CN101205548B - 酿酒酵母在制备(s)-(-)-3-氯-1-苯丙醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物新菌种：酿酒酵母CGMCC No.2230在微生物转化制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇中的应用。所述的应用为：以3-氯-1-苯丙酮为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于25～30℃下，转化反应时间为8～72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇。该微生物转化方法环境友好，反应条件温和，产物分离简单，底物转化率高，产品纯度好，催化剂可重复利用，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物新菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2230在微生物转化制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇中的应用。
背景技术
(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇((S)-(-)-3-Chloro-1-phenylpropanol)，分子式为C9H11ClO，分子量170.64，比旋度为-26°(c＝1，氯仿)。(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇可以合成(S)-氟西汀，(S)-氟西汀在人体内药物作用持续的时间是(R)-氟西汀的3倍。氟西汀又称百忧解，是一种选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，能有效地抑制神经元从突触间隙中摄取5-羟色胺，增加间隙中可供实际利用的这种神经递质，从而改善情感状态，治疗抑郁性精神障碍。适应于治疗各种抑郁性精神障碍、包括轻性或重性抑郁症、双相情感性精神障碍的抑郁症，心因性抑郁及抑郁性神经症。目前，氟西汀是抗抑郁的一线用药。
利用化学法和生物法均可以实现3-氯-1-苯丙酮的羰基不对称还原制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇。化学法合成手性化合物需要制备手性催化剂，手性催化剂的制备过程繁琐，价格昂贵。采用微生物细胞不对称还原3-氯-1-苯丙酮具有反应条件温和、环境友好的特点；微生物细胞易于生长繁殖，价廉易得；微生物细胞产生的羰基还原酶立体选择性好，可以获得高光学纯度的(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇。
1992年，伊藤美智夫等人在日本专利公开特许公报4-234989中报道过采用IFO10253、IFO10182、DSM70269和DSM70718等菌种在水相体系中不对称还原3-氯-1-苯丙酮制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇。以IFO10182为生产菌种，产物的对映体过剩值＞98％，但转化率仅有3.9％。转化率过低不适用于工业化生产。
已有的专利报道中采用游离细胞在水相体系进行生物转化，有机底物在水中的溶解度很低，因此生物转化效率较低；游离细胞的催化活性容易受到外界环境变化的影响，重复利用的效率较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用酿酒酵母CGMCCNo.2230生物转化3-氯-1-苯丙酮合成(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的方法。
酿酒酵母CGMCC No.2230，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No.2230，保藏日期2007年10月24日。
菌株来源：本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCCNo.2230是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化3-氯-1-苯丙酮，得到酿酒酵母CGMCC No.2230具有良好的选择性转化3-氯-1-苯丙酮生产(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的能力。
所述酿酒酵母CGMCC No.2230的菌落特征和生化特性：在琼脂培养基上为乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，菌落质地均匀。
所述酿酒酵母CGMCC No.2230可用于微生物转化制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇。
所述的应用具体为：以3-氯-1-苯丙酮为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于25～30℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇。
在上述转化中，在邻苯二甲酸二丁酯中，所述的底物3-氯-1-苯丙酮的初始浓度推荐为5.86～58.6mmol/L；每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重/发酵液体积。
上述生物催化剂通过酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液以包埋法制得，具体制备步骤可按照如下进行：将经酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为2.5～4.0％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒。将得到的固定化颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为本发明的生物催化剂。
所述的固定化细胞颗粒的直径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为1～5mm，最优选2mm。
在包埋处理过程中，海藻酸钠的浓度推荐为1～5％，最优选2％。
本发明采用固定化细胞颗粒作为催化剂，将3-氯-1-苯丙酮还原为(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的生物转化机理如下：
本发明所述的应用可按如下方法获得发酵液：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2230菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得环菌体；所述的斜面培养基组成(g/L)：麦芽汁0.5～1.5％，酵母粉0.2～0.4％，蛋白胨0.4～0.6％，葡萄糖0.7～1.2％，琼脂1.5～2.5％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基组成(g/L)：葡萄糖2.6～3.2％，酵母粉0.2～0.4％，硫酸铵0.3～0.6％，无水MgSO4 0.02～0.04％，K2HPO4·3H2O 0.05～0.15％，KH2PO4 0.06～0.15％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述的发酵培养基的组成同种子培养基。
具体推荐按照如下步骤处理获得生物催化剂：将前述方法得到的发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h得到增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。
具体推荐所述的应用为：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以3-氯-1-苯丙酮为底物，在邻苯二甲酸二丁酯中，于30℃、180r/min条件下转化反应72h，转化液经分离纯化得到产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇；所述的分离纯化可采用如下步骤：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，得到的有机相层旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，获得样品混合物，利用硅胶柱层析将样品混合物分离得到产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇；每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；在邻苯二甲酸二丁酯中所述的底物3-氯-1-苯丙酮的初始浓度为5.86～58.6mmol/L。
转化率和产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇对映体过剩值(ee％)的确定：
采用气相色谱仪分析检测。色谱柱采用手性柱，型号为HP Chiral10％β-Cyclodextrin(30m×0.32mm×0.25um)；检测条件：载气为氮气，进样器、色谱柱和检测器温度分别为250℃、130℃和255℃；离子火焰检测器。手性柱可以检测到(R)-(+)-3-氯-1-苯丙醇和(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇两种对映体的含量，进一步计算出反应的转化率和(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的对映体过剩值(ee％)。
过滤得到的固定化细胞颗粒可重复使用于微生物转化制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的反应。
本发明的有意效果体现在以下几个方面：
1、本发明采用的微生物转化法生产(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇与化学合成法相比具有以下优点：①生产所用的菌株安全无毒。②生物催化剂比化学催化剂成本低廉。③反应的立体选择性好，生产操作简便，生物转化效率较高。④环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化。⑤不受季节影响，易于实现大规模工业化生产。
2、本发明中采用固定化细胞在邻苯二甲酸二丁酯介质中进行生物转化与传统的游离细胞在水相中的生物转化相比具有如下优点：①固定化细胞作为生物催化剂有利于实现产物的分离提取。②固定化细胞作为生物催化剂有利于实现催化剂的重复利用，节约成本。③易于实现大规模工业化生产。④邻苯二甲酸二丁酯具有较好的生物相容性，对微生物细胞的催化活性影响较小。
利用本发明方法生产(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的产品纯度达到99.6％，产物的对映体过剩值＞98％，底物摩尔转化率达到85.2％，硅胶柱层析产物提取收率为96.2％，固定化细胞颗粒可以重复利用8次。
附图说明
图1为实施例1的工艺流程示意图。
具体实施方式
下面以具体实施例来进一步阐释本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
斜面培养：将CGMCC No.2230菌种接种在含麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值的培养基中进行培养。30℃培养4～6天。
种子培养和发酵：种子和发酵培养基均采用液体培养基，成分为葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4 0.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以10％的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，用获得的发酵液用于菌体的固定化。
将5瓶菌体干重为430mg的100ml发酵液分别与等体积浓度为1％、2％、3％、4％和5％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，颗粒直径大小为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。
将5种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到300ml邻苯二甲酸二丁酯的反应体系中，加入17.58mmol 3-氯-1-苯丙酮，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每隔8h取样，采用气相色谱测定产物含量，结果如表1所示。结果表明，固定化过程中，海藻酸钠的浓度对固定化细胞颗粒的生物转化能力有影响，当海藻酸钠的浓度为最佳浓度2％时，生物转化的摩尔转化率可以达到72.2％。上述生物转化条件下，产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的对映体过剩值均＞98％。
表1不同浓度的海藻酸钠溶液固定化CGMCC No.2230转化3-氯-1-苯丙酮
实施例2
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将4瓶菌体干重为430mg的100ml发酵液分别与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的4瓶固定化细胞颗粒分别继续在液体培养基中增殖培养0h、24h、48h和72h。
将4种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到300ml邻苯二甲酸二丁酯的反应体系中，加入17.58mmol 3-氯-1-苯丙酮，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后，采用气相色谱测定产物含量，结果如表2所示。结果表明，固定化细胞颗粒的增殖培养时间越长越有利于生物转化率的提高，增殖培养时间达到72h的固定化细胞颗粒用于转化3-氯-1-苯丙酮摩尔转化率可以达到73.8％。采用不同增殖培养时间获得的固定化细胞颗粒用于生物转化，产物的对映体过剩值均＞98％。
表2不同增殖培养时间的固定化细胞颗粒转化3-氯-1-苯丙酮
| 增殖培养时间(h) | 0 | 24 | 48 | 72 |
| 摩尔转化率(％) | 0 | 72.2 | 73.6 | 73.8 |
实施例3
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的100ml发酵液与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。
将上述增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到5瓶盛有300ml邻苯二甲酸二丁酯的三角瓶中，每瓶中含有菌体干重为430mg的100ml发酵液制备的固定化细胞颗粒。在上述5瓶三角瓶中分别加入8.79、17.58、26.37、35.16和43.95mmol 3-氯-1-苯丙酮，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后过滤出固定化细胞颗粒活化备用，采用气相色谱测定产物含量，结果如表3所示。结果表明，随着底物浓度的增加转化率逐渐降低，底物加入量为8.79mmol时，摩尔转化率为85.2％。说明底物浓度过高对生物转化反应存在抑制作用。不同的底物加入量用于生物转化，产物的对映体过剩值均＞98％。
表3固定化细胞颗粒转化不同量的3-氯-1-苯丙酮
| 3-氯-1-苯丙酮的加入量(mmol) | 8.79 | 17.58 | 26.37 | 35.16 | 43.95 |
| 摩尔转化率(％) | 85.2 | 72.2 | 58.7 | 33.5 | 18.2 |
实施例4
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重分别为172mg、344mg、430mg、516mg和602mg的100ml发酵液与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。
将上述不同菌体干重的发酵液形成的增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到5瓶300ml邻苯二甲酸二丁酯的三角瓶中，分别加入17.58mmol 3-氯-1-苯丙酮，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后过滤出固定化细胞颗粒，采用气相色谱测定产物含量，结果如表4所示。结果表明，转化体系中固定化细胞颗粒的用量增加有利于提高转化率。采用将菌体干重为602mg的100ml发酵液形成的固定化细胞颗粒转化3-氯-1-苯丙酮的转化率为79.5％。在上述生物转化条件下获得的产物对映体过剩值均＞98％。
表4不同菌体干重的发酵液形成的固定化细胞颗粒转化3-氯-1-苯丙酮
实施例5
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的发酵液与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。
将增殖培养好的固定化细胞颗粒加入到300ml邻苯二甲酸二丁酯的反应体系中，加入17.58mmol 3-氯-1-苯丙酮，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后过滤出固定化颗粒，将固定化细胞颗粒重新悬浮在300ml邻苯二甲酸二丁酯的反应体系中，加入17.58mmol 3-氯-1-苯丙酮，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，如此重复利用固定化细胞颗粒8次，每次都采用气相色谱测定产物含量，结果如表5所示。结果表明，固定化细胞颗粒可以很好的重复利用于3-氯-1-苯丙酮的生物转化，第8次的转化效率为第一次转化效率的28.4％。重复利用的条件下产物的对映体过剩值均＞98％。
表5固定化CGMCC No.2230转化3-氯-1-苯丙酮的重复利用
| 重复利用次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 摩尔转化率(％) | 72.2 | 68.5 | 60.3 | 53.5 | 40.4 | 32.8 | 28.6 | 20.5 |
Claims (10)
1.酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2230在微生物转化制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用为：以3-氯-1-苯丙酮为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于25～30℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于在邻苯二甲酸二丁酯中所述的底物3-氯-1-苯丙酮的初始浓度为5.86～58.6mmol/L。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重/发酵液体积。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的生物催化剂的具体制备步骤如下：将经酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为2.5～4.0％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒，将得到的固定化颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的固定化细胞颗粒的直径为1～5mm。
7.如权利要求2～6之一所述的应用，其特征在于所述的应用按如下方法获得发酵液：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2230菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得环菌体；所述的斜面培养基组成以g/L计表示如下：麦芽汁0.5～1.5％，酵母粉0.2～0.4％，蛋白胨0.4～0.6％，葡萄糖0.7～1.2％，琼脂1.5～2.5％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基组成以g/L计表示如下：葡萄糖2.6～3.2％，酵母粉0.2～0.4％，硫酸铵0.3～0.6％，无水MgSO4 0.02～0.04％，K2HPO4·3H2O0.05～0.15％，KH2PO4 0.06～0.15％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述的发酵培养基的组成同种子培养基。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的生物催化剂具体按如下方法获得：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以3-氯-1-苯丙酮为底物，在邻苯二甲酸二丁酯中，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇；所述分离纯化的步骤如下为：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，得到的有机相层旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，获得样品混合物，利用硅胶柱层析将样品混合物分离得到产物(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇；在邻苯二甲酸二丁酯中，所述的底物3-氯-1-苯丙酮的初始浓度为5.86～58.6mmol/L，每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的分离纯化步骤中过滤得到的固定化细胞颗粒重复使用于微生物转化制备(S)-(-)-3-氯-1-苯丙醇的反应。
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