CN105713061A

CN105713061A - 一种罗汉果苷v含量≥95％的罗汉果提取物的制备方法

Info

Publication number: CN105713061A
Application number: CN201610121910.4A
Authority: CN
Inventors: 张宝堂; 谭家忠; 李芳�
Original assignee: HUNAN NUTRAMAX Inc
Current assignee: HUNAN NUTRAMAX Inc
Priority date: 2016-03-03
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2016-06-29

Abstract

本发明公开了一种罗汉果苷V含量≥95％的罗汉果提取物的制备方法，该方法包括步骤：挑选罗汉果，破碎，加入蒸馏水，加热使沸腾，提取3次，合并提取液；在提取液中加入壳聚糖乙酸水溶液，充分搅拌，离心过滤，得到滤液；按照原料重量kg比树脂体积L为1:1～1.2，将滤液按照流速为2～3BV/h过树脂柱，用蒸馏水按照相同流速洗脱树脂柱，弃掉第1～3BV的洗脱液，取第4～6BV洗脱液，真空浓缩至原料重量的1/25～1/20；将浓缩液冷藏，离心过滤无定形絮状物，将离心液真空浓缩，干燥得到粗品；将粗品上硅胶柱层析，收集罗汉果苷V≥95％组分，真空浓缩干燥，即得。本发明制备95％罗汉果苷V成本低，设备要求低，只使用无毒或者低毒非管制溶剂，适合于工业化生产。

Description

一种罗汉果苷V含量≥95％的罗汉果提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及植物有效成分分离提取技术领域，更具体涉及一种罗汉果苷V含量≥95％的罗汉果提取物的制备方法。

背景技术

罗汉果皂苷是葫芦素烷三萜类皂苷，罗汉果醇是罗汉果皂苷中各个成分的苷元。现已从罗汉果中分离得到皂苷类成分有：罗汉果苷V、罗汉果苷IV、罗汉果苷III、罗汉果苷IIE、罗汉果苷IIIE、罗汉果苷VI(罗汉果新苷)、罗汉果苷A、赛门苷I、11-O-罗汉果苷V、20-羟基-11-O-罗汉果苷IA等物质。其中罗汉果苷V是主要的甜味成分，具有稳定性好、甜度高、卡路里几乎为零的特点，可作为一种天然的食品添加剂。

公开号为CN1706861A的中国专利文件中介绍有一种高纯度罗汉果甜苷V的制备方法：先将罗汉果粉碎，用乙醇加热回流提取，再将提取物用D101型大孔树柱分离，先用去离子水和乙醇分别洗脱至无色，再收集其洗脱液，减压浓缩至浸膏状，然后用正相硅胶柱分离，加入氯仿、甲醇、水为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，再用反相硅胶C18柱分离，减压浓缩，即可分别得到纯度在90％～98％的罗汉果甜苷V。

公开号为CN101029071A的中国专利文件介绍了一种从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法：先将罗汉果粉碎成粗粉，加入乙醇回流提取，制得浸膏后用水溶解，再用乙酸乙酯萃取1次-3次，回收乙酸乙酯母液后继用正丁醇萃取1次-3次母液，回收正丁醇后通过聚酰胺柱，水洗液浓缩后过硅胶柱层析，用氯仿-甲醇-水洗脱，收集得罗汉果苷V粗品；然后过C18反相硅胶柱层析，水洗，乙醇洗脱，收集纯度大于95％以上的罗汉果苷V。

公开号为CN102675399A的中国专利文件提供一种从罗汉果中提取罗汉果苷V的方法，步骤如下：将干罗汉果进行破壳压碎处理，并将干罗汉果、50％乙醇70℃回流提取4h，浓缩至无乙醇味后用等体积乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯溶液浓缩干燥加水溶解，上AB-8大孔吸附树脂柱，使用乙醇浓度为20-60％，梯度洗脱，收集60％乙醇的洗脱液浓缩到一定体积后，加入丙酮溶液至终浓度为50％左右，室温过夜结晶和重结晶，得罗汉果苷V纯品含量98％。

公开号为CN104530168A的中国专利文件提供了一种用制备液相纯化罗汉果苷V的方法，方法如下：提取将罗汉果苷溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱内填料为反相球形硅胶，上样量为0.1％～3％，柱内流动相为有机溶剂水溶液，先控制有机溶液水溶液的初始梯度为2∶8～4∶6，流速100ml/min，洗脱30min～50min；调整梯度≥1，继续洗脱至50min～60min，调整紫外光度检测器的检测波长为203nm，自流动相开始注入动态轴向压缩柱制备色谱系统起进行液相色谱检测，在线收集对应色谱峰的洗脱液，得到纯度大于95％的罗汉果苷V。

公开号为CN104892717A的中国专利文件描述了一种罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，取罗汉果粗制品，以固液比1:10～20加入甲醇进行溶解，过滤，将滤液离心，超滤，再将超滤液注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，然后用洗脱剂进行洗脱，收集目标段洗脱液，干燥，得产品罗汉果甜苷V纯度≥95％。

公开号为CN1101407535A的中国专利文件描述了一种用30-60％的罗汉果苷V为原料制备98％含量的罗汉果苷V的方法，步骤如下：将30-60％苷V溶于甲醇过滤，滤液用丙酮沉淀，沉淀用硅胶柱层析吸附，用乙酸乙酯、乙酸丁酯之类的低碳链脂与乙醇的混合溶液洗脱，用丙酮和甲醇的混合溶液结晶得98％以上罗汉果苷V。

现有的90％以上含量的罗汉果苷V制备方法有相当大的局限性，用制备级的液相色谱分离纯化虽然简单，但对设备要求相当高，且分离量少成本大，用C18反相柱层析类似于制备液相色谱；C18反相硅胶昂贵，成本相当高；而溶剂萃取丙酮结晶等方法操作工艺复杂，用到有毒和管制的有机溶剂如丙酮、氯仿等，对生产条件要求很高，无法规模化生产。因此需要开发出工艺简单，设备要求低，并且成本低的新工艺方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题就是在制备罗汉果提取物中，如何只使用无毒或者低毒非管制溶剂，降低成本，降低对设备要求，并适合于工业化生产，从而提供一种罗汉果提取物的制备方法。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种罗汉果提取物的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤一：挑选罗汉果，水洗去除脏污，挤压破碎，按照原料重量kg比蒸馏水体积L为1:3向原料中加入蒸馏水，加热使沸腾，提取0.5～1.5小时，提取3次，合并提取液；

步骤二：在提取液中加入相对原料重量10～15％的质量浓度为0.5％的壳聚糖乙酸水溶液，充分搅拌，将冷却提取液到室温，离心过滤，得到滤液；

步骤三：按照原料重量kg比树脂体积L为1:1～1.2，将滤液按照流速为2～3BV/h过树脂柱，用蒸馏水按照相同流速洗脱树脂柱，弃掉第1～3BV的洗脱液，取第4～6BV洗脱液，真空浓缩至原料重量的1/25～1/20；

步骤四：将浓缩液pH值调节至10～11，在8～12℃冷藏结晶，1周后，离心过滤无定形絮状物，将离心液在2～5℃冷藏，结晶1周，低温离心过滤无定形絮状物，将离心液真空浓缩，干燥得到粗品；

步骤五：按照粗品重量比硅胶重量为1:15～20，径高比为1:8，上硅胶柱层析，先用二氯甲烷：甲醇体积比为100:15，洗脱15BV，去除杂质；再用二氯甲烷：甲醇体积比为100:35洗脱，收集用HPLC检测到的罗汉果苷V≥95％组分，真空浓缩干燥，即得。

优选地，在步骤一中，所挑选的罗汉果为果皮完整的金黄色的成熟罗汉果。

优选地，在步骤三中，所述的树脂柱为LSA-700B弱碱性大孔吸附树脂柱(市购得到)。

优选地，步骤三至五中，所述真空浓缩的真空度为0.08～0.09MPa。

优选地，所述方法包括如下步骤：

步骤一：挑选果皮完整的金黄色的成熟罗汉果，水洗去除脏污，挤压破碎，按照原料重量kg比蒸馏水体积L为1:3向原料中加入蒸馏水，加热使沸腾，提取1小时，提取3次，合并提取液；

步骤二：在提取液中加入相对原料重量10％的质量浓度为0.5％的壳聚糖乙酸水溶液，充分搅拌，将冷却提取液到室温，离心过滤，得到滤液；

步骤三：按照原料重量kg比树脂体积L为1:1，将滤液按照流速为2～3BV/h过LSA-700B弱碱性大孔吸附树脂柱，用蒸馏水按照相同流速洗脱树脂柱，弃掉第1～3BV的洗脱液，取第4～6BV洗脱液，真空浓缩至原料重量的1/20；

步骤四：将浓缩液pH值调节至10.5，在10℃冷藏结晶，1周后，离心过滤无定形絮状物，将离心液在4℃冷藏，结晶1周，低温离心过滤无定形絮状物，将离心液真空浓缩，干燥得到粗品；

步骤五：按照粗品重量比硅胶重量为1:18，径高比为1:8，上硅胶柱层析，先用二氯甲烷：甲醇体积比为100:15，洗脱15BV，去除杂质；再用二氯甲烷：甲醇体积比为100:35洗脱，收集用HPLC检测到的罗汉果苷V≥95％组分，真空浓缩干燥，即得。

本发明还提供了所述的罗汉果提取物的制备方法所制得的罗汉果提取物，其中汉果苷V含量≥95％。

(三)有益效果

本发明设备要求及耗材要求低，不会用到高端的制备色谱，价格昂贵的C18反相硅胶，避免了昂贵的耗材、仪器的依赖对工业化生产的限制，降低了生产成本。本发明方法步骤简单，简化了生产过程，提高了罗汉果的利用率。水沸提，能充分提高罗汉果苷V的提取率；在过柱前进行絮凝，能大量除去悬浮在水提液中的黄酮、多糖、果胶、蛋白、鞣质等成分，使得水提液更加澄清，减小了弱碱性大孔吸附树脂的负担；用弱碱性大孔吸附树脂能起到富集罗汉果苷V与脱色的作用，快速高效地提高目标成分含量；在对罗汉果苷V进行结晶得时候发现罗汉果苷V非常难结晶出来，但是在一定的碱性条件下长时间的低温冷藏能析出大量杂质，起到提高含量的效果；最后用硅胶柱层析的方法将含量提高到95％以上。本发明所用的试剂均为低毒或者无毒，不用像丙酮、氯仿这样受管制的的化学试剂，更安全更环保。过弱碱性大孔吸附树脂时，前段流出液与中段弃掉的第1～3BV的洗脱液中也含有少量的罗汉果苷V成分，用硅胶柱层析纯化时也会有少量的罗汉果苷V混在杂质中流出来，本发明能收集这些低含量的罗汉果苷V并做成中低含量的产品，节约了资源。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

实施例1：

选果皮为金黄色的成熟罗汉果500kg，水洗去除表皮脏污，挤压破碎，加入蒸馏水1500L，沸腾提取1小时，提取3次，合并提取液，在提取液中加入50kg质量浓度0.5％壳聚糖乙酸水溶液，充分搅拌半小时，待提取液冷却到室温后，用三足离心机离心过滤。过滤液以2BV/h的流速过500LLSA-700B弱碱性大孔吸附树脂柱，待上柱完全，用蒸馏水按照相同流速洗脱树脂柱，弃掉前面1500L的洗脱液，取后面1500L洗脱液，循环真空浓缩设备浓缩至20kg，将浓缩液调节pH值至10，8℃左右冷藏结晶1周后，离心过滤无定形絮状物，离心液2℃左右冷藏结晶1周，低温离心过滤无定形絮状物，离心液真空浓缩干燥得粗品，按照粗品重量：硅胶重量＝1:15,径高比为1:8，上硅胶柱层析，先用二氯甲烷：甲醇(V：V)＝100:15洗脱15BV去除杂质,再用二氯甲烷：甲醇(V：V)＝100:35洗脱，收集用HPLC检测到罗汉果苷V≥95％组分，真空浓缩，冷冻干燥，即得罗汉果提取物，其罗汉果苷V的含量为95.11％。

实施例2：

选果皮为金黄色的成熟罗汉果50kg，水洗去除表皮脏污，挤压破碎，加入蒸馏水150L，沸腾提取1.5小时，提取3次，合并提取液，在提取液中加入7.5kg质量浓度0.5％壳聚糖乙酸水溶液，充分搅拌半小时，待提取液冷却到室温，离心过滤，过滤液以3BV/h的流速过60LLSA-700B弱碱性大孔吸附树脂柱，待上柱完全，用蒸馏水按照相同流速洗脱树脂柱，弃掉前面150L的洗脱液，取后面150L洗脱液，循环真空浓缩设备浓缩至2.5kg，将浓缩液调节pH值至11，12℃左右冷藏结晶1周后，离心过滤无定形絮状物，离心液5℃左右冷藏结晶1周，低温离心过滤无定形絮状物，离心液真空浓缩干燥得粗品，按照粗品重量：硅胶重量＝1:20,径高比为1:8，上硅胶柱层析，先用二氯甲烷：甲醇(V：V)＝100:15洗脱15BV去除杂质,再用二氯甲烷：甲醇(V：V)＝100:35洗脱，收集用HPLC检测到罗汉果苷V≥95％组分，真空浓缩，冷冻干燥，即得罗汉果提取物，其罗汉果苷V的含量为95.64％。

实施例3：

选果皮为金黄色的成熟罗汉果5kg，水洗去除表皮脏污，挤压破碎，加入蒸馏水15L，沸腾提取1小时，提取3次，合并提取液，在提取液中加入650g质量浓度0.5％壳聚糖乙酸水溶液，充分搅拌半小时，待提取液冷却到室温后，离心过滤。过滤液以2BV/h的流速过5LLSA-700B弱碱性大孔吸附树脂柱，待上柱完全，用蒸馏水按照相同流速洗脱树脂柱，弃掉前面15L的洗脱液，取后面15L洗脱液，浓缩至200g，将浓缩液调节pH值至10.5，10℃左右冷藏结晶1周后，离心过滤无定形絮状物，离心液4℃左右冷藏结晶1周，低温离心过滤无定形絮状物，离心液真空浓缩干燥得粗品，按照粗品重量：硅胶重量＝1:18径高比为1:8，上硅胶柱层析，先用二氯甲烷：甲醇(V：V)＝100:15洗脱15BV去除杂质,再用二氯甲烷：甲醇(V：V)＝100:35洗脱，收集用HPLC检测到罗汉果苷V≥95％组分，真空浓缩，冷冻干燥，即得罗汉果提取物，其罗汉果苷V的含量为95.50％。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种罗汉果提取物的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的罗汉果提取物的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所挑选的罗汉果为果皮完整的金黄色的成熟罗汉果。

3.根据权利要求1所述的罗汉果提取物的制备方法，其特征在于，在步骤三中，所述的树脂柱为LSA-700B弱碱性大孔吸附树脂柱。

4.根据权利要求1所述的罗汉果提取物的制备方法，其特征在于，在步骤三至五中，所述真空浓缩的真空度为0.08～0.09MPa。

5.根据权利要求1-4任一项所述的罗汉果提取物的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

6.权利要求1-5任一项所述的罗汉果提取物的制备方法所制得的罗汉果提取物，其特征在于，其中汉果苷V含量≥95％。