CN108395487B - 一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法及其设备 - Google Patents

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Abstract

一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，其特征在于它的制作步骤为：1)将灵芝原药材粉碎成10~30目灵芝颗粒，2）将粉碎后的灵芝颗粒投入高压超临界萃取装置的萃取罐中，密封，打开高压泵通CO2，升压至600~2000bar，温度40~60℃，静态萃取30~60min，打开微调阀门，动态萃取，分离罐压力80~120bar，温度30~50℃，控制CO2流量10~16kg/h条件下，循环萃取2~4h；3）水萃取：CO2萃取结束后，向萃取罐加水，加温到70~80℃，通入CO2升压到80~100bar，保压萃取1.5~3h，真空浓缩、冷冻干燥得到浅棕色的灵芝多糖。本发明萃取分离方法简单，适宜于工业化生产，所得灵芝多糖萃取物具有强的抗肿瘤活性。

Description

一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法及其设备
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，属于食药用菌的深加工领域，特别是高压超临界CO2的萃取除杂而增加灵芝多糖抗肿瘤活性的方法。
背景技术
灵芝又称瑞草、仙草，性平味甘，为我国名贵的传统中药，中华传统医学长期以来一直视为滋补强身、固本扶正的珍贵中草药。灵芝的成分非常丰富，包括灵芝多糖、三萜及甾醇类化合物、核苷、蛋白质以及微量元素等十几种，其中灵芝多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗衰老、清除自由基、降血糖等功效，近年来一直是人们研究的重点。
在传统的萃取工艺中，灵芝多糖萃取方法主要是热水萃取法、酸碱法和酶法浸提。传统热水萃取法通常是：称取粉碎成10～30目的灵芝颗粒1kg，投入到萃取罐中，加入12倍量水，100℃沸水，循环回流萃取2.5小时，过滤，滤渣再加入10倍量水，100℃沸水，循环回流萃取2小时，共萃取2次，合并滤液，真空浓缩、冷冻干燥得到灵芝多糖萃取物。由于灵芝子实体由纤维素和木质素构成，结构致密，而灵芝多糖多附着于细胞壁、细胞内，较难渗出，水浸提工艺简单，萃取的主要是胞外多糖，得率较低，萃取物中含有色素等杂质较多，呈黄褐色，纯度较低。酸碱萃取法可能会对灵芝多糖的结构及其药用活性有影响，萃取物中也难免有残留成分或新生成复杂的成分。中国专利CN200910007918“一种萃取灵芝菌丝体胞内多糖的工艺和方法”，采用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶除去胞壁合膜上的果胶、纤维素及蛋白质等成分，使胞内多糖的溶出，从而提高多糖的萃取率，但由于萃取过程中加入酶，不仅生产成本提高，同时也给产物的分离纯化增加了困难。
传统热水提法获得的灵芝萃取物中含有色素、蛋白及小分子杂质，使得多糖颜色深褐色且多糖含量不高，现有的脱色、脱蛋白技术较为复杂。中国专利CN201510541581“灵芝多糖的萃取方法”通过灵芝乙醇萃取脱脂后，将滤渣再用水萃取，滤液依次用乙醇沉淀、丙酮洗涤、活性炭脱色获得灵芝多糖。该发明将灵芝水萃取液浓缩到一定体积后，加入乙醇进行醇沉以去除其中的单糖，提高多糖纯度，但在醇沉过程中由于单糖会连同多糖一起被醇沉下来，单糖去除率较低，需要多次重复醇沉，耗费乙醇和人工，生产成本较高。中国专利CN03113450“赤灵芝多糖及其制备和用途”，通过加入氯仿和正丁醇有机溶剂除去蛋白，再透析得到灵芝多糖，但该法会造成有害有机溶剂的残留，且多糖损失大得率低，工序复杂，不利于规模化生产。
超临界CO2萃取技术，经过50多年来的快速发展，现已在医药、食品、材料、化学化工、无水印染和环境保护等许多领域获得广泛应用。目前，超临界CO2萃取压力大都在300bar少数达到500bar，在这种压力下，CO2的密度比较低，通常只能萃取脂溶性成分。为了提高萃取率，增加萃取低极性成分，通常采用加入极性夹带剂—乙醇，以提高超临界CO2的极性达到萃取低极性成分的能力，但是乙醇加入后，要把乙醇从萃取物中分离出去，则会引来新的问题并增加成本，使该方法应用受到限制。
传统常规萃取设备如图1所示，它包括二氧化碳钢瓶1，二氧化碳储罐2，萃取罐3，分离罐4，加热外套5，管道和微调阀门7，CO2流量控制阀8，热交换器Ⅰ9，高压泵10，热交换器Ⅱ11，阀门12，收集阀门13。二氧化碳储罐2通过管道与二氧化碳钢瓶1连接，萃取罐3通过微调阀门7和管道与分离罐4连接，二氧化碳储罐、热交换器Ⅰ，高压泵，热交换器Ⅱ，阀门12，萃取罐通过管道顺序相接，分离罐的下方设计有收集阀门13，萃取灵芝三萜，收集灵芝三萜萃取液，真空浓缩得灵芝三萜萃取物。第二步是在三萜萃取完成后，减压放空CO2，打开萃取罐，取出萃取三萜后灵芝粉(渣)，倒入如图2所示的常压提取罐中，加水，100℃，提取，真空浓缩、冷冻干燥得到灵芝多糖提取物。
常压的提取罐由罐体21、搅拌器23、提取液流出阀16构成。
发明内容
针对上述技术及工艺萃取多糖纯度及活性低等问题，本发明对灵芝萃取技术工艺进行创新，提供一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，不仅提高灵芝多糖的得率和纯度，并具有良好的抗肿瘤功效。
本发明所采用的技术方案为一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，其要点在于它的制作步骤为：1)将灵芝原药材粉碎成10～30目的灵芝颗粒，2)高压超临界CO2萃取脱除杂质：将粉碎后的灵芝颗粒投入超临界萃取装置的萃取罐中，密封，打开高压泵通入二氧化碳，升高压力600～2000bar，温度为40～60℃，静态萃取30～60min，然后打开微调阀门，进行动态萃取，在分离罐压力80～120bar，温度30～50℃，控制CO2流量10～16kg/h条件下，循环萃取2～4h，将灵芝细胞结构内油脂、三萜和色素等脂溶性成分及部分低极性成分脱除掉，形成许多“空穴”，结构更加疏松，卸压排空二氧化碳使灵芝细胞内外压差激烈膨胀而发生破壁；3)水萃取：CO2萃取结束后，向萃取罐加入重量等于所加灵芝颗粒重量3～6倍量的洁净水，加温到70～80℃，通入CO2升压到80～100bar，保压萃取1.5～3h，真空浓缩、冷冻干燥得到浅棕色的灵芝多糖。
其提取的灵芝多糖为浅棕色，易溶于水。
其超临界二氧化碳萃取过程中最佳参数调节为萃取压力1050bar，萃取温度40℃，静态萃取30min，然后，在CO2流量12kg/h，动态萃取时间2h。
一种灵芝多糖的萃取装置，它包括二氧化碳钢瓶、二氧化碳储罐、萃取罐、分离罐、管道、微调阀门、热交换器Ⅰ、高压泵、热交换器Ⅱ、阀门、收集阀门，其要点在于它还具有洁净水储罐、水泵、提取液流出阀，洁净水储罐通过管道和水泵与萃取罐连接，在萃取罐的下方设计有提取液流出阀。
萃取罐可耐压600～2000bar，高压泵可升压到600～2000bar。
本发明是在常规超临界CO2的萃取设备基础上进行革新改进，即在萃取罐连接管路中，增加了洁净水储罐、水泵、提取液流出的阀门，使萃取罐在完成灵芝三萜萃取后能同时作为灵芝多糖的提取罐，一罐两用，使整套设备可在线提取灵芝三萜和灵芝多糖。特别是在提取多糖时由于萃取罐内有CO2能隔绝氧，可免除提取过程中多糖被氧化，保护了多糖活性不被破坏，提取出灵芝多糖的抗肿瘤活性高。
与传统技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1、本发明工艺过程简单，生产成本低，利用高压超临界CO2萃取技术，当萃取压力达到600-1000bar及以上，CO2的密度高，不需要添加乙醇夹带剂，就能将灵芝细胞结构内油脂等脂溶性成分和三萜、色素等低极性成分萃取出来，脱除掉，形成显著的多孔结构，出现许多“空穴”，纤维结构疏松，渗透性增加，通过卸压对灵芝细胞进行破壁处理。萃取罐卸压到常压时，由于萃取罐内CO2能隔绝氧，免除萃取过程中多糖被氧化，提高了萃取多糖的抗肿瘤活性，将破壁后的灵芝颗粒加入一定比例的水，通入CO2升压到80～100bar，保压萃取出灵芝多糖，不仅萃取率高，纯度高，而且有良好的抗肿瘤功效。
2、超临界CO2作为介质，在高压下，容易渗入到灵芝细胞内，卸压后，细胞内外压差变大，激烈膨胀而破裂，达到破壁效果。
3、通入CO2升压到80～100bar保压水萃取，在压力的作用下，水溶剂与灵芝多糖的充分接触，促进其溶出，借助高压原理，加入少量水即能获得高萃取率，避免了类似传统萃取法料液比大造成能耗多的问题。
4、本发明方法萃取得到的灵芝多糖与传统热水萃取技术相比，萃取率提高20～30％，纯度提高20～45％，对小鼠肝癌H22皮下瘤的抑瘤率提高了1.5～1.8倍，抗肿瘤活性获得显著提高。
附图说明
图1为现有常规超临界CO2萃取设备原理示意图
图2为现有常压提取罐的结构示意图
图3为本发明在线高压超临界CO2萃取设备原理示意图
其中：1.二氧化碳钢瓶 2.二氧化碳储罐 3.萃取罐 4.分离罐 5.加热外套 7.微调阀门 8.CO2流量控制阀 9.热交换器Ⅰ 10.高压泵 11.热交换器Ⅱ 12.阀门 13.收集阀门 14.洁净水储罐 15.水泵 16.提取液流出阀 21罐体 23搅拌器。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的技术人员更理解本发明，但不以任何形式限制本发明。本发明对比传统技术萃取法，经过定量检测，本发明的灵芝多糖萃取得率及纯度提高，抗肿瘤效果好，更好地利用了原料资源。
灵芝多糖纯度的检测方法：使用《灵芝[M].中华人民共和国药典2015版第一部:188～189》中记载的蒽酮-硫酸法对本发明中灵芝水萃取物的灵芝多糖的含量进行检测。
本发明的萃取装置是在传统常规萃取设备基础上进行改进，在萃取罐上增加了洁净水储罐14，水泵15，提取液流出阀16，使整套设备可直接进行灵芝的水萃取，具有结构简单，所用设备少、占地少，加工过程简单等优点。即一种灵芝多糖的萃取设备，它包括二氧化碳钢瓶1、二氧化碳储罐2、萃取罐3、分离罐4、管道、微调阀门7、热交换器Ⅰ9、高压泵1O、热交换器Ⅱ11、阀门12、收集阀门13、洁净水储罐14、水泵15、提取液流出阀16，二氧化碳储罐2通过管道与二氧化碳钢瓶1连接，萃取罐3通过微调阀门7、管道与分离罐4连接。二氧化碳储罐、热交换器Ⅰ9、高压泵10、热交换器Ⅱ11、阀门12与萃取罐3通过管道顺序相接，灵芝三萜提取液通过收集阀门13放出，洁净水储罐通过管道和水泵与萃取罐3连接，在萃取罐的下方设计有提取液流出阀16，灵芝多糖提取液通过提取液流出阀放出。萃取罐3耐压要达到600～2000bar，高压泵10的升压要能达到600～2000bar，其余未述部分与现有技术相同。
一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，它的制备步骤为：1)将灵芝原药材粉碎成10～30目的灵芝颗粒，2)高压超临界CO2萃取脱除杂质：将粉碎后的灵芝颗粒投入超临界萃取装置的萃取罐3中，密封，打开高压泵通入二氧化碳，升高压力600～2000bar，温度为40～60℃，静态萃取30～60min，然后打开微调阀门，进行动态萃取，在分离罐压力80～120bar，温度30～50℃，控制CO2流量10～16kg/h条件下，循环萃取2～4h，将灵芝细胞结构内油脂、三萜和色素等脂溶性成分及部分低极性成分脱除掉，由分离罐下方的收集阀门13排出，同时卸压排空二氧化碳使灵芝细胞内外压差激烈膨胀而发生破壁，灵芝颗粒内部形成许多“空穴”，结构更加疏松；3)水萃取：CO2萃取结束后，关闭CO2系统(关闭微调阀门7、阀门12)，利用水泵15向萃取罐加入重量等于所加灵芝颗粒重量3～6倍量的洁净水，加温到70～80℃，通入CO2升压到80～100bar，保压萃取1.5～3h，由提取液流出阀16收取萃取液，萃取液经真空浓缩、冷冻干燥得到浅棕色的灵芝多糖。
实施例1：一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，灵芝原药材粉碎成10～30目的灵芝颗粒1kg，投入到超临界CO2萃取装置的萃取罐中，密封，通入超临界二氧化碳，在压力650bar，温度为60℃条件下，静态萃取30min，然后打开高压泵和阀门，进行动态萃取，调节分离罐压力80bar，温度30℃，控制CO2流量10kg/h，如此循环萃取3.0h之后，从分离罐收集到油脂、三萜和色素等脂溶性和部分低极性成分的混合物。停止萃取，打开排气阀快速卸压，CO2萃取结束后，再向萃取罐加入4kg的洁净水，加温到70～80℃，通入CO2升压到80～100bar，保压萃取3小时，所得的萃取液经真空浓缩、冷冻干燥得到灵芝多糖萃取物，灵芝多糖为浅棕色，易溶于水，采用蒽酮硫酸法检测灵芝多糖纯度为30.17％
实施例2：一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的技术及其制备方法，将灵芝原药材粉碎成10～30目的灵芝颗粒1kg，投入到超临界CO2萃取装置的萃取罐中，密封，通入超临界二氧化碳，在压力850bar，温度为50℃条件下，静态萃取30min，然后打开高压泵和阀门，进行动态萃取，调节分离罐压力100bar，温度50℃，控制CO2流量12kg/h，如此循环萃取4.0h之后，从分离罐收集到油脂、三萜和色素等脂溶性和部分低极性成分的混合物。停止萃取，打开排气阀快速卸压，CO2萃取结束后，再向萃取罐加入5kg的洁净水，加温到70～80℃，通入CO2升压到80～100bar，保压萃取3小时，所得的萃取液经真空浓缩、冷冻干燥得到灵芝多糖萃取物。灵芝多糖为浅棕色，易溶于水，采用蒽酮硫酸法检测灵芝多糖纯度为40.32％
实施例3：一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的技术及其制备方法，将灵芝原药材粉碎成10～30目左右的灵芝颗粒1kg，投入到超临界CO2萃取装置的萃取罐中，密封，通入超临界二氧化碳，在压力1050bar，温度为40℃条件下，静态萃取30min，然后打开高压泵和阀门，进行动态萃取，调节分离罐压力120bar，温度40℃，控制CO2流量14kg/h，如此循环萃取2.0h之后，从分离罐收集到油脂、三萜和色素等脂溶性和部分低极性成分的混合物。停止萃取，CO2萃取结束后，再向萃取罐加入6kg的洁净水，加温到70～80℃，通入CO2升压到80～100bar，保压萃取3小时，萃取液经真空浓缩、冷冻干燥得到灵芝多糖萃取物。灵芝多糖为浅棕色，易溶于水，采用蒽酮硫酸法检测灵芝多糖纯度为44.45％
为了进一步验证本灵芝多糖萃取物的抗肿瘤效果，将由实施实例1、2、3获得的灵芝多糖萃取物与未经过超临界的热水萃取的灵芝多糖萃取物(对比例)进行活性实验对比。
实验步骤：取对数生长期的鼠源肝癌腹水H22细胞，用PBS洗两遍去除含有的血细胞，稀释1000倍用细胞计数板计数，配成200万/ml细胞悬液，0.2ml/只接种于清洁级ICR小鼠右前臂处，随机分组，每组10只小鼠。阴性对照组给予生理盐水，阳性组为环磷酰胺(30mg/kg，qod)，药物组分别为灵芝(未经过超临界)多糖萃取物150mg/kg、灵芝超临界萃取(650bar)余渣多糖萃取物150mg/kg、灵芝超临界萃取(850bar)余渣多糖萃取物150mg/kg、灵芝超临界萃取(1050bar)余渣多糖萃取物150mg/kg，连续给药7天后，颈椎脱臼处死，剥取瘤块称瘤重，计算抑瘤率(％)。
实验结果：超临界萃取余渣多糖萃取物在浓度为150mg/kg，对小鼠肝癌H22皮下瘤具有明显的抑制作用，而且压力增大，抑瘤率增大，在650bar、850bar、1050bar抑瘤率分别为29.27％(p<0.05)、30.65％(p<0.05)、33.95％(p<0.05)，比未经过超临界萃取的灵芝多糖萃取物18.82％高，而阳性对照环磷酰胺的抑瘤率69.52％。(见表1)
Figure BDA0001651992530000051

Claims (3)

1.一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，其特征在于它的制作步骤为：1)将灵芝原药材粉碎成10~30目的灵芝颗粒，2）高压超临界CO2萃取脱除杂质：将粉碎后的灵芝颗粒投入高压超临界萃取装置的萃取罐中，密封，打开高压泵通入二氧化碳，升高压力至600~2000bar，温度为40~60℃，静态萃取30~60min，然后打开微调阀门，进行动态萃取，在分离罐压力80~120bar，温度30~50℃，控制CO2流量10~16kg/h条件下，循环萃取2~4h，将灵芝细胞结构内脂溶性的油脂、三萜和色素及低极性成分脱除掉；3）水萃取：CO2萃取结束后，向萃取罐加入重量等于所加灵芝颗粒重量3~6倍量的洁净水，加温到70~80℃，通入CO2升压到80~100bar，保压萃取1.5~3h，真空浓缩、冷冻干燥得到浅棕色的灵芝多糖。
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，其特征在于其超临界二氧化碳萃取过程中的参数为萃取压力1050bar，萃取温度40℃，静态萃取30min，然后，在CO2流量12kg/h，动态萃取时间2h。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤活性高的灵芝多糖的制备方法，其特征在于其萃取的灵芝多糖为浅棕色，溶于水。
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