CN103804506B - 一种从小肠浸出液中提取肝素和硫酸皮肤素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从猪小肠浸出液中获得高纯度肝素和高纯度硫酸皮肤素的方法，本发明以猪小肠粘膜浸出液为原料，通过离子交换层析、透析、旋蒸、有机溶剂沉淀生产高纯度的肝素钠以及高纯度的硫酸皮肤素。通过离子交换层析的分步洗脱得到两步洗脱液，以透析法除盐，经旋蒸浓缩得浓缩液，再进行一步醇沉即得到高纯度肝素与硫酸皮肤素。在离子交换树脂的洗脱中使用了梯度的氯化钠溶液洗脱，从而使肝素和硫酸皮肤素能在不同的洗脱液浓度下分离下来，达到了肝素与硫酸皮肤素的分离，并且分别提高了肝素和硫酸皮肤素的纯度，且效价也有了提高，分子量分布及旋光度均符合药典要求。

Description

一种从小肠浸出液中提取肝素和硫酸皮肤素的方法

技术领域

本发明属于制药与化工领域，涉及肝素和硫酸皮肤素的制备方法，具体涉及从小肠浸出液中提取肝素和硫酸皮肤素的方法。

背景技术

肝素钠(heparinsodium)是N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖，目前肝素钠生产主要是从猪的小肠粘膜中提取，它属粘多糖(GAG)类物质，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血管栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查、体外循环和血液透析等。

硫酸皮肤素(dermatansulfate，DS或CSB)也是糖胺聚糖的一种，由N-乙酰氨基半乳糖-β-1,4-L-艾杜糖醛酸-α(或D-葡萄糖醛酸-β)-1，3的二糖重复单位构成的多糖。DS广泛分布于动物组织中，属于硫酸软骨素(CS)的一种，具有抗血栓、抗水肿、促进皮肤更新、阻止皮肤的过度角质化和棘皮症、滋润皮肤和保持水分的作用，可用于降血脂、骨关节疾病治疗以及滴药液。

传统的硫酸皮肤素来源于动物皮层或牛肺中，特别是水生生物(如鮟鱇鱼等)的皮层，通过酶降解和酸碱沉淀的方式得到，最后再通过离子交换层析获得高纯度的硫酸皮肤素。目前较为成熟的提取方法是从鮟鱇鱼皮中进行提取，再通过醇沉冻干后即可得硫酸皮肤素粗品，该法得到的硫酸皮肤素粗品灰色粉末状，纯度为75％。

2006年唐明龙等人(专利申请号：200610039006.5)以粗品肝素为原料，通过离子交换、高锰酸钾氧化、超滤和有机溶剂分级沉淀生产高纯度肝素钠原料药，该方法使用不同浓度的氯化钠溶液进行了多次洗脱，有效的分离了杂质，所得的肝素钠效价、光吸收等指标均达到国家药典要求。

2009年李坦等人(专利申请号：200910039361.6)以肝素副产物为原料，通过酸碱沉淀，再以离子交换吸附，线性梯度洗脱，最后以浓缩醇沉后得到高纯度的硫酸皮肤素，其所得的硫酸皮肤素的HPLC测定纯度，旋光度及抗凝效价的检测均较为理想。

目前国内的肝素生产以粗品肝素为主，其中含有大量的硫酸皮肤素，本发明提供的从猪小肠粘膜浸出液中一步纯化肝素和硫酸皮肤素的方法，不仅提高了产品的质量，得到了高纯度的肝素，并且充分利用了生产的副产物，得到了高纯度硫酸皮肤素，所得的肝素和硫酸皮肤素的纯度均较高，适合用于工业的大规模生产。

发明内容

本发明的任务是提供一种从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法和一种从小肠浸出液中提取肝素的方法，以改进现有粗品肝素的生产工艺，提高肝素产品的纯度，以解决目前生产的粗品肝素中含有大量硫酸皮肤素杂质的问题，获得能用于生产注射级精品肝素以及药用级硫酸皮肤素。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，包括以下步骤：

步骤一：称取新鲜猪小肠粘膜，在绞肉机中绞碎，加入重量为猪小肠粘膜重量0.25％的市售胰蛋白酶，37℃搅拌30分钟；加入重量为猪小肠粘膜重量3％的氯化钠一边搅拌一边加入30％的氢氧化钠溶液，直至pH达到9.0；于55℃保温继续以20rpm速度搅拌2～3小时；升温至95℃10分钟，迅速冷却到室温，即得猪小肠粘膜浸出液；将猪小肠粘膜浸出液用2层市售医用纱布过滤，除去大颗粒的不溶物，得澄清的无色液体；加入0.5-1.5倍体积的去离子水，使猪小肠粘膜浸出液总体积达到稀释1.5-2.5倍，即得到稀释后的猪小肠粘膜浸出液；

步骤二：取已填充D254树脂或Amberlite树脂或Lewatit树脂的填充柱，将填充柱固定到常规的层析设备上，填充柱以去离子水清洗2个柱体积；利用蠕动泵以3mL/min的速度将稀释后的猪小肠粘膜浸出液加入D254树脂填充柱，加入稀释后猪小肠粘膜浸出液体积为柱体积的1.5～2.0倍；待猪小肠粘膜浸出液后全部加到填充柱后，向填充柱加入2倍柱体积的pH8.5的Tris-HCl的缓冲液；

步骤三：向填充柱加入1.1～1.3mol/L氯化钠溶液，进行第一次洗脱，洗脱流速为5mL/min，具体收集体积以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集的洗脱液标为洗脱液1；向填充柱加入2.0～2.3mol/L氯化钠溶液，进行第二次洗脱，洗脱流速为5mL/min；具体收集体积也以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集洗脱液标为洗脱液2；

步骤四：先按以下(A)、(B)两种方法中的一种制取浓缩洗脱液1：

(A)将步骤3获得的洗脱液1通过1000Da的透析膜，在去离子水中透析除盐，透析18～22h，体积增大45～55％；在55～65℃下旋蒸45min，得到浓缩洗脱液1；旋蒸度具体可以是60℃。

(B)采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液1进行超滤，当体积减小到原体积的20～22％，得到浓缩洗脱液1；所述的采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液1进行超滤的具体方法可以是：采用密理博公司的Pellicom超滤系统，以1000Da的超滤膜进行超滤，当体积浓缩4.5～5.0倍即可。

再向所得浓缩洗脱液1中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40～50％，出现白色沉淀物，通过离心，去除上清，将沉淀在60℃烘箱中放置过夜，获得纯度为85～89％的硫酸皮肤素。

本发明提供的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法是：

先将权利要求1之步骤三获得的洗脱液2，按照以下(a)、(b)两种方法中的一种制备浓缩洗脱液2：

(a)将步骤3获得的洗脱液2通过1000Da的透析膜，在去离子水中透析除盐，透析18～22h，体积增大45～55％；在55～65℃下旋蒸45min，得到浓缩洗脱液2；旋蒸度具体可以是60℃；

(b)采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液2进行超滤，当体积减小到原体积的20～22％，得到浓缩洗脱液2；所述的采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液2进行超滤的具体方法可以是：采用密理博公司的Pellicom超滤系统，以1000Da的超滤膜进行超滤，当体积浓缩4.5～5.0倍即可；

再向所得浓缩洗脱液2中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40～50％，出现白色沉淀物，通过离心去除上清，将沉淀在60℃烘箱中放置过夜，获得纯度为95～98％的肝素。

本发明以猪小肠粘膜浸出液为原料，在原有工艺的基础上，通过离子交换层析、梯度洗脱、透析、旋蒸和醇沉最终生产得到高纯度肝素和硫酸皮肤素。对获得的硫酸皮肤素与肝素采用常规旋光仪测定其旋光度，采用常规高效液相色谱测定其纯度，采用羊血浆法测定其效价。本发明利用硫酸皮肤素和肝素的离子强度差异所导致的与强阴离子树脂的吸附强度的不同，在不同的氯化钠浓度下洗脱使肝素与硫酸皮肤素分离，硫酸皮肤素在较低浓度的洗脱下得到充分的分离，肝素在第二个梯度的洗脱液浓度下得到充分的分离，洗脱步骤中应严格按照规定浓度的洗脱液进行，否则将影响硫酸皮肤素与肝素的纯度。本发明仍然是采用传统的离子交换层析的方法进行分离，对肝素和硫酸皮肤素的分子结构与性质并没有影响，本发明在维持了当前肝素生产工艺的生产成本的基础上，提高了产品的质量，并且充分利用也生产中的副产物，纯化所得到的肝素的效价及分子量测定均符合《中国药典》相关要求。

本发明与现有公开的中国专利申请号为200610039006.5的技术方案相比，200610039006.5号专利的主要特征是将粗品肝素通过二次离子交换层析获得更纯的肝素，而本发明与其主要差别在于省去了第二次的重复层析步骤；直接以猪小肠粘膜为原料进行，而不是以粗品肝素为原料；改进了现在常用的洗脱方法，使肝素纯度得到了提升；同时得到了纯度为85～89％的硫酸皮肤素。本发明不仅简化了肝素生产工艺，同时也提高了生产的收益，获得了更大的综合效益。在肝素与硫酸皮肤素浓缩阶段引进与应用超滤技术，可直接扩大到生产规模，提高了生产效率，节约了生产成本。与现有公开的硫酸皮肤素的专利(中国专利申请号：200910039361.6)提取方法相比，本发明的优势在于，不是在肝素生产工艺之外，专门从从副产物里分离纯化硫酸皮肤素，而是在肝素生产的同时，基本不增加额外的工艺手段，仅仅更改一次洗脱浓度，即获得了纯度高达85～89％的硫酸皮肤素，大大减少了工艺步骤并且缩短了生产周期。

总体而言，本发明的优势在于一次层析技术，分步洗脱获得纯度高达95～98％的肝素与纯度高达85～89％的硫酸皮肤素，工艺技术可直接扩大到生产规模。本发明可一次实现传统的粗品肝素生产、粗品肝素再加工成精品肝素(纯度95％以上的肝素)、肝素生产副产品中提取硫酸皮肤素等三类生产过程，极大提高生产效率。

本发明在分析肝素与硫酸皮肤素在结构上的差异(硫酸化程度不同而导致的带电荷数与分子量的差异)基础上，利用离子交换层析对猪小肠粘膜浸出液进行纯化，通过两次不同的洗脱液浓度将肝素和硫酸皮肤素分别洗脱下来，通过精确的控制洗脱液的浓度及其它相关条件，本发明不仅有效地分离肝素和硫酸皮肤素，而且肝素和硫酸皮肤素纯度经SAX-HPLC分析，分别达到95～98％和85～89％，旋光度分别为+55和-40，效价分别为170USP/mg和8USP/mg。

本发明制得的肝素可做为原料药，用于口服或注射用肝素钠的生产，亦可用于下游低分子量肝素钠的生产；本发明制得的硫酸皮肤素可用于口服或注射用硫酸皮肤素的生产。本发明通过对现有的离子交换层析工艺的改进，在原有工艺上的升级使粗品肝素的生产向上提升了一个台阶，向精品肝素与精品硫酸皮肤素的生产上过渡，对当前国内绝大多数以生产粗品肝素用于出口的现状改善有一定的帮助。本发明有其独特的创新性与实用性。

附图说明

图1：猪小肠粘膜浸出液AKTA蛋白层析检测的洗脱峰，其中：A1、A2分别为215nm、298nm吸收光谱下的洗脱液1；B1、B2分别为215nm、298nm吸收光谱下的洗脱液2。

图2、图3、图4、图5：为各类样品的强阳离子高效液相色谱(SAX-HPLC)图谱，其

中：图2为市售肝素标准品、硫酸皮肤素标准品混合样品的SAX-HPLC图谱，图2中

A为硫酸皮肤素标准品；B为肝素标准品；

图3为市售粗品肝素的SAX-HPLC图谱，图3中A为粗品肝素中的硫酸皮肤素杂质；B为粗品肝素中的肝素峰；

图4为洗脱液1的SAX-HPLC图谱，图4中A为洗脱液1中的硫酸皮肤素峰；B为洗脱液1中的肝素峰；

图5为洗脱液2的SAX-HPLC图谱，图5中A为洗脱液2中的硫酸皮肤素峰应出现的位置；B为洗脱液2中的肝素峰。

图6：本发明工艺流程图。

具体实施方式

实施例1：50mL猪小肠粘膜浸出液层析分离肝素与硫酸皮肤素

取新鲜猪小肠粘膜，在绞肉机中绞碎，加入重量为猪小肠粘膜重量0.25％的市售胰蛋白酶，37℃搅拌30分钟；加入重量为猪小肠粘膜重量3％的氯化钠一边搅拌一边加入30％的氢氧化钠溶液，直至pH达到9.0；于55℃保温继续以20rpm速度搅拌2.5小时；升温至95℃10分钟，迅速冷却到室温，即得猪小肠粘膜浸出液；将猪小肠粘膜浸出液用2层市售医用纱布过滤，除去大颗粒的不溶物，得澄清的无色液体；加入1倍体积的去离子水，使猪小肠粘膜浸出液总体积达到稀释2倍，得到稀释后的猪小肠粘膜浸出液；再依次按以下步骤操作：

1.取发明步骤3所得的猪小肠粘膜浸出液50mL，以2层洁净的市售医用纱布过滤除去大颗粒的不溶物；

2.加入去离子水50mL，充分搅拌；

3.取200g大孔阴离子树脂D254，加入4％氢氧化钠与4mol/L氯化钠溶液浸泡过夜，将经过浸泡的树脂填入填充柱(Φ3cm×15cm)，柱体积为60mL；

4.将上步骤制备的填充柱固定在AKTA蛋白纯化仪的支架上，上下端口分别连接硅胶管，上端硅胶管固定在蠕动泵上，下端硅胶管连接到检测器入口；

5.层析实验条件如下：

215/298nm双波长检测；

A泵：去离子水()；

B泵：4mol/L氯化钠()；

以手动方式控制蠕动泵速度和开关，调控样品、缓冲液加入填充柱；

6.以3mL/min的速度加入待分离的样品共100mL，然后开动A泵用缓冲液A淋洗60mL；

7.加入1.15mol/L氯化钠缓冲液进行第1次洗脱，当洗脱峰A2下降到渐趋水平时，收集洗脱液90mL，参见图1；

8.加入2.0mol/L氯化钠缓冲液进行第2次洗脱，当洗脱峰B2下降到渐趋平缓时，收集洗脱液60mL，参见图1；

9.将步骤7、8所得洗脱液收集后分别于60℃下旋蒸浓缩5倍；

10.取所得的浓缩液各1mL，分别加入4mol/L氢氧化钠0.1mL，振荡10分钟，再分别加入2mol/L盐酸0.2mL，振荡10分钟，进行酸碱除蛋白处理；

11.分别加入到常规离心式透析管(1000Da)，离心透析，再分别采用0.45μm一次性滤器过滤，利用SAX-HPLC分别检测；

12.HPLC条件如下：

仪器为Agilent1100高效液相色谱仪

色谱柱为IonPacAS11-HC戴安阴离子分析柱(250×4mm)

流动相A为超纯水

流动相B为2.5mol/L氯化钠，含20mmol/LTris，用磷酸调节pH至3.0

线性梯度洗脱：流速为0.3mL/min，进样体积为10μL，检测波长为215nm二元梯度为：02min：95％流动相A和5％流动相B；26min：100％流动相B；31min：100％流动相B；32-40min：95％流动相A和5％流动相B

13.将市售的肝素标准品与硫酸皮肤素标准品按2∶1的质量比混合，按照步骤12的条件进行HPLC检测，获得肝素标准品与硫酸皮肤素标准品HPLC液相图谱，见附图2，图2中A为硫酸皮肤素标准品；B为肝素标准品；

14.将市售的粗品肝素按照步骤12的条件进行HPLC检测，获得粗品肝素HPLC液相图谱，见附图3，图3中A为粗品肝素中的硫酸皮肤素杂质；B为粗品肝素中的肝素峰；

15.将步骤11处理后的浓缩洗脱液1按照步骤12的条件进行HPLC检测，获得洗脱液1HPLC液相图谱，见附图4，图4中A为洗脱液1中的硫酸皮肤素峰；B为洗脱液1中的肝素峰；

16.将步骤11处理后的浓缩洗脱液2按照步骤12的条件进行HPLC检测，获得洗脱液2HPLC液相图谱，见附图5，图5中A为洗脱液2中的硫酸皮肤素峰应出现的位置；B为洗脱液2中的肝素峰；

计算得图4中硫酸皮肤素的纯度为88％，图5中肝素的纯度为96.6％；

17.将步骤9分别得到的浓缩洗脱液1、洗脱液2分别加入相同体积的无水乙醇，出现沉淀，将沉淀置于60℃烘箱过夜烘干；

18.将步骤17制备的烘干样品分别取少量，加入去离子水溶解成40mg/mL的样品，在实验室常规旋光度仪上测定旋光度，洗脱液1与洗脱液2的旋光度分别为+55和-40，采用羊血浆法测得效价分别为170USP/mg和8USP/mg。

【参考文献：(1)张虹，鮟鱇鱼皮硫酸皮肤素的提取，食品与发酵工业，2009，35(2)：167；(2)唐明龙，粗品肝素黄分离纯化为高纯度肝素钠的方法，发明专利，2006；(3)李坦等，一种从肝素副产物中纯化硫酸皮肤素的方法，发明专利，2009；(3)国家药典委员会，《中华人民共和国药典》(三部)，化学工业出版社，2010.】。

Claims (7)

1.一种从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，包括以下步骤：

步骤一：称取新鲜猪小肠粘膜，在绞肉机中绞碎，加入重量为猪小肠粘膜重量0.25％的市售胰蛋白酶，37℃搅拌30分钟；加入重量为猪小肠粘膜重量3％的氯化钠，一边搅拌一边加入30％的氢氧化钠溶液，直至pH达到9.0；于55℃保温继续以20rpm速度搅拌2～3小时；升至95℃，保温10分钟，迅速冷却到室温，即得猪小肠粘膜浸出液；将猪小肠粘膜浸出液用2层市售医用纱布过滤，除去大颗粒的不溶物，得澄清的无色液体；加入0.5-1.5倍体积的去离子水，使猪小肠粘膜浸出液总体积达到稀释1.5～2.5倍，即得到稀释后的猪小肠粘膜浸出液；

步骤二：取已填充D254树脂的填充柱，将填充柱固定到常规的层析设备上，填充柱以去离子水清洗2个柱体积；利用蠕动泵以3mL/min的速度将稀释后的猪小肠粘膜浸出液加入D254树脂填充柱，加入稀释后猪小肠粘膜浸出液体积为柱体积的1.5～2.0倍；待猪小肠粘膜浸出液全部加到填充柱后，向填充柱加入2倍柱体积的pH8.5的Tris-HCl的缓冲液；

步骤三：向填充柱加入1.1～1.3mol/L氯化钠溶液，进行第一次洗脱，具体收集体积以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集的洗脱液标为洗脱液1；向填充柱加入2.0～2.3mol/L氯化钠溶液，进行第二次洗脱，具体收集体积也以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集洗脱液标为洗脱液2；

步骤四：先按以下(A)、(B)两种方法中的一种制取浓缩洗脱液1：

(A)将步骤三获得的洗脱液1通过1000Da的透析膜，在去离子水中透析除盐，透析18～22h，体积增大45～55％；在55～65℃下旋蒸45min，得到浓缩洗脱液1；

(B)采用切向流超滤方法对步骤三获得的洗脱液1进行超滤，当体积减小到原体积的20～22％，得到浓缩洗脱液1；

再向所得浓缩洗脱液1中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40～50％，出现白色沉淀物，通过离心，去除上清，将沉淀在60℃烘箱中放置过夜，获得纯度为85～89％的硫酸皮肤素。

2.根据权利要求1所述的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，其特征在于，在步骤三中，第一次洗脱和第二次洗脱的洗脱流速为5mL/min。

3.根据权利要求1所述的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，其特征在于，在步骤四之方法(A)中，旋蒸温度为60℃。

4.根据权利要求1所述的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，其特征在于，在步骤四之方法(B)中，所述的采用切向流超滤方法对步骤三获得的洗脱液1进行超滤的具体方法是：采用密理博公司的Pellicon超滤系统，以1000Da的超滤膜进行超滤。

5.一种从猪小肠浸出液中提取肝素的方法，其步骤是：

先将权利要求1之步骤三获得的洗脱液2，按照以下(a)、(b)两种方法中的一种制备浓缩洗脱液2：

(a)将步骤三获得的洗脱液2通过1000Da的透析膜，在去离子水中透析除盐，透析18～22h，体积增大45～55％；在55～65℃下旋蒸45min，得到浓缩洗脱液2；

(b)采用切向流超滤方法对步骤三获得的洗脱液2进行超滤，当体积减小到原体积的20～22％，得到浓缩洗脱液2；

再向所得浓缩洗脱液2中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40～50％，出现白色沉淀物，通过离心去除上清，将沉淀在60℃烘箱中放置过夜，获得纯度为95～98％的肝素。

6.根据权利要求5所述的从猪小肠浸出液中提取肝素的方法，其特征在于，在方法(a)中，旋蒸温度为60℃。

7.根据权利要求5所述的从猪小肠浸出液中提取肝素的方法，其特征在于：方法(b)中所述的采用切向流超滤方法对步骤三获得的洗脱液2进行超滤的具体方法是：采用密理博公司的Pellicon超滤系统，以1000Da的超滤膜进行超滤。