CN104045724B - 从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，其特征是，包括如下步骤：A．原料的脱脂预处理；B．热水浸提制备粗多糖；C．粗多糖酶解；D．大孔吸附树脂DM301处理；E．超滤去除小分子；F．真空冷冻干燥；制备桦褐孔菌多糖。使用该工艺最终得到脱色的并去除大部分蛋白和小分子杂质的桦褐孔菌精制多糖，适合产业化规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法。
背景技术
桦褐孔菌[Inonotus obliquus (Fr.)Pilat]是一著名的民间野生药用真菌。研究表明，桦褐孔菌多糖是重要的活性成分之一，具有增强免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖及抗病毒等多种药理活性，已成为国内外研究的热点领域之一。但目前对桦褐孔菌多糖的分离纯化的研究报道相对较少。
由于多糖的组成复杂性，多糖粗提物的分子量分布较广，多糖种类也很多，而且前期实验表明，提取后的桦褐孔菌粗多糖中含有一定量的蛋白和色素，影响多糖的化学结构和生物活性研究，因此有必要对多糖进行分离纯化。但去除粗多糖中的蛋白和色素，一直是多糖分离纯化中的一大难题，传统的去蛋白以Sevage法为主，方法操作繁琐，效率低，采用的有机溶剂有毒性因而影响多糖的生物活性；活性炭法去除色素效果较好，但后期的活性炭粉末不易去除，过氧化氢法因为较强的抗氧化活性去除色素效果很好，但对多糖的活性影响较大，因此急需探索一种新的精制方法。
大孔吸附树脂是一类不含交换基团的高分子吸附材料，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，具有很好的吸附活性，某些大孔树脂已经用到植物多糖中的去蛋白研究中，取得了很好的效果。
申请公布CN102603906A（申请号 201110461635.8）的中国专利文献公开了一种桦褐孔菌多糖水溶液的制备方法：一种桦褐孔菌多糖水溶液的制备方法，包括以下步骤： 三氯乙酸脱蛋白：向桦褐孔菌提取物中加入三氯乙酸，静置，然后固液分离，取分离得到的固体物质；活性炭脱色：向步骤； 所得固体物质按体积加入50-100 倍的水，然后加入活性炭脱色，然后固液分离，取所得上清液；用天然澄清剂澄清：所得上清液加入天然澄清剂澄清。
大孔树脂用以去除桦褐孔菌粗多糖尚未见有文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种精制桦褐孔菌粗多糖的工艺，本发明的核心技术是：应用生物酶和大孔吸附树脂替代传统的Sevage法、活性炭法和过氧化氢法去除蛋白和色素，适合规模化产业化制备桦褐孔菌精制多糖。
本发明的技术方案如下：
从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，其包括如下步骤：A．原料的脱脂预处理；B．热水浸提制备粗多糖；C．粗多糖酶解；D．大孔吸附树脂DM301处理；E．超滤去除小分子；F.真空冷冻干燥；制备桦褐孔菌多糖。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤A．原料的脱脂预处理是指，取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于4-8倍体积的60-95%乙醇溶液中浸泡16-24 h（优选的，置于6-7倍体积的70-90%乙醇溶液中浸泡18-20 h，更加优选的，置于6.5倍体积的80%乙醇溶液中浸泡20 h），以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤B．热水浸提制备粗多糖是指，预处理后的残渣风干后，加10-20倍蒸馏水（v/w），沸水提取1-3 h， 80-120目纱布过滤（优选的，加13-18倍蒸馏水（v/w），沸水提取1.5-2.5h， 85-100目纱布过滤，更加优选的，加15倍蒸馏水（v/w），沸水提取2 h，100目纱布过滤），滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤C．粗多糖酶解是指，将粗多糖加水溶解，加入木瓜蛋白酶，35-45℃反应20-40 min（优选的，36-42℃反应25-35 min，更加优选的，40℃反应30 min），得粗多糖的酶解液。更加优选的，粗多糖加水溶解后配制为0.5-2.0%（w/w）的水溶液（优选的，配制为0.6-1.8%（w/w）的水溶液，更加优选的，配制为1.5%（w/w）的水溶液）。更加优选的，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3-5%（w/w）（优选的，加入量为粗多糖水溶液的3.5-4.5%（w/w），更加优选的，加入量为粗多糖水溶液的4.0%（w/w））。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤D．大孔吸附树脂DM301处理是指，粗多糖的酶解液加入预处理好的DM301树脂层析柱中，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.2-2.0︰1（w/v），流速控制在1.5-2.2 ml/min（优选的，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.5-1.8︰1（w/v），流速控制在1.5-2 ml/min，更加优选的，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.6︰1（w/v），流速控制在1.8 ml/min），收集流出液。更加优选的，所述的预处理是指，大孔吸附树脂DM301用无水乙醇浸泡24 h，并以无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无醇味。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤E．超滤去除小分子是指，采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤F.真空冷冻干燥是指，先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3 h，然后转入-80℃下冷冻6 h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
本发明公开了一种桦褐孔菌精制多糖及其制备工艺，制备工艺如下：1、原料的预处理；2、桦褐孔菌多糖的溶出；3、蛋白酶水解；4、大孔吸附树脂处理；5、超滤，然后干燥。使用该工艺最终得到脱色的并去除大部分蛋白和小分子杂质的桦褐孔菌精制多糖，多糖保留率为61.8%以上，脱色率为73.2%，蛋白脱除率高达62.4%。本方法适合产业化规模化生产桦褐孔菌精制多糖。
除此在外，本发明的技术优势还体现在：1、采用木瓜蛋白酶处理粗多糖，提高了蛋白杂质的去除率（去除率高达到62.4%），提高了多糖的纯度；2、采用大孔树脂处理制备的精制多糖，无毒副作用，操作更加简便，纯化效果好，多糖保留率和得率高（分别高达61.8%和62.4%）。而Sevage法，所用氯仿有毒性，且回收不便，得率仅为48.9%；活性炭吸附法和过氧化氢法去除色素，均存在一定的缺陷，活性炭吸附法脱色时间长且多糖损失率较大（得率仅为48.6%），而且活性炭难以除去，过氧化氢脱色，对多糖的化学结构和生物活性破坏性极大。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案详加描述，但保护范围不被此限制。实施例中所用原料皆可从市场获得，桦褐孔菌野生菌核购自黑龙江微生物研究所；采用的树脂为无极性大孔吸附树脂，型号为DM301，购自上海蓝季科技发展有限公司，粒度直径为0.3-1.25mm，纯白色；本发明所用的蛋白酶为木瓜蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司。
实施例1 从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于4倍体积的60%乙醇溶液中浸泡16 h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加10倍蒸馏水（v/w），沸水提取1h， 80目纱布过滤，滤液浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为0.5%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3%（w/w），35℃反应20 min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔吸附树脂DM301处理是指，粗多糖的酶解液加入预处理（大孔吸附树脂DM301用无水乙醇浸泡24 h，并以无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无醇味）好的DM301树脂层析柱中，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.2︰1（w/v），流速控制在1.5 ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得桦褐孔菌多糖样品。
F.真空冷冻干燥:先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3 h，然后转入-80℃下冷冻6 h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例2 从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于8倍体积的95%乙醇溶液中浸泡24 h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加20倍蒸馏水（v/w），沸水提取3h， 120目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为2.0%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的5%（w/w），45℃反应40 min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔吸附树脂DM301处理：大孔吸附树脂DM301用无水乙醇浸泡24 h，并以无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无醇味。
粗多糖的酶解液加入预处理好的DM301树脂层析柱中，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=2.0︰1（w/v），流速控制在2.2 ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F.真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3 h，然后转入-80℃下冷冻6 h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例3 从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，其包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于7倍体积的90%乙醇溶液中浸泡20 h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加18倍蒸馏水（v/w），沸水提取2.5h，100目纱布过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为1.8%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.5%（w/w），42℃反应35 min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔吸附树脂DM301处理: 粗多糖的酶解液加入预处理（预处理方式与实施例1-2同）好的DM301树脂层析柱中，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.8︰1（w/v），流速控制在2ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F.真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3 h，然后转入-80℃下冷冻6 h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例4 从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于6倍体积的70%乙醇溶液中浸泡18 h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加13倍蒸馏水（v/w），沸水提取1.5h， 85目纱布过滤，提取1次，滤液浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为0.5%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3.5%（w/w）， 36℃反应25min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔吸附树脂DM301处理：粗多糖的酶解液加入预处理好的DM301树脂层析柱中，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.5︰1（w/v），流速控制在1.5 ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F.真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3 h，然后转入-80℃下冷冻6 h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例5 从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，其包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理:取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于6.5倍体积的80%乙醇溶液中浸泡20 h，以除去脂肪、部分寡糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加15倍蒸馏水（v/w），沸水提取2h，100目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解:将粗多糖加水溶解，配制为1.5%（w/w）的水溶液,加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.0%（w/w）, 40℃反应30min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔吸附树脂DM301处理: 粗多糖的酶解液加入预处理(所述的预处理是指，大孔吸附树脂DM301用无水乙醇浸泡24 h，并以无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无醇味)好的DM301树脂层析柱中，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.6︰1（w/v），流速控制在1.8 ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F.真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3 h，然后转入-80℃下冷冻6 h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
试验例 实施例5所得桦褐孔菌多糖多糖含量和蛋白含量的测定，以及蛋白脱除率、色素脱除率和多糖保留率的计算。其中多糖含量(%)=总糖的含量(%)-还原糖的含量(%)。
总糖含量测定采用苯酚-硫酸法；还原糖含量测定采用DNS法；蛋白含量测定采用Bradford法。
式中：A0、A1 分别为脱色前和脱色后溶液在波长450 nm 处的吸光度。
式中：C0、C1分别为脱色前和脱色后溶液在波长450 nm 处的吸光度。
式中：M0、M1分别为处理前后的多糖含量。
下面是大孔树脂DM301（本发明实施例5）与Sevage法、活性炭法和过氧化氢法精制桦褐孔菌粗多糖的结果比较，由此可以看出，大孔树脂D301G，兼具去除蛋白和色素的能力。见下表：
本发明从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法不仅可以去除蛋白，还兼具去除色素的能力，因此制备的多糖纯度较高，与处理之前的粗多糖相比较，色素脱除率为73.2%、蛋白脱除率为62.4%，多糖保留率61.8%。
本申请由山东省自然科学基金项目（ZR2010CL008）资助。
最后应说明的是，实施例只是本发明最优的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.从桦褐孔菌中提取制备桦褐孔菌多糖的方法，其特征是，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于4-8倍体积的60-95%乙醇溶液中浸泡16-24 h，以除去脂肪、部分单糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干；
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加10-20倍蒸馏水，v/w，沸水提取1-3h，80-120目纱布过滤，滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖；
C．粗多糖酶解：粗多糖加水溶解后配制为0.5-2.0 w/w %的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3-5 w/w %，35-45℃反应20-40 min，得粗多糖的酶解液；
D．大孔吸附树脂DM301处理：粗多糖的酶解液加入预处理好的DM301树脂层析柱中，按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.2-2.0︰1，w/v，流速控制在1.5-2.2 ml/min，收集流出液；所述的预处理是指，大孔吸附树脂DM301用无水乙醇浸泡24 h，并以无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无醇味；
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得桦褐孔菌多糖样品；
F．真空冷冻干燥；制备桦褐孔菌多糖：所述真空冷冻干燥是指，先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3 h，然后转入-80℃下冷冻6 h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤A：置于6-7倍体积的70-90%乙醇溶液中浸泡18-20 h，以除去脂肪、部分单糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤A：置于6.5倍体积的80%乙醇溶液中浸泡20 h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤B：加13-18倍蒸馏水，v/w，沸水提取1.5-2.5h， 85-100目纱布过滤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，步骤B：加15倍蒸馏水，v/w，沸水提取2 h，100目纱布过滤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤C：36-42℃反应25-35 min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是， 步骤C：40℃反应30 min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤C：粗多糖加水溶解后配制为0.6-1.8 w/w %的水溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是，步骤C：粗多糖加水溶解后配制为1.5 w/w %的水溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤C：木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3.5-4.5 w/w %。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征是，步骤C：木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.0 w/w %。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤D：按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.5-1.8︰1，w/v，流速控制在1.5-2 ml/min，收集流出液。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征是，步骤D：按照DM301树脂︰粗多糖酶解液=1.6︰1，w/v，流速控制在1.8 ml/min。
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