CN102191293A - 一种微生物转化制备(s)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法 - Google Patents

一种微生物转化制备(s)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法 Download PDF

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沈文和
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Abstract

本发明公开了一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法，所述的方法为：以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于20～40℃下，转化反应时间为8～72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯；该微生物转化方法反应条件温和，环境友好，产物光学纯度高，底物转化率较高，分离纯化过程简单，催化剂可重复利用，适于工业化生产。

Description

一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法，特别涉及一种以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，进行转化反应制备产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法。
(二)背景技术
(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯(Ethyl(S)-3-hydroxy-3-(2-thienyl)-propanoate)，分子式C9H12O3S，分子量200。(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯是新型抗抑郁药物度洛西汀的重要手性中间体。度洛西汀(Duloxetine)是一种5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂(SNRIs)，用于治疗各种类型的抑郁症，可以作用于与抑郁症相关的两个关键神经递质，改善躯体症状。抑郁症躯体症状经常被忽视，治疗中超过80％的抑郁症患者仍有躯体症状，其中包括疼痛。据认为未考虑抑郁症躯体症状是漏诊的最主要原因之一。疼痛病理学证实，在脊髓疼痛传递通路中，5-羟色胺和去甲肾上腺素共同作用以传递痛觉信息，度洛西汀对抑郁症的其他躯体症状如全身疼痛和胃肠紊乱有疗效，因而比目前的抗抑郁药物具有优势，这些症状在现有常规疗法中未予治疗。度洛西汀可能通过阻断5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取，增加神经递质水平，继而刺激控制尿道外括约肌的阴部神经，通过刺激增强了尿道外括约肌的收缩性，预防尿失禁的发生。可治疗由糖尿病引起的周围神经疼痛症状。文献Wada，M.等人于2004年的期刊Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，Vol.68(2004)，No.7 pp.1481-1488中报道了采用游离微生物细胞不对称还原3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯合成(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的过程，从土壤筛选得到NADPH-依赖型脱氢酶菌种Exiguobacterium sp.F42，将其酶基因在Escherichia coli重组表达，得到的酶用于催化底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯选择性还原，0.05mol/L底物，磷酸钾缓冲液pH7.0，温度30℃，时间6h，产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯产率80％，光学纯度大于98％。上述微生物法实现不对称还原可以采用高产选择性还原酶的微生物为催化剂来实现，微生物易于实现大规模的培养，反应条件温和，环境友好。因此，以微生物为催化剂不对称还原3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的是制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的理想方法，理论上可以将反应物100％地转化为产物，易于实现大规模工业化生产。但是反应过程中底物的添加量仅为0.05mol/L，反应过程的生产效率不高。同时，分离提取过程中萃取时会产生严重的乳化现象，影响提取收率。
由于固定化微生物细胞在有机相中仍然具有很好的催化能力，采用固定化微生物细胞做为生物催化剂不对称还原底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯有利于实现微生物细胞的重复利用，有利于简化产物的分离提取，有利于转化反应的连续进行，有利于实现(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的工业化生产。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法，该方法具有环境友好、反应条件温和、生产菌株安全无毒、不受季节影响、生产操作简便，生物转化率较高等优点。
本发明采用的技术方案是：
一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法为：以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，进行转化反应制备产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。
进一步，所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法按照以下步骤进行：以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于20～40℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。
本发明在邻苯二甲酸二丁酯中底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的初始浓度0.01～3mol/L，优选为0.01～1mol/L，进一步优选为0.2mol/L。
本发明所述的生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基20～40℃中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。所述发酵液中菌体浓度定义为单位体积的发酵液中所含有的菌体的干重。
所述的生物催化剂按以下方法制备：将经酿酒酵母菌株CGMCCNo.2266发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠水溶液混合，所述的发酵液菌体浓度为2.0～25.0g/L，搅拌均匀得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙水溶液中，连续搅拌，获得固定化悬浮液，将悬浮液于35～38℃下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中20～40℃进行增殖培养16～72h，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂；所述氯化钙水溶液以能使固定化细胞颗粒悬浮为宜，一般推荐每10～400mL含有菌体的海藻酸钠混合液加入氯化钙水溶液100～1000mL；所述的用于固定化细胞颗粒增殖培养的发酵培养基的用量以使固定化细胞颗粒悬浮为宜，发酵培养基的体积用量一般推荐为每10～300g固定化细胞颗粒加入100～1000mL发酵培养基。
所述的固定化细胞颗粒的直径为1～5mm，优选为2mm，增殖培养后的固定化细胞颗粒的直径基本没有变化。
微生物在固定化细胞颗粒中的增殖培养不会导致固定化细胞颗粒的大小发生太大变化，本发明所述增殖培养后的固定化细胞颗粒大小与增殖培养前固定化细胞颗粒大小相比，变化不大，对本发明结果没有影响。
进一步，所述的生物催化剂具体按照以下步骤制备：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠水溶液混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液于37℃条件下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中30℃进行增殖培养24h，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂。
所述的反应结束后，从生物转化体系中获得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯纯品的方法为：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，得到混合物，得到的混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比10∶1，先采用体积比为90∶10石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用体积比80∶20石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，制得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，再用体积比70∶30的石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱硅胶柱回收利用。
所述的发酵液按照以下步骤制备：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，蛋白胨0.4～0.6g/L，葡萄糖0.7～1.2g/L，琼脂1.5～2.5g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：葡萄糖2.6～3.2g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，硫酸铵0.3～0.6g/L，无水MgSO40.02～0.04g/L，K2HPO4·3H2O 0.05～0.15g/L，KH2PO40.06～0.15g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述的发酵培养基的终浓度组成：葡萄糖2.6～3.2g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，硫酸铵0.3～0.6g/L，无水MgSO40.02～0.04g/L，K2HPO4·3H2O0.05～0.15g/L，KH2PO40.06～0.15g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却。
所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，推荐按照以下步骤进行：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，蛋白胨0.4～0.6g/L，葡萄糖0.7～1.2g/L，琼脂1.5～2.5g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：葡萄糖2.6～3.2g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，硫酸铵0.3～0.6g/L，无水MgSO40.02～0.04g/L，K2HPO4·3H2O 0.05～0.15g/L，KH2PO40.06～0.15g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述发酵液菌体浓度为3～10g/L；所述的发酵培养基的组成与步骤(2)所述的种子培养基组成相同；
(4)细胞固定化：将步骤(3)制得的发酵液与等体积2％的海藻酸钠水溶液相混合，搅拌均匀得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，获得固定化悬浮液，将固定化悬浮液在37℃条件下固化，获得固定化颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中30℃进行增殖培养24h，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂；
(5)生物转化：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液经分离纯化得到(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯；在邻苯二甲酸二丁酯中底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的初始浓度为0.01～1mol/L，所述的生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中20～40℃增殖培养24～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述的转化过程中，间隔1～10h取出1mL转化液作为样品，将样品经有机滤膜过滤后采用高效液相色谱进行检测，流动相为正己烷/异丙醇(95/5)，在紫外220nm处检测样品中产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的产量及对映体过剩值(ee％)；所述的转化液样品中含有邻苯二甲酸二丁酯、底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯和产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯；
(6)分离纯化：反应结束后，从生物转化体系中获得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯纯品的方法为：反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯获得混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比10∶1，先采用体积比为90∶10石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用体积比80∶20石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，制得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，再用体积比70∶30的石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱硅胶柱回收利用。
本发明所述发酵液菌体浓度根据发酵液中菌落数计算，当发酵液中菌落数为2×1011个/mL时，发酵液的菌体浓度为4.3g/L。
所述发酵液菌体干重的测定是将发酵液离心分离后，弃去上清液，将湿细胞在120℃烘干48小时至恒重，测定干细胞的重量；取部分发酵液中离心所得湿细胞测定细胞干重，计算出发酵液中单位含酶菌体细胞中干菌体比率，再以这个比率计算定量菌体干重所需含有含酶菌体细胞发酵液用量。
酿酒酵母CGMCC No.2266，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No.2266，保藏日期2007年11月26日。
菌株来源：本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCC No.2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，得到酿酒酵母CGMCC No.2266具有良好的转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯生产(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的能力。
所述酿酒酵母CGMCC No.2266的菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。
本发明采用固定化细胞颗粒作为催化剂，将3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯还原为(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的生物转化机理如下：
Figure BDA0000050959300000081
3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯    (S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯
本发明得到的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯纯品用液相色谱-质谱联用仪进行检测确定产物的纯度和分子量。
本发明摩尔转化率和产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯对映体过剩值(ee％)的确定：
采用安捷伦1200液相色谱仪分析检测。色谱柱为手性柱，型号为Daicel OB-H；流动相为正己烷/异丙醇(95/5)；紫外检测波长为220nm。手性柱可以检测到(R)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯和(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯两种对映体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的对映体过剩值(ee％)。
过滤得到的固定化细胞颗粒可重复使用于微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的反应。
利用本发明方法生产的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯对映体过剩值大于99.0％，底物摩尔转化率可以达到98.7％，产品纯度达到99.8％，硅胶柱层析产物提取收率为93.2%固定化细胞颗粒可以重复利用10次。
与现有技术相比，本发明的有意效果主要体现在：
(1)本发明采用的微生物转化法制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯具有环境友好、反应条件温和、生产所用的菌株安全无毒、不受季节影响、生产操作简便、生物转化率较高等优点；(2)固定化细胞作为生物催化剂有利于实现产物的分离提取及实现催化剂的重复利用，节约成本；(3)易于实现大规模工业化生产；(4)邻苯二甲酸二丁酯可以溶解大量的底物和产物，可以降低有机底物和产物对生物催化反应过程的抑制作用，提高底物的转化量，提高生物转化的生产效率。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述硅胶柱层析，硅胶型号100目，柱床高径比10∶1，先采用体积比为90∶10石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用体积比80∶20石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，制得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，再用体积比70∶30的石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱硅胶柱回收利用。
本发明固定化细胞颗粒增殖培养后的粒径与增殖培养前的粒径没有大差别，微生物增殖的菌体是生长在凝胶的网格状结构中的，增殖培养后的粒径与培养前没有尺寸上的差别，所以以增殖培养前固定化细胞颗粒的直径为实验依据。
实施例1
斜面培养基的配制：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水，121℃灭菌20min，制成斜面备用。
种子培养基的配制：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO40.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO41g/L，自然pH值，溶剂为水，121℃灭菌20min，备用。
发酵培养基组成与种子培养基组成相同。
斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266菌种接种在斜面培养基中，30℃培养4～6天，获得菌体斜面。
种子培养：用接种针从菌体斜面中取一接种环菌体接种在含有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得种子液；
发酵培养：将种子液以10％的接种量接种于含有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，所得发酵液用于菌体的固定化，发酵液的菌体浓度为4.3g/L。
细胞固定化：将菌体浓度为4.3g/mL发酵液100mL5份分别与等体积质量浓度为1％、2％、3％、4％和5％的海藻酸钠水溶液混合，将混合液分别装入直径大小为2mm注射器，滴入500mL3.5％(w/v)CaCl2水溶液中形成固定化细胞颗粒，颗粒直径大小为2mm，于37℃固化30min，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在500mL发酵培养基中30℃增殖培养24h，过滤，分别获得增殖后的固定化细胞颗粒5份，备用。
生物转化：将5份增殖培养后的固定化细胞颗粒分别加入到含有0.18mol3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的300mL邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每份固定化细胞转化液间隔8h取样1mL作为样品液，样品液经有机滤膜过滤后采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表1所示，转化反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯获得混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，制得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。结果表明，固定化过程中，海藻酸钠的浓度对固定化细胞颗粒的生物转化能力有影响，当海藻酸钠的浓度为最佳浓度2％时，生物转化的摩尔转化率可以达到82.7％，在5种不同浓度的海藻酸钠包埋条件下获得的固定化酿酒酵母CGMCC No.2266颗粒转化底物所得到的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。
表1不同浓度的海藻酸钠溶液固定化酿酒酵母转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯
Figure BDA0000050959300000111
实施例2
将酿酒酵母CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体浓度为4.3g/mL的发酵液100mL4份分别与等体积质量浓度为2％的海藻酸钠水溶液混合，将混合液分别装入针头尺寸2mm、3mm、4mm和5mm的注射器中，逐滴滴入500mL 3.5％(w/v)CaCl2水溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径大小分别为2mm、3mm、4mm和5mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续分别在500mL发酵培养基中30℃增殖培养24h，过滤，获得4份增殖后固定化细胞颗粒，固定化颗粒直径大小分别为2mm、3mm、4mm和5mm。
将上述4份增殖培养后的固定化细胞颗粒分别加入到含有0.18mol3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的300mL邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每份固定化细胞转化液间隔8h取样1mL作为样品液，样品液经有机滤膜过滤后采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表2所示，转化反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯获得混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，制得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。结果表明，固定化细胞颗粒直径的不同对生物转化的摩尔转化率有影响，当固定化细胞颗粒最佳直径为2mm时，生物转化的摩尔转化率达到82.7％，以上述四种直径的固定化颗粒作为催化剂制备的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。
表2不同直径的固定化细胞颗粒转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯
Figure BDA0000050959300000121
Figure BDA0000050959300000131
实施例3
将酿酒酵母CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体浓度为4.3g/mL的发酵液100mL4份分别与等体积质量浓度为2％的海藻酸钠水溶液混合，将混合液分别装入针头尺寸2mm的注射器中，滴入500mL 3.5％(w/v)CaCl2水溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的4份固定化细胞颗粒分别继续在500mL发酵培养基中30℃增殖培养0h、24h、48h和72h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒。
将上述4份增殖培养后的固定化细胞颗粒分别加入含有0.18mol3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的300mL邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，每份固定化细胞转化液取样1mL作为样品液，样品液经有机滤膜过滤后采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表3所示，转化反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯获得混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，制得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。结果表明，固定化细胞颗粒的增殖培养时间越长越有利于摩尔转化率的提高，增殖培养时间达到72h的固定化细胞颗粒用于转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯摩尔转化率可以达到92.6％，以上述4种不同的增殖培养时间获得的固定化细胞颗粒为生物催化剂制备的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。
表3不同增殖培养时间的固定化细胞颗粒转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯
  增殖培养时间(h)   0   24   48   72
  摩尔转化率(％)   0   82.7   88.5   92.6
实施例4
将酿酒酵母CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体浓度为4.3g/mL的发酵液100mL与等体积质量浓度为2％的海藻酸钠水溶液混合，将混合液装入针头尺寸2mm的注射器中，滴入500mL 3.5％(w/v)CaCl2水溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在500mL发酵培养基30℃增殖培养72h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒。
将上述增殖培养后的固定化细胞颗粒加入到含有0.18mol3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的300mL邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后过滤出固定化细胞颗粒，将固定化细胞颗粒重新悬浮在300mL邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，如此重复利用固定化细胞颗粒10次，每次取固定化细胞转化液1mL作为样品液，样品液经有机滤膜过滤后采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表4所示，转化反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯获得混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，制得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。结果表明，固定化细胞颗粒可以很好地重复利用于(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的生物合成，产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。
表4固定化CGMCC No.2266颗粒转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的重复利用
Figure BDA0000050959300000151
实施例5
将酿酒酵母CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体浓度为4.3g/mL的发酵液100mL与等体积质量浓度为2％的海藻酸钠水溶液混合制成混合液，将混合液装入针头尺寸2mm的注射器中，滴入500mL 3.5％(w/v)CaCl2水溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在500mL发酵培养基中30℃增殖培养72h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒。
将增殖培后的固定化细胞颗粒加入到5份3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯初始浓度分别为0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L和1.0mol/L的300mL邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，分别取固定化细胞转化液1mL作为样品液，样品液经有机滤膜过滤后采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表5所示，转化反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯获得混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，制得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。结果表明，底物初始浓度对固定化细胞生物转化3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的摩尔转化率有较大影响。反应的摩尔转化率随着底物浓度的提高而降低。当底物初始浓度为0.2mol/L时，反应的摩尔转化率可以达到98.7％。在上述5种不同的底物初始浓度条件下的生物转化过程中，产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。
表5固定化CGMCC No.2266转化不同初始浓度的3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯
Figure BDA0000050959300000161

Claims (10)

1.一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的方法，其特征在于所述的方法为：以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，进行转化反应制备产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。
2.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行：以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于20～40℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯。
3.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的初始浓度为0.01～3mol/L。
4.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中20～40℃增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度为单位体积的发酵液中所含有的菌体的干重。
5.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的生物催化剂按以下方法制备：将经酿酒酵母菌株CGMCCNo.2266发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠水溶液混合，所述的发酵液菌体浓度为2.0～25.0g/L，搅拌均匀获得含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为2.5～4.0％的氯化钙水溶液中制成悬浮液，连续搅拌，获得固定化细胞悬浮液，将悬浮液于35～38℃条件下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中20～40℃进行增殖培养16～72h，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。
6.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的固定化细胞颗粒的直径为1～5mm。
7.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的生物催化剂具体按照以下步骤制备：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠水溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液在37℃条件下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后散于发酵培养基中30℃进行增殖培养24h，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂。
8.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的分离纯化方法为：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯得到混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比10∶1，先采用体积比为90∶10石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用体积比80∶20石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，制得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，再用体积比70∶30的石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱硅胶柱回收利用。
9.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的发酵液按照以下步骤制备：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，蛋白胨0.4～0.6g/L，葡萄糖0.7～1.2g/L，琼脂1.5～2.5g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：葡萄糖2.6～3.2g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，硫酸铵0.3～0.6g/L，无水MgSO40.02～0.04g/L，K2HPO4·3H2O 0.05～0.15g/L，KH2PO40.06～0.15g/L，自然pH值，溶剂为水；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述的发酵培养基的终浓度组成为：葡萄糖2.6～3.2g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，硫酸铵0.3～0.6g/L，无水MgSO40.02～0.04g/L，K2HPO4·3H2O 0.05～0.15g/L，KH2PO40.06～0.15g/L，自然pH值，溶剂为水。
10.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的制备方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，蛋白胨0.4～0.6g/L，葡萄糖0.7～1.2g/L，琼脂1.5～2.5g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：葡萄糖2.6～3.2g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，硫酸铵0.3～0.6g/L，无水MgSO40.02～0.04g/L，K2HPO4·3H2O 0.05～0.15g/L，KH2PO40.06～0.15g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述发酵液菌体浓度为3～10g/L；所述的发酵培养基组成与步骤(2)所述的种子培养基组成相同；
(4)细胞固定化：将步骤(3)制备的发酵液与等体积2％的海藻酸钠水溶液相混合，搅拌均匀得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，获得固定化悬浮液，将固定化悬浮液在37℃条件下固化，获得固定化颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中30℃进行增殖培养24h，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂；
(5)生物转化：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯为底物，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液经分离纯化得到(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯；在邻苯二甲酸二丁酯中底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯的初始浓度为0.01～1mol/L，所述的生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中20～40℃增殖培养24～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；
(6)分离纯化：反应结束后，从生物转化体系中获得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯纯品的方法为：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，得到混合物，得到的混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比10∶1，先采用体积比为90∶10石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用体积比80∶20石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，制得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙酸乙酯，再用体积比70∶30的石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱硅胶柱回收利用。
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