CN111662946A - 一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,将灵芝粉加入到蒸馏水中提取,得到灵芝蛋白提取液;将灵芝蛋白提取液离心,取上清液,经过滤、浓缩和冷冻干燥得水溶性灵芝蛋白;在灵芝蛋白中加入双酶进行酶解,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液;将灭活液依次进行离心和膜分离,浓缩、干燥,得到灵芝蛋白低聚肽。本发明制备的低聚肽具有良好的溶解性和稳定性,保质期长,容易被皮肤和人体吸收,具有较高的营养价值和生物活性,可用于食品和化妆品领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,属于多肽制备技术领域。
背景技术
灵芝属于担子菌纲多孔菌目灵芝科,是一种珍贵的药用真菌,在古代享有“仙草”、“还魂草”的美誉。灵芝的生物活性物质十分丰富,现在已分离得到两百多种化合物。主要是多糖类、核苷类、生物碱类、氨基酸蛋白类、三萜类等。灵芝蛋白类是一类重要的活性物质,其具有延缓衰老、抗氧化,提高人体机能、改善内脏微循环的作用。
灵芝水溶性蛋白由于其与人体皮肤具有良好的相容性,而受到研究者们的广泛关注。低聚肽是以灵芝为原料经过水提得到水溶性蛋白,再通过双酶解所得。低聚肽一般由2到10个氨基酸组成,在人体内不需要消化可以直接吸收,具有很高的生物活性,它能促进细胞分裂,增强细胞新陈代谢,修复人体各种受损、病变细胞。其应用于化妆品中可以起到清除自由基、延缓皮肤衰老、美白、保湿等作用。随着人们对美的追求和护肤意识的不断增强,低聚肽的提取制备越来越成为了研究的热点。而现有的技术大多制备的低聚肽存在纯度低、不稳定、易分解、难保存、不易吸收等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:现有技术制备的低聚肽存在纯度低、不稳定、易分解、难保存、不易吸收等问题。
为了解决上述问题,本发明提供了以下技术方案:
一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1):将采购的灵芝子实体清洗后,烘干;
步骤2):将干燥后的灵芝子实体置于粉碎机中粉碎,过筛,得到灵芝粉;
步骤3):将灵芝粉加入到蒸馏水中提取,得到灵芝蛋白提取液;
步骤4):将灵芝蛋白提取液离心,取上清液,经过滤、浓缩和冷冻干燥得水溶性灵芝蛋白;
步骤5):在灵芝蛋白中加入双酶进行酶解,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液;
步骤6):将灭活液依次进行离心和膜分离,浓缩、干燥,得到灵芝蛋白低聚肽。
优选地,所述步骤1)中烘干温度为50℃。
优选地,所述步骤2)中过筛的规格为30~50目。
优选地,所述步骤3)中灵芝粉与蒸馏水的质量比为1:(10~15);提取温度为25~35℃,pH值为6~8,提取时间为7-10h。
优选地,所述步骤5)中加入的双酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
更优选地,所述木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的质量比为2:(1~1.5)。
优选地,所述步骤5)中酶解的温度为50~60℃,时间为1.5~2.5h,pH值为6~8;灭活的温度为80~90℃,时间为15~20min。
优选地,所述步骤6)中离心的转速为4000~4500r/min,时间为10~15min。
优选地,所述步骤6)中的膜分离采用超滤;浓缩采用凝胶浓缩法;干燥采用冷冻干燥。
更优选地,所述凝胶浓缩法所采用的凝胶柱为SephadexG-25。
本发明提供的方法以灵芝子实体为原材料,通过水提获得水溶性灵芝蛋白,利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶通过控制酶解的时间、温度、pH进行双酶酶解获得酶解液,通过超滤、凝胶浓缩、冷冻干燥的技术从而获得了养价值更高、更稳定、容易被人体皮肤吸收的低聚肽,实验结果表明所得低聚肽营养价值高,低聚肽的保质期一般在一年半以上。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,作详细说明如下。
本发明提供了一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,具体步骤如下:
1)将采购的灵芝子实体清洗3到5次,置于50℃烘箱中干燥;
2)将所述步骤1)的干燥灵芝子实体置于粉碎机中粉碎,过30到50目筛,得到灵芝粉;
所述粉碎机为万能粉碎机;
3)将所述步骤2)的灵芝粉称取2到3克,按一定的料液比加入蒸馏水,在一定的温度和pH下提取一定的时间,得灵芝蛋白提取液;
4)将所述步骤3)的灵芝蛋白提取液离心,取上清液,经过滤、浓缩和冷冻干燥得水溶性灵芝蛋白;
5)将所述步骤4)的灵芝蛋白加入双酶进行酶解,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液;
所述双酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶;
6)将所述步骤5)的灭活液依次进行离心和膜分离,浓缩、干燥,得到灵芝蛋白低聚肽。
本发明将采购所得的灵芝子实体通过清洗、烘干、粉碎,得到灵芝粉。在本发明中,所述灵芝为赤芝,对于灵芝的来源没有特别的要求,一般市售的即可。本发明实施例中的灵芝购买自吉林省白山市,属长白山灵芝。本发明所用水均为去离子水。在本发明中,所述灵芝粉的目数优选为30到50目,更优选为40目。
得过目的灵芝粉后,本发明将称取2到3克灵芝粉,按优选地料液比1:10~15(质量比)加入去离子水,在提取温度为25~35℃,提取pH为6~8,的条件下提取7到10h,得到灵芝蛋白提取液;所述料液比为1:10~15(质量比),优选为1:12。在本发明中,提取温度优选为30℃,提取pH优选为8,提取时间优选为9h。在本发明中用去离子水比用普通水减少了杂质的引入;提高了低聚肽的纯度,温度和pH条件都较为温和,蛋白质不易变形有利于提高低聚肽的产率。
得到灵芝蛋白提取液后,本发明将灵芝蛋白提取液离心,取上清液,经过滤、浓缩和冷冻干燥,得水溶性灵芝蛋白;
得水溶性灵芝蛋白后,本发明将向所述灵芝蛋白中加入双酶进行水解,将所得的酶解液进行灭活,得到灭活液;所述双酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。在本发明中采用双酶酶解提高了低聚肽得率;所述双酶质量浓度比优选为为2:1~1.5,更优选为2:1。在本发明中,优选温度为55℃时加入双酶;所述酶解时间优选为1.5~2.5h,更优选为2h。在本发明中所述灭酶温度优选为80~90℃,更优选为90℃;灭酶时间优选为15~20min,更优选为15min,酶解的pH优选为为6~8,更优选为8。在本发明中对木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶没有特殊限定,市售的即可。在本发明中采用双酶水解,得到低聚肽。
得到灭活液后,本发明将灭活液进行离心和膜分离,浓缩、干燥,得到灵芝蛋白低聚肽。在本发明中,所述离心的转速优选为4000~4500r/min,更优选为4500r/min;在本发明中,所述离心的时间优选为10min~15min,更优选为15min;在本发明中所述膜分离技术为超滤,其操作压强低,一般为0.1~0.5MPa,可以不考虑渗透压的影响,易于工业化,应用范围广泛;在本发明中所述浓缩技术为凝胶浓缩法,所述凝胶柱优选为SephadexG-25;在本发明中,所述干燥的方法优选为冷冻干燥法。
实施例1
1)将采购的灵芝子实体清洗3次,置于50℃烘箱中干燥;
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎,过30目筛,得到过目后的灵芝粉;
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克,按料液比1:10(质量比)加入蒸馏水20克,在温度为25℃、pH=6的提取条件下提取7h,得到灵芝蛋白提取液;
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4000r/min的条件下离心,取上清液,经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白;
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.2加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,在温度为50℃、pH为6、的条件下酶解1.5h,得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为80℃的条件下灭酶处理18min,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4200r/min的条件下离心,通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱SephadexG-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例2
1)将采购的灵芝子实体清洗3次,置于50℃烘箱中干燥;
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎,过40目筛,得到过目后的灵芝粉;
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克,按料液比1:12(质量比)加入蒸馏水24克,在温度为30℃、pH=8的提取条件下提取9h,得到灵芝蛋白提取液;
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4500r/min的条件下离心,取上清液,经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白;
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,在温度为55℃、pH为8、的条件下酶解2h,得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为90℃的条件下灭酶处理15min,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4500r/min的条件下离心,通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱SephadexG-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例3
1)将采购的灵芝子实体清洗3次,置于50℃烘箱中干燥;
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎,过50目筛,得到过目后的灵芝粉;
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克,按料液比1:15(质量比)加入蒸馏水30克,在温度为35℃、pH=7的提取条件下提取10h,得到灵芝蛋白提取液;
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4300r/min的条件下离心,取上清液,经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白;
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.5加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,在温度为60℃、pH为7、的条件下酶解2.5h,得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为85℃的条件下灭酶处理20min,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4300r/min的条件下离心,通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱SephadexG-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例4
1)将采购的灵芝子实体清洗3次,置于50℃烘箱中干燥;
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎,过50目筛,得到过目后的灵芝粉;
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克,按料液比1:11(质量比)加入蒸馏水22克,在温度为32℃、pH=7.5的提取条件下提取8.5h,得到灵芝蛋白提取液;
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4100r/min的条件下离心,取上清液,经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白;
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.4加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,在温度为60℃、pH为7、的条件下酶解2.5h,得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为85℃的条件下灭酶处理17min,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4300r/min的条件下离心,通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱SephadexG-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例5
1)将采购的灵芝子实体清洗3次,置于50℃烘箱中干燥;
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎,过50目筛,得到过目后的灵芝粉;
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克,按料液比1:13(质量比)加入蒸馏水26克,在温度为32℃、pH=6.5的提取条件下提取7.5h,得到灵芝蛋白提取液;
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4400r/min的条件下离心,取上清液,经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白;
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.3加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,在温度为56℃、pH为7、的条件下酶解2.3h,得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为85℃的条件下灭酶处理20min,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4100r/min的条件下离心,通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱SephadexG-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
分别对实施例1到5制得的低聚肽进行相对分子质量测定,具体测定方法参考GB/T22729-2008,计算相对分子质量180到1000低聚肽比例,具体结果如表1所示。
表1
从表1可见,本发明制备的低聚肽占多肽总量的40.2%~44.5%,实验结果表明,本发明通过灵芝水溶性蛋白酶解制备的低聚肽得率高、纯度较高,利于皮肤吸收,具有较高的营养价值。
Claims (10)
1.一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1):将采购的灵芝子实体清洗后,烘干;
步骤2):将干燥后的灵芝子实体置于粉碎机中粉碎,过筛,得到灵芝粉;
步骤3):将灵芝粉加入到蒸馏水中提取,得到灵芝蛋白提取液;
步骤4):将灵芝蛋白提取液离心,取上清液,经过滤、浓缩和冷冻干燥得水溶性灵芝蛋白;
步骤5):在灵芝蛋白中加入双酶进行酶解,将所得酶解液进行灭活,得到灭活液;
步骤6):将灭活液依次进行离心和膜分离,浓缩、干燥,得到灵芝蛋白低聚肽。
2.如权利要求1所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述步骤1)中烘干温度为50℃。
3.如权利要求1所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述步骤2)中过筛的规格为30~50目。
4.如权利要求1所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述步骤3)中灵芝粉与蒸馏水的质量比为1:(10~15);提取温度为25~35℃,pH值为6~8,提取时间为7-10h。
5.如权利要求1所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述步骤5)中加入的双酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
6.如权利要求5所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的质量比为2:(1~1.5)。
7.如权利要求1所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述步骤5)中酶解的温度为50~60℃,时间为1.5~2.5h,pH值为6~8;灭活的温度为80~90℃,时间为15~20min。
8.如权利要求1所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述步骤6)中离心的转速为4000~4500r/min,时间为10~15min。
9.如权利要求1所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述步骤6)中的膜分离采用超滤;浓缩采用凝胶浓缩法;干燥采用冷冻干燥。
10.如权利要求9所述的利用灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法,其特征在于,所述凝胶浓缩法所采用的凝胶柱为SephadexG-25。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200915 |
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