CN110272506A - 一种桦褐孔菌多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种桦褐孔菌多糖的提取方法，主要采用高压脉冲电场辅助复合酶提法，对桦褐孔菌粉末进行多次提取，克服了传统浸提法高温环境对桦褐孔菌多糖生物活性的影响，同时提高了桦褐孔菌多糖的提取率。
Description
技术领域
本发明属于多糖提取的技术领域，具体涉及一种桦褐孔菌多糖的提取方法。
背景技术
桦褐孔菌属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褐菌目，锈革孔菌科，褐卧孔菌属，目前桦褐孔菌的化学组成主要有羊毛脂烷型甾体类化合物、多糖类、多酚类、木质素类、黑色素、生物碱类、单宁化合物、叶酸衍生物以及芳香的香草酸和丁香酸等，桦褐孔菌是俄罗斯、波兰、日本等国的民间常用药物。目前，有关研究人员已对桦褐孔菌中的各类活性成分展开各项研究，希望将其逐渐的应用于恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、肝病及艾滋病等预防和治疗中。
桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌中重要的一种天然活性物质，具有多种生理功能且对人体无毒无害，因此近年来受到极大关注，有研究证实桦褐孔菌的菌丝和菌核中的多糖具有显著的降血糖作用，并且几乎无副作用，使其有望成为预防糖尿病和心血管疾病、增强免疫力的天然药物。
目前，多糖的常用提取方法除了传统的水提法外，超声法、酸提法、碱提法和酶提法等方法也常被用来提取多糖；水提法需要较高的温度容易破坏桦褐孔菌多糖的生物活性，同时存在提取时间长，提取效率低的缺点；酸提法和碱提法利用浓度梯度原理，令存在植物植物药纤维组织之内的有效成分逐步向提取溶剂中扩散，但是由于植物细胞壁存在的屏障作用，常常导致萃取时间过长，还会浪费大量提取溶剂，提取率较低，溶剂浸提的方法还可能是提取的多糖含有重金属等杂质。酶提法是近年来较为热门的方法，作为一种“仿生化提取”方法能够克服传统的高温煎煮对活性成分的影响，使整个提取工艺条件更加温和，显著提高多糖的提取效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桦褐孔菌多糖的提取方法，采用高压脉冲电场辅助复合酶提法，对桦褐孔菌进行多次提取，克服了传统浸提法高温环境对桦褐孔菌多糖生物活性的影响，同时提高了桦褐孔菌多糖的提取率。
本发明的技术方案如下：
一种桦褐孔菌多糖的提取方法，具体包括如下步骤：
(1)经过筛选的桦褐孔菌经冷冻干燥后打粉，得桦褐孔菌干粉；
(2)将桦褐孔菌干粉放入提取釜内，再向提取釜内加入90％的乙醇，回流提取2-4次，弃去上清液，余下的桦褐孔菌原料备用；
(3)经过步骤(2)处理得到的桦褐孔菌原料加入到纯化水中，调整悬浊液的pH为7.5～8.5，常温下超声处理2～4h后抽滤分离，分别获得提取液和浸提后的桦褐孔菌粉末，获得的提取液进行减压浓缩；
(4)在经过步骤(3)获得的浓缩提取液中加入复合酶混合物，进行一次酶解反应；
(5)将步骤(4)一次酶解反应后，含有复合酶混合物的浓缩提取液加入到步骤(3)中分离得到的浸提后桦褐孔菌中，进行二次酶解反应，二次酶解反应后抽滤分离得上清液和滤渣；
(6)将经过步骤(5)二次酶解反应后取得的上清液加入至滤渣中混合均匀进行再次提取，然后采用泵送的方式，将混合液经高压脉冲电场的处理后抽滤去沉淀，取的最终上清液；
(7)经过步骤(6)获得的上清液经过水浴蒸发浓缩后加入95％的乙醇溶液，静置后多糖成为絮状物沉淀，离心过滤后，收集沉淀物，真空干燥至恒重，即得最终的多糖产物。
进一步的，所述步骤(3)中料液比为20mL/g；步骤(5)和步骤(6)中料液比为10mL/g。
进一步的，所述步骤(4)中复合酶包括纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶中的两种或三种混合物。
进一步的，所述步骤(4)中复合酶混合物与浓缩提取液的比例为10～12mL:1mg。
进一步的，所述步骤(4)和(5)中酶解反应的具体操作过程为：首先在35～45℃的条件下进行酶解反应1～2h后迅速升温至45～55℃浸提1～2h。
进一步的，所述步骤(4)一次酶解反应，步骤(5)二次酶解反应以及步骤(6)高压脉冲电场复合酶解反应中混合溶液的pH均为6～10。
进一步的，所述步骤(6)中电场强度为10～30kV/cm，脉冲数为2～6。
进一步的，所述步骤(7)中加入的95％乙醇溶液与上清液的体积比为4～5:1，静置时间为6～8h，离心转速为4000～5000r/min，离心时间为6～9min，真空干燥温度为50～60℃。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明中采用多次酶解法对桦褐孔菌多糖进行提取，首由于多糖成分大多为细胞内产物，光靠机械破碎和常温水提无法从细胞内将大部分多糖活性成分提取出来，因此，本发明在传统的水提法结合超声辅助后结合高压脉冲电场辅助复合酶提法，对桦褐孔菌的提取液和滤渣都进行了多次提取，整个提取工艺反应条件温和，提取温度不超过55℃，多次酶解法能够在较低的温度下有效的破坏桦褐孔菌的细胞壁，实现低温条件下的多糖提取，不会对多糖活性造成影响，同时多次酶解法最大程度的保持了多糖的原有性质。
2、本发明在首次纯化水浸提的过程中将溶液的pH控制在7.5～8.5，主要由于桦褐孔菌中含有特定立体旋光结构的真菌类多糖，酸性条件下浸提会破坏糖苷键而令多糖降解为单糖和低聚糖，因此，在预提时将纯化水的pH调整为弱碱性，能够避免多糖的损失。在整个酶解过程中混合液均保持弱碱性状态，碱液可以使桦褐孔菌紧密的结构变得疏松，同时，弱碱环境对多糖具有增溶的作用。
3、本发明在水浸预提的阶段采用超声波辅助，能引起空化效应，对细胞壁有较大的破坏作用，有利于多糖的溶出，但是预提过程中多糖的纯度较低，纯化水也会使得重金属等杂质溶出；多次酶解提取采用具有针对性的复合酶，能够大幅度提高多糖提取效率和纯度。
4、本发明在酶解反应的同时利用高压脉冲电场辅助，高压脉冲电场能够使得极性溶剂在电场中运动速度加快，使更多的提取溶剂进入到细胞内，加速细胞壁破碎，从而使细胞内的物质更容易地渗透出来，另一方面，细胞内外的电场强度差异使细胞电极化而破坏细胞膜，使细胞内的物质被提起的更快更彻底，进而提高多糖的提取率。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行详细的说明。
实施例1
一种桦褐孔菌多糖的提取方法，具体包括如下步骤：
(1)经过筛选的桦褐孔菌经冷冻干燥后打粉，得桦褐孔菌干粉；
(2)将桦褐孔菌干粉放入提取釜内，再向提取釜内加入90％的乙醇，回流提取2次，弃去上清液，余下的桦褐孔菌原料备用；
(3)经过步骤(3)处理得到的桦褐孔菌原料加入到纯化水中，料液比为20mL/g，调整悬浊液的pH为7.5，常温下超声处理2h后抽滤分离，分别获得提取液和浸提后的桦褐孔菌，获得的提取液进行减压浓缩；
(4)在经过步骤(3)获得的浓缩提取液中加入纤维素酶和果胶酶的混合物，浓缩提取液和复合酶混合物比为10mL:1mg，调整混合液的pH为7，进行一次酶解反应；
(5)将步骤(4)一次酶解反应后，含有复合酶混合物的浓缩提取液加入到步骤(3)中分离得到的浸提后桦褐孔菌中，料液比为10mL/g，调整混合物的pH为7，进行二次酶解反应，二次酶解反应后抽滤分离得上清液和滤渣；
(6)将经过步骤(5)二次酶解反应后取得的上清液再次加入至滤渣中混合均匀进行再次提取，料液比为10mL/g，调整混合液的pH为7，然后采用泵送的方式，将混合液经高压脉冲电场的处理后抽滤去沉淀，取的最终上清液；其中，电场强度为10kV/cm，脉冲数为3；
(7)经过步骤(6)获得的上清液经过水浴蒸发浓缩后加入95％的乙醇溶液，95％乙醇溶液与上清液的体积比为4:1，静置6h后多糖成为絮状物沉淀，以4000r/min离心6min后，收集沉淀物，在50℃条件下真空干燥至恒重，即得最终的多糖产物。
进一步的，所述步骤(4)和(5)中酶解反应的具体操作过程为：首先在35～45℃的条件下进行酶解反应1～2h后迅速升温至45～55℃浸提1～2h。
实施例2
一种桦褐孔菌多糖的提取方法，具体包括如下步骤：
(1)经过筛选的桦褐孔菌经冷冻干燥后打粉，得桦褐孔菌干粉；
(2)将桦褐孔菌干粉放入提取釜内，再向提取釜内加入90％的乙醇，回流提取4次，弃去上清液，余下的桦褐孔菌原料备用；
(3)经过步骤(3)处理得到的桦褐孔菌原料加入到纯化水中，料液比为20mL/g，调整悬浊液的pH为8.5，常温下超声处理4h后抽滤分离，分别获得提取液和浸提后的桦褐孔菌，获得的提取液进行减压浓缩；
(4)在经过步骤(3)获得的浓缩提取液中加入果胶酶和木瓜蛋白酶混合物，浓缩提取液和复合酶混合物比为11mL:1mg，调整混合液的pH为9，进行一次酶解反应；
(5)将步骤(4)一次酶解反应后，含有复合酶混合物的浓缩提取液加入到步骤(3)中分离得到的浸提后桦褐孔菌中，料液比为10mL/g，调整混合物的pH为9，进行二次酶解反应，二次酶解反应后抽滤分离得上清液和滤渣；
(6)将经过步骤(5)二次酶解反应后取得的上清液再次加入至滤渣中混合均匀进行再次提取，料液比为10mL/g，调整混合液的pH为9，然后采用泵送的方式，将混合液经高压脉冲电场的处理后抽滤去沉淀，取的最终上清液；其中，电场强度为30kV/cm，脉冲数为4；
(7)经过步骤(6)获得的上清液经过水浴蒸发浓缩后加入95％的乙醇溶液，95％乙醇溶液与上清液的体积比为5:1，静置8h后多糖成为絮状物沉淀，以5000r/min离心8min后，收集沉淀物，在60℃条件下真空干燥至恒重，即得最终的多糖产物。
进一步的，所述步骤(4)和(5)中酶解反应的具体操作过程为：首先在35～45℃的条件下进行酶解反应1～2h后迅速升温至45～55℃浸提1～2h。
实施例3
一种桦褐孔菌多糖的提取方法，具体包括如下步骤：
(1)经过筛选的桦褐孔菌经冷冻干燥后打粉，得桦褐孔菌干粉；
(2)将桦褐孔菌干粉放入提取釜内，再向提取釜内加入90％的乙醇，回流提取3次，弃去上清液，余下的桦褐孔菌原料备用；
(3)经过步骤(3)处理得到的桦褐孔菌原料加入到纯化水中，料液比为20mL/g，调整悬浊液的pH为8，常温下超声处理3h后抽滤分离，分别获得提取液和浸提后的桦褐孔菌，获得的提取液进行减压浓缩；
(4)在经过步骤(3)获得的浓缩提取液中加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶混合物，浓缩提取液和复合酶混合物比为12mL:1mg，调整混合液的pH为10，进行一次酶解反应；
(5)将步骤(4)一次酶解反应后，含有复合酶混合物的浓缩提取液加入到步骤(3)中分离得到的浸提后桦褐孔菌中，料液比为10mL/g，调整混合物的pH为10，进行二次酶解反应，二次酶解反应后抽滤分离得上清液和滤渣；
(6)将经过步骤(5)二次酶解反应后取得的上清液再次加入至滤渣中混合均匀进行再次提取，料液比为10mL/g，调整混合液的pH为10，然后采用泵送的方式，将混合液经高压脉冲电场的处理后抽滤去沉淀，取的最终上清液；其中，电场强度为20kV/cm，脉冲数为6；
(7)经过步骤(6)获得的上清液经过水浴蒸发浓缩后加入95％的乙醇溶液，95％乙醇溶液与上清液的体积比为4:1，静置7h后多糖成为絮状物沉淀，以4500r/min离心9min后，收集沉淀物，在55℃条件下真空干燥至恒重，即得最终的多糖产物。
进一步的，所述步骤(4)和(5)中酶解反应的具体操作过程为：首先在35～45℃的条件下进行酶解反应1～2h后迅速升温至45～55℃浸提1～2h。
对比实施例
授权公告号为CN1279061C的专利公开的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，以无霉变、烘干的桦褐孔菌破碎成玉米粒大小，再把粉碎后的桦褐孔菌加入乙醇浸泡然后把去掉上清液的原料倒入提取缸里加水加热提取后6层细纱进行第一次过滤，沉渣再加入水加热提取2～3h后进行第二次过滤，再往过滤后的沉渣倒入水，加热提取2～3h后进行第三次过滤，合并三次过滤液真空减压浓缩，然后倒入洁净容器中冷却，冷却后的浓缩液里加入乙醇进行充分搅拌、静置20h，沉降物进行离心分离，将分离后的多糖粘稠膏状物薄铺在平盘上，晾干、进行自然干燥得桦褐孔菌多糖。
分析测试：
桦褐孔菌多糖含量测定方法：苯酚-硫酸比色法
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比实施例 | |
| 多糖提取率(％) | 42.3 | 41.6 | 43.8 | 1.99 |
| 多糖纯度(％) | 27.2 | 26.8 | 26.1 |
综上所述，采用水浸预提加高压脉冲电场辅助多次酶解的方法提取桦褐孔菌中的多糖，其中多糖的提取率平均为42.6％，多糖纯度平均为26.7％，相较于传统的水提法，多糖的提取率和纯度都有较大幅度的提升。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）经过筛选的桦褐孔菌经冷冻干燥后打粉，得桦褐孔菌干粉；
（2）将桦褐孔菌干粉放入提取釜内，再向提取釜内加入90%的乙醇，回流提取2-4次，弃去上清液，余下的桦褐孔菌原料备用；
（3）经过步骤（2）处理得到的桦褐孔菌原料加入到纯化水中，调整悬浊液的pH为5.0~5.5，常温下超声处理6~8h后抽滤分离，分别获得提取液和浸提后的桦褐孔菌，获得的提取液进行减压浓缩；
（4）在经过步骤（3）获得的浓缩提取液中加入复合酶混合物，进行一次酶解反应；
（5）将步骤（4）一次酶解反应后，含有复合酶混合物的浓缩提取液加入到步骤（3）中分离得到的浸提后桦褐孔菌中，进行二次酶解反应，二次酶解反应后抽滤分离得上清液和滤渣；
（6）将经过步骤（5）二次酶解反应后取得的上清液加入至滤渣中混合均匀进行再次提取，然后采用泵送的方式，将混合液经高压脉冲电场的处理后抽滤去沉淀，取的最终上清液；
（7）经过步骤（6）获得的上清液经过水浴蒸发浓缩后加入95%的乙醇溶液，静置后多糖成为絮状物沉淀，离心过滤后，收集沉淀物，真空干燥至恒重，即得最终的多糖产物。
2.如权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中料液比为20mL/g；所述步骤（5）和步骤（6）中料液比为10mL/g。
3.如权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（4）中复合酶包括纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶中的两种或三种混合物。
4.如权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（4）中复合酶混合物与浓缩提取液的比例为10~12mL:1mg。
5.如权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（4）和（5）中酶解反应的具体操作过程为：首先在50~60℃的条件下进行酶解反应1~2h后迅速升温至70~80℃浸提1~2h。
6.如权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（4）一次酶解反应，步骤（5）二次酶解反应以及步骤（6）高压脉冲电场复合酶解反应中混合溶液的pH均为7~10。
7.如权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（6）中电场强度为10~30kV/cm，脉冲数为2~6。
8.如权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（7）中加入的95%乙醇溶液与上清液的体积比为4~5:1，静置时间为6~8h，离心转速为4000~5000r/min，离心时间为6~9min，真空干燥温度为50~60℃。
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