CN103571897A - 一种维生素k2及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种维生素K2及其制备方法，该方法利用1-羟基-2-萘甲酸抗性黄杆菌株HNA12-D进行发酵培养，通过碳源甘油、氮源蛋白胨以及前体物质的分批补料，获得维生素K2在菌体内的高效代谢，并采用有机溶剂萃取，大孔树脂联合硅胶柱提取分离维生素K2，提高了产品的收率和纯度。本发明的黄杆菌HNA12-D经发酵培养120～144小时后，维生素K2粗品的总产量为200～600mg/L，经吸附层析后，产品的纯度达到80～99%，与现有技术相比，其产量和纯度都有大幅提高，并能应用于工业化生产中。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种维生素K2，尤其涉及的是一种维生素K2及其制备方法。
背景技术
维生素K（VK）是一族含有共同化学结构（2-甲基-1,4-萘醌环）的物质的统称，根据萘醌环3’位置所连接侧链化学结构长度的不同，VK又分为不同的类别，天然存在的VK主要有两种类型，即维生素K1（叶绿醌类，简称PK）和维生素K2（甲萘醌类，简称MK），都属于脂溶性维生素，均可由微生物合成。维生素K2的化学结构式为2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，分子式为C16H16O2﹒(C5H8)n，依据C-3上异戊二烯侧链长度的不同，维生素K2可分为14种，通常以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数，其中利用黄杆菌发酵产生的维生素K2的主要成分为MK-4、MK-5或MK-6中的一种或多种，其主要成分的分子式分别为：C31H40O2，C36H48O2，C41H56O2，结构式如下所示：
维生素K2的生物活性主要体现在促进凝血酶原的产生和增加骨钙素的合成上，在血液凝固以及骨骼代谢中有重要作用，可用于治疗和预防维生素K2缺乏引起的出血症和骨质疏松症，并可降低肝硬化转化为肝癌的风险，在增加人体骨密度方面优于其他维生素K。近年来，自然和科学等顶级国际期刊上都相继发表了维生素K2具有修复损伤细胞的新功能，这些新功能的发现，将促使维生素K2更加广泛地应用于医药、食品等领域。
维生素K2的制备方法中微生物发酵法因其原料易得、条件温和、环境压力低，且具有高生物活性和高生物相容性、易于人体吸收与利用等特点而备受青睐。目前能够进行发酵生产维生素K2的菌种主要属于革兰氏阴性菌的黄杆菌和革兰氏阳性菌的纳豆芽孢杆菌。其中，纳豆芽孢杆菌生产维生素K2因产量极低而只限于在食品行业中应用。在利用黄杆菌发酵生产维生素K2方面，日本的谷吉树（TaniYoshiki）课题组在菌种选育和发酵培养条件优化方面做了很多的工作，他们采用结构类似物抗性初筛结合NTG和紫外诱变筛选高产菌，得到了1-羟基-2-萘甲酸抗性菌株HNA12-D，并结合表面活性剂渗漏技术，使维生素K2的总产量提高达280mg/L。然而，产量低仍然制约着维生素K2的广泛应用，无法使其满足市场的需求，因此，如何得到较高的维生素K2产量成为目前研究的焦点。
另外，大多数微生物发酵法生产的产品，发酵液往往成分复杂，产品分离纯化难度较大，因而选择合适的下游技术是保证生产工艺成功的一个极其重要的环节。有报道采用有机溶剂提取、反向薄层色谱、固相萃取高效液相色谱法等分离纯化方法来提取和精制维生素K2，取得了较好的效果。
等人采用凝胶层析成功分离维生素K2，Berger等研究者运用超临界色谱，CO2为流动相，快速分离K1的顺反异构体，但这些方法多限于实验室规模，若进行工业化生产则成本很高，因此开发一种适合于工业化生产的简单廉价的维生素K2分离和提纯方法有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种维生素K2及其制备方法，以解决现有技术的制备方法不能应用于工业化生产的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
一种维生素K2的制备方法，包括以下步骤：
（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，30～38℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏2～15天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，通过控制菌种的斜面保藏时间，可以抑制菌体的生命活动，但也不至于使菌体进入休眠状态；
（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，在30～38℃下摇瓶培养24～48小时，获得种瓶培养物；
（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于28～38℃下发酵培养120～144小时，获得发酵液，发酵培养期间每隔20～30小时补加营养物质，所述营养物质为甘油、蛋白胨和维生素K2生物合成的前体物质，通过碳源甘油、氮源蛋白胨以及前体物质的分批补料，可以获得维生素K2在菌体内的高效代谢；
（4）取上述发酵液，加入絮凝剂进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体，由于发酵液体积大，采用絮凝沉淀的方法可以倾去大量上清液，大大浓缩了发酵液中菌体的浓度，提高菌体的收集效率，为后续粗分和精制工序创造有利条件；
（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻3～10分钟，然后在室温中融化；
（6）重复上述步骤（5）2～6次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；
（7）取上述破碎菌体，先用有机溶剂进行萃取，获得维生素K2粗品，再用大孔吸附树脂对维生素K2粗品进行粗分，最后用硅胶柱精制，获得维生素K2的纯品提取液；
（8）将上述纯品提取液干燥，获得所述维生素K2的纯品。
优选地，所述步骤（1）的斜面培养基配方为：甘油8～12g/L，蛋白胨8～12g/L，酵母提取物1.5～4.5g/L，氯化钠2～6g/L，磷酸氢二钾2～10g/L，硫酸镁0.1～4g/L，琼脂20g/L；所述步骤（2）的种瓶培养基配方为：甘油4～10g/L，蛋白胨4～10g/L，酵母提取物1.5～3.5g/L，氯化钠2～5g/L，磷酸氢二钾2～8g/L，硫酸镁0.05～5g/L；所述步骤（3）的发酵培养基配方为：甘油4～10g/L，蛋白胨4～10g/L，酵母提取物1.5～3.5g/L，氯化钠2～5g/L，磷酸氢二钾2～8g/L，硫酸镁0.05～5g/L，聚氧乙烯油醚0.5～1.5g/L。
优选地，所述步骤（2）中，斜面保藏菌的接种量为每50mL种瓶培养基接种0.1～0.5立方厘米的斜面保藏菌，将接种量控制在每50mL种瓶培养基接种0.1～0.5立方厘米的斜面保藏菌，人为控制传代转接的菌量，从而控制菌体代谢，使菌体内积累大量参与代谢的酶，提高菌体内代谢酶的浓度，提高菌体在产物生成期的代谢能力，达到提高菌株产能的目的。
优选地，所述步骤（3）中，种瓶培养物的接种量占发酵培养基的体积百分比为4～10%。
优选地，所述步骤（3）中，营养物质添加的重量百分比为：甘油0.05～0.15%，蛋白胨0.05～0.15%，前体物质0.005～0.05%，所述前体物质为异戊二烯、多聚异戊二烯、松柏油、松香、1,4-二羟基-2-萘甲酸、1-羟基-2-萘甲酸、甲萘醌、对苯醌、对羟基萘中的一种或多种。
优选地，所述步骤（4）中的絮凝剂为明矾、聚合氯化铝、聚丙烯酰胺、亚铁氰化钾或硫酸锌。
优选地，所述步骤（7）中的有机溶剂为正己烷、异丙醇、甲醇、正丁醇中的一种或多种。
优选地，所述步骤（7）中的大孔吸附树脂的型号为HZ8l6、HZ807、HZ806、HZ818或HZ820，吸附层析是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离的目的，本发明以吸附树脂作为吸附剂，利用吸附树脂对不同组分吸附力的差异进行分离纯化，由于MK-4，MK-5，MK-6分子的极性较低，因此，本发明中选用HZ8l6，HZ807，HZ806，HZ818和HZ820中的一种作为大孔吸附树脂对维生素K2粗品进行粗分。
优选地，所述步骤（7）的硅胶柱精制中，洗脱溶剂为体积比为10～20：1的正己烷与乙酸乙酯混合液，洗脱流速为0.5～4.5BV/h。
本发明还提供了一种利用上述维生素K2的制备方法制备获得的维生素K2，所述维生素K2的组分为MK-4、MK-5或MK-6中的一种或多种。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种维生素K2及其制备方法，该制备方法利用1-羟基-2-萘甲酸抗性的黄杆菌HNA12-D菌株进行发酵培养，获得的发酵液中维生素K2的总产量可达200～600mg/L；对发酵液进行进一步地萃取、粗分和精制后，获得的维生素K2纯品的纯度可达80～99%；本发明的制备方法与现有技术相比，具有产量高、成本低的优点，能够适应于工业生产的要求，该制备方法制备获得的维生素K2纯度高，能够广泛应用于医药和保健品等领域，
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供的维生素K2的制备方法，包括以下步骤：
（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，30℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏2天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培养基的配方为：甘油8g/L，蛋白胨8g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L；
（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，每50mL种瓶培养基接种0.1立方厘米的斜面保藏菌，在30℃下摇瓶培养24小时，摇瓶转速120rpm，获得种瓶培养物，所述种瓶培养基配方为：甘油4g/L，蛋白胨4g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.05g/L；
（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于28℃下发酵培养120小时，获得发酵液，每100ml发酵培养基接种4ml的种瓶培养物，发酵培养期间每隔20小时补加营养物质的重量百分比分别为：甘油0.05%、蛋白胨0.05%以及异戊二烯0.005%，发酵培养基的配方为：在上述种瓶培养基中添加聚氧乙烯油醚0.5g/L；
（4）取上述发酵液，加入明矾进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体；
（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻3分钟，然后在室温中融化；
（6）重复上述步骤（5）2次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；
（7）纯化：
a、用20mL正己烷对上述破碎菌体进行萃取，提取有机层并旋转蒸发，得到维生素K2粗品；
b、取维生素K2粗品，溶于5mL无水乙醇中，用溶胀好的HZ816树脂装柱30mL，连接紫外检测器和收集器，以3BV/h的流速将维生素K2粗品溶液倒入层析柱上，然后用100%工业乙醇对树脂进行洗脱，洗脱至紫外检测器所示数值恒定不变，此时大部分杂质基本被洗脱干净了，再用丙酮溶液将维生素K2洗脱下来，获得的丙酮洗脱液置于0℃下静置，即得到维生素K2粗分品；
c、将适量的硅胶装入层析柱中，硅胶装入层析柱的高径（直径）比为3：1，取维生素K2粗分品溶于体积比为10：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脱剂中，从层析柱顶端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脱的流速为0.5BV/h；
（8）将上述纯品提取液干燥，获得维生素K2的纯品。
实施例2
本实施例提供的另一种维生素K2的制备方法，包括以下步骤
（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，32℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏8天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培养基的配方为：甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠4g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁1g/L，琼脂20g/L；
（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，每50mL种瓶培养基接种0.3立方厘米的斜面保藏菌，在32℃下摇瓶培养30小时，摇瓶转速240rpm，获得种瓶培养物，所述种瓶培养基配方为：甘油6g/L，蛋白胨6g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁1g/L；
（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于30℃下发酵培养130小时，获得发酵液，每100mL的发酵培养基接种6mL的种瓶培养物，发酵培养期间每隔25小时补加营养物质的重量百分比为：甘油0.1%，蛋白胨0.1%以及多聚异戊二烯0.01%，发酵培养基的配方为：在上述种瓶培养基中添加聚氧乙烯油醚1g/L；
（4）取上述发酵液，加入聚合氯化铝进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体；
（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻5分钟，然后在室温中融化；
（6）重复上述步骤（5）5次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；
（7）纯化：
a、用20mL正己烷对上述破碎菌体进行萃取，提取有机层并旋转蒸发，得到维生素K2粗品；
b、取维生素K2粗品，溶于5mL无水乙醇中，用溶胀好的HZ807树脂装柱30mL，连接紫外检测器和收集器，以3BV/h的流速将维生素K2粗品溶液倒入层析柱上，然后用100%工业乙醇对树脂进行洗脱，洗脱至紫外检测器所示数值恒定不变，此时大部分杂质基本被洗脱干净了，再用丙酮溶液将维生素K2洗脱下来，获得的丙酮洗脱液置于0℃下静置，即得到维生素K2粗分品；
c、将适量的硅胶装入层析柱中，硅胶装入层析柱的高径（直径）比为4：1，取维生素K2粗分品溶于体积比为12：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脱剂中，从层析柱顶端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脱的流速为2BV/h；
（8）将上述纯品提取液干燥，获得所述维生素K2的纯品。
实施例3
本实施例提供的另一种维生素K2的制备方法，包括以下步骤：
（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，38℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏15天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培养基的配方为：甘油12g/L，蛋白胨12g/L，酵母提取物4.5g/L，氯化钠6g/L，磷酸氢二钾10g/L，硫酸镁4g/L，琼脂20g/L；
（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，每50mL种瓶培养基接种0.5立方厘米的斜面保藏菌，在38℃下摇瓶培养48小时，摇瓶转速200rpm，获得种瓶培养物，所述种瓶培养基的配方为：甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物3.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁5g/L；
（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于38℃下发酵培养144小时，获得发酵液，每100mL发酵培养基接种10mL的种瓶培养物，发酵培养期间每隔30小时补加营养物质的体积百分比为：甘油0.15%，蛋白胨0.15%，松柏油0.01%，1-羟基-2-萘甲酸0.02%以及松香0.02%，发酵培养基的配方为：甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物3.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁5g/L，聚氧乙烯油醚1.5g/L；
（4）取上述发酵液，加入聚丙烯酰胺进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体；
（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻10分钟，然后在室温中融化；
（6）重复上述步骤（5）6次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；
（7）纯化：
a、用10mL正己烷和异丙醇（体积比为4：1）对上述破碎菌体进行萃取，提取有机层并旋转蒸发，得到维生素K2粗品；
b、取维生素K2粗品，溶于5mL无水乙醇中，用溶胀好的HZ806树脂装柱30mL，连接紫外检测器和收集器，以3BV/h的流速将维生素K2粗品溶液倒入层析柱上，然后用100%工业乙醇对树脂进行洗脱，洗脱至紫外检测器所示数值恒定不变，此时大部分杂质基本被洗脱干净了，再用丙酮溶液将维生素K2洗脱下来，获得的丙酮洗脱液置于0℃下静置，即得到维生素K2粗分品；
c、将适量的硅胶装入层析柱中，硅胶装入层析柱的高径（直径）比为6：1，取维生素K2粗分品溶于体积比为20：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脱剂中，从层析柱顶端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脱的流速为4.5BV/h；
（8）将上述纯品提取液干燥，获得维生素K2的纯品。
实施例4
本实施例提供的另一种维生素K2的制备方法，包括以下步骤：
（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，30℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏12天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培养基的配方为：甘油10g/L，蛋白胨12g/L，酵母提取物4g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁3g/L，琼脂20g/L；
（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，每50mL种瓶培养基接种0.5立方厘米的斜面保藏菌，在30℃下摇瓶培养35小时，摇瓶转速150rpm，获得种瓶培养物，所述种瓶培养基配方为：甘油8g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁4g/L；
（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于35℃下发酵培养140小时，获得发酵液，每100mL发酵培养基接种8mL种的瓶培养物，发酵培养期间每隔25小时补加营养物质的重量百分比为：甘油0.05%，蛋白胨0.15%，对羟基萘0.015%以及对苯醌0.015%，发酵培养基的配方为：甘油4g/L，蛋白胨6g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸镁4g/L，聚氧乙烯油醚1.5g/L；
（4）取上述发酵液，加入亚铁氰化钾进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体；
（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻5分钟，然后在室温中融化；
（6）重复上述步骤（5）5次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；
（7）纯化：
a、用20mL正己烷和甲醇（体积比为5：1）对上述破碎菌体进行萃取，提取有机层并旋转蒸发，得到维生素K2粗品；
b、取维生素K2粗品，溶于5mL无水乙醇中，用溶胀好的HZ818树脂装柱30mL，连接紫外检测器和收集器，以3BV/h的流速将维生素K2粗品溶液倒入层析柱上，然后用100%工业乙醇对树脂进行洗脱，洗脱至紫外检测器所示数值恒定不变，此时大部分杂质基本被洗脱干净了，再用丙酮溶液将维生素K2洗脱下来，获得的丙酮洗脱液置于0℃下静置，即得到维生素K2粗分品；
c、将适量的硅胶装入层析柱中，硅胶装入层析柱的高径（直径）比为5：1，取维生素K2粗分品溶于体积比为12：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脱剂中，从层析柱顶端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脱的流速为1.5BV/h；
（8）将上述纯品提取液干燥，获得维生素K2的纯品。
实施例5
本实施例提供的另一种维生素K2的制备方法，包括以下步骤：
（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，37℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏3天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培养基的配方为：甘油10g/L，蛋白胨12g/L，酵母提取物4g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂20g/L；
（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，每50mL种瓶培养基接种0.5立方厘米的斜面保藏菌，在37℃下摇瓶培养45小时，摇瓶转速220rpm，获得种瓶培养物，所述种瓶培养基配方为：甘油4g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁0.1g/L；
（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于37℃下发酵培养130小时，获得发酵液，每100mL发酵培养基接种6mL的种瓶培养物，发酵培养期间每隔25小时补加营养物质的重量百分比为：甘油0.15%，蛋白胨0.15%以及甲萘醌0.02%，发酵培养基的配方为：甘油4g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁0.1g/L，聚氧乙烯油醚1.5g/L；
（4）取上述发酵液，加入硫酸锌进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体；
（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻3分钟，然后在室温中融化；
（6）重复上述步骤（5）3次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；
（7）纯化：
a、用20mL正己烷和正丁醇（体积比为3：1）对上述破碎菌体进行萃取，提取有机层并旋转蒸发，得到维生素K2粗品；
b、取维生素K2粗品，溶于5mL无水乙醇中，用溶胀好的HZ820树脂装柱30mL，连接紫外检测器和收集器，以3BV/h的流速将维生素K2粗品溶液倒入层析柱上，然后用100%工业乙醇对树脂进行洗脱，洗脱至紫外检测器所示数值恒定不变，此时大部分杂质基本被洗脱干净了，再用丙酮溶液将维生素K2洗脱下来，获得的丙酮洗脱液置于0℃下静置，即得到维生素K2粗分品；
c、将适量的硅胶装入层析柱中，硅胶装入层析柱的高径（直径）比为4：1，取维生素K2粗分品溶于体积比为16：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脱剂中，从层析柱顶端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脱的流速为4BV/h；
（8）将上述纯品提取液干燥，获得所述维生素K2的纯品。
以上实施例1～5均做两次重复。
以下为实施例1～5获得的产品产量和纯度的测定及结果：
1、维生素K2粗品的产量测定：
取实施例1～5中步骤二（4）得到的维生素K2粗品进行称量，计算产量，所述产量的计算公式为：
产量（mg/L）=粗品质量（mg）/发酵液体积（L）
2、维生素K2粗品的纯度测定：
1）配置流动相：所述流动相为体积比为4：1的甲醇与二氯甲烷的混合溶液。
2）准确称取MK-4、MK-5和MK-6标准品，用流动相分别配制成含量为1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL和3.0mg/mL的溶液，微孔滤膜（0.45μm）过滤，取滤液，即为对照品溶液；
3）利用高效液相色谱法测定对照品，获得对照品浓度-峰面积的标准曲线；
4）取实施例1～5中步骤二（4）获得的维生素K2粗品至5mL具塞离心管中，加入流动相振荡溶解，微孔滤膜（0.45μm）过滤，取滤液，高效液相色谱法测定，获得MK-4、MK-5和MK-6的峰面积，带入标准曲线计算出维生素K2的浓度，将浓度×粗品总体积，获得粗品中含有的维生素K2的质量，利用如下公式计算纯度：
纯度=（维生素K2的质量/维生素K2粗品的质量）×100%
测定结果如下表1所示：
表1：实施例1～5获得的维生素K2粗品的产量及纯度
3、维生素K2纯品的产量和纯度的测定：
取实施例1～5制备获得的维生素K2纯品，称重，利用高效液相色谱法测定纯品中维生素K2的产量和纯度（测定步骤同上述维生素K2粗品的产量和纯度的测定），结果如下表2所示：
表2：实施例1～5获得的维生素K2纯品的产量及纯度
由上述表1和表2的结果可以看出，本发明制备获得的微生物K2粗品的产量达200～600mg/L，粗品的纯度为67～76%，而谷吉树课题组提出的制备方法中，维生素K2的产量为14.1～280mg/L，同时，经过萃取、粗分和精制的过程，维生素K2纯品的产量为200～450mg/L，而纯度达到80～99%，因此，本发明的制备方法与现有技术相比，维生素K2的产量和纯度都得到了大幅提高，该纯度下的维生素K2可广泛应用于医药和保健品领域。
Claims (10)
1.一种维生素K2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，30～38℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏2～15天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌；
（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，在30～38℃下摇瓶培养24～48小时，获得种瓶培养物；
（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于28～38℃下发酵培养120～144小时，获得发酵液，发酵培养期间每隔20～30小时补加营养物质，所述营养物质为甘油、蛋白胨和维生素K2生物合成的前体物质；
（4）取上述发酵液，加入絮凝剂进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体；
（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻3～10分钟，然后在室温中融化；
（6）重复上述步骤（5）2～6次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；
（7）取上述破碎菌体，先用有机溶剂进行萃取，获得维生素K2粗品，再用大孔吸附树脂对维生素K2粗品进行粗分，最后用硅胶柱精制，获得维生素K2的纯品提取液；
（8）将上述纯品提取液干燥，获得所述维生素K2的纯品。
2.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的斜面培养基配方为：甘油8～12g/L，蛋白胨8～12g/L，酵母提取物1.5～4.5g/L，氯化钠2～6g/L，磷酸氢二钾2～10g/L，硫酸镁0.1～4g/L，琼脂20g/L；
所述步骤（2）的种瓶培养基配方为：甘油4～10g/L，蛋白胨4～10g/L，酵母提取物1.5～3.5g/L，氯化钠2～5g/L，磷酸氢二钾2～8g/L，硫酸镁0.05～5g/L；
所述步骤（3）的发酵培养基配方为：甘油4～10g/L，蛋白胨4～10g/L，酵母提取物1.5～3.5g/L，氯化钠2～5g/L，磷酸氢二钾2～8g/L，硫酸镁0.05～5g/L，聚氧乙烯油醚0.5～1.5g/L。
3.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，斜面保藏菌的接种量为每50mL种瓶培养基接种0.1～0.5立方厘米的斜面保藏菌。
4.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，种瓶培养物的接种量占发酵培养基的体积百分比为4～10%。
5.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，营养物质添加的重量百分比为：甘油0.05～0.15%，蛋白胨0.05～0.15%，前体物质0.005～0.05%，所述前体物质为异戊二烯、多聚异戊二烯、松柏油、松香、1,4-二羟基-2-萘甲酸、1-羟基-2-萘甲酸、甲萘醌、对苯醌、对羟基萘中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的絮凝剂为明矾、聚合氯化铝、聚丙烯酰胺、亚铁氰化钾或硫酸锌。
7.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中的有机溶剂为正己烷、异丙醇、甲醇、正丁醇中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中的大孔吸附树脂的型号为HZ8l6、HZ807、HZ806、HZ818或HZ820。
9.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）的硅胶柱精制中，洗脱溶剂为体积比为10～20：1的正己烷与乙酸乙酯混合液，洗脱流速为0.5～4.5BV/h。
10.一种利用如权利要求1～9任一所述的维生素K2的制备方法制备获得的维生素K2，其特征在于，所述维生素K2的组分为MK-4、MK-5或MK-6中的一种或多种。
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