CN109402187A - 天然维生素k2和血栓溶解酶联产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法。采用的技术方案是：将代谢产物中含有维生素K2和血栓溶解酶的菌株于发酵培养基中进行发酵，得发酵液；于发酵液中加入高分子化合物进行吸附，吸附发酵液中的维生素K2，过滤，固体物加入有机溶剂进行洗脱，洗脱液经浓缩干燥，得维生素K2产品；滤液通过膜过滤技术回收血栓溶解酶。本发明的方法可以同时生产维生素K2和血栓溶解酶，提高了原料的利用率，节省了资源，不会造成原料的浪费，极大地降低了生产成本。采用联产方法，提高了天然维生素K2的产率和纯度。同时也提高了血栓溶解酶的产率。
Description
技术领域
本发明属于食品营养强化剂、功能食品和药品领域，具体涉及一种预防与治疗骨质疏松症的天然维生素K2和在心脑血管病的预防与治疗领域具有明显作用的血栓溶解酶的联产技术。
背景技术
在人类所面对的众多疾病中，骨质疏松成为了威胁人体健康的一种非常严重的疾病。据统计，目前我国骨质疏松患者达16％，约有2.3亿人之多。特别是对一些老年或绝经后的妇女，骨流失现象非常严重，骨质疏松症已逐渐成为困扰这部分人群健康和生活质量的主要因素之一。对于骨质疏松症的预防与治疗，目前市场上虽有众多的针对骨质疏松症的补钙食品或药品，但“补钙而总是不钙，补钙而缺钙”、补钙效果不佳的现象仍是当今食品与医药界需要努力克服和解决的不争的事实。一般来说，外源的钙离子只有在维生素D的作用下才能被人体吸收，但进入体内的钙只有在VK2的协同作用下才能沉积到骨骼中。目前国际上虽有一些激素类药物对骨质疏松治疗具有治疗效果，但其有效作用期只有2-3年，且副作用大。VK2是目前国际上公认的预防与治疗骨质疏松最有效的化合物。
国际上生产VK2主要有微生物发酵和化学合成两种方法。用化学方法合成的VK2主要为VK2-4，但是其产率低、污染大、产品活性低、作用时间短、毒副作用大。而天然的VK2-7是目前公认的维生素K2中生物活性最高、稳定性最好的化合物，对骨质疏松症具有良好的预防与治疗效果。但在天然VK2的生产中，要用到大量的有机溶剂来提取VK2，生产效率低且操作危险性大、环境污染也大。
心脑血管疾病为人类健康的头号杀手，目前临床上使用的尿激酶等抗血栓药物存在稳定性差、作用时间短、半衰期短等缺点。
另外，目前虽有关于天然VK2和血栓溶解酶生产的报道，但都是通过独立的技术途径进行生产，致使生产一种产品时会损失掉另一种产品，或者会使另一种产品的结构被破坏而失去其生物活性或效价，同时使得产品的生产成本偏高而利用效率低下。目前生产上还没有关于这两种产品联产的技术报道。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明提供一种简单、高效生产VK2和血栓溶解酶的方法。
本发明采用的技术方案是：天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，方法如下：
1)将代谢产物中含有维生素K2和血栓溶解酶的菌株于发酵培养基中进行发酵，得发酵液；
2)于发酵液中加入高分子化合物进行吸附，吸附发酵液中的维生素K2，过滤，滤液备用，固体物加入有机溶剂进行洗脱，洗脱液经浓缩干燥，得维生素K2产品；
3)滤液通过膜过滤技术回收血栓溶解酶。
进一步的，上述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，所述的菌株是枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、乳酸菌或其他代谢产物中含有VK2和血栓溶解酶的微生物。
进一步的，上述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，所述的高分子化合物是水不溶性高分子化合物和/或水溶性高分子化合物或吸附树脂类物质。
进一步的，上述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，所述的水不溶性高分子化合物是纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、木质素及其衍生物、甲壳素及其衍生物、多糖类蛋白质改性产物、聚乳酸、明胶的一种或二种以上的混合。
进一步的，上述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，所述的水溶性高分子化合物是聚谷氨酸、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、琼脂胶、壳聚糖、魔芋胶、果胶、黄原胶、阿拉伯树胶、瓜儿豆胶或刺槐树胶的一种或二种以上的混合。
进一步的，上述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，所述的吸附树脂类物质是大孔吸附树脂、硅胶或活性炭。
进一步的，上述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、异丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、正己烷的一种或二种以上的混合。
进一步的，上述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，步骤3)具体为：将滤液先经截留分子量为10万道尔顿的超滤膜过滤，超滤后的滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行二次超滤，所得滤液冷冻干燥，得血栓溶解酶。
本发明的有益效果是：
1、本发明的方法适用于所有代谢产物中含有维生素K2和/或血栓溶解酶的微生物菌体，微生物的发酵溶液，以及植物和动物的组织与器官。
2、本发明的方法是利用高分子化合物从含有维生素K2的发酵液中把维生素K2吸附分离出来，然后通过解吸作用简便的回收维生素K2。再从提取维生素K2的残余液体中，通过膜过滤技术回收血栓溶解酶。
3、本发明的方法可以同时生产维生素K2和血栓溶解酶，提高了原料的利用率，节省了资源，不会造成原料的浪费，极大地降低了生产成本。
4、采用联产方法，提高了天然维生素K2的产率和纯度。同时也提高了血栓溶解酶的产率。
附图说明
图1是实施例1生产的维生素K2的液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
1)将枯草芽孢杆菌接种于含蛋白胨和酵母粉的液体发酵培养基中，于37℃下发酵培养48-72h，得发酵液；发酵液会同时产生维生素K2和血栓溶解酶。
含蛋白胨和酵母粉的液体发酵培养基的组成：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％淀粉，水余量。
2)于发酵液中加入大孔吸附树脂吸附30-60min，发酵液中的维生素K2会转移吸附到大孔吸附树脂上，过滤，分离出大孔吸附树脂，滤液备用。于吸附了维生素K2的大孔吸附树脂中加入有机溶剂乙醇进行洗脱，洗脱液经浓缩干燥，得维生素K2产品。维生素K2的产量达到20mg/L，经液相色谱检测，纯度达到99％以上(如图1)。
液相色谱检测的条件为：色谱柱，Agilent zobax SB C-18(4.6×250mm)；检测波长，248nm；流动相，97％乙醇。
有机溶剂也可以是甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、异丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、正己烷等的一种或几种的混合物。
3)将步骤2)过滤所得的滤液，先经截留分子量为10万道尔顿的超滤膜超滤，超滤后的滤出液再经截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行二次超滤。将二次超滤后的滤液，冷冻干燥，即得血栓溶解酶产品。经国际通用的血栓溶解酶活性定量法检测到的酶活性达到34800FU/g。
实施例2
1)经蒸煮后的大豆接入纳豆芽孢杆菌中后进行固体发酵培养，发酵培养后浸入水中，4℃下搅拌洗脱10-30min后，过滤去除大豆颗粒，收集滤液。
2)于滤液中加入甲壳素吸附60-120min，过滤，分离出固体物，滤液备用。于固体物中加入有机溶剂异丙醇进行洗脱，洗脱液经浓缩干燥，得维生素K2产品。经液相色谱检测，纯度达到99％以上。
有机溶剂也可以是甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、异丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、正己烷等的一种或几种的混合物。
3)将步骤2)过滤所得的滤液，先经截留分子量为10万道尔顿的超滤膜超滤，超滤后的滤出液再经截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行二次超滤。将二次超滤后的滤液，冷冻干燥，即得血栓溶解酶产品。经国际通用的血栓溶解酶活性定量法检测到的酶活性达到28000FU/g。
实施例3
1)将乳酸菌接种于含蛋白胨和酵母粉的液体发酵培养基中，于37℃下发酵培养48-72h，得发酵液；发酵液会产生维生素K2和血栓溶解酶。
含蛋白胨和酵母粉的液体发酵培养基的组成：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％淀粉，水余量。
2)于发酵液中加入活性炭吸附60-120min，过滤，分离出固体物，滤液备用。于固体物中加入有机溶剂乙醇进行洗脱，洗脱液经浓缩干燥，得维生素K2固体产品。维生素K2的产量达到2mg/L，经液相色谱检测，纯度达到99％以上。
有机溶剂也可以是甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、异丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、正己烷等的一种或几种的混合物。
3)将步骤2)过滤所得的滤液，先经截留分子量为10万道尔顿的超滤膜超滤，超滤后的滤出液再经截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行二次超滤。将二次超滤后的滤液，冷冻干燥，即得血栓溶解酶产品。经国际通用的血栓溶解酶活性定量法检测到的酶活性达到28000FU/g。
实施例4
1)将纳豆芽孢杆菌接种于含蛋白胨和酵母粉的液体发酵培养基中，于37℃下发酵培养48-72h，得发酵液；发酵液会产生维生素K2和血栓溶解酶。
含蛋白胨和酵母粉的液体发酵培养基的组成：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％淀粉，水余量。
2)于发酵液中加入壳聚糖和明胶的复合物(质量比，壳聚糖:明胶＝1:)吸附30-60min，过滤，分离出固体物，滤液备用。于固体物中加入有机溶剂乙醇进行洗脱，洗脱液经浓缩干燥，得维生素K2产品。维生素K2的产量达到2mg/L，经液相色谱检测，纯度达到99％以上。
有机溶剂也可以是甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、异丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、正己烷等的一种或几种的混合物。
3)将步骤2)过滤所得的滤液，先经截留分子量为10万道尔顿的超滤膜超滤，超滤后的滤出液再经截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行二次超滤。将二次超滤后的滤液，冷冻干燥，即得血栓溶解酶产品。经国际通用的血栓溶解酶活性定量法检测到的酶活性达到32000FU/g。
Claims (8)
1.天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，方法如下：
1)将代谢产物中含有维生素K2和血栓溶解酶的菌株于发酵培养基中进行发酵，得发酵液；
2)于发酵液中加入高分子化合物进行吸附，吸附发酵液中的维生素K2，过滤，滤液备用，固体物加入有机溶剂进行洗脱，洗脱液经浓缩干燥，得维生素K2产品；
3)滤液通过膜过滤技术回收血栓溶解酶。
2.根据权利要求1所述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，所述的菌株是枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、乳酸菌或其他代谢产物中含有VK2和血栓溶解酶的微生物。
3.根据权利要求1所述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，所述的高分子化合物是水不溶性高分子化合物和/或水溶性高分子化合物或吸附树脂类物质。
4.根据权利要求3所述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，所述的水不溶性高分子化合物是纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、木质素及其衍生物、甲壳素及其衍生物、多糖类蛋白质改性产物、聚乳酸、明胶的一种或二种以上的混合。
5.根据权利要求3所述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，所述的水溶性高分子化合物是聚谷氨酸、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、琼脂胶、壳聚糖、魔芋胶、果胶、黄原胶、阿拉伯树胶、瓜儿豆胶或刺槐树胶的一种或二种以上的混合。
6.根据权利要求3所述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，所述的吸附树脂类物质是大孔吸附树脂、硅胶或活性炭。
7.根据权利要求1所述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、异丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、正己烷的一种或二种以上的混合。
8.根据权利要求1所述的天然维生素K2和血栓溶解酶联产方法，其特征在于，步骤3)具体为：将滤液先经截留分子量为10万道尔顿的超滤膜过滤，超滤后的滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行二次超滤，所得滤液冷冻干燥，得血栓溶解酶。
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