CN104817633A - 一种红菇凝集素的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红菇凝集素的制备方法及应用，其制备方法首先将红菇子实体粉碎，加入磷酸缓冲液低温浸提，然后加入硫酸铵沉淀，再经离心透析脱盐，通过DEAE离子交换层析、SephadexG-100凝胶层析等纯化步骤获得红菇凝集素（RLN）。利用本发明提供的方法制备得到的红菇凝集素具有抗菌活性，因此本发明在于红菇活性成分多方位开发利用。

Description

一种红菇凝集素的制备方法及应用
技术领域
    本发明涉及生物技术中功能蛋白制备方法，具体地说，涉及一种红菇凝集素的制备方法及应用。
背景技术
红菇隶属于担子菌亚门、层菌纲、红菇目、红菇科、红菇属（Russula）真菌，是一种美味的野生菌根性食药兼用真菌。该红菇多年来一直是容县畅销名产，成为人们馈赠亲朋好友的佳品。由于此菇生境特殊，目前尚未能人工栽培，野生红菇的价格年年攀升，野生红菇的开发与利用已成为国内外学者们的研究热点。
凝集素一类具有特异糖结合活性的蛋白，具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域，广泛存在于各种植物、动物、人体的组织器官、真菌和某些病毒中。凝集素最显著的特点是具有细胞凝集能力，不仅能凝集红细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌、病毒等，还能特异性识别并结合细菌、病毒、肿瘤细胞表面的糖结构从而抵制其生长，因此凝集素被广泛用于病原菌的防治、肿瘤的治疗、含糖基生物大分子的检测等方面。
红菇含有丰富的营养物质和生物活性物质，目前国内外尚未发现有关红菇凝集素的所道。而本发明通过浸提、沉淀、透析脱盐、离子交换层析、凝胶层析等过程获得了红菇凝集素并具有抑菌活性，因此本发明在于红菇活性成分多方位开发利用。
发明内容
    本发明的目的在于提供一种红菇凝集素的制备方法及应用，通过本发明通过浸提、沉淀、透析脱盐、离子交换层析、凝胶层析等过程获得了红菇凝集素并具有抑菌活性，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种红菇凝集素的制备方法及应用，包括以下的工艺步骤：
    （1）凝集素粗品的提取：红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液，于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入适量的磷酸盐缓冲液，于2～6℃中浸提24～48h，四层纱布过滤，滤液经8000～12000r/min于4℃下离心20～40min，弃沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至75%～80%饱和度，4℃下静默12～24h，于4℃下以8000～12000r/min速度离心30～60min，收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到红菇凝集素粗制品。
    （2）DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的红菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱，将活力峰部分收集，透析除盐，冷冻干燥。
    （3）SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液，流速为40ml/h，3ml/tube约5min收集1管。将活力峰部分收集，透析，冷冻干燥得到红菇凝集素（RLN）。
上述步骤（1）、（2）所述的磷酸盐缓冲液指的是pH值为7.2的内含0.15mol/L NaCl的0.015mol/L的磷酸缓冲液。
上述步骤（1）中浸提时的液料比为10:1。
上述步骤（2）洗脱峰共有4个，其中活力峰指的是第4个洗脱峰。
上述步骤（3）中将收集到的活力峰经过SephadexG-100分子筛层析后得到3个蛋白峰，其中活力峰指的是第2个蛋白峰。
上述步骤（3）获得的红菇凝集素具有抑菌活性。
本发明的优点是：将红菇子实体粉碎，加入磷酸缓冲液低温浸提，然后加入硫酸铵沉淀，再经离心透析脱盐，通过DEAE离子交换层析、SephadexG-100凝胶层析等纯化步骤获得红菇凝集素（RLN）。利用本发明提供的方法制备得到的红菇凝集素具有抗菌活性，因此本发明在利于红菇活性成分多方位开发利用。
附图说明
图1为本发明一种红菇凝集素的制备方法及应用的凝血活性检测示意图。
图2为本发明一种红菇凝集素的制备方法及应用的抑菌活性示意图。
具体实施方式
    以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
   （1）凝集素粗品的提取：红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS,0.015mol/L,pH7.2，内含0.15mol/L NaCl），于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入磷酸盐缓冲液（液料比为10:1），于2℃中浸提30h，四层纱布过滤，滤液经10000r/min于4℃下离心20min，弃沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至75%饱和度，4℃下静默12h，于4℃下以8000r/min速度离心45min，收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到红菇凝集素粗制品。
   （2）DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的红菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱，收集第4个洗脱峰部分透析除盐，冷冻干燥。
   （3）SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液，流速为40ml/h，3ml/tube约5min收集1管。将收集第2个蛋白峰部分透析脱盐，冷冻干燥得到红菇凝集素（RLN）。
 对红菇凝集素进行抑菌活性检测（平板培养法）。
实施例2
    （1）凝集素粗品的提取：红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS,0.015mol/L,pH7.2，内含0.15mol/L NaCl），于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入磷酸盐缓冲液（液料比为10:1），于4℃中浸提48h，四层纱布过滤，滤液经8000r/min于4℃下离心40min，弃沉淀，收集上清液。加入固体硫酸铵至80%饱和度，4℃下静默30h，于4℃下以12000r/min速度离心30min，收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到红菇凝集素粗制品。
   （2）DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的红菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱，收集第4个洗脱峰部分透析除盐，冷冻干燥。
   （3）SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液，流速为40ml/h，3ml/tube约5min收集1管。将收集第2个蛋白峰部分透析脱盐，冷冻干燥得到红菇凝集素（RLN）。
 对红菇凝集素进行抑菌活性检测（平板培养法）。

Claims (6)

1.一种红菇凝集素的制备方法及应用，其特征在于包括以下工艺步骤：
凝集素粗品的提取：红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液，于高速组织捣碎机中捣碎，然后加入适量的磷酸盐缓冲液，于2～6℃中浸提24～48h，四层纱布过滤，滤液经8000～12000r/min于4℃下离心20～40min，弃沉淀，收集上清液，加入固体硫酸铵至75%～80%饱和度，4℃下静默12～24h，于4℃下以8000～12000r/min速度离心30～60min，收集沉淀物，加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析除盐，检测凝血活性，冷冻干燥，得到红菇凝集素粗制品；
DEAE离子交换层析：取步骤（1）所得的红菇凝集素粗制品，用磷酸盐缓冲液重新溶解，上样于DEAE-纤维柱，上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱，将活力峰部分收集，透析除盐，冷冻干燥；
SephadexG-100凝胶层析：用蒸馏水平衡柱子，洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液，流速为40ml/h，3ml/tube约5min收集1管，将活力峰部分收集，透析，冷冻干燥得到红菇凝集素（RLN）。
2.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用，其特征在于步骤（1）、（2）所述的磷酸盐缓冲液指的是pH值为7.2的内含0.15mol/L NaCl的0.015mol/L的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用，其特征在于步骤（1）中浸提时的液料比为10:1。
4.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用，其特征在于步骤（2）洗脱峰共有4个，其中活力峰指的是第4个洗脱峰。
5.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用，其特征在于步骤（3）中将收集到的活力峰经过SephadexG-100分子筛层析后得到3个蛋白峰，其中活力峰指的是第2个蛋白峰。
6.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用，其特征在于步骤（3）获得的红菇凝集素具有抑菌活性。
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