CN110218717B - 一种灵芝多糖的制备方法及其对超氧化物歧化酶干燥失活的保护作用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灵芝多糖的制备方法及其对超氧化物歧化酶(SOD)干燥失活的保护作用。本发明首次公开了灵芝多糖在干燥环境中可有效地保护SOD活性的作用，当多糖分子量在10000～20000，在相对湿度为10％的干燥环境下放置4小时后，灵芝多糖可使SOD的活力保持在80％以上；且随着灵芝多糖使用量的增加，对SOD的保护作用也增强。本发明还提供了制备灵芝多糖的方法，采用超临界CO2萃取法，可有效地去除脂溶性成分，可保持灵芝多糖的天然结构，且操作简便，成本较低。本发明同时提供了一种保持或提高干燥环境下SOD的方法，可为在化妆品、药品或食品的应用中的SOD保持活性提供新的思路和方法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂研发技术领域，特别涉及一种灵芝多糖的制备方法及其对超氧化物歧化酶干燥失活的保护作用。
背景技术
灵芝(Ganoderma Lucidum)来源于担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是我国的名贵中药材，拥有数千年药用历史。扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效早在《神农本草经》中就有记载。现代药理学研究表明，灵芝具有抗肿瘤、增强免疫、保肝和促进睡眠等多种重要药理作用。1)抗肿瘤作用：中国专利文献 CN2015105805942公开了一种全灵芝抗肿瘤软胶囊及其制备方法；中国专利文献 CN2004100339286公开了灵芝抗肿瘤注射剂及其供试品的制备方法。2)保肝作用：中国专利文献CN2011101246378公开了一种灵芝保肝茶及其制备方法；中国专利文献CN2015101375733公开了一种缓解化学性肝损伤的中药组合物、其制备方法及中药制剂。3)增强免疫作用：中国专利文献CN2015107562748公开了一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。4)促进睡眠作用：中国专利文献 CN2004100061980公开一种用于预防、改善或治疗失眠症的灵芝多糖组合物等。
灵芝富含多糖，这类成分近年来逐渐受到研究人员的重视。灵芝多糖的多种富集方法被报道。例如中国专利文献CN201811446626X公开了一种低农残灵芝多糖提取物及其制备方法：取灵芝药材粉碎成粗粉后热水回流提取，过滤，减压浓缩，得浓缩液；醇沉：向浓缩液中加入乙醇，搅拌，室温静置，抽滤；然后进行吸附和萃取。中国专利文献CN2018115123430公开了一种灵芝子实体提取灵芝多糖工艺：将所述灵芝子实体颗粒放置在盐酸中浸泡；将经过盐酸浸泡的灵芝子实体颗粒进行高压保温；从经过高压保温的灵芝子实体颗粒中提取灵芝多糖。中国专利文献CN2012105578131公开了一种灵芝多糖的提取方法及应用：采用超声波结合酶法(真菌酸性蛋白酶)提取灵芝多糖，灵芝粉碎后，通过提取、超滤、浓缩和乙醇沉淀分离获得灵芝多糖。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是在进化过程中形成的广泛存在于生物体内的有效清除活性氧的主要酶类之一，它在抗氧化防御中发挥最重要的作用，可以催化超氧化物自由基生成H2O2和O2，对于清除氧自由基、防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十分重要的作用。
SOD根据其辅基部位结合的不同金属离子分为三类：锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)，铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和铜锌超氧化物歧化酶 (Cu/Zn-SOD)。Fe-SOD主要存在于植物细胞中的叶绿体中，Cu/Zn-SOD主要位于细胞质中，而Mn-SOD定位于线粒体。Mn-SOD的酶活性不受H2O2和KCN 的抑制，而氰化物、H2O2等可抑制Cu/Zn-SOD的活力，H2O2也可以影响Fe-SOD 的活性。因此Mn-SOD被认为是抵御氧化压力的第一线，Mn-SOD的抗氧化应激、抗癌、抗辐射的潜力较Cu/Zn-SOD、Fe-SOD高。
超氧化物歧化酶在抗氧化、防辐射、抗衰老、防治肿瘤等方面显示出独特的功能，目前其生产方法和在医药、食品及化妆品领域得到越来越广泛的应用都受到关注。例如中国专利文献CN2016101325052公开了一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法；中国专利文献CN2010106049579公开了一种抗衰老、降压、降脂SOD药物组合物及其制备方法。
然而，超氧化物歧化酶的稳定性不好，尤其在干燥环境中，其活性迅速降低；这对SOD的应用造成了限制；例如，对于应用于化妆品中的SOD，在秋、冬干燥季节，如果长时间暴露在干燥空气中，面霜中的SOD容易失活而不能发挥抗氧化作用。因此，寻找一种有效的、能在干燥环境中保护SOD活性的物质具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供灵芝多糖作为干燥环境下超氧化物歧化酶的保护剂的用途。
本发明的另一目的在于提供一种保持或提高干燥环境下超氧化物歧化酶活性的方法。
本发明的又一目的在于提供所述的灵芝多糖的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种含有超氧化物歧化酶的化妆品、药品或食品。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
灵芝多糖作为干燥环境下超氧化物歧化酶(SOD)的保护剂的用途，发明人首次发现了灵芝多糖在干燥环境中可有效地保护SOD的活性。
所述的灵芝多糖优选为分子量大于5000的灵芝多糖；进一步优选为大于 10000的灵芝多糖，更优选为分子量为10000～20000的灵芝多糖。
所述的超氧化物歧化酶包括：锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)中的至少一种。
所述的干燥环境的相对湿度可低至10％。
一种保持或提高干燥环境下超氧化物歧化酶活性的方法，将灵芝多糖与超氧化物歧化酶混合后保存。
所述的灵芝多糖与超氧化物歧化酶优选按重量比(0.5～2):1混合，进一步优选按重量比(1～2):1混合；更优选按重量比2:1进行混合。
所述的灵芝多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)灵芝粉碎，得到灵芝粉；
(2)灵芝粉用超临界CO2提取，其中，以绝对乙醇为夹带剂，通过此步，去除脂溶性物质；
(3)将步骤(2)提取后剩余的灵芝粉用水提取，得到水提取液；
(4)将步骤(3)得到的水提取液进行超滤，收集透过液部分；
(5)将步骤(4)得到的透过液进行浓缩，得到浓缩液；
(6)在步骤(5)得到的浓缩液中加入乙醇，混均后静置，过滤，收集沉淀物，干燥后即得所述的灵芝多糖。
步骤(1)所述的粉碎优选为粉碎至可过100目筛。
步骤(2)中所述的绝对乙醇按体积比1～5％进行添加。
步骤(2)中所述的超临界条件CO2萃取条件为：萃取压力25～30MPa、萃取温度300～320K、CO2流量12～18L/h，萃取时间120～150min；更优选为萃取压力30MPa、萃取温度320K、CO2流量15L/h，萃取时间150min。
步骤(2)中所述的CO2的用量优选为灵芝粉体积的8～10倍。
步骤(3)中所述的水优选为去离子水、蒸馏水或超纯水；所述的水的添加量优选为灵芝粉体积的8～10倍。
步骤(3)中所述的提取优选为超声提取；所述的超声的时间优选为每次1～ 2小时，重复次数优选为2～3次。
步骤(4)中所述的超滤的超滤膜的截留分子量优选为至少5000道尔顿；所述的超滤膜的截留分子量更优选为20000、10000、5000道尔顿的一种或至少两种。
步骤(5)中所述的浓缩优选为真空浓缩；所述的浓缩优选浓缩至原来体积的1/5～1/3。
步骤(6)中所述的乙醇的添加量优选为使乙醇终浓度达到体积百分比60～ 80％。
步骤(6)中所述的静置的时间优选为12小时。
步骤(6)中所述的干燥优选为冷冻干燥。
一种含有超氧化物歧化酶的化妆品、药品或食品，含有灵芝多糖，所述的灵芝多糖为超氧化物歧化酶在干燥环境下的保护剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次提出了灵芝多糖在干燥环境中可有效地保护SOD的活性。
(2)在多糖纯化方面，本发明采用超临界CO2萃取法，可有效地去除脂溶性成分，可保持灵芝多糖的天然结构，且费用低。已报道的酸水提取法会破坏多糖结构(中国专利文献CN2018115123430)；酶辅助提取法(中国专利文献 CN2012105578131)，酶的用量多因而成本较高。
附图说明
图1是灵芝多糖对在干燥环境中的Mn-SOD的活力的保护作用结果分析图。
图2是灵芝多糖对在干燥环境中的Cu/Zn-SOD的活力的保护作用结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所用的超氧化物歧化酶有两种，其中，铜锌超氧化物歧化酶购自上海江莱生物科技有限公司，锰超氧化物歧化酶为本实验室表达和纯化制得。
实施例1人锰超氧化物歧化酶的来源与保存
(1)用PCR扩增人锰超氧化物歧化酶基因
以293T细胞(购自中国科学院细胞库，293T/17人胚肾细胞)的cDNA为模板，PCR扩增目的片断。PCR正向引物：5’-AAGCACAGCCTCCCCGACCT-3’；反向引物：5’-TTATCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGCTTTTTGCAAGCCA TGTATCTTTC-3’。PCR反应体系为:10×buffer 8μL,25mmol/L MgSO4 4μL,10 mmol/L dNTP 8μL,KOD-plus聚合酶4μL,加水至80μL。PCR反应条件如下： 94℃变性5min后，进行30个循环。
(2)PCR产物回收及连接反应
从琼脂糖凝胶上切下含目的片断的电泳条带，按胶回收试剂盒使用说明书进行PCR产物回收。取回收的PCR产物4μL，pET15b载体(购自优宝生物，货号VT1192)1μL，5×buffer 2μL，T4DNA连接酶1μL，加水至10μL，16℃过夜，得到重组质粒。
(3)重组质粒转化及鉴定
将重组质粒用CaCl2法转化DH5α感受态宿主菌，涂布于含有0.1％氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和0.2％IPTG的LB培养基平板，37℃培养过夜。挑取菌落进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送广州市英骏生物公司测序。
(4)蛋白的诱导表达
平板上挑取单菌落接种于5～10mL含0.1％Amp的LB培养基，于37℃、 220r/min培养过夜。按体积比1:100的比例接种二级菌，于37℃、220r/min培养2～2.5h，直至OD600为0.5左右。然后加入0.2％的IPTG，混匀，于37℃、 220r/min诱导表达12小时。于4℃、12000r/min离心5min收集诱导表达后的菌体。将菌体总蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测。
(5)分离
将诱导表达菌液12 000r/min离心5min，收集菌体，加入冰预冷的PBS，重悬后置冰浴中进行超声破碎处理。超声处理完毕，于4℃、13000r/min离心15 min，取上清液。
(6)纯化
由于目的蛋白有His标签(pET15b载体上带有His标签)，能与亲和色谱上的Ni紧密结合，而被分离出来。将步骤(5)的上清2mL上载于镍柱上，用5 倍柱体积的清洗缓冲液(40mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠)去除杂质，再用10倍柱体积的200mM咪唑缓冲液洗(200mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠)脱出目的蛋白。将洗脱下来的蛋白用20kDa超滤管浓缩蛋白，并加入PBS(pH＝7.4)缓冲液透析2次以除盐，于-80℃保存，即得到人锰超氧化物歧化酶。
实施例2SOD活力测定
使用SOD测试试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号：A001-3： WST-1法)测定总Mn-SOD(实施例1得到的人锰超氧化物歧化酶)和Cu/Zn-SOD (铜锌超氧化物歧化酶)活力，按试剂盒说明书配制相关试剂和进行操作。蛋白总SOD活力(U/mgpro t)＝总SOD活力/蛋白浓度。
实施例3灵芝多糖的制备I
(1)灵芝100g，粉碎，过100目筛；
(2)灵芝粉用8倍体积的超临界CO2提取(用体积比为1％的绝对乙醇为夹带剂)，去除脂溶性物质；其中，萃取压力25MPa、萃取温度320K、CO2流量 12L/h，萃取时间120min；
(3)将步骤(2)提取后剩余的灵芝粉用8倍体积的常温水超声提取2小时，重复3次，合并三次提取液，得到水提取液；
(4)所得的水提取液用截留分子量为5000道尔顿(美国GE公司)超滤膜进行超滤，收集透过液部分；
(5)将超滤透过液进行真空浓缩，浓缩到原体积的1/3，得到浓缩液。
(6)在浓缩液中加入乙醇，混均，使醇浓度达到60％，静置12小时，过滤，得多糖沉淀；
(7)收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖I(2.1g，多糖的分子量在5000 以内)。
实施例4灵芝多糖的制备II
(1)灵芝100g，粉碎，过100目筛；
(2)灵芝粉用9倍体积的超临界CO2提取(用体积比为1％的绝对乙醇为夹带剂)，去除脂溶性物质；其中，萃取压力28MPa、萃取温度310K、CO2流量 14L/h，萃取时间135min；
(3)将步骤(2)提取后剩余的灵芝粉用10倍体积的常温水超声提取2次，每次1小时，合并两次提取液得到水提取液；
(4)所得的水提取液用截留分子量为10000道尔顿超滤膜进行超滤，收集透过液部分；
(5)将超滤透过液进行真空浓缩，浓缩到原体积的1/4，得到浓缩液；
(6)在浓缩液中加入乙醇，混均，使醇浓度达到70％，静置12小时，过滤，得多糖沉淀；
(7)收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖II(2.8g，多糖的分子量在10000 以内)。
实施例5灵芝多糖的制备III
(1)灵芝100g，粉碎，过100目筛；
(2)灵芝粉用10倍体积的超临界CO2提取(用体积比为1％的绝对乙醇为夹带剂)，去除脂溶性物质；其中，萃取压力29MPa、萃取温度315K、CO2流量 14L/h，萃取时间145min；
(3)将步骤(2)提取后剩余的灵芝粉用9倍体积的常温水超声提取2次，每次 2小时，合并2次提取液得到水提取液；
(4)所得的水提取液用截留分子量为20000道尔顿超滤膜进行超滤，收集透过液部分；
(5)将超滤透过液进行真空浓缩，浓缩到原体积的1/5，得到浓缩液；
(6)在浓缩液中加入乙醇，混均，使醇浓度达到75％，静置12小时，过滤，得多糖沉淀；
(7)收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖III(3.6g，多糖的分子量在20000 以内)。
实施例6灵芝多糖的制备IV
(1)灵芝100g，粉碎，过100目筛；
(2)灵芝粉用8倍体积的超临界CO2提取(用体积比为1％的绝对乙醇为夹带剂)，去除脂溶性物质；其中，萃取压力30MPa、萃取温度320K、CO2流量 15L/h，萃取时间150min；
(3)将步骤(2)提取后剩余的灵芝粉用10倍体积的常温水超声提取两次，每次1.5小时，合并两次提取液得到水提取液。
(4)所得的水提取液用截留分子量为20000道尔顿超滤膜进行超滤，收集透过液部分，再用截留分子量为10000道尔顿发超滤膜进行超滤，收集被截留的部分。
(5)将被截留的部分的溶液进行真空浓缩，浓缩到原体积的1/4，得到浓缩液。
(6)在浓缩液中加入乙醇，混均，使醇浓度达到80％，静置12小时，过滤，得多糖沉淀；
(7)收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖IV(0.8g，多糖的分子量在10000～20000之间)。
实施例7灵芝多糖的制备V
(1)灵芝100g，粉碎，过100目筛；
(2)灵芝粉用8倍体积的超临界CO2提取(用体积比为1％的绝对乙醇为夹带剂)，去除脂溶性物质；其中，萃取压力30MPa、萃取温度320K、CO2流量 15L/h，萃取时间150min；
(3)将步骤(2)提取后剩余的灵芝粉用10倍体积的常温水超声提取2次，每次1小时，合并后得到水提取液。
(4)所得的水提取液用截留分子量为10000道尔顿超滤膜进行超滤，收集透过液部分，再用截留分子量为5000道尔顿发超滤膜进行超滤，收集被截留的部分。
(5)将被截留的部分的溶液进行真空浓缩，浓缩到原体积的1/4，得到浓缩液。
(6)在浓缩液中加入乙醇，混均，使醇浓度达到75％，静置12小时，过滤，得多糖沉淀；
(7)收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖V(0.7g，多糖的分子量在5000～ 10000之间)。
实施例8灵芝多糖对干燥环境中对两种SOD活性的保护作用
实施例1中获得的两种SOD(20℃，60％湿度下的Mn-SOD活力分别为1800 U/mg；Cu/Zn-SOD的活力为1725U/mg)，与实施例3～7中获得的灵芝多糖组合物(灵芝多糖与SOD的重量比为1:1或2:1)置于干燥箱中，保持4小时，使用SOD测试盒(购自南京建成公司，货号：A001-3：WST-1法)测定各样品中 SOD活力，重复三次，按试剂盒说明书配制相关试剂和进行操作。相关结果见表 1、表2、图1和图2。
表1干燥环境(相对10％湿度)中Mn-SOD的活性
| 组分(比例为重量比) | Mn-SOD的活力(U/mg) |
| Mn-SOD | 300±23 |
| H<sub>2</sub>O+Mn-SOD(1:1) | 340±28 |
| H<sub>2</sub>O+Mn-SOD(2:1) | 407±31 |
| 灵芝多糖I+Mn-SOD(1:1) | 1150±110 |
| 灵芝多糖I+Mn-SOD(2:1) | 1330±116 |
| 灵芝多糖II+Mn-SOD(1:1) | 1173±112 |
| 灵芝多糖II+Mn-SOD(2:1) | 1356±121 |
| 灵芝多糖III+Mn-SOD(1:1) | 1196±107 |
| 灵芝多糖III+Mn-SOD(2:1) | 1370±105 |
| 灵芝多糖IV+Mn-SOD(1:1) | 1486±103 |
| 灵芝多糖IV+Mn-SOD(2:1) | 1771±101 |
| 灵芝多糖V+Mn-SOD(1:1) | 1196±108 |
| 灵芝多糖V+Mn-SOD(2:1) | 1388±117 |
表2干燥环境(相对10％湿度)中Cu/Zn-SOD的活性
| 组分(比例为重量比) | Cu/Zn-SOD的活力(U/mg) |
| Cu/Zn-SOD | 282±21 |
| H<sub>2</sub>O+Cu/Zn-SOD(1:1) | 313±24 |
| H<sub>2</sub>O+Cu/Zn-SOD(2:1) | 378±29 |
| 灵芝多糖I+Cu/Zn-SOD(1:1) | 1120±103 |
| 灵芝多糖I+Cu/Zn-SOD(2:1) | 1308±104 |
| 灵芝多糖II+Cu/Zn-SOD(1:1) | 1135±108 |
| 灵芝多糖II+Cu/Zn-SOD(2:1) | 1333±116 |
| 灵芝多糖III+Cu/Zn-SOD(1:1) | 1156±109 |
| 灵芝多糖III+Cu/Zn-SOD(2:1) | 1356±105 |
| 灵芝多糖IV+Cu/Zn-SOD(1:1) | 1398±99 |
| 灵芝多糖IV+Cu/Zn-SOD(2:1) | 1652±102 |
| 灵芝多糖V+Cu/Zn-SOD(1:1) | 1135±104 |
| 灵芝多糖V+Cu/Zn-SOD(2:1) | 1328±109 |
从表1～2可知，在干燥环境下，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的活性显著降低，约为原来的1/6；水分只能轻微增加两种SOD的活性。但是灵芝多糖对SOD具有很强的活性保护作用，在相对湿度为10％的干燥环境下，4小时后，对于灵芝多糖I,II,III和V而言，灵芝多糖:SOD＝1:1时，SOD的活力约为原来的60％；随着灵芝多糖使用量的增加，对SOD的保护作用也增强，灵芝多糖:SOD＝2:1时， SOD的活力约为原来的75％。
比较灵芝多糖I～III的保护作用可知，随着截留分子量的增加，两种SOD 的活力增加，这表明大分子量的多糖更有利于保护SOD的活力；灵芝多糖IV由于去除了分子量为10000以下的小分子量多糖，组成中的多糖的分子量在 10000～20000之间，对两种SOD均具有最强的活力保护作用。4小时后，灵芝多糖IV:SOD＝1:1时，SOD的活力约为原来的80％；同样，随着灵芝多糖使用量的增加，对SOD的保护作用也增强，灵芝多糖IV:SOD＝2:1时，SOD的活力约为原来的90％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种灵芝多糖的制备方法及其对超氧化物歧化酶干燥失活的保护作用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 1
aagcacagcc tccccgacct 20
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 2
ttatcgtcgt cgtcgtcgtc gtcgtcgtcg ctttttgcaa gccatgtatc tttc 54
Claims (5)
1.灵芝多糖作为干燥环境下超氧化物歧化酶的保护剂的用途。
2.根据权利要求1所述的灵芝多糖作为干燥环境下超氧化物歧化酶的保护剂的用途，其特征在于：
所述的灵芝多糖为分子量大于5000的灵芝多糖；
所述的超氧化物歧化酶包括锰超氧化物歧化酶、铁超氧化物歧化酶和铜锌超氧化物歧化酶中的至少一种；
所述的灵芝多糖与超氧化物歧化酶按重量比（0.5～2）:1混合。
3.根据权利要求1所述的灵芝多糖作为干燥环境下超氧化物歧化酶的保护剂的用途，其特征在于：
所述的灵芝多糖为分子量大于10000的灵芝多糖；
所述的干燥环境的相对湿度低至10%；
所述的灵芝多糖与超氧化物歧化酶按重量比（1～2）:1混合。
4.一种保持或提高干燥环境下超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于：
将灵芝多糖与超氧化物歧化酶混合后保存。
5.根据权利要求4所述的一种保持或提高干燥环境下超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于：
所述的灵芝多糖为分子量为10000～20000的灵芝多糖；
所述的灵芝多糖与超氧化物歧化酶按重量比2:1进行混合。
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