CN103275198A - 一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于凝集素分离纯化技术领域，提供了一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法，生理盐水浸提过夜，并离心收集上清，采用40-70％硫酸铵沉淀，离心去沉淀，透析除去硫酸铵，冷冻干燥，将溶解的上层清夜经过DEAE-52离子交换层析柱，收集洗脱峰，冷冻干燥，将溶解的上层清夜经过SaphedexG-100上样，收集洗脱峰，检测凝血活性，阿魏菇分离纯化凝集素的工艺过程较为简便，凝集素的分离纯化效率较高，生产及使用成本较低，实用性强，具有较强的推广与应用价值。

Description

一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法
技术领域
本发明属于阿魏菇凝集素分离纯化技术领域，尤其涉及一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法。
背景技术
凝集素有多种生物学活性，广泛用于医药、食品、保鲜等行业，凝集素对机体免疫有双重调节作用，能够促进机体对肿瘤细胞的识别与清除，凝集素单独作用于肿瘤细胞能够引起肿瘤细胞凋亡，对于病毒在体内复制也有很好的抑制作用，还能促进炎症后机体的恢复过程。
现有技术提供的从阿魏菇分离纯化凝集素的工艺过程较为复杂，凝集素的分离纯化效率较低，生产及使用成本较高。
发明内容
本发明提供了一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法，旨在解决现有技术提供的从阿魏菇分离纯化凝集素的工艺过程较为复杂，凝集素的分离纯化效率较低，生产及使用成本较高的问题。
本发明的目的在于提供一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法，该方法包括以下步骤：
磷酸盐缓冲液浸提过夜，并离心收集上清；
采用40-70％硫酸铵沉淀，离心去沉淀，透析除去硫酸铵，冷冻干燥；
将溶解的上层清夜经过DEAE-52离子交换层析柱，收集洗脱峰，冷冻干燥；
将溶解的上层清夜经过SaphedexG-100上样，收集洗脱峰，检测凝血活性。
进一步，使用0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜；第二天对浸泡液8000rpm离心20min，弃沉淀，保留上清液待用。
进一步，用石油醚萃取法去除上清液中的脂肪，用70％硫酸铵的沉淀上清液中的蛋白。
进一步，搅拌6-8h，8000rpm离心20min，收集沉淀弃去上清液。
进一步，将沉淀溶解于70％的饱和硫酸铵，再离心收集沉淀溶解于磷酸盐缓冲液溶液中，透析除盐，测凝血活性，过夜，真空冷冻即得凝集素粗品。
本发明提供的阿魏菇凝集素分离纯化的方法，生理盐水浸提过夜，并离心收集上清，采用40-70％硫酸铵沉淀，离心去沉淀，透析除去硫酸铵，冷冻干燥，将溶解的上层清夜经过DEAE-52离子交换层析柱，收集洗脱峰，冷冻干燥，将溶解的上层清夜经过SaphedexG-100上样，收集洗脱峰，检测凝血活性，阿魏菇分离纯化凝集素的工艺过程较为简便，凝集素的分离纯化效率较高，生产及使用成本较低，具有较强的推广与应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的阿魏菇凝集素分离纯化的方法的实现流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
图1示出了本发明实施例提供的阿魏菇凝集素分离纯化的方法的实现流程。
该方法包括以下步骤：
在步骤S101中，磷酸盐缓冲液浸提过夜，并离心收集上清；
在步骤S102中，采用40-70％硫酸铵沉淀，离心去沉淀，透析除去硫酸铵，冷冻干燥；
在步骤S103中，将溶解的上层清夜经过DEAE-52离子交换层析柱，收集洗脱峰，冷冻干燥；
在步骤S104中，将溶解的上层清夜经过SaphedexG-100上样，收集洗脱峰，检测凝血活性。
作为本发明实施例的一优化方案，使用0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜；第二天对浸泡液8000rpm离心20min，弃沉淀，保留上清液待用。
作为本发明实施例的一优化方案，用石油醚萃取法去除上清液中的脂肪，用70％硫酸铵的沉淀上清液中的蛋白。
作为本发明实施例的一优化方案，搅拌6-8h，8000rpm离心20min，收集沉淀弃去上清液。
作为本发明实施例的一优化方案，将沉淀溶解于70％的饱和硫酸铵，再离心收集沉淀溶解于磷酸盐缓冲液溶液中，透析除盐，测凝血活性，过夜，真空冷冻即得凝集素粗品。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
阿魏菇凝集素浸提：生理盐水浸提过夜，离心收集上清，40-70％硫酸铵沉淀，离心去沉淀，透析除去硫酸铵，冷冻干燥，溶解上样，经过DEAE-52离自己换层析柱，手收集洗脱峰，冷冻干燥，溶解上样，经过SaphedexG-100上样，收集洗脱峰，检测凝血活性。
本发明的具体制作步骤为：取适量的成熟优质阿魏菇，用打浆机打碎阿魏菇组织，0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜；第二天对浸泡液8000rpm离心20min，弃沉淀，保留上清液待用；用石油醚萃取法去除上清液中的脂肪，用70％硫酸铵的沉淀上清液中的蛋白，搅拌6-8h，8000rpm离心20min，收集沉淀弃去上清液，将沉淀溶解于70％的饱和硫酸铵，再离心收集沉淀溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，透析除盐，测凝血活性，过夜，真空冷冻即得凝集素粗品，
1)超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，从而使大分子物质得到了部分的纯化，将凝集素粗品溶解，经过超滤装置截留样液一定分子量大小，超滤6h，期间补加蒸馏水4次，收集截留下来的样品A备用，
(2)DEAE-cellulose52层析
将样品A装柱于直径为1.1em，柱长30em层析柱，填料DEAE-cellulose52进行分离纯化，分别用NaCl溶液进行洗脱，浓度分别为0.1mol/L；0.2mol/L；0.3mol/L；0.4mol/L；0.5mol/L的，用自动集样器收集洗脱液各15管，280nm处测定紫外吸收，绘制紫外吸收曲线，收集有峰值的管将其合并得到样品B，
(3)琼脂糖凝胶层析
将Sepharose4B取出并与B溶液混合：将15-20mL B溶液与20mL的Sepharose4B于烧杯中混合，4℃，每隔半个小时轻轻搅拌一次，共3h，然后装柱于直径为1.1cm，柱长30Gm层析柱，
以1mL/min的流速，用PBS洗脱杂蛋白约1h，至基线平稳后停止，再用0.25mol D-半乳糖溶液解吸附约30min，并控制流速为1mL/min，收集洗脱液，至280nm吸光度值小于0.01将样品透析除盐后冷冻干燥，得目的凝集素，
2.2仪器设备
Q/TEDUC台式高速冷冻离心机：保持离心恒温4℃，力康发展有限公司；SH21-1恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；BT-200E恒流泵：上海琪特分析仪器有限公司；QT-58A智能核酸蛋白检测仪：配有可变式恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；BSZ160-LCD自动部分收集器：上海琪特分析仪器有限公司；FDU-1200真空冷冻干燥机：Tokyo Rikakikai co，LTD madeinJapan；Ultrospec-5300紫外分光光度仪：Amersham生物科技公司。
本发明实施例提供的阿魏菇凝集素分离纯化的方法，生理盐水浸提过夜，并离心收集上清，采用40-70％硫酸铵沉淀，离心去沉淀，透析除去硫酸铵，冷冻干燥，将溶解的上层清夜经过DEAE-52离子交换层析柱，收集洗脱峰，冷冻干燥，将溶解的上层清夜经过SaphedexG-100上样，收集洗脱峰，检测凝血活性，阿魏菇分离纯化凝集素的工艺过程较为简便，凝集素的分离纯化效率较高，生产及使用成本较低，具有较强的推广与应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
磷酸盐缓冲液浸提过夜，并离心收集上清；
采用40-70％硫酸铵沉淀，离心去沉淀，透析除去硫酸铵，冷冻干燥；
将溶解的上层清夜经过DEAE-52离子交换层析柱，收集洗脱峰，冷冻干燥；
将溶解的上层清夜经过SaphedexG-100上样，收集洗脱峰，检测凝血活性。
2.如权利要求1所述的阿魏菇凝集素分离纯化的方法，其特征在于，使用0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜；第二天对浸泡液8000rpm离心20min，弃沉淀，保留上清液待用。
3.如权利要求1所述的阿魏菇凝集素分离纯化的方法，其特征在于，用石油醚萃取法去除上清液中的脂肪，用70％硫酸铵的沉淀上清液中的蛋白。
4.如权利要求1所述的阿魏菇凝集素分离纯化的方法，其特征在于，搅拌6-8h，8000rpm离心20min，收集沉淀弃去上清液。
5.如权利要求1所述的阿魏菇凝集素分离纯化的方法，其特征在于，将沉淀溶解于70％的饱和硫酸铵，再离心收集沉淀溶解于磷酸盐缓冲液溶液中，透析除盐，测凝血活性，过夜，真空冷冻即得凝集素粗品。
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