冲液中备用；首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室1、6、冲洗室2、5、和进样室3。然后开启电泳仪电源，当篮胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室3，开始电泳吸附.电泳吸附过程持续约60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱用处理好的鲜兔血红细胞检测活性，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品，用处理好的鲜兔血红细胞检测活性，收集活性部分，透析除盐，用硝酸银溶液测试透透终点，真空浓缩后注入用灭菌生理盐水平衡的填料是Sephacryl S-200分子筛中层析柱中，用灭菌生理盐水洗脱，检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性，收集活性部分，透析除盐，真空浓缩、冷冻干燥，粉碎后得含石蒜凝集素90.80％产品68.5g.

石蒜凝集素提取率＝68.5g*90.80％/(20*1000*0.38％)*100％

                ＝81.84％

石蒜凝素含量的测定

紫外吸收法对蛋白质浓度的测定

准确称取石蒜凝集素0.1g，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，用紫外分光光度计(UV-6000PC)，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度。再按下列公式计算蛋白质浓度

样品石蒜凝集素浓度(mg/ml)＝1.45×0D280-0.74×0D260

石蒜凝集素的含量＝(1.45×0D280-0.74×0D260)mg/ml×100ml/100mg×100％。

实验记录：

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (1)

1.一种用石蒜鳞茎提取并纯化石蒜凝集素的方法，是以石蒜属植物鳞茎为原料，经提取纯化而得到的石蒜凝集素，其工艺步骤依次为：

(1)原料制备：将新鲜石蒜鳞茎去根、除杂、清洗干净、去黑皮，切片得新鲜原料；

(2)打浆：将新鲜原料片经粉碎机粉碎打浆得浆状原料；

(3)第一次离心分离：浆状原料用离心机经3500转／分离心分离，得离心分离液1和离心固相1；

(4)酶解浸提：离心固相1加入4倍离心固相重的生理盐水分两次浸提，生理盐水中含植物复合酶0.05ml／L，植物复合酶的浓度为105000U／mL，浸提时间为4-5小时，浸提温度为常温；

(5)第二次离心分离：浸提完成后都用离心机在3500转／分离心分离，得离心分离液2和离心固相2，离心固相2用于生产乙醇；

(6)合并离心分离液1和离心分离液2；

(7)分级沉淀：在合并后的离心液中逐步加入饱和硫酸铵溶液，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0.43倍重至2.4倍重的沉淀，当饱和硫酸铵溶液加入量为离心液0.43倍重前和饱和硫酸铵溶液加入量为离心液2.4倍重后的沉淀皆不取；

(8)第三次离心分离，收集加入饱和硫酸铵溶液的量为离心液0.43倍重至2.4倍重的沉淀经管式离心机在转速为3500转／分离心分离得离心液3和离心固相3；离心液3用以生产石蒜多糖、石蒜胶、石蒜生物总碱，保留离心固相3；

(9)第一次透析除盐：将离心固相3放在透析袋中用纯净水透析除去硫酸铵盐，用氯化钡溶液至检不出硫酸根离子为终点，得石蒜凝集素粗品，

透析袋截留分子量≥10KD，10KD=10000道尔顿

(10)电泳色谱分离：将石蒜凝集素粗品溶于0.02mo1／L的NaAC-HAC，pH4.5的吸附缓冲液中备用；

首先用泵将吸附缓冲液连续输入电极室、冲洗室和进样室，然后开启电泳仪电源，当蓝胶亲和介质与吸附缓冲液达到平衡后，将含有石蒜凝集素粗品的缓冲液用泵输入进样室，开始电泳吸附，电泳吸附过程持续60分钟之后进行15分钟的电泳淋洗，关闭电源，将吸附缓冲液换成洗脱缓冲液，再打开电泳电源，进行电泳洗脱，收集活性部分经浓缩得石蒜凝集素浓缩样品，

吸附缓冲液：20mM NaAC-HAC，pH4.5，电流强度I=60mA，

洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.5，电流强度I=40mA，

(11)分子筛层析：将石蒜凝集素浓缩样品注入层析柱中，层析柱的填料是Sephacryl S-200分子筛，平衡Sephacryl S-200分子筛层析柱用的是灭菌生理盐水；

(12)洗脱：洗脱时用的洗脱液是灭菌生理盐水，流速是1.0-1.5ml／min，收集活性部分，活性的检测方法是处理好的鲜兔血红细胞检测其活性；

(13)第二次透析除盐：将活性部分放在透析袋中用纯净水透析除盐，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为终点，得石蒜凝集素精品溶液透析袋截留分子量≥10KD，10KD=10000道尔顿

(14)真空浓缩：将得到石蒜凝集素精品溶液采用真空浓缩，真空度为-0.085MPa，浓缩温度为35-40℃得浓缩样品

(15)真空干燥：将得到的浓缩样品采用真空干燥，真空度为-0.085MPa，干燥温度为常温，得不定形粉末。