CN1940064A

CN1940064A - 溶栓激酶(纳豆激酶)生产方法及其应用

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Publication number: CN1940064A
Application number: CNA2005100217832A
Authority: CN
Inventors: 程金权; 谢文渊; 康建平; 潘红梅; 王拥军
Original assignee: Sichuan Food Fermentation Industry Research and Design Institute
Current assignee: Sichuan Food Fermentation Industry Research and Design Institute
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2007-04-04

Abstract

本发明提出发酵法生产高活性溶栓激酶方法和用途，是微生物技术领域技术发明。该发明以农副产品(白砂糖、大豆、淀粉等)为原料，利用枯草杆菌高产溶栓激酶菌株，采用液体深层发酵工艺，复杂系统调控代谢技术，经膜分离技术、冻干等工艺技术生产溶栓激酶。该酶属于丝氨酸蛋白酶，功能用途是溶化血栓、抑制血小板凝固、预防高血压和动脉硬化、调节血脂、保持血流通畅。既可作为医药原料，也可作为功能性食品专用酶，食品添加剂，功能性食品，溶栓药品；可开发成冲剂，片剂、(肠溶)胶囊，口服液等。本发明采用的发酵配料和工艺，提高了溶栓激酶产率，解决了目前溶栓激酶纯化工艺复杂，操作步骤繁杂的问题，该酶经功能性成分科学配伍，可以增强血栓、高血压和高血脂预防和治疗效果。

Description

溶栓激酶(纳豆激酶)生产方法及其应用

技术领域

本发明提出发酵法生产溶栓激酶(纳豆激酶)方法及其应用，是微生物技术领域科技发明。主要涉及提高溶栓激酶产率方法，适合工业化生产溶栓激酶膜分离提取方法以及功能性配伍溶栓激酶组合物应用于溶血栓、辅助降血压、辅助调血脂。

技术背景

溶栓激酶是枯草杆菌生长代谢产生的一种易溶于水的胞外碱性蛋白酶，最初由日本学者于1987年从传统食品纳豆中提取得到，命名为纳豆激酶。从1996年起，国内学者也从纳豆类似食品(豆豉、豆酱等豆类发酵食品)中提取得到溶栓激酶，其性质与纳豆激酶基本一致，从豆类发酵食品中分离出微生物经鉴定为枯草芽孢杆菌。经药理实验证明溶栓激酶具有高纤溶活性，不仅具有较强的直接降解纤维蛋白作用，还有激活血管内皮细胞产生组织纤溶酶原激活剂，还能激活尿激酶原产生尿激酶，既可静脉给药，也可口服给药，酶活活性稳定，是一种较为理想的溶栓制剂。

血管栓塞、高血压、血脂水平升高、高血粘、冠心病、中风互相关联常常合并存在，因此，单一成分有一定局限，采用功能性辅助成分配伍，综合防治可以起到协同增效作用。

叶酸(folic acid)又叫叶精，是一种水溶性维生素。叶酸作为辅酶是构成含铁血红蛋白的成分，主要生理功能是预防恶性贫血。叶酸在体内必须转变成具有生物活性的四氢叶酸才能发挥作用。维生素C可将叶酸还原成四氢叶酸。叶酸是蛋白质和核酸合成的必需因子，在细胞分裂和繁殖中起重要作用；使甘氨酸和丝氨酸相互转化，使苯丙氨酸形成酪氨酸，组氨酸形成谷氨酸，使半胱氨酸形成蛋氨酸；参与大脑中长链脂肪酸如DHA的代谢，肌酸和肾上腺素的合成等。膳食中缺乏叶酸将使血中高半胱氨酸水平提高，易引起动脉硬化；膳食中摄入叶酸不足，易诱发结肠癌和乳腺癌。叶酸在正常情况下没有毒性。叶酸易被紫外线破坏，因此，新鲜蔬菜在室温下贮藏2～3天其叶酸量会损失50～70％。食物中50～95％的叶酸在烹调时被破坏。叶酸缺乏症在全世界被公认为一个保健问题。

维生素B₁₂(vitamin B₁₂)是体内多种代谢过程中所必需的辅酶，参与蛋白质、脂肪、糖的代谢。在造血系统中，对红血球的形态和代谢，特别是在DAN合成中作为辅酶，有重要作用。

外源性叶酸、VB₁₂补充剂可预防心脏系统疾病。早有研究证实高半胱氨酸含量偏高的人群更易患中风、心脏病；其心脏系统疾病致死率也会增加。临床试验发现，服用叶酸或VB₁₂补充剂可使体内高半胱氨酸含量分别降低25％、32％。叶酸和VB₁₂具有治疗心脏病的强大潜能。叶酸以及VB₁₂在预防心脏系统疾病方面比大蒜、VE或其它饮食补充物更有效。FDA

曾于1998年发布通知，要求谷类制品(如：面食)中都必须加入叶酸补充剂。据调查，此后美国国民体内的平均高半胱氨酸水平趋于下降。

Vc能增强人体抵抗力，保护微血管，预防坏血病促进伤口愈合。维生素C能增加铁的利用，其生化过程是通过使膳食中三价铁还原为二价铁，促进铁的吸收，再以铁蛋白的形式储存于肝和骨骼中。实践表明，在补充铁的同时补充VC可使铁的吸收率提高22％基本可以达到血红素的正常吸收率。

卵磷脂具有很多的生理功能，在本组方中主要作用是增强老年人的记忆力，延缓脑细胞衰老，预防老年痴呆症。卵磷脂中的不饱和脂肪酸的乳化作用能将体内多余脂肪溶解成极小的颗粒，代谢排除体外，从而达到减肥的目的。防治心脑血管疾病，卵磷脂具有极佳的脂溶乳化性，可以迅速快捷地化解沉积的胆固醇和有害血脂，就像流淌在血管中的清道夫，随时会为您去污除垢，彻底消除心血管疾病的诱因。

目前，发酵法生产溶栓激酶的分离提取工艺多是采用盐析、透析、离子交换、离心、浓缩等才能得到精制溶栓激酶，其提取步骤多，操作复杂，酶活损失大，不利于规模化生产。

发明内容

该发明以农副产品(白砂糖、大豆等)为原料，利用枯草杆菌高产溶栓激酶菌株，采用液体深层发酵工艺，采用复杂系统调控技术优选发酵条件，经膜分离技术、冻干等工艺技术，生产溶栓激酶。该酶属于丝氨酸蛋白酶，功能用途是溶化血栓、抑制血小板凝固，预防高血压和动脉硬化、调节血脂、保持血流通畅。既可作为医药原料，也可作为功能性食品专用酶，食品添加剂，功能性食品；可开发成冲剂，片剂，(肠溶)胶囊，口服液等。

本发明采用的发酵配料和工艺，提高了深层发酵溶栓激酶产率，解决了目前溶栓激酶提取工艺复杂，操作步骤繁杂的问题，提供了一种行之有效、过程短、步骤简单的适合工业化分离提取溶栓激酶的方法。该酶经功能性成分科学配伍，可以增强血栓预防和治疗效果。

实现上述发明内容技术方案：

1、发明涉及的工艺流程

原料→粉碎→配料→灭菌→接种→发酵→膜分离(两级微滤→两级超滤)→冻干，然后按照产品用途包装成成冻干粉原料，或添加功能性成分，制成溶栓激酶组合产品。

2、深层发酵配料和工艺条件

枯草杆菌培养产生溶栓激酶，特征在于：利用碳源有木糖、麦芽糖、葡萄糖和白砂糖，该发明优选白砂糖；利用氮源有大豆(包括豆粕、豆粉、豆饼、大豆蛋白)及其酶解产物、营养素A、玉米提取物；利用无机盐有KH₂PO₄，K₂HPO₄，MgSO₄·7H₂O等；进行深层发酵。

发酵配料

种子培养基：葡萄糖1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，KH₂PO₄ 0.2％，K₂HPO₄ 0.4％，pH7.0～pH7.2，0.1MPa、20min。

发酵培养基：蔗糖0.5～5％，黄豆粉0～5％，酵母膏0.1～1％，FeCl₃0.005～0.01％，泡敌0.2～0.5％，KH₂PO₄ 0.01～0.2％，K₂HPO₄0.2～0.5％，MgSO₄·7H₂O0.01～0.1％。

发酵工艺条件为发酵罐装量60-80％，通气量为1：0.5～1(V/V)，起始pH6.6～pH7.4，灭菌0.1MPa、20～30min，罐压0.03～0.05MPa，种量2～3％，温度32～38℃，搅拌速度280～350rpm，发酵周期42～45小时。

3、分离提取工艺条件和溶栓激酶制备

发酵成熟醪液经预冷；经两级微滤处理得到清亮滤过液；经第一级中空纤维超滤柱，收集渗透液；经第二级中空纤维超滤柱浓缩20余倍，添加辅料(作用是保护酶活，改善品质和加工性能)，冷冻干燥，得到微黄色的溶栓激酶粉未。

第一级微滤膜孔孔径为0.2um～0.45um，第二级为0.02um～0.1um，第一级超滤膜孔孔径为300KD～500KD，第二级为5KD～10KD，保持分离系统温度0℃～18℃。

上述溶栓激酶制备涉及辅料包括可溶性糖类、变性淀粉、糊精类(麦芽糊精或环状糊精)、乳清粉，或其中1种或几种。

4、栓激酶应用

枯草杆菌生产的溶栓激酶粉未，可作为医药原料，也可作为功能性食品专用酶，食品添加剂；将溶栓激酶粉未，按口服5000IU～6000IU的剂量加入功能性辅助成分(期待增强溶栓效果)，混合得到溶栓激酶组合物，制成冲剂、肠溶胶囊，口服液等，作为心脑血管保健食品和预防或治疗药品。

在上述溶栓激酶应用中，涉及功能性辅助成分包括：叶酸、Vc、卵磷脂、低聚糖(低聚异麦芽或低聚麦芽糖)，VB₁₂，或其中1种到几种。其中添加量叶酸1～5毫克/天，Vc100～200毫克/天、卵磷脂0.4～0.5克/天、VB₁₂2～6毫克/天，优选低聚异麦芽糖调整容量。

该技术方案优点

经过多批次溶栓激酶深层发酵，微滤澄清、超滤分离和浓缩、冷冻干燥制样，功能性成分科学配伍，分装技术方法试验研究，是行之有效的。具有原料易得，发酵酶活高，工艺流程短，能耗低，操作方便，提取收率高，相对成本低，适合规模化生产等优点。经国家认可的单位进行急毒检测，该产品达到无毒级。经四川大学华西公共卫生学院关于溶栓激酶体外溶栓检测，溶栓效果非常明显。

实例1溶栓激酶的生产

枯草芽胞杆菌斜面菌种活化后，接入摇瓶种子培养基，32～38℃恒温150～250rpm培养24小时，接入发酵培养基，发酵罐发酵42～45小时后出罐。平均酶活达到2100IU，预冷到10℃左右，泵入两级微滤机，收集滤过液，酶活收率90％以上；再经第一级中空纤维超滤去除大分子，第二级中空纤维超滤浓缩达到20余倍，酶活收率80％以上；将溶栓激酶浓缩液添加辅料，冷冻干燥，可以得到酶活20000IU/克以上的固体粉未。

实例2溶栓激酶应用(以胶囊成品为例)

该技术方案生产的溶栓激酶活性(相当于尿激酶)达到20000IU克以上，以日服5000IU，日服2次，每次1粒，可直接装入肠溶胶囊，低聚异麦芽糖调整容量，每粒装量0.25克。

还可将1克溶栓激酶(以20000IU/克计算)冻干粉，组合功能性辅助料叶酸8毫克，Vc400毫克，VB₁₂12毫克，大豆卵磷脂1克，混合均匀，分装肠溶胶囊8粒。

上述产品，作为心脑血管疾病易发人群的保健品，用于预防或辅助治疗血栓类心脑血管疾病。

Claims

1.以辅料、功能性辅助成分组合的溶栓激酶(纳豆激酶)，用作医药原料，功能性食品及其添加剂、食品专用酶、溶栓药品；可制成片剂、粉剂、口服液、胶囊等。

2.根据权利要求1所述溶栓激酶采用如下工艺过程生产：原料→粉碎→配料→灭菌→接种→发酵→膜分离(两级微滤→两级超滤)→辅料→冻干(溶栓激酶原料)→功能辅助成分→溶栓激酶组合物。

3.根据权利要求1所述溶栓激酶辅料包括：可溶性糖类、变性淀粉、糊精类(麦芽糊精或环状糊精)、乳清粉，用量按需要的酶活单位任意比添加。

4.根据权利要求1所述溶栓激酶功能性辅助成分及用量分别为：叶酸1～5毫克/天、Vc100～200毫克/天、卵磷脂0.4～0.5克/天、低聚糖(低聚异麦芽糖或低聚麦芽糖)、VB122～6毫克/天。

5.根据权利要求2所述的溶栓激酶发酵配料包括：白砂糖0.5～5％，黄豆粉0～5％，酵母膏0.1～1％，泡敌0.2～0.5％，FeCl₃ 0.005～0.01％，KH₂PO₄ 0.01～0.2％，K₂HPO₄ 0.2～0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.1％；发酵工艺条件为发酵罐装量60-80％，通气量为1∶0.5～1(V/V)，起始pH6.6～pH7.4，灭菌0.1MPa、20～30min，罐压0.03～0.05MPa，种量2～3％，温度32～38℃，搅拌速度280～350rpm，发酵周期42～45小时。

6.根据权利要求2所述溶栓激酶分离提纯工艺采用以下步骤：

发酵成熟醪液经两级微滤，澄清发酵液经第一级超滤除去大分子物质得到粗酶液；粗酶液经第二级超滤除去小分子物质得到溶栓激酶浓缩液；浓缩酶液添加辅料，经冷冻干燥制成溶栓激酶原料；

提取工艺条件为：第一级微滤膜孔孔径为0.02um～0.45um，第二级为0.02um～0.1um，第一级超滤膜孔孔径为300KD～500KD，第二级为5KD～10KD，保持膜分离系统温度0℃-18℃。

7.一种由权利要求1～6所述的溶栓激酶应用，该酶可与辅料中的一种或几种混合；可与功能性辅助成分中的一种或几种混合，按照所需酶活单位调配，制成以溶栓激酶为主要成分的心脑血管疾病预防或治疗产品。