CN107827965B

CN107827965B - 一种面包树果实凝集素的提取方法

Info

Publication number: CN107827965B
Application number: CN201711327644.1A
Authority: CN
Inventors: 杨愈丰; 张晓青; 施青; 刘振勇; 李均; 彭莉萍
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2037-12-13
Also published as: CN107827965A

Abstract

本方案公开了一种面包树果实凝集素的提取方法，包括(1)原料制备：从新鲜的面包树果实中取果实籽，得新鲜原料；(2)打浆：在新鲜原料中加入Tris‑HCl缓冲液，经匀浆机打碎得浆状原料；(3)热水浴浸提：在40～90℃的条件下对浆状原料浸提1～2h，浸提后过滤得滤液；(4)第一次离心：在4000～8000r/min的条件下对滤液离心处理15～30min，然后取上清液；(5)硫酸铵沉淀目的蛋白：在上清液中加入硫酸铵至饱和度为60～100％，静置2～8h得悬浊液；(6)第二次离心：在4000～8000r/min的条件下对悬浊液离心处理15～30min，弃上清液，沉淀用Tris‑HCl缓冲液重悬，得面包树果实凝集素粗品。采用本方案的方法提取面包树果实凝集素，能有效提高面包树果实凝集素的提取率和纯度。

Description

一种面包树果实凝集素的提取方法

技术领域

本发明属于植物有效成分提取技术领域，特别涉及一种面包树果实凝集素的提取方法。

背景技术

凝集素是一组广泛分布在多种动物、植物、真菌、细菌和病毒等生物的非免疫来源的糖蛋白，包含至少一个非催化结构域，能够特异性地识别和可逆性地结合到特定的游离糖或寡糖上，且在不改变糖分子结构的基础上发挥一系列的生物学效应。植物凝集素主要分布在植物中，以储藏器官和繁殖器官为主。大量研究指出，植物凝集素在对靶细胞的识别和结合，细胞的定位，诱导细胞凋亡与自噬，免疫学的防御功能以及细胞毒性和跨膜信号的转导等方面均发挥着重要的调控作用，特别是其在抗肿瘤和抗病毒方面的应用越来越广泛和成熟。由于植物凝集素来源广泛、特异性高且功能多样，是细胞生物学和免疫学的重要工具。

面包树（Artocarpus incisa (Thunb.) L.）原产于新几内亚，印度尼西亚，菲律宾等热带地区，其果实具有抗炎、抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用。面包树果实凝集素（frutalin，FTL）是从面包果籽中分离出的糖蛋白，具有四聚体结构。面包树果实凝集素的氨基酸序列、结构以及糖结合特异性等与Jacalin家族中第一个被发现的半乳糖结合凝集素A. integrifolia seeds—jackfruit的极其相似，经证实属于Jacalin家族。在功能性质方面，面包树果实凝集素与Jacalin也表现出相似性，然而由于面包树果实凝集素拥有高强度的凝血活性，相较于jackfruit，它的生物学活性更显著。研究表明，面包树果实凝集素是一种能够引起免疫调节的植物凝集素，可以作为肿瘤标志物，在生物医学应用中越来越受到人们的关注。

目前，面包树果实凝集素的提取主要是对果实籽进行打浆、离心、浓缩而得，由于提取工艺粗糙，导致面包树果实凝集素的提取率和纯度均较低。

发明内容

本发明意在提供一种面包树果实凝集素的提取方法，以实现较高的面包树果实凝集素提取率和纯度。

本方案中的一种面包树果实凝集素的提取方法，包括以下步骤：

（1）原料制备：从新鲜的面包树果实中取果实籽，得新鲜原料；

（2）打浆：在新鲜原料中加入Tris-HCl缓冲液，经匀浆机打碎得浆状原料；

（3）热水浴浸提：在40～90℃的条件下对浆状原料浸提1～2h，浸提后过滤得滤液；

（4）第一次离心：在4000～8000r/min的条件下对滤液离心处理15～30min，然后取上清液；

（5）硫酸铵沉淀目的蛋白：在上清液中加入硫酸铵至饱和度为60～100％，静置2～8h得悬浊液；

（6）第二次离心：在4000～8000r/min的条件下对悬浊液离心处理15～30min，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液重悬，得面包树果实凝集素粗品。

本方案的工作原理及其有益效果：

本方案在对果实籽进行打浆时加入Tris-HCl缓冲液提高了蛋白质的溶解度，果实籽打浆后再经40～90℃的高温浸提，提高了面包树果实凝集素的溶出率，通过过滤去除多余杂质，提高面包树果实凝集素的纯度；然后进行第一次离心，显著缩短了沉淀的时间；离心后取上清液进一步减少了杂质含量，提高了面包树果实凝集素的纯度。第一次离心后，采用硫酸铵沉淀目的蛋白，高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来；在上清液中加入硫酸铵至饱和度为60～100％，可将目标蛋白沉淀下来。目标蛋白沉淀下来后在低温下进行第二次离心，使目标蛋白快速沉淀；二次离心后去除上清液，进一步降低杂质含量，提高面包树果实凝集素的纯度。采用本方案的提取方法提取面包树果实凝集素，每千克面包树新鲜果实籽可提取出300~400毫克的面包树果实凝集素，其纯度可达90%以上。

进一步，透析除盐：将步骤（6）中的面包树果实凝集素粗品在截留分子量不大于10kDa的透析袋中用超纯水透析12～24h，得面包树果实凝集素样品。由于面包树果实凝集素粗品是经过硫酸铵沉淀处理的，其中含有较多小分子盐离子，通过透析除盐有利于除去硫酸铵盐等小分子盐离子，进而提高面包树果实凝集素的纯度。

进一步，所述透析除盐的步骤为：将所述面包树果实凝集素粗品加入到透析袋中，扎紧透析袋两端，把透析袋放入盛有超纯水的搅拌容器中，以60～120r/min进行搅拌，水温为18～60℃，透析袋体积/超纯水体积为1:7～1:20。将透析除盐的水温设为18～60℃，转速设为60～120r/min，透析袋体积/超纯水体积为1:7～1:20，有利于硫酸铵盐等小分子盐离子的去除。

进一步，阳离子交换层析：将所述面包树果实凝集素样品上阳离子交换柱，用Buffer A和Buffer B梯度洗脱，收集25%～30%Buffer B的洗脱组分；Buffer A为浓度20mmol/L、经浓HCl调节pH值至6.5的Na₂HPO₄溶液；Buffer B为经浓HCl调节pH值至6.5的溶液，溶液中包含为浓度20mmol/L的Na₂HPO₄和0.5mol/L NaCl。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。阳离子交换层析中，基质是由带有电荷的数脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之为阳离子交换树脂。由于蛋白质具有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白质可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。通过阳离子交换层析进一步提高了面包树果实凝集素的纯度。

进一步，超滤浓缩洗脱：将阳离子交换层析中收集的洗脱组分用截留分子量为10KDa的超滤浓缩管进行离心处理得到面包树果实凝集素超滤浓缩液，离心转速为4000～8000r/min。通过超滤浓缩洗脱，使得面包树果实凝集素的纯度进一步提高。

基础方案中的面包树果实凝集素粗品即实现了对面包树果实凝集素的提取，进一步优化过程中提及的面包树果实凝集素样品、面包树果实凝集素超滤浓缩液是面包树果实凝集素粗品的进一步纯化提取所得。

进一步，步骤（2）中，Tris-HCl缓冲液的pH为7.2，Tris-HCl缓冲液含0.02mol/LTris和0.2mol/L NaCl。pH为7.2的Tris-HCl缓冲液，有利于面包树果实凝集素溶解在Tris-HCl缓冲液中，同时有利于保持面包树果实凝集素的稳定性。

进一步，步骤（3）中浸提温度为40～60℃。浸提温度超过60℃后会导致面包树凝集素的稳定性下降，将浸提温度设置为40～60℃在提高了面包树果实凝集素的溶出率的同时避免了面包树凝集素稳定性的降低。

附图说明

图1为一种面包树果实凝集素的提取方法的工艺流程图；

图2为硫酸铵饱和度对面包树果实凝集素提取的影响图；

图3为浓缩后的洗脱液蛋白电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

如图1所示的一种面包树果实凝集素的提取方法，包括以下步骤：

（1）原料制备：将新鲜的面包树果实去皮，去果肉，清洗干净，得新鲜的面包树果实籽50g；

（2）打浆：将果实籽加入100mL Tris-HCl缓冲液后经匀浆机打碎得浆状原料，Tris-HCl缓冲液的pH为7.2，Tris-HCl缓冲液含0.02mol/L Tris和0.2mol/L NaCl；

（3）热水浴浸提：将浆状原料转移到250mL的烧杯中于恒温水浴锅中50℃浸提1h后，用纱布过滤取滤液；

（4）第一次离心：将滤液于冷冻离心机中4℃，5500r/min，离心20min后，弃沉淀，取上清液，量取上清液的体积为96mL；

（5）硫酸铵沉淀目的蛋白：于上清液中加入45.32g硫酸铵至饱和度为70％，静置4h得悬浊液；

（6）第二次离心：将悬浊液于冷冻离心机中4℃，5500r/min，离心20min后，弃上清液，用4mL Tris-HCl缓冲液取沉淀，得面包树果实凝集素粗品，用2%鼠红细胞悬液检测凝集素活性，最后于4℃冰箱保存；

（7）透析除盐：透析除盐：将步骤（6）中的面包树果实凝集素粗品于透析袋（截留分子量为7KD）中用超纯水透析12～24h，目的是除去硫酸铵盐等小分子盐离子，用硝酸银溶液检测至检不出氯离子为止，得面包树果实凝集素样品；

（8）阳离子交换层析：将透析后的面包树果实凝集素样品上阳离子交换柱，用Buffer A (20mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH6.5)和Buffer B(20mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.5mol/L NaCl，pH6.5)洗脱，收集25%～30%BufferB的洗脱组分；

（9）样品处理：

1）取10ml提取的面包树果实凝集素样品于透析袋中，用超纯水透析12～24h，中间要按时换水几次；

2）透析结束后，将样品用100ml Buffer A(20mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH6.5) 稀释后4℃，13000r/min离心30min；

3）取上清液，先用100ml Buffer A(20mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH6.5)将上清液稀释后，抽滤并超声除气；

试剂配置：

1）Buffer A：配制1L浓度为20mmol/L的Na₂HPO₄溶液，用浓HCl将pH调为6.5，抽滤并超声除气；

2）Buffer B：配制1L浓度为20mmol/L的Na₂HPO₄溶液（含0.5M NaCl）,用浓HCl将pH调为6.5，抽滤并超声除气；

纯化步骤：

1）打开AKTA纯化仪用超纯水冲洗管路，去除管路保护液；

2）装柱：调节柱前压至0.5MPa，将5mL HiTrap SP预装柱接到AKTA纯化仪上，用超纯水冲洗至基线平衡；

3）柱子平衡：用Buffer A冲洗柱子至基线平衡，流速为2mL/min；

4）上样：将紫外调零，按流速2mL/min，上样结束后，用Buffer A冲洗直到基线水平为止；

5）洗脱：设置洗脱时间为10min，进行连续梯度洗脱（0-100%的Buffer B），收集每个洗脱峰，洗脱结束后用Buffer B继续冲洗约10min，到紫外吸收值无明显变化。洗脱过程中，收集各个洗脱峰，分别检测活性；

6）柱子再生：用超纯水冲洗柱子10min左右，用0.5mol/L NaOH冲柱子，直至将上样柱中的吸附物洗出，然后再用超纯水冲洗10min后，用20%的乙醇溶液冲柱，直至乙醇溶液充满仪器后将层析柱取下，4℃保存；

（10）超滤浓缩洗脱：将上述收集的活性组分于超滤浓缩管（截留分子量10KDa）中，4℃，5000r/min，离心至体积为500μL，所得的超滤浓缩液于4℃冰箱保存。

采用本方案的提取方法提取面包树果实凝集素，每千克面包树新鲜果实籽可提取出300~400毫克的面包树果实凝集素，其纯度可达98%以上。

面包树果实凝集素提取步骤的优化结果

（1）硫酸铵饱和度优化

图2中：A:空白对照；B:60%硫酸铵；C：70%硫酸铵；D:80%硫酸铵；E：90%硫酸铵；F：100%硫酸铵。

由图2可知，当硫酸铵的浓度70～90%时凝血活性最大，最终硫酸铵沉淀目的蛋白的浓度定为70%。为了方便比较，将凝集活力均采用效价方式描述，即如果第5孔出现沉淀，则该样品的凝集效价为25。

由于该凝集素的凝集活力较强，以上结果均是将凝集素稀释100倍后的实验结果。

（2）浸提液体积优化

由表1可知，当浸提液体积为100mL时凝血活性最大，最终浸提液体积定为100mL。

（3）硫酸铵沉淀时间优化

由表2可知，硫酸铵沉淀时间为4h，6h，8h的凝血活性较好，且很稳定，所以最终硫酸铵沉淀目的蛋白的时间定为4h。

(4)浸提时间优化

由表3可知，当浸提时间为1h时凝血活性最大，最终浸提液体积定为1h。

（5）浸提温度优化

由表4可知，当浸提温度为50～60℃时凝血活性最大，最终浸提液体积定为50℃。

浓缩后的洗脱液蛋白电泳图如图3所示：

图3中：1泳带为蛋白Marker；2泳带为浓缩液稀释30倍后的蛋白电泳条带，其中上带对应15.5KD，下带对应12KD。

面包树果实凝集素超滤浓缩后理化性质研究结果

（1）糖抑制试验结果：

由表5可知，以上所有糖对面包树果实凝集素均无抑制作用。

（2）热稳定性试验结果：

由表6可知，当温度为50℃时凝血活性最大，随着温度的升高，凝集素的活性逐渐降低，所以面包树果实凝集素可以耐受较高的温度，但温度不应超60℃。

（3）金属离子稳定性试验结果：

由表7可知，以上所用金属离子对面包树果实凝集素均无抑制作用。

（4）pH稳定性试验结果：

由表8可知，面包树果实凝集素的稳定性较好，在偏酸或者偏碱的环境中均不易失活。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种面包树果实凝集素的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

（2）打浆：在新鲜原料中加入Tris-HCl缓冲液，经匀浆机打碎得浆状原料；Tris-HCl缓冲液的pH为7.2，Tris-HCl缓冲液含0.02mol/L Tris和0.2mol/L NaCl；

（3）热水浴浸提：在40～60℃的条件下对浆状原料浸提1～2h，浸提后过滤得滤液；

（5）硫酸铵沉淀目的蛋白：在上清液中加入硫酸铵至饱和度为70～90％，静置2～8h得悬浊液；

（6）第二次离心：在4000～8000r/min的条件下对悬浊液离心处理15～30min，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液重悬，得面包树果实凝集素粗品；

（7）透析除盐：将步骤（6）中的面包树果实凝集素粗品在截留分子量为7kDa的透析袋中用超纯水透析12～24h，得面包树果实凝集素样品；透析除盐时，扎紧透析袋两端，把透析袋放入盛有超纯水的搅拌容器中，以60～120r/min进行搅拌，水温为18～60℃，透析袋体积/超纯水体积为1:7～1:20；

（8）阳离子交换层析：将所述面包树果实凝集素样品上阳离子交换柱，用Buffer A和Buffer B梯度洗脱，收集25%～30%Buffer B的洗脱组分；Buffer A为浓度20mmol/L、经浓HCl调节pH值至6.5的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄溶液；Buffer B为经浓HCl调节pH值至6.5的溶液，溶液中包含为浓度20mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄和0.5mol/L NaCl；梯度洗脱时包括以下过程：①打开AKTA纯化仪用超纯水冲洗管路，去除管路保护液；②装柱：调节柱前压至0.5MPa，将5mL HiTrap SP预装柱接到AKTA纯化仪上，用超纯水冲洗至基线平衡；③柱子平衡：用Buffer A冲洗柱子至基线平衡，流速为2mL/min；④上样：将紫外调零，按流速2mL/min，上样结束后，用Buffer A冲洗直到基线水平为止；⑤洗脱：设置洗脱时间为10min，使用0-100%的Buffer B进行连续梯度洗脱；

（9）超滤浓缩洗脱：将阳离子交换层析中收集的洗脱组分用截留分子量为10KDa的超滤浓缩管进行离心处理得到面包树果实凝集素超滤浓缩液，离心转速为4000～8000r/min。