CN101704899A - 一种猕猴桃根多糖提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猕猴桃根多糖提取物的制备方法，所述的方法包括：取干燥猕猴桃根(Radix Actinidia Chinensis)以水加热回流提取，提取液离心，取上清液过微孔滤膜，滤液超滤，浓缩至生药材含量为0.1～5g/mL，浓缩液加入85～95％乙醇至乙醇体积浓度为50～90％，静置醇沉，离心，取沉淀洗涤后在60～80℃真空干燥，得到猕猴桃根粗多糖经进一步纯化得到猕猴桃根精制多糖；本发明的有益效果主要体现在：(1)采用本发明方法制备猕猴桃根多糖，达到最大限度的分离、纯化作用，猕猴桃根多糖纯度高、提取率大，使有效成分得到富集，药效得以提高；(2)采用本发明方法，大大节约了乙醇用量，降低了成本；(3)采用本发明方法，大大减少了乙醇用量、且不需要使用乙醚，提高了生产安全性。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种猕猴桃根多糖提取物(包括猕猴桃根粗多糖与猕猴桃根精制多糖)的制备方法。
(二)背景技术
猕猴桃根(Radix Actinidia Chinensis)，为中华猕猴桃(Actindiachinensis Planch)的根，又名藤梨根，收载于《中国药典》(1977年版)，具有清热、利尿、活血、消肿等作用，临床上主要用于治疗胃肠道肿瘤及乳腺癌，疮疖，瘰疬结核，肝炎等。
现代药理研究发现猕猴桃根中的多糖成分-中华猕猴桃根多糖(Actindia Chinensis Planch Polysaccharide，ACPS)具有抗肿瘤、增强免疫机能、消除活性氧自由基等作用，且无副作用。近年来，对于猕猴桃根多糖的药理研究已有文献报道，阎家麒等发现中华猕猴桃根提取物对超氧自由基的去除能力与SOD相同，对氢自由基的去除能力比VC略强。张菊明、林佩芳等研究表明猕猴桃根多糖复合物可以抑制小鼠肿瘤的增长以及增强细胞天然杀伤功能，并且对于宿主具有保护作用，机体特异抗菌抗体的水平，激活巨噬细胞的吞噬功能。目前，猕猴桃根多糖提取物的制备主要采用以下两种方法：
方法1：猕猴桃根药材加20倍的水加热提取，每次0.5h，提取2次，水提液加入乙醇使含醇量达80％(v/v)，静置过夜，抽滤，得沉淀。这种方法制备的猕猴桃根多糖提取物提取率低，纯度低，药效活性低，颜色深、质量差，能耗大，成本高。
方法2：是本专利发明人申请(并授权)的专利，专利公告号CN1067258C，具体方法：猕猴桃根药材加2～8倍量20～50％(v/v)的乙醇浸渍1～3次，每次18～30小时，静置，取上清液，合并，加乙醇调至含乙醇量为60～95％(v/v)，静置24小时，离心，沉淀物再加2～7倍量50～80％乙醇(v/v)、无水乙醇各洗一次，弃去洗液，沉淀物再加2～4倍量乙醚洗涤一次，弃去乙醚液，沉淀物室温减压干燥。它的缺点是猕猴桃根多糖提取率、纯度与药效活性较低，能耗大，操作繁琐，耗时长，成本高，而且由于使用了乙醚，增加了安全隐患。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种工艺简便，提取率高，纯度高，药效活性高，能耗小、成本低的猕猴桃根多糖提取物的制备方法。
本发明采用的技术方案是：
一种猕猴桃根多糖提取物的制备方法，所述的方法包括：
取干燥猕猴桃根(Radix Actinidia Chinensis)(含饮片)以水加热回流提取，提取液高速离心(转速5000～25000r/min，时间5～30min)除去不溶物，上清液先用截留分子量为3000000Da的膜超滤除去蛋白质等大分子物质；超滤液再用截留分子量为5000Da的膜超滤除去无机盐、氨基酸、小分子色素等小分子杂质，同时除去滤液中的部分水份，浓缩至所得浓缩液中药材含量为0.1～5g/mL，浓缩液加入乙醇至乙醇浓度为50～90％(v/v)，静置醇沉，离心，取沉淀洗涤后干燥，即得所述猕猴桃根(粗)多糖.
猕猴桃根粗多糖，还可进一步采用以下纯化步骤：
(1)取猕猴桃根粗多糖，每g加蒸馏水50～200ml配制成水溶液，水溶液采用聚酰胺或活性炭或硅藻土等脱色剂脱色，过滤，取滤液进行下一步纯化操作；
(2)步骤(1)滤液上大孔吸附树脂柱(可除去蛋白质，多肽，核酸等杂质)或DEAE纤维素柱(可除去多糖中的蛋白质，多肽，核酸等杂质)，以NaCl溶液洗脱，洗脱液采用截留分子量为1000～5000Da的超滤膜洗滤1～3次，除盐并浓缩，得浓缩液；
(3)浓缩液干燥即得猕猴桃根多糖。
上述步骤(2)中的大孔吸附树脂柱和DEAE纤维素柱纯化技术可以单独使用，也可以两项联用，即步骤(2)可重复进行，通常先用大孔吸附树脂纯化，再用DEAE纤维素柱纯化。
以上所述大孔吸附树脂的型号可以是AB-8型，MG-1型，LSA-5B型，X-5型，H107型，S-8型，D900型，HPSIP1300型，SIP1400型，NKA-9型，DM130型或D3520型等，所述DEAE纤维素可以是DEAE-32或DEAE-52。
具体的，优选的，所述的方法按如下步骤进行：
取干燥猕猴桃根，加入质量为猕猴桃根质量6～30倍的水，加热回流提取1～3次、每次1～3小时，合并提取液，5000～25000r/min离心10min～30min，除去不溶物，上清液过0.2～0.8μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量5000Da的膜超滤，浓缩至所得浓缩液中生药材含量为0.2～2g/mL，浓缩液在25～45℃下加入85～95％乙醇至乙醇体积浓度为60～80％，静置6～72小时，5000～25000r/min离心10min～20min，取沉淀以无水乙醇洗涤1～3次，洗涤后的沉淀60～80℃真空干燥，得到所述猕猴桃根粗多糖。
猕猴桃根粗多糖纯化步骤如下：
(1)取猕猴桃根粗多糖，每g加蒸馏水50～200ml配制成水溶液，水溶液按药脂比50～70mg∶1g加入聚酰胺吸附脱色，调pH至5～6，在室温下振摇50～60min，过滤，取滤液进行下一步纯化操作；
(2)步骤(1)滤液上大孔吸附树脂柱，以NaCl溶液洗脱，洗脱液采用截留分子量为1000～5000Da的超滤膜洗滤1～3次，除盐并浓缩，得浓缩液1；所述大孔树脂的型号为下列之一：AB-8型、MG-1型、LSA-5B型、X-5型、H107型、S-8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；
(3)步骤(1)滤液或步骤(2)浓缩液1上DEAE纤维素柱，以NaCl溶液洗脱，洗脱液采用截留分子量为1000～5000Da的超滤膜洗滤1～3次，除盐并浓缩，得浓缩液2；
(4)浓缩液1或浓缩液2干燥即得猕猴桃根多糖。
本发明主要采用高速离心结合超滤、柱层析等分离、纯化技术，对猕猴桃根多糖的制备方法进行了改进。本发明集成了超滤法与柱层析等技术的优点，以药效作用为指标，最大限度的除去无机盐、氨基酸、小分子色素等小分子杂质，与蛋白质等大分子杂质。该方法是一个纯物理过程，条件温和，节能环保，适合工业生产。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明方法将猕猴桃根水提液离心、微滤后，滤液先用截留分子量为3000000Da的超滤膜除去蛋白质等大分子物质，再用截留分子量为5000Da的超滤膜除去无机盐、氨基酸、小分子色素等小分子杂质，同时除去滤液中的水份浓缩，再醇沉制备猕猴桃根多糖，与现有技术相比，最大限度的分离除去了小分子与大分子杂质、显著提高了猕猴桃根多糖的得率与纯度，药效明显优于现有技术制备的猕猴桃根多糖；
(2)采用本发明制备猕猴桃根多糖，大大节约了乙醇用量，降低了成本；
(3)采用本发明制备猕猴桃根多糖，大大减少了乙醇用量、且不需要使用乙醚，提高了生产安全性。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：猴桃根粗多糖提取物活性部位的确定
取干燥猕猴桃根饮片5000g，加10倍质量水，加热回流提取3次、每次2小时，合并提取液，高速离心(15000r/min，20min)，上清液过0.45μm孔径的微孔滤膜，滤液依次采用截留分子量为300万，100万，10万，3万，5千的超滤膜，进行超滤分级，得到A(5000以下)，B(5000-3万)，C(3万-10万)，D(10万-100万)，E(100万-300万)，F(300万以上)等6个部位。各部位分别浓缩、干燥，并分别测定其多糖含量，计算其占总提取物(多糖)的百分比例。
各部位猕猴桃根提取物以注射给药进行抗小鼠H22肝癌药效实验：选择体重(20±1.0)g，雄性ICR小鼠140只，随机分成7组：模型对照组(生理盐水)，A组(5000以下)，B组(5000-3万)，C组(3万-10万)，D组(10万-100万)，E组(100万-300万)，F组(300万以上)。按法造模，各组于皮下瘤液接种的第2天开始给药(80mg/kg·日)，连续8天。停药一天后，分离肿瘤组织，并称取瘤重，得各组抑瘤率，结果见表1：
表1猕猴桃根提取物各部位含多糖比例及抑瘤率比较
| 部位(分子量) | 各部位含多糖比例(％) | 抑瘤率(％) |
| A(5000以下) | 1.2 | 9.65 |
| B(5000-3万) | 3.5 | 40.74 |
| C(3万-10万) | 4.4 | 43.28 |
| D(10万-100万) | 6.3 | 57.83 |
| E(100万-300万) | 83.0 | 65.37 |
| F(300万以上) | 1.6 | 13.71 |
由以上数据可知A(5000以下)及F(300万以上)部位含多糖量低、药效活性低，猕猴桃根提取物中有效部位主要是B、C、D与E.因此，本发明确定分子量5000DA至3000000DA部分为有效多糖部位，选用截留分子量5000DA的超滤膜除去小分子杂质，截留分子量3000000DA的超滤膜，除去大分子物质，以有效保留药性活性多糖，然后进行醇沉、离心、干燥等操作制备猕猴桃根多糖.
实施例2：本发明工艺与现有工艺的比较
取同批猕猴桃根，按文献工艺、专利工艺及本发明工艺等方法分别提取猕猴桃根多糖，进行比较(每种方法5个批次)：
文献工艺(即背景技术部分的方法1)：干燥猕猴桃根饮片1000g，加20倍质量的水加热提取，每次0.5h，提取2次，水提液加入乙醇使含醇量达80％(v/v)，静置过夜，抽滤，得产品。
专利工艺(即背景技术部分的方法2)：干燥猕猴桃根饮片1000g，加5倍质量30％(v/v)的乙醇浸渍2次，每次24小时，静置，取上清液，合并，加乙醇调至含乙醇量为72％(v/v)，静置24小时，离心，沉淀物再加5倍量72％乙醇(v/v)、无水乙醇各洗一次，弃去洗液，沉淀物再加3倍量乙醚洗涤一次，弃去乙醚液，沉淀物室温减压干燥。
本发明工艺：取干燥猕猴桃根饮片1000g，加10倍量水，加热回流提取3次、每次2小时，合并提取液，高速离心(15000r/min，20min)，上清液过0.45μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤、浓缩至1000毫升，浓缩液加入乙醇至乙醇体积浓度为70％(v/v，下同)，静置12小时，高速离心(15000r/min，20min)，取沉淀以无水乙醇洗涤3次，干燥，即得到所述猕猴桃根粗多糖。
制备的猕猴桃根粗多糖称重，采用硫酸-苯酚法测定含糖量、计算其纯度及得率，结果见表2、表3：
表2：3种工艺猕猴桃根多糖提取率与纯度比较
ACPS纯度(％)＝ACPS中总多糖量(mg)/ACPS质量(mg)×100％
ACPS得率(％)＝ACPS质量(g)/药材(饮片)质量(g)×100％
表3本发明与现有工艺以1kg药材投料计运行成本比较(单位：元)
实施例3：猕猴桃根多糖的制备
取干燥猕猴桃根饮片500g，加6倍质量的水，加热回流1小时，提取3次，合并提取液，高速离心(10000r/min，20min)，上清液过0.65μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液以截留分子量为5000Da的膜超滤、浓缩至500ml，浓缩液加入乙醇调醇浓度至55％(v/v)，静置60小时，高速离心(10000r/min，20min)，沉淀以无水乙醇洗1次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖得率为2.07％、纯度为55.81％。
取上述猕猴桃根粗多糖加蒸馏水配制浓度为10mg/ml的水溶液，按药脂比20mg∶1g加入聚酰胺，调pH至5，在室温下振摇30min，滤过，滤液上AB-8型大孔树脂柱，采用0.1mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，浓缩液上DEAE-52纤维素柱，以0.01mol/LNaCl洗脱至显色(硫酸-苯酚法，下同)无色，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根精制多糖，经测定其纯度为83.10％，得率0.91％。
实施例4：
取干燥猕猴桃根800g，加8倍质量水，加热回流2小时，提取3次，合并提取液，高速离心(20000r/min，10min)，上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为300000Da的膜超滤，超滤液以截留分子量为5000Da的超滤膜超滤、浓缩至1600ml，加入乙醇调醇浓度至90％(v/v)，静置6小时，高速离心(20000r/min，10min)，沉淀以无水乙醇洗2次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根多糖纯度为58.97％、得率为2.47％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水150ml配制水溶液，按药脂比40mg∶1g加入聚酰胺，调pH至6，在室温下振摇60min，滤过，滤液上MG-1型大孔树脂柱，采用0.2mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱液用3000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根精制多糖，经测定其纯度为78.23％，得率1.34％。
实施例5：
取干燥猕猴桃根1000g，加10倍质量水，加热回流3小时，提取2次，合并提取液，离心(5000r/min，30min)，上清液过0.8μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液以截留分子量为5000Da的膜超滤、浓缩至5000毫升，加入乙醇调醇浓度至85％(v/v)，静置8小时，离心(5000r/min，30min)，沉淀以无水乙醇洗3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根多糖纯度为60.11％，提取率为2.39％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水200ml配制水溶液，按药脂比60mg∶1g加入聚酰胺，调pH至7，在室温下振摇80min，滤过，滤液上DEAE-32纤维素柱，以0.02mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用2000Da的超滤膜洗滤3次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为79.89％，得率1.37％.
实施例6：
取干燥猕猴桃根1500g，加12倍质量水，加热回流4小时，提取2次，合并提取液，高速离心(12000r/min，20min)，上清液过0.65μm孔径的微孔滤膜，微滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至750毫升，加入乙醇调醇浓度至60％(v/v)，静置48小时，高速离心(12000r/min，20min)，沉淀以无水乙醇洗1次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度为55.10％，提取率为2.41％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水200ml配制水溶液，按药脂比80mg∶1g加入聚酰胺，调pH至8，在室温下振摇100min，滤过，滤液上LSA-5B型大孔树脂柱，采用0.5mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩；浓缩液上DEAE-52纤维素柱，以0.06mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用5000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为83.10％，得率1.18％。
实施例7：
取干燥猕猴桃根饮片2000g，加12倍质量水，加热回流1小时，提取3次，合并提取液，高速离心(7500r/min，25min)，上清液过0.8μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至1000毫升，加入乙醇调醇浓度至70％(v/v)，静置48小时，高速离心(7500r/min，25min)，沉淀以无水乙醇洗2次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度为56.13％，得率为2.56％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水50ml配制水溶液，按药脂比100mg∶1g加入聚酰胺，调pH至4，在室温下振摇30min，滤过，滤液上D3520型大孔树脂柱，采用0.6mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，浓缩液上DEAE-52纤维素柱，以0.07mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为83.97％，得率0.89％。
实施例8：
取干燥猕猴桃根饮片3000g，加30倍质量水，加热回流2小时，提取液高速离心(15000r/min，20min)，上清液过0.45μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至600毫升，加入乙醇调醇浓度至80％(v/v)，静置24小时，离心(10000r/min，20min)，沉淀以无水乙醇洗3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，其纯度为59.10％，得率为2.87％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水80ml配制水溶液，按药脂比20mg∶1g加入聚酰胺，调pH至5，在室温下振摇40min，滤过，滤液上S-8型大孔树脂柱，采用0.7mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为78.58％，得率1.51％。
实施例9：
取干燥猕猴桃根500g，加20倍质量水，加热回流2小时，提取2次，合并提取液，高速离心(20000r/min，10min)，上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至500毫升，加入乙醇调醇浓度至50％(v/v)，静置60小时，离心(20000r/min，5min)，沉淀以无水乙醇洗1次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度58.67％，得率2.16％.
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水100ml配制水溶液，按药脂比40mg∶1g加入聚酰胺，调pH至6，在室温下振摇50min，滤过，滤液上H107型大孔树脂柱，采用0.8mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用2000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩；浓缩液上DEAE-52纤维素柱，以0.08mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用2000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为82.31％，得率1.07％。
实施例10：
取干燥猕猴桃根800g，加25倍质量水，加热回流提取3小时，提取液，高速离心(22000r/min，5min)，上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至800毫升，加入乙醇调醇浓度至70％(v/v)，静置36小时，离心(22000r/min，5min)，沉淀以无水乙醇洗2次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度56.78％，得率2.81％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水150ml配制水溶液，按药脂比60mg∶1g加入聚酰胺，调pH至7，在室温下振摇60min，滤过，滤液上HPSIP1300型大孔树脂柱，采用0.9mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩。浓缩液上DEAE-32纤维素柱，以0.09mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤3次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为83.49％，得率1.28％。
实施例11：
取干燥猕猴桃根1000g，加25倍质量水，加热回流提取6小时，提取液高速离心(25000r/min，5min)，上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至2000毫升，加入乙醇调醇浓度至80％(v/v)，静置时间48小时，离心(25000r/min，5min)，沉淀以无水乙醇洗3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度59.78％，得率3.01％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水180ml配制水溶液，按药脂比70mg∶1g加入聚酰胺，调pH至8，在室温下振摇70min，过滤收集滤液，滤液上NKA-9型大孔树脂柱，采用1.0mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，浓缩液上DEAE-32纤维素柱，以0.1mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为85.10％，得率1.24％。
实施例12：
取干燥猕猴桃根1500g，加8倍质量水，加热回流1.5小时，提取3次，合并提取液，高速离心(20000r/min，8min)，上清液过0.45μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至15000毫升，加入乙醇调醇浓度至70％(v/v)，静置48小时，离心(20000r/min，8min)，沉淀以无水乙醇洗2次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度60.21％，得率2.13％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水200ml配制水溶液，按药脂比80mg∶1g加入聚酰胺，调pH至4，在室温下振摇80min，滤过，滤液上LSA-5B型大孔树脂柱，采用0.1mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤3次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为83.03％，得率1.31％.
实施例13：
称取干燥猕猴桃根2000g，加10倍质量水，加热回流2.5小时/次，提取2次，合并提取液，高速离心(22500r/min，5min)，上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至2000毫升，加入乙醇调醇浓度至80％(v/v)，静置时间54小时，离心(22500r/min，5min)，沉淀以无水乙醇洗2次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度56.79％，得率2.94％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水50ml配制水溶液，按药脂比90mg∶1g加入聚酰胺，调pH至5，在室温下振摇90min，滤过，滤液上LSA-5B型H107型大孔树脂柱，采用0.3mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液上DEAE-52纤维素柱，以0.07mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤3次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为77.79％，得率1.03％。
实施例14：
取干燥猕猴桃根饮片3000g，加12倍质量水，加热回流1小时，提取3次，合并提取液，高速离心(25000r/min，5min)，上清液过0.22μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至1000毫升，加入乙醇调醇浓度至60％(v/v)，静置60小时，离心(20000r/min，5min)，沉淀以无水乙醇洗3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度58.25％，得率2.55％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水70ml配制水溶液，按药脂比100mg∶1g加入聚酰胺，调pH至6，在室温下振摇100min，滤过，滤液上H107型大孔树脂柱，采用0.6mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用5000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩；浓缩液上DEAE-32纤维素柱，以0.05mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用2000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为82.67％，得率1.17％。
实施例15：
取干燥猕猴桃根500g，加14倍质量水，加热回流2小时，提取2次，提取液高速离心(15000r/min，15min)，上清液过0.45μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为1000Da的膜超滤，浓缩至1500毫升，加入乙醇调醇浓度至70％(v/v)，静置66小时，离心(15000r/min，15min)，沉淀以无水乙醇洗2次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，其纯度为60.05％，得率2.47％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水90ml配制水溶液，按药脂比20mg∶1g加入聚酰胺，调pH至7，在室温下振摇30min，滤过，滤液上HPSIP1300型大孔树脂柱，采用0.4mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，浓缩液上DEAE-52纤维素柱，以0.03mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为81.85％，得率0.91％。
实施例16：
取干燥猕猴桃根1000g，加16倍质量水，加热回流2小时，提取2次，合并提取液，高速离心(10000r/min，25min)，上清液过0.65μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至1250毫升，加入乙醇调醇浓度至80％(v/v)，静置72小时，离心(10000r/min，25min)，沉淀以无水乙醇洗3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度57.9％，得率2.93％.
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水100ml配制水溶液，按药脂比50mg∶1g加入聚酰胺，调pH至8，在室温下振摇60min，滤过，滤液上HPSIP1300型大孔树脂柱，采用0.6mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤3次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为76.53％，得率1.17％。
实施例17：
取干燥猕猴桃根饮片500g，加10倍质量水，加热回流提取3次、每次2小时，合并提取液，高速离心(9000r/min，20min)，上清液过0.8μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤、浓缩至250毫升，浓缩液加入乙醇至乙醇体积浓度为70％(v/v)，静置12小时，高速离心(9000r/min，20min)，取沉淀以无水乙醇洗涤3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度60.12％，得率3.18％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水120ml配制水溶液，按药脂比80mg∶1g加入聚酰胺，调pH至5，在室温下振摇80min，滤过，滤液上SIP1400型大孔树脂柱，采用0.6mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，浓缩液上DEAE-32纤维素柱，以0.05mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为82.50％，得率1.36％。
实施例18：
称取干燥猕猴桃根1000g，加10倍质量水，加热回流3小时，提取3次，合并提取液，高速离心(12500r/min，15min)，上清液过0.65μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至800毫升，加入乙醇调醇浓度至70％(v/v)，静置24小时，离心(12500r/min，15min)，沉淀以无水乙醇洗3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度55.8％，得率2.74％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水150ml配制水溶液，按药脂比80mg∶1g加入聚酰胺，调pH至5，在室温下振摇80min，滤过，滤液上SIP1400型大孔树脂柱，采用0.6mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，浓缩液上DEAE-52纤维素柱，以0.05mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根精制多糖，经测定其纯度为84.90％，得率1.25％。
实施例19：
称取干燥猕猴桃根20kg，加10倍质量水，加热回流2.5小时，提取2次，合并提取液，高速离心(10000r/min，20min)，上清液过0.8μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量为5000Da的膜超滤，浓缩至10升，加入乙醇调醇浓度至70％(v/v)，静置24小时，离心(10000r/min，20min)，沉淀以无水乙醇洗3次，干燥即得猕猴桃根粗多糖，经测定、计算，猕猴桃根粗多糖纯度55.8％，得率1.95％。
所得猕猴桃根粗多糖每克加蒸馏水150ml配制水溶液，按药脂比80mg∶1g加入聚酰胺，调pH至5，在室温下振摇80min，滤过，滤液上SIP1400型大孔树脂柱，采用0.6mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液采用1000Da的超滤膜洗滤2次，除盐并浓缩，浓缩液上DEAE-52纤维素柱，以0.05mol/LNaCl洗脱至显色无色，洗脱液采用3000Da的超滤膜洗滤1次，除盐并浓缩，干燥即得猕猴桃根(精制)多糖，经测定其纯度为80.90％，得率1.01％.
实施例20：药效学实验
用按上述实施实例19中提供的方法制备得到的猕猴桃根粗多糖与精制多糖，注射给药进行药效学实验：
一、抗小鼠H22肝癌实验
(一)材料与方法
1、动物模型的建立
1.1制备肿瘤细胞悬液
在无菌条件下从H22瘤株腹腔抽取含肿瘤细胞的半透明、未溶血、未感染的腹水(符合要求者呈半透明乳白色，含血细胞者呈淡红色，已感染者呈黄绿色)，用生理盐水稀释10倍、100倍。瑞氏染色，光镜下计数每毫升腹水中的瘤细胞数(光镜下肿瘤细胞为大而圆的透明亮点)，用生理盐水稀释腹水液使细胞终浓度为1×107/ml，存活的瘤细胞≥95％，并充分混匀。整个操作过程严格注意无菌操作，避免污染。
1.2接种肿瘤细胞
用酒精棉球在小鼠右前腋下进行消毒处理，皮下注射已制备好的肿瘤细胞悬液0.2mL/只。
2、分组与给药
2.1分组：选择体重(20±1.0)g，雄性ICR小鼠120只，随机分成6组：模型对照组(生理盐水注射)，ACPS低、中、高剂量组(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)，猕猴桃根粗多糖组(80mg/kg)，阳性对照组(香菇多糖注射液，市售注射剂)(0.7mg/kg·日，相当于人临床常用量的5～8倍)。
2.2给药：于皮下瘤液接种的第2天开始给药，连续8天。
3、给药后动物处理及标本采集
3.1用于观察抑瘤率等指标的各组(10只/组)小鼠于停药后第1天称重后，摘眼球取血，每只小鼠取血量0.5～1.0ml，置1.5ml离心管中，室温下静置2-4小时，离心(2000r/min，20min)，分离血清。全程避免交叉污染，分装后置1.5ml离心管中，冰箱中-20℃保存，用于检测血清中肿瘤坏死因子TNFa浓度。
3.2脱臼处死摘眼球取血后的动物，分离肿瘤组织，并称取瘤重，计算抑瘤率。将肿瘤组织标本在中性缓冲福尔马林(pH＝7.4)中固定，12小时后取材制成石蜡切片。
3.3用于观察生命延长期的各组(10只/组)小鼠停药后正常饲养，记录生存天数，计算生命延长期。
4、标本检测
4.1瘤组织石蜡切片HE染色(苏木素-伊红染色)镜下观察结果，主要观察肿瘤组织的增生，坏死及凋亡情况。
4.2TNFa ELISA Kit试剂盒测定血清中肿瘤坏死因子TNFa浓度。
5、数据分析
SPSS11.0对所得结果进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用T检验。
(二)结果
1、猕猴桃根多糖对小鼠H22肝癌细胞的抑制作用，结果见表4：
表4猕猴桃根多糖注射给药对H22肝癌小鼠抑瘤率的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数 | 平均瘤重(g) | 抑瘤率(％) |
| 模型对照 | - | 9 | 1.217±0.276 | - |
| ACPS(低) | 20 | 9 | 1.051±0.081 | 13.64 |
| ACPS(中) | 40 | 9 | 0.681±0.184** | 44.08 |
| ACPS(高) | 80 | 9 | 0.435±0.144** | 64.28 |
| 猕猴桃根粗多糖 | 80 | 9 | 0.693±0.112** | 43.09 |
| 香菇多糖 | 0.7 | 9 | 0.636±0.141** | 47.72 |
注：“**”表示与模型组比较具有极显著差异P＜0.01
(1)与模型组抑瘤率数据比较，ACPS注射液对小鼠H22肝癌具有良好的抑制作用，且在20至80mg/kg范围内呈现量效关系，中剂量组和高剂量组与模型组比较差异极显著(P＜0.01)，低剂量组抑瘤率较低，与模型组比较无显著差异。
(2)猕猴桃根粗多糖组的抑瘤率低于相同剂量的ACPS注射液组，而与中剂量ACPS注射液组相当。高剂量ACPS注射液组的抑瘤率高于阳性对照组，说明ACPS药效确切，具有很好的开发价值。
(3)瘤组织切片HE染色镜下可以见到肿瘤坏死，少数标本坏死较严重；阳性对照组和ACPS注射剂治疗组(高、中剂量)多数肿瘤坏死非常明显，只剩下周边少量的肿瘤细胞；ACPS注射剂低剂量组及猕猴桃根粗多糖组肿瘤坏死也较明显。
2、猕猴桃根多糖对荷瘤小鼠生命延长期的影响，结果见表5：
表5猕猴桃根多糖注射给药对荷瘤小鼠生命延长期的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数 | 平均生存天数 | 生命延长期(％) |
| 模型对照 | - | 9 | 2.167±1.169 | -- |
| ACPS(低) | 20 | 10 | 2.556±2.068 | 17.95 |
| ACPS(中) | 40 | 10 | 3.600±1.647 | 66.15 |
| ACPS(高) | 80 | 10 | 3.667±1.871 | 69.23 |
| 猕猴桃根粗多糖 | 80 | 9 | 4.000±2.449 | 84.62 |
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数 | 平均生存天数 | 生命延长期(％) |
| 香菇多糖 | 0.7 | 9 | 3.667±1.581 | 69.23 |
由上表可知：ACPS具有延长平均生存天数的作用，且呈现一定的量效关系，中剂量和高剂量组ACPS的生命延长期与香菇多糖相近。
3、猕猴桃根多糖注射给药对荷瘤小鼠血清TNFa的影响，结果见表6：
表6猕猴桃根多糖注射给药对荷瘤小鼠血清TNFa的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数 | TNFa浓度(pg/ml) |
| 模型对照 | - | 9 | 148.03±22.50 |
| ACPS(低) | 20 | 9 | 167.13±42.80 |
| ACPS(中) | 40 | 9 | 173.58±28.00 |
| ACPS(高) | 80 | 9 | 180.18±31.37 |
| 猕猴桃根粗多糖 | 80 | 9 | 164.17±33.92 |
| 香菇多糖 | 0.7 | 9 | 189.46±45.49 |
由上表可知，ACPS低、中、高剂量组、猕猴桃根粗多糖组，及香菇多糖组的TNFa浓度均比模型组高，可见猕猴桃根多糖具有一定的提高血清TNFa浓度的作用。
(三)结论：
猕猴桃根多糖对小鼠H22肝癌细胞具有抑制作用，并可延长H22肝癌小鼠的生存期，该作用可能与其提高小鼠血清TNFa浓度有关。
二、抗小鼠S180荷瘤实验
(一)材料与方法
1、动物模型的建立
1.1制备肿瘤细胞悬液
在无菌条件下从S180瘤株腹腔抽取含肿瘤细胞的半透明、未溶血、未感染的腹水(符合要求者呈半透明乳白色，含血细胞者呈淡红色，已感染者呈黄绿色)，用生理盐水稀释10倍、100倍。瑞氏染色，光镜下计数每毫升腹水中的瘤细胞数(光镜下肿瘤细胞为大而圆的透明亮点)，用生理盐水稀释腹水液使细胞终浓度为1×107/ml，存活的瘤细胞≥95％，并充分混匀。整个操作过程严格注意无菌操作，避免污染。
1.2接种肿瘤细胞
用酒精棉球在小鼠右前腋下进行消毒处理，皮下注射已制备好的肿瘤细胞悬液0.2mL/只。
2、分组与给药：每组10只小鼠，其余同前(抗小鼠H22肝癌实验)操作。
3、各组小鼠于停药后第1天称重后，颈椎脱臼处死小鼠，脱臼处死后的动物，分离肿瘤组织，并称取瘤重，计算抑瘤率.
4、数据分析：SPSS11.0对所得结果进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用T检验。
(二)结果
猕猴桃根多糖注射给药对小鼠S180荷瘤细胞的抑制作用，结果见表7：
表7：猕猴桃根多糖注射给药对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数 | 平均瘤重(g) | 抑瘤率(％) |
| 模型对照 | - | 9 | 2.114±0.336 | - |
| ACPS(低) | 20 | 9 | 1.354±0.320** | 35.96 |
| ACPS(中) | 40 | 10 | 1.138±0.254** | 46.16 |
| ACPS(高) | 80 | 10 | 0.943±0.205** | 55.39 |
| 猕猴桃根粗多糖 | 80 | 10 | 1.270±0.214** | 39.92 |
| 香菇多糖 | 0.7 | 10 | 1.080±0.285** | 48.93 |
注：“**”表示与模型组比较具有极显著差异P＜0.01
由上表可知：与模型组抑瘤率数据比较，猕猴桃根多糖对S180荷瘤小鼠具有良好的抑制作用，且在20至80mg/kg范围内呈现量效关系；猕猴桃根粗多糖组的抑瘤率低于相同剂量的ACPS组，而与低剂量ACPS组相当，高剂量ACPS组的抑瘤率高于阳性对照组，说明ACPS药效确切。
(三)结论：
猕猴桃根多糖对S180荷瘤小鼠具有明确的抑制作用。
Claims (6)
1.一种猕猴桃根多糖提取物的制备方法，其特征在于所述方法包括：取干燥猕猴桃根(Radix Actinidia Chinensis)以水加热回流提取，提取液离心除去不溶物，取上清液过0.2～0.8μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量5000Da的膜超滤，浓缩至所得浓缩液中生药材含量为0.1～5g/mL，浓缩液加入85～95％乙醇至乙醇体积浓度为50～90％，静置醇沉，离心，取沉淀洗涤后在60～80℃真空干燥，得到猕猴桃根粗多糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括猕猴桃根粗多糖纯化步骤：
(1)取猕猴桃根粗多糖，每g加蒸馏水50～200ml配制成水溶液，水溶液脱色，过滤，取滤液进行下一步纯化操作；
(2)步骤(1)滤液上大孔吸附树脂柱或DEAE纤维素柱，以NaCl溶液洗脱，洗脱液采用截留分子量为1000～5000Da的超滤膜洗滤1～3次，除盐并浓缩，得浓缩液；
(3)浓缩液干燥即得猕猴桃根多糖。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(2)联用大孔吸附树脂柱和DEAE纤维素柱纯化进行猕猴桃根粗多糖的纯化。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂的型号为下列之一：AB-8型、MG-1型、LSA-5B型、X-5型、H107型、S-8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；所述DEAE纤维素为DEAE-32或DEAE-52。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行：取干燥猕猴桃根，加入质量为猕猴桃根质量6～30倍的水，加热回流提取1～3次、每次1～3小时，合并提取液，5000～25000r/min离心10min～30min，除去不溶物，上清液过0.2～0.8μm孔径的微孔滤膜，滤液用截留分子量为3000000Da的膜超滤，超滤液用截留分子量5000Da的膜超滤，浓缩至所得浓缩液中生药材含量为0.2～2g/mL，浓缩液在25～45℃下加入85～95％乙醇至乙醇体积浓度为60～80％，静置6～72小时，5000～25000r/min离心10min～20min，取沉淀以无水乙醇洗涤1～3次，洗涤后的沉淀60～80℃真空干燥，得到所述猕猴桃根粗多糖。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括猕猴桃根粗多糖纯化步骤：
(1)取猕猴桃根粗多糖，每g加蒸馏水50～200ml配制成水溶液，水溶液按药脂比50～70mg∶1g加入聚酰胺吸附脱色，调pH至5～6，在室温下振摇50～60min，过滤，取滤液进行下一步纯化操作；
(2)步骤(1)滤液上大孔吸附树脂柱，以NaCl溶液洗脱，洗脱液采用截留分子量为1000～5000Da的超滤膜洗滤1～3次，除盐并浓缩，得浓缩液1；所述大孔树脂的型号为下列之一：AB-8型、MG-1型、LSA-5B型、X-5型、H107型、S-8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；
(3)步骤(1)滤液或步骤(2)浓缩液1上DEAE纤维素柱，以NaCl溶液洗脱，洗脱液采用截留分子量为1000～5000Da的超滤膜洗滤1～3次，除盐并浓缩，得浓缩液2；
(4)浓缩液1或浓缩液2干燥即得猕猴桃根多糖。
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