CN103059086A - 一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法。本发明以蛹虫草固体培养基为原料，经粉碎、渗漉提取、除杂、活性炭脱色、阴离子交换树脂纯化、结晶、干燥等提取纯化技术，获得虫草素，纯度可达99.0％以上。本发明以蛹虫草固体培养基为原料，变废为宝，同时具有提取率高、操作简单、可行性强、节约能源等特点，适于工业化生产。

Description

一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法
技术领域
本发明属于医药工业领域，涉及药用天然化合物的提取纯化，更具体地讲，本发明涉及一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，北虫草，为子囊菌亚门麦角菌科虫草属，是一种药用真菌，在中医学上应用历史悠久。其菌丝体含有多种生物活性物质：虫草素，虫草多糖，虫草酸和超氧化物歧化酶等，具有降血压、抗病毒、降血脂、滋补疗效和提高人体免疫的功能。
虫草素(cordycepin)又名3′-脱氧腺苷，是Cuningham于1951年分离得到的一种腺苷类活性物质，其结构式如下图，分子式为C10H13N5O3，分子量为251.24，熔点230-231℃。
Figure BSA00000826847100011
虫草素是蛹虫草中主要的有效成份之一，具有抗菌抗病毒、抗肿瘤、以及抗疲劳、抗衰老、抗炎提高人体免疫能力，抑制单胺氧化酶活性，具有较高的药用价值和广泛的药理作用。临床上主要应用治疗癌症、白血病、扩张支气管、显著增强肾素、抗衰老等作用。
天然虫草素的主要来源是蛹虫草，因此，目前有关提取技术的研究对象大都为蛹虫草，提取剂可利用蒸馏水、甲醇、乙醇等，而辅助提取手段通常有微波、超声、酶法等。国内关于虫草素分离的技术手段主要为层析法，根据分离原理大致可以分为2类：一类为离子交换吸附层析，另一类为分配纯化常用离子交换树脂法，如732阳离子树脂等。也有利用其他分离方法，如活性炭吸附、氧化铝柱层析、硅胶柱层析和超临界萃取等方法。从总体上而言，上述方法的成本过高、回收率也低，只限于实验室研究，难以实现工业化生产。
现代生活工作节奏加快，压力增大，使得人们免疫系统功能减弱，极易引起肿瘤、肝炎等一系列疾病，虫草素具有抗菌，消炎、抗氧化、抗肿瘤、调节人体内分泌和增强人体免疫功能等显著作用，因此无论是医疗康复，还是保健养生，虫草素都将会拥有巨大的现实市场和潜在市场。在生产中，如何降低产业化成本大量制备高纯度虫草素将是今后进一步研究的重点。
随着人工培养蛹虫草产业规模的不断扩大，作为培养附属产物的蛹虫草固体培养基产出量越来越大，目前固体培养基在培养完子实体后，基本上是弃之，长满菌丝的培养基中含有较多的虫草素，若能有效利用这一废弃物，其经济和环境效益可观。
发明内容
本发明是针对现有生产虫草素方法的成本过高、收率低等问题，提供一种蛹虫草固体培养基虫草素提取纯化的方法。
本发明特征在于以蛹虫草固体培养基为原料，充分利用蛹虫草发酵后的培养基废弃物，降低了生产虫草素的成本，减少了资源浪费；采用渗漉法提取虫草素，提取率高、操作简单、可行性强、节约能源；采用阴离子树脂柱层析方法分离纯化虫草素，产率高、成本低，是一条适合于工业生产的工艺路线。
本发明提供了提取纯化蛹虫草固体培养基虫草素的方法，具体步骤如下：
1.原料处理
取蛹虫草固体培养基，用粉粹机粉碎，过60目筛。
2.渗漉提取
称取一定量的蛹虫草固体培养基，置于渗漉柱中，用4-6倍量的50％乙醇浸渍12-16h后开始渗漉，控制流速1.0-1.5mL/min，收集渗漉液。
3.除杂
将收集到的渗漉液加3-5倍无水乙醇，沉淀过夜，布氏漏斗过滤；取滤液，于3500-4500r/min下离心10-30min，以除去粗多糖等物质；取上清液，用滴管加入2mol/L HCl滴定，操作过程中，用酸度计随时测试溶液中的pH值，当HCl滴定至溶液pH值3.5时，停止滴定，3500-4500r/min下离心10-30min，去除乙醇不溶性杂质和一些蛋白质。
4.活性炭脱色
向上步所得上清液中加入1-3％活性炭，于60℃水浴中脱色20-40min，旋转蒸发仪浓缩。
5.阴离子交换树脂纯化
用蠕动泵缓慢将浓缩液加入到阴离子交换树脂床面，待浓缩液完全进入阴离子交换树脂床面，用去离子水进行洗脱；将洗脱液去离子水加入层析柱内进行洗脱，用核酸蛋白检测仪(254nm)进行检测，直至示数为零，停止洗脱。
6.结晶
将收集到的溶液减压浓缩至干，用95％乙醇溶解，而后放于冰箱中，温度＜5℃，放置一周，有白色针状晶体析出，抽滤，于60℃真空干燥器中进行真空干燥，获得虫草素，纯度达99％以上。
具体实施方式
实施例1
1.原料处理
取蛹虫草固体培养基，用粉粹机粉碎，过60目筛。
2.渗漉提取
称取蛹虫草固体培养基1kg，置于渗漉柱中，用4倍量的50％乙醇浸渍12h后开始渗漉，控制流速1.0-1.5mL/min，收集渗漉液。
3.除杂
将收集到的渗漉液加5倍无水乙醇，沉淀过夜，布氏漏斗过滤；取滤液，于3500r/min下离心20min，以除去粗多糖等物质；取上清液，用滴管加入2mol/L HCl滴定，操作过程中，用酸度计随时测试溶液中的pH值，当HCl滴定至溶液pH值3.5时，停止滴定，3500r/min下离心20min，去除乙醇不溶性杂质和一些蛋白质。
4.活性炭脱色
向上步所得上清液中加入1％活性炭，于60℃水浴中脱色20min，旋转蒸发仪浓缩。
5.阴离子交换树脂纯化
用蠕动泵缓慢将浓缩液加入到阴离子交换树脂床面，待浓缩液完全进入阴离子交换树脂床面，用去离子水进行洗脱；将洗脱液去离子水加入层析柱内进行洗脱，用核酸蛋白检测仪(254nm)进行检测，直至示数为零，停止洗脱。
6.结晶
将收集到的溶液减压浓缩至干，用95％乙醇溶解，而后放于冰箱中，温度＜5℃，放置一周，有白色针状晶体析出，抽滤，于60℃真空干燥器中进行真空干燥，获得虫草素，纯度99.29％。
实施例2
1.原料处理
取蛹虫草固体培养基，用粉粹机粉碎，过60目筛。
2.渗漉提取
称取蛹虫草固体培养基1kg，置于渗漉柱中，用5倍量的50％乙醇浸渍14h后开始渗漉，控制流速1.0-1.5mL/min，收集渗漉液。
3.除杂
将收集到的渗漉液加5倍无水乙醇，沉淀过夜，布氏漏斗过滤；取滤液，于4500r/min下离心30min，以除去粗多糖等物质；取上清液，用滴管加入2mol/L HCl滴定，操作过程中，用酸度计随时测试溶液中的pH值，当HCl滴定至溶液pH值3.5时，停止滴定，4500r/min下离心30min，去除乙醇不溶性杂质和一些蛋白质。
4.活性炭脱色
向上步所得上清液中加入3％活性炭，于60℃水浴中脱色20min，旋转蒸发仪浓缩。
5.阴离子交换树脂纯化
用蠕动泵缓慢将浓缩液加入到阴离子交换树脂床面，待浓缩液完全进入阴离子交换树脂床面，用去离子水进行洗脱；将洗脱液去离子水加入层析柱内进行洗脱，用核酸蛋白检测仪(254nm)进行检测，直至示数为零，停止洗脱。
6.结晶
将收集到的溶液减压浓缩至干，用95％乙醇溶解，而后放于冰箱中，温度＜5℃，放置一周，有白色针状晶体析出，抽滤，于60℃真空干燥器中进行真空干燥，获得虫草素，纯度99.23％。
实施例3
1.原料处理
取蛹虫草固体培养基，用粉粹机粉碎，过60目筛。
2.渗漉提取
称取蛹虫草固体培养基1kg，置于渗漉柱中，用5倍量的50％乙醇浸渍15h后开始渗漉，控制流速1.0-1.5mL/min，收集渗漉液。
3.除杂
将收集到的渗漉液加5倍无水乙醇，沉淀过夜，布氏漏斗过滤；取滤液，于4000r/min下离心30min，以除去粗多糖等物质；取上清液，用滴管加入2mol/L HCl滴定，操作过程中，用酸度计随时测试溶液中的pH值，当HCl滴定至溶液pH值3.5时，停止滴定，4000r/min下离心30min，去除乙醇不溶性杂质和一些蛋白质。
4.活性炭脱色
向上步所得上清液中加入2％活性炭，于60℃水浴中脱色30min，旋转蒸发仪浓缩。
5.阴离子交换树脂纯化
用蠕动泵缓慢将浓缩液加入到阴离子交换树脂床面，待浓缩液完全进入阴离子交换树脂床面，用去离子水进行洗脱；将洗脱液去离子水加入层析柱内进行洗脱，用核酸蛋白检测仪(254nm)进行检测，直至示数为零，停止洗脱。
6.结晶
将收集到的溶液减压浓缩至干，用95％乙醇溶解，而后放于冰箱中，温度＜5℃，放置一周，有白色针状晶体析出，抽滤，于60℃真空干燥器中进行真空干燥，获得虫草素，纯度99.18％。
实施例4
1.原料处理
取蛹虫草固体培养基，用粉粹机粉碎，过60目筛。
2.渗漉提取
称取蛹虫草固体培养基1kg，置于渗漉柱中，用6倍量的50％乙醇浸渍15h后开始渗漉，控制流速1.0-1.5mL/min，收集渗漉液。
3.除杂
将收集到的渗漉液加3-5倍无水乙醇，沉淀过夜，布氏漏斗过滤；取滤液，于4500r/min下离心25min，以除去粗多糖等物质；取上清液，用滴管加入2mol/L HCl滴定，操作过程中，用酸度计随时测试溶液中的pH值，当HCl滴定至溶液pH值3.5时，停止滴定，4500r/min下离心25min，去除乙醇不溶性杂质和一些蛋白质。
4.活性炭脱色
向上步所得上清液中加入2％活性炭，于60℃水浴中脱色30min，旋转蒸发仪浓缩。
5.阴离子交换树脂纯化
用蠕动泵缓慢将浓缩液加入到阴离子交换树脂床面，待浓缩液完全进入阴离子交换树脂床面，用去离子水进行洗脱；将洗脱液去离子水加入层析柱内进行洗脱，用核酸蛋白检测仪(254nm)进行检测，直至示数为零，停止洗脱。
6.结晶
将收集到的溶液减压浓缩至干，用95％乙醇溶解，而后放于冰箱中，温度＜5℃，放置一周，有白色针状晶体析出，抽滤，于60℃真空干燥器中进行真空干燥，获得虫草素，纯度99.36％。

Claims (8)

1.一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于：以蛹虫草固体培养基为原料，经粉碎、渗漉提取、除杂、活性碳脱色、阴离子交换树脂纯化、结晶、干燥后获得纯度可达99.0％以上的虫草素。
2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于，所述的蛹虫草固体培养基粉碎至40-80目，过筛。
3.根据权利要求1所述的一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于，所述的渗漉提取中用4-6倍量的50％乙醇浸渍蛹虫草固体培养基粉末，12-16h后开始渗漉，控制流速1.0-1.5mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于，所述的除杂是渗漉液中加3-5倍无水乙醇，沉淀过夜，过滤，3500-4500r/min下离心10-30min；上清液中加入2mol/L HCl滴定，当HCl滴定至溶液pH值3.5时，停止滴定，3500-4500r/min下离心10-30min，除去杂质。
5.根据权利要求1所述的一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于，所述的活性碳脱色中加入1-3％活性炭，于60℃水浴中脱色20-40min。
6.根据权利要求1所述的一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂纯化：用蠕动泵将浓缩液加入到阴离子交换树脂床面，用去离子水进行洗脱；将洗脱液去离子水加入层析柱内进行洗脱，用核酸蛋白检测仪(254nm)进行检测，直至示数为零，停止洗脱。
7.根据权利要求1所述的一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于，所述的结晶：将收集到的洗脱液减压浓缩至干，用95％乙醇溶解，而后放于冰箱中，温度＜5℃，放置一周，有白色针状晶体析出。
8.根据权利要求1所述的一种蛹虫草固体培养基虫草素的提取纯化方法，其特征在于，所述的晶体于60℃真空干燥器中进行真空干燥，获得虫草素。
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