CN105175566A - 聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其工艺流程如下：人参粉碎→过筛→乙醇回流→沸水浴提取→提取液浓缩→醇沉→过夜→乙醇丙酮无水乙醚洗涤→干燥→称重→粗多糖干品→复溶→上样→去离子水洗脱→收集洗脱液→洗脱液浓缩→真空冷冻干燥→无色无蛋白多糖。本方法纯化条件温和既不破坏人参多糖的有效成分,又不影响多糖得率,同时又能有效的除去多糖中的蛋白质和色素，且柱层析系统便于实现工厂化，可用于大规模处理。未经柱层析处理的粗糖溶液杂质和蛋白峰比较多，经过联合柱层析处理后多糖溶液在260nm和280nm无吸收峰，表明处理后的粗多糖不含蛋白和核酸。

Description

聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法

技术领域

本发明涉及一种有效去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，用于食药工业中西洋参多糖的提取纯化，并为其进一步的加工提供重要依据。

背景技术

西洋参（PanaxquinquefoliumL.）英文名：Americanginseng，又名美国参旗参、西洋人参洋参、花旗参、广东人参，系五加科人参属多年生草本植物，西洋参起源于北美原始森林，主要分布于美国和加拿大。20世纪80年代初在我国引种成功后，种植面积逐年扩大，现已成为世界上生产西洋参的第三大国，亦是世界上最大的西洋参消费国。西洋参一直以来被人们视为保健佳品，其独特的药理作用也引起了众多学者的关注，现代药理研究表明，西洋参中含有多种活性成分，如皂苷、多糖、多肽、黄酮类物质、氨基酸等，随着多糖逐渐为消费者所接受，西洋参多糖药品及保健食品的开发也逐渐成为西洋参研究的热点之一。西洋参多糖（PPQ）是西洋参中含量最多的一类具有特殊生物活性的物质，西洋参及其提取物的可溶性果胶中均含有一定的多糖类成分，目前分离出来的成分有蔗糖、人参三糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等。西洋参多糖在西洋参根中含量达11.7%左右。

近年来，天然多糖的研究逐渐受到人们的重视，其在发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用。药理学研究也表明，一些植物多糖有调节机体免疫功能、降血糖、降血脂、抗肿瘤等方面的生物活性。由于多糖组成复杂、结构相似，其分离纯化和结构鉴定较为困难，以致很多药理试验采用多糖粗品为实验材料，这极大地影响了多糖构效关系研究的进程，导致多糖的高级结构与生物活性的关系至今还不十分清楚。

多糖的纯化首要考虑去除游离蛋白质。因为蛋白质常与多糖共存于植物体内，两者分子量相近、性质相似，在提取中常一起被提取出来。传统多糖溶液脱蛋白方法主要是Sevage法、TCA法以及酶法，活性炭法、双氧水法以及离子交换法则是目前常用的多糖脱色方法。查阅相关文献证明Sevage法反复多次可以很好的去除蛋白质，但操作麻烦耗时多，且有机溶剂用量大污染环境。TCA法由于酸水解蛋白的同时一定程度上也破坏了多糖的结构，对于后续多糖结构分析和活性测定方面都有所影响。酶法多糖损失少，单纯使用酶法脱蛋白效果并不是特别理想，成本较高不适宜工业化生产。至于三种脱色方法脱色率差别不是很大，但由于粉末型活性碳吸附力较强，吸附色素的同时也吸附了一定量的多糖，其多糖损失率较大。双氧水脱色率较活性碳较高，但其原理上是把有色物质氧化为无色，本质没有去除色素，且氧化色素的同时多糖也被氧化分解，多糖损失较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，本方法纯化条件温和既不破坏人参多糖的有效成分,又不影响多糖得率,同时又能有效的除去多糖中的蛋白质和色素，且柱层析系统便于实现工厂化，可用于大规模处理。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，包括如下步骤：

一、西洋参粗多糖的制备

（1）西洋参整根经生物粉碎机粉碎，过20~80目筛，得西洋参粉；

（2）取干燥至恒重的西洋参粉以料液比1：10~40g/ml加入60~95%的乙醇60~90℃水浴回流1~6h，离心弃上清液，沉淀重复1~3次，烘干沉淀以料液比1：10~40g/ml加入蒸馏水在60~100℃水浴回流提取1~6h，离心收集沉淀，沉淀重复1~3次，合并上清液；

（3）浓缩上清液，加入乙醇使醇浓度达60~95%置于冰箱中2~6℃醇沉至4~12h；

（4）离心后得沉淀经无水乙醇、无水乙醚、丙酮依次洗涤后减压冷冻干燥得西洋参粗多糖干品。

二、联合柱层析

（1）称取一定量的西洋参粗多糖，用去离子水在30~60℃的水浴锅中震摇溶解，使得多糖浓度在1~20mg/ml，离心去除不溶物后作为粗糖原液备用；

（2）选用Ф26mm×600mm的层析柱×2，分别填入150~300ml处理好的聚酰胺和大孔树脂，并串联两柱，先用3~4倍柱体积去离子水从聚酰胺柱端进行平衡，将配置好的西洋参粗多糖原液，从聚酰胺柱端进行上样，吸附平衡一定时间后，再用去离子水洗脱，收集洗脱液，真空浓缩，冷冻干燥后得到无色无蛋白多糖，控制上样量为1~5g，上样体积为0.5~2.5BV，吸附平衡时间为10~60min，洗脱速率为2~10mL/min。

本发明中，所述聚酰胺的处理方法如下：

（1）新买的聚酰胺

取聚酰胺以90~95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3~4倍体积的90~95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2~2.5倍体积5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2~2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用。

（2）用过的聚酰胺

一般用5%NaOH水溶液洗脱，洗至NaOH水溶液颜色极淡为止。有时因某些鞣质与聚酰胺又不可逆吸附，用NaOH水溶液很难洗脱，可用5%NaOH在柱中浸泡，每天将柱中的NaOH水溶液放出一次，并加入新的5%NaOH水溶液，这样浸泡一周后，鞣质可基本洗脱完。然后用蒸馏水洗脱至pH8~9，再用2倍量的10%醋酸水溶液洗脱，最后蒸馏水洗脱至pH中性，重复使用。

本发明中，所述大孔树脂的处理方法如下：

（l）树脂的预处理：用95%乙醇浸泡树脂24小时，浸泡之后用水冲洗取代乙醇；搅拌，去除小颗树脂。

（2）树脂的再生处理:吸附树脂运行到终点后，先以2体积的水冲洗树脂柱，用2%~5%氢氧化钠溶液冲洗树脂柱，直至氢氧化钠溶液充满树脂柱（即流出液呈碱性）浸泡4个小时以上，用水冲洗，使流出液显中性，再用2%~5%的盐酸溶液冲洗树脂柱，直到流出液显酸性，浸泡8个小时以上，用水冲洗树脂柱，使流出液显中性，树脂柱再生完毕。

本发明采用聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素，原理如下：

一、聚酰胺层析柱对西洋参多糖中蛋白质的去除

1、吸附机理

聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键（-CO-NH-）的高分子聚合物，酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷，以静电引力形成吸附溶液中的阴离子，故可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基的化合物形成氢键而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。

2、洗脱机理

聚酰胺分子中有极性酰胺基团和非极性的脂肪键。作为一个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂（如水、乙醇、丙酮等）时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为类似反相分配层析，极性较大的吸附物易被洗脱。随着洗脱剂极性降低，极性较小的化合物可相继被洗脱下来。

二、大孔树脂柱对西洋参多糖色素的去除

大孔吸附树脂是以苯乙烯、丙烯酸酯、丙烯脂、异丁烯等为单体，加入二乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯、等石蜡为致孔剂，它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。树脂一般为白色的球状颗粒，粒度为20～60目，是一类含离子交换集团的交联聚合物，它的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子（吸附质）之间的范德华引力或生成氢键，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。

本发明中，聚酰胺柱可同时吸附西洋参粗多糖溶液中的色素与蛋白质，西洋参粗多糖溶液经聚酰胺柱处理后，蛋白脱除率可达到60~80%，而色素脱除率可达到40~70%，因此单独用聚酰胺柱初步纯化西洋参粗多糖，纯化效果不是特别理想；而多糖再经大孔树脂柱吸附处理后，洗脱下来的多糖溶液中蛋白和色素的脱除率可达到80~100%，，提高了多糖初步纯化效率，且聚酰胺和大孔树脂均可再生重复利用，利于成本降低，因此本发明选择聚酰胺柱和大孔树脂柱联用法为西洋参粗多糖理想的纯化方法。由图1可知，未经柱层析处理的粗糖溶液杂质和蛋白峰比较多，经过联合柱层析处理后多糖溶液在260nm和280nm无吸收峰，表明处理后的粗多糖不含蛋白和核酸。

附图说明

图1为经过联合柱层析吸附后粗糖溶液紫外扫描图；

图2为联合柱层析纯化西洋参多糖上样量的确定；

图3为联合柱层析纯化西洋参多糖上样体积的确定；

图4为联合柱层析纯化西洋参多糖吸附时间的确定；

图5为联合柱层析纯化西洋参多糖洗脱速率的确定。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其工艺流程如下:

人参粉碎→过筛→乙醇回流→沸水浴提取→提取液浓缩→醇沉→过夜→乙醇丙酮无水乙醚洗涤→干燥→称重→粗多糖干品→复溶→上样→去离子水洗脱→收集洗脱液→洗脱液浓缩→真空冷冻干燥→无色无蛋白多糖。

具体技术方案如下：

1、西洋参粗多糖的制备

西洋参整根经生物粉碎机粉碎，过60目药典筛，取干燥至恒重的西洋参粉以1:20g/ml料液比加入95%的乙醇90℃水浴回流2h，离心弃去上清液，沉淀重复一次，烘干沉淀以1:25g/ml料液比加入蒸馏水沸水浴回流提取2h，离心收集上清液，沉淀重复一次，合并上清液。浓缩上清液，加入乙醇使醇浓度至80%置于冰箱中低温醇沉过夜。离心后得沉淀经无水乙醇、无水乙醚、丙酮依次洗涤后减压冷冻干燥得西洋参粗多糖干品。

2、大孔树脂的筛选

本发明选择了四种不同的大孔树脂对西洋参多糖溶液的脱色效果进行比较，不同类型树脂的性质如表1所示，脱色效果比较如表2所示。

表1不同类型树脂性质

表2不同类型树脂脱色效果比较

由表2可知，大孔树脂S-8脱色率可达到95.8%，对西洋参粗多糖溶液的脱色效果最好且多糖损失率较低，因此本发明选择S-8作为大孔树脂柱填料。

3、联合柱层析最优条件确定

称取一定质量的西洋参粗多糖，用去离子水在60℃水浴中复溶，离心去除不溶物后作为粗糖原液备用。选用Ф26mm×600mm的层析柱×2，分别填入300mL处理好的聚酰胺和大孔树脂，3倍柱体积去离子水平衡后，上样，吸附平衡，去离子水洗脱，收集含糖管。以脱色率、脱蛋白率和多糖损失率为评价指标，从上样量、上样体积、吸附平衡时间以及洗脱速率4个方面确定联合柱层析的洗脱条件。

（1）最佳上样量的确定

取复溶粗糖液，通过稀释使多糖溶液的上样量分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g，上样体积为1BV，吸附平衡30min，4mL/min速率洗脱。

由图2可知，随着上样量的增大脱色率和脱蛋白率不断降低，多糖损失率也呈递减趋势，综合考虑多糖损失与脱色脱蛋白效果，本发明选择上样量为3.0g。

（2）最佳上样体积的确定

取复溶粗糖液，上样量为3.0g，通过稀释使多糖的上样体积分别0.5、1BV、1.5BV、2BV、2.5BV，吸附平衡30min，4mL/min速率洗脱。

由图3可知，随着上样体积的不断增大脱色率和脱蛋白率呈递减趋势，而多糖损失率变化不明显，综合考虑处理量和脱色脱蛋白率在1BV时效果较好，因此本发明选择1BV作为最佳上样体积。

（3）最佳吸附平衡时间的确定

取复溶粗糖原液，上样量为3.0g，上样体积为1BV，分别吸附平衡5、10、20、30、60min，4mL/min速率洗脱。

由图4可知，随着吸附平衡时间的增大，聚酰胺柱和大孔树脂柱对多糖的吸附量也增大，但对脱色和脱蛋白率影响不大，因此确定吸附平衡时间为20min。

（4）最佳洗脱速率的确定

取复溶粗糖液，上样量为3.0g，上样体积为1BV，吸附平衡30min，分别以2、4、6、8、10mL/min的速率洗脱。

由图5可知，随着洗脱速率的增大，多糖的损失率逐渐降低，脱色和脱蛋白效果也逐渐减弱，因此选择洗脱速率在6ml/min时联柱法脱色和脱蛋白效果较好且多糖损失不大。

Claims (7)

1.一种聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述方法步骤如下：

（1）称取一定量的西洋参粗多糖，用去离子水在30~60℃的水浴锅中震摇溶解，使得多糖浓度在1~20mg/ml，离心去除不溶物后作为粗糖原液备用；

（2）选用Ф26mm×600mm的层析柱×2，分别填入150~300ml处理好的聚酰胺和大孔树脂，并串联两柱，先用3~4倍柱体积去离子水从聚酰胺柱端进行平衡，将配置好的西洋参粗多糖原液，从聚酰胺柱端进行上样，吸附平衡一定时间后，再用去离子水洗脱，收集洗脱液，真空浓缩，冷冻干燥后得到无色无蛋白多糖，控制上样量为1~5g，上样体积为0.5~2.5BV，吸附平衡时间为10~60min，洗脱速率为2~10mL/min。

2.根据权利要求1所述的聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述西洋参粗多糖的制备方法如下：

（1）西洋参整根经生物粉碎机粉碎，过筛，得西洋参粉；

（2）取干燥至恒重的西洋参粉以料液比1：10~40g/ml加入60~95%的乙醇60~90℃水浴回流1~6h，离心弃上清液，沉淀重复1~3次，烘干沉淀以料液比1：10~40g/ml加入蒸馏水在60~100℃水浴回流提取1~6h，离心收集沉淀，沉淀重复1~3次，合并上清液；

（3）浓缩上清液，加入乙醇使醇浓度达60~95%置于冰箱中2~6℃醇沉至4~12h；

（4）离心后得沉淀经无水乙醇、无水乙醚、丙酮依次洗涤后减压冷冻干燥得西洋参粗多糖干品。

3.根据权利要求1所述的聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述大孔树脂柱为S-8。

4.根据权利要求1所述的聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述上样量为3.0g。

5.根据权利要求1所述的聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述上样体积为1BV。

6.根据权利要求1所述的聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述吸附平衡时间为20min。

7.根据权利要求1所述的聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法，其特征在于所述洗脱速率为6ml/min。