CN104817633A - 一种红菇凝集素的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红菇凝集素的制备方法及应用,其制备方法首先将红菇子实体粉碎,加入磷酸缓冲液低温浸提,然后加入硫酸铵沉淀,再经离心透析脱盐,通过DEAE离子交换层析、SephadexG-100凝胶层析等纯化步骤获得红菇凝集素(RLN)。利用本发明提供的方法制备得到的红菇凝集素具有抗菌活性,因此本发明在于红菇活性成分多方位开发利用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术中功能蛋白制备方法,具体地说,涉及一种红菇凝集素的制备方法及应用。
背景技术
红菇隶属于担子菌亚门、层菌纲、红菇目、红菇科、红菇属(Russula)真菌,是一种美味的野生菌根性食药兼用真菌。该红菇多年来一直是容县畅销名产,成为人们馈赠亲朋好友的佳品。由于此菇生境特殊,目前尚未能人工栽培,野生红菇的价格年年攀升,野生红菇的开发与利用已成为国内外学者们的研究热点。
凝集素一类具有特异糖结合活性的蛋白,具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域,广泛存在于各种植物、动物、人体的组织器官、真菌和某些病毒中。凝集素最显著的特点是具有细胞凝集能力,不仅能凝集红细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌、病毒等,还能特异性识别并结合细菌、病毒、肿瘤细胞表面的糖结构从而抵制其生长,因此凝集素被广泛用于病原菌的防治、肿瘤的治疗、含糖基生物大分子的检测等方面。
红菇含有丰富的营养物质和生物活性物质,目前国内外尚未发现有关红菇凝集素的所道。而本发明通过浸提、沉淀、透析脱盐、离子交换层析、凝胶层析等过程获得了红菇凝集素并具有抑菌活性,因此本发明在于红菇活性成分多方位开发利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红菇凝集素的制备方法及应用,通过本发明通过浸提、沉淀、透析脱盐、离子交换层析、凝胶层析等过程获得了红菇凝集素并具有抑菌活性,从而实现了本发明的目的。
本发明的一种红菇凝集素的制备方法及应用,包括以下的工艺步骤:
(1)凝集素粗品的提取:红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液,于高速组织捣碎机中捣碎,然后加入适量的磷酸盐缓冲液,于2~6℃中浸提24~48h,四层纱布过滤,滤液经8000~12000r/min于4℃下离心20~40min,弃沉淀,收集上清液。加入固体硫酸铵至75%~80%饱和度,4℃下静默12~24h,于4℃下以8000~12000r/min速度离心30~60min,收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀,透析除盐,检测凝血活性,冷冻干燥,得到红菇凝集素粗制品。
(2)DEAE离子交换层析:取步骤(1)所得的红菇凝集素粗制品,用磷酸盐缓冲液重新溶解,上样于DEAE-纤维柱,上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积,然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱,将活力峰部分收集,透析除盐,冷冻干燥。
(3)SephadexG-100凝胶层析:用蒸馏水平衡柱子,洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液,流速为40ml/h,3ml/tube约5min收集1管。将活力峰部分收集,透析,冷冻干燥得到红菇凝集素(RLN)。
上述步骤(1)、(2)所述的磷酸盐缓冲液指的是pH值为7.2的内含0.15mol/L NaCl的0.015mol/L的磷酸缓冲液。
上述步骤(1)中浸提时的液料比为10:1。
上述步骤(2)洗脱峰共有4个,其中活力峰指的是第4个洗脱峰。
上述步骤(3)中将收集到的活力峰经过SephadexG-100分子筛层析后得到3个蛋白峰,其中活力峰指的是第2个蛋白峰。
上述步骤(3)获得的红菇凝集素具有抑菌活性。
本发明的优点是:将红菇子实体粉碎,加入磷酸缓冲液低温浸提,然后加入硫酸铵沉淀,再经离心透析脱盐,通过DEAE离子交换层析、SephadexG-100凝胶层析等纯化步骤获得红菇凝集素(RLN)。利用本发明提供的方法制备得到的红菇凝集素具有抗菌活性,因此本发明在利于红菇活性成分多方位开发利用。
附图说明
图1为本发明一种红菇凝集素的制备方法及应用的凝血活性检测示意图。
图2为本发明一种红菇凝集素的制备方法及应用的抑菌活性示意图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,不是对本发明的限制。
实施例1
(1)凝集素粗品的提取:红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液(PBS,0.015mol/L,pH7.2,内含0.15mol/L NaCl),于高速组织捣碎机中捣碎,然后加入磷酸盐缓冲液(液料比为10:1),于2℃中浸提30h,四层纱布过滤,滤液经10000r/min于4℃下离心20min,弃沉淀,收集上清液。加入固体硫酸铵至75%饱和度,4℃下静默12h,于4℃下以8000r/min速度离心45min,收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀,透析除盐,检测凝血活性,冷冻干燥,得到红菇凝集素粗制品。
(2)DEAE离子交换层析:取步骤(1)所得的红菇凝集素粗制品,用磷酸盐缓冲液重新溶解,上样于DEAE-纤维柱,上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积,然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱,收集第4个洗脱峰部分透析除盐,冷冻干燥。
(3)SephadexG-100凝胶层析:用蒸馏水平衡柱子,洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液,流速为40ml/h,3ml/tube约5min收集1管。将收集第2个蛋白峰部分透析脱盐,冷冻干燥得到红菇凝集素(RLN)。
对红菇凝集素进行抑菌活性检测(平板培养法)。
实施例2
(1)凝集素粗品的提取:红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液(PBS,0.015mol/L,pH7.2,内含0.15mol/L NaCl),于高速组织捣碎机中捣碎,然后加入磷酸盐缓冲液(液料比为10:1),于4℃中浸提48h,四层纱布过滤,滤液经8000r/min于4℃下离心40min,弃沉淀,收集上清液。加入固体硫酸铵至80%饱和度,4℃下静默30h,于4℃下以12000r/min速度离心30min,收集沉淀物。加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀,透析除盐,检测凝血活性,冷冻干燥,得到红菇凝集素粗制品。
(2)DEAE离子交换层析:取步骤(1)所得的红菇凝集素粗制品,用磷酸盐缓冲液重新溶解,上样于DEAE-纤维柱,上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积,然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱,收集第4个洗脱峰部分透析除盐,冷冻干燥。
(3)SephadexG-100凝胶层析:用蒸馏水平衡柱子,洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液,流速为40ml/h,3ml/tube约5min收集1管。将收集第2个蛋白峰部分透析脱盐,冷冻干燥得到红菇凝集素(RLN)。
对红菇凝集素进行抑菌活性检测(平板培养法)。
Claims (6)
1.一种红菇凝集素的制备方法及应用,其特征在于包括以下工艺步骤:
凝集素粗品的提取:红菇子实体称重、粉碎、加入少量的磷酸盐缓冲液,于高速组织捣碎机中捣碎,然后加入适量的磷酸盐缓冲液,于2~6℃中浸提24~48h,四层纱布过滤,滤液经8000~12000r/min于4℃下离心20~40min,弃沉淀,收集上清液,加入固体硫酸铵至75%~80%饱和度,4℃下静默12~24h,于4℃下以8000~12000r/min速度离心30~60min,收集沉淀物,加入少量的磷酸盐缓冲液溶解沉淀,透析除盐,检测凝血活性,冷冻干燥,得到红菇凝集素粗制品;
DEAE离子交换层析:取步骤(1)所得的红菇凝集素粗制品,用磷酸盐缓冲液重新溶解,上样于DEAE-纤维柱,上样前柱材料先用磷酸盐缓冲液平衡三个柱体积,然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值为7.2的磷酸缓冲液以流速为30ml/h速度洗脱,将活力峰部分收集,透析除盐,冷冻干燥;
SephadexG-100凝胶层析:用蒸馏水平衡柱子,洗脱液为pH值为7.2的0.15mol/L的磷酸缓冲液,流速为40ml/h,3ml/tube约5min收集1管,将活力峰部分收集,透析,冷冻干燥得到红菇凝集素(RLN)。
2.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用,其特征在于步骤(1)、(2)所述的磷酸盐缓冲液指的是pH值为7.2的内含0.15mol/L NaCl的0.015mol/L的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用,其特征在于步骤(1)中浸提时的液料比为10:1。
4.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用,其特征在于步骤(2)洗脱峰共有4个,其中活力峰指的是第4个洗脱峰。
5.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用,其特征在于步骤(3)中将收集到的活力峰经过SephadexG-100分子筛层析后得到3个蛋白峰,其中活力峰指的是第2个蛋白峰。
6.根据权利要求1所述的一种红菇凝集素的制备方法及应用,其特征在于步骤(3)获得的红菇凝集素具有抑菌活性。
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