CN107217007A - 一种生产pf1022a的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产PF1022A的发酵培养基及发酵方法。其包括(i)7～13.5％有机碳源，有机碳源为选自山梨醇与乳糖中的一种或两种、葡萄糖和可溶性淀粉，(ii)0.5～0.7％无机盐，无机盐包括NaCl和CaCO3，和(iii)有机氮源，所述有机氮源为(1)1～6％的花生饼粉或(2)0.3～2％的酵母提取物；或(3)包括花生饼粉和酵母提取物，所述有机氮源的含量为3～4％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。本发明所述的发酵培养基能够高产PF1022A。本发明所述的发酵生产PF1022A的方法采用了所述的发酵培养基，操作简单，有利于PF1022A的产业化生产。

Description

一种生产PF1022A的发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，具体涉及一种生产PF1022A的发酵培养基及发酵方法。
背景技术
PF1022A是半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022产生的N-甲基-CODP(环状缩肽)类化合物。PF1022A是一种对动物低毒、防治谱广、效果好的驱虫药物，其是继大环内酯类驱虫药后，最有潜力的用于牲畜和宠物的一类驱虫药。
美国专利文献US09901393A1(公开日2002年4月18日)公开了一种转化PF1022A生产其衍生物emodepside的化学法。目前emodepside与吡喹酮的组合物Profender已上市，用于控制猫或狗胃肠道内的线虫和绦虫。随后emodepside与妥曲珠利的组合物Procox也已上市。
目前PF1022A合成有固相合成法和生物合成方法。但固相合成法步骤繁琐、工艺复杂，不适于大规模生产。而生物合成方法以及产生该物质的该培养基存在成分复杂、不稳定、不能显著提高PF1022A产量的缺陷。因此有必要研究新的培养基，以提高PF102A的产量及其可重复性，以期满足实际应用的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前的发酵培养基培养半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022产生PF1022A的产量低的现状，提供一种生产PF1022A的发酵培养基及发酵方法。所述的发酵培养基大大提高了PF1022A的发酵单位，适用于PF1022A的工业化大规模生产。所述的发酵方法简便易行，极大地提高了PF1022A的发酵单位，适用于PF1022A的工业化大规模生产。
本发明通过对发酵培养基中有机碳源和有机氮源的改良，采用葡萄糖、可溶性淀粉和山梨醇与乳糖中的一种或两种的组合有机碳源，同时采用花生饼粉和/或酵母提取物作为有机碳源，能够大大提高PF1022A的产量，与现有技术中发酵培养基相比，将产量最高提高至180.7％。发明人还发现，当发酵培养基中的有机碳源为葡萄糖、可溶性淀粉和山梨醇时，或为葡萄糖、可溶性淀粉和乳糖时，能够更有效地提高PF1022A的产量。本发明改良的发酵培养基含有足够的营养成分，能够满足摇瓶实验的需要，也能将摇瓶发酵的结果放大到发酵罐中。同时本发明的发酵培养基的组分的价格很低，能够大幅度地降低生产成本。
本发明提供的技术方案之一是：一种生产PF1022A的发酵培养基，其包括，
(i)7～13.5％有机碳源，所述有机碳源为选自山梨醇与乳糖中的一种或两种、葡萄糖和可溶性淀粉，
(ii)0.5～0.7％无机盐，所述无机盐包括NaCl和CaCO3，和
(iii)有机氮源，所述有机氮源为以下(1)～(3)中的一种：
(1)1～6％的花生饼粉；或者，
(2)0.3～2％的酵母提取物；或者，
(3)3～4％有机氮源，所述有机氮源包括花生饼粉和酵母提取物，
所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
本发明所述的发酵培养基中，所述有机碳源的含量为7～13.5％，所述有机碳源为选自山梨醇与乳糖中的一种或两种、葡萄糖和可溶性淀粉。其中，较佳地，所述有机碳源的含量为8.5～11.5％，更佳地为10～10.5％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述葡萄糖的含量为1～2％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述淀粉的含量为3～3.5％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述山梨醇的含量为2～7％，更佳地为4～5％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述乳糖的含量为3～8％，更佳地为6～8％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述有机碳源还包括本领域中用于生产PF1022A的发酵培养基中常规使用的，除山梨醇、乳糖、葡萄糖和可溶性淀粉以外的、与所述发酵培养基中的各组分之间不存在相互拮抗的作用的有机碳源，如麦芽糖和甘油。较佳地，所述有机碳源一次性地加入所述发酵培养基。
本发明所述的发酵培养基中，所述有机氮源为以下(1)～(3)中一种：(1)所述有机氮源为1～6％的花生饼粉；或者，(2)所述有机氮源为0.3～2％的酵母提取物；或者，(3)所述有机氮源包括花生饼粉和酵母提取物，所述有机氮源的含量为3～4％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。其中，较佳地，所述有机氮源为2～5％的花生饼粉，更佳地为3～3.5％的花生饼粉，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述有机氮源为0.5～1.5％的酵母提取物，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述有机氮源为花生饼粉和酵母提取物，所述有机氮源的含量为3～4％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述有机氮源还包括本领域中用于生产PF1022A的发酵培养基中常规使用的，除花生饼粉和酵母提取物以外的、与所述发酵培养基中的各组分之间不存在相互拮抗的作用的有机氮源，如酵母粉和黄豆饼粉。
本发明所述的发酵培养基中，所述无机盐的含量为0.5～0.7％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。其中，较佳地，所述NaCl的含量为0.2～0.3％，更佳地为0.2％；较佳地，所述CaCO3的含量为0.2～0.4％，更佳地为0.3％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述无机盐还包括硫酸镁。所述硫酸镁的化学式为MgSO4·7H2O或MgSO4，较佳地为MgSO4·7H2O。较佳地，所述硫酸镁的含量为0.2％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。较佳地，所述无机盐还包括本领域中用于生产PF1022A的发酵培养基中常规使用的，除NaCl、CaCO3和MgSO4·7H2O以外的、与所述发酵培养基中的各组分之间不存在相互拮抗的作用的无机盐，如硫酸亚铁和氯化铜。
较佳地，所述的发酵培养基还包括消泡剂。所述的消泡剂为本领域常规的消泡剂，较佳地为泡敌。所述消泡剂的含量为本领域常规的含量，较佳地为0.05～0.2％，更佳地为0.1％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
本发明所述的发酵培养基的pH为本领域常规的pH，较佳地为5.2～8，更佳地为5.7～6.6，最佳地为6.2～6.4。
本发明的一最佳实例是，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉6％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O0.2％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
本发明的另一最佳实例是，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.5％、NaCl 0.2％和CaCO3 0.3％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
若无特别说明，本发明所述的质量体积百分比指每100ml培养基中，含有组分的克数。如，7～13.5％有机碳源表示每100ml所述发酵培养基中含有7～13.5g有机碳源。
本发明所述的发酵培养基的制备方法是本领域常规的制备方法，较佳地为用水溶解所述有机碳源、所述有机氮源和所述无机盐等组分，高温灭菌。更佳地，所述的水为蒸馏水。
本发明提供的技术方案之二是：一种发酵生产PF1022A的方法，其包括以下的步骤：将半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022接种于上述的发酵培养基中发酵，从发酵液中获得PF1022A。
较佳地，所述半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022为购自NITEBiological Resource Center(日本技术评价研究所生物资源中心)，编号为NBRC-33096的菌株。
本发明所述发酵的容器为本领域常规的容器，较佳地为发酵瓶或发酵罐，更佳地为发酵罐。
较佳地，所述发酵在发酵罐中进行，其还包括如下的步骤：在所述发酵的时间为第3天时，加入麦芽糖。所述麦芽糖的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为0～5％，更佳地为2～4％，最佳地为2～3％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
本发明所述发酵的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～28℃，更佳地为25～27℃，最佳地为26℃。
本发明所述发酵的时间为本领域常规的时间，较佳地为6～12天，更佳地为7～10天，最佳地为8天。
本发明所述发酵培养基的溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为1～30％，更佳地为10～30％，最佳地为20～30％，所述百分比为体积百分比。
本发明所述发酵的种子液的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为5～25％，更佳地为8～20％，最佳地为15％，所述百分比为体积百分比。
较佳地，所述种子液由包括如下的步骤的方法获得：将所述的半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022在种子培养基中培养。更佳地，所述种子液由包括如下的步骤的方法获得：
(1)将半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022接种于斜面培养基活化，得活化的PF1022；
(2)将步骤(1)所得的活化的PF1022接种于一级种子培养基培养得到一级种子液；
(3)将步骤(2)所得的一级种子液接种于二级种子培养基培养得到种子液。
步骤(1)为：将半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022接种于斜面培养基活化，得活化的PF1022。其中，所述斜面培养基为本领域常规的斜面培养基，较佳地为葡萄糖马铃薯琼脂培养基，更佳地为购自上海源聚生物科技有限公司的葡萄糖马铃薯琼脂培养基。所述活化的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～27℃，更佳地为26℃。所述活化的时间为本领域常规的时间，较佳地为6天。
步骤(2)为：将步骤(1)所得的活化的PF1022接种于一级种子培养基培养得到一级种子液。其中，所述的一级种子培养基为本领域常规的一级种子培养基，较佳地包括0.5～1.5％葡萄糖、1～3％可溶性淀粉、0.1～0.5％酵母抽提物、0.5～1％麦芽浸粉、0.1～0.5％豆饼粉和0.1～0.4％碳酸钙，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。所述一级种子培养基的pH为本领域常规的pH，较佳地为6～6.4，更佳地为6.2。所述培养的方式为本领域常规的方式，较佳地为摇床培养。所述培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～27℃，更佳地为26℃。所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为2～4天，更佳地为2～3天。所述接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为5～20％，更佳地为8～15％，最佳地为10％，所述百分比为体积百分比。
步骤(3)为：将步骤(2)所得的一级种子液接种于二级种子培养基培养得到种子液。其中，所述的二级种子培养基为本领域常规的二级种子培养基，较佳地包括0.5～1.5％葡萄糖、1～3％可溶性淀粉、0.1～0.5％酵母抽提物、0.5～1％麦芽浸粉、0.1～0.5％豆饼粉和0.1～0.4％碳酸钙，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。所述二级种子培养基的pH为本领域常规的pH，较佳地为6～6.4，更佳地为6.2。所述培养的方式为本领域常规的方式，较佳地为摇床培养。所述培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～27℃，更佳地为26℃。所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为2～4天，更佳地为2～3天。所述接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为5～20％，更佳地为8～15％，最佳地为10％，所述百分比为体积百分比。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的发酵培养基能够高产PF1022A，在5L发酵罐上发酵单位最高达到1481mg/L；在摇瓶中发酵单位最高达到812mg/L，与现有技术中发酵培养基相比，将产量最高提高318.4％。并且所述的发酵培养基制备简便、成本低廉。本发明所述的发酵培养基实现5L发酵罐上发酵单位1481mg/L的高产量，在产量上高于现有文献报道，有利于PF1022A的产业化生产。
附图说明
图1为实施例1得到的PF1022A的HPLC分析图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中，若无特别说明，百分比的含义为相对于培养基总体积的质量体积百分比。所述质量体积百分比指每100ml所述发酵培养基中，含有组分的克数。如，葡萄糖2％指每100ml所述发酵培养基中含有2g葡萄糖。
实施例中，半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022为购自NITE BiologicalResource Center(日本技术评价研究所生物资源中心)，编号为NBRC-33096的PF1022菌株。
实施例1
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇2％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
种子培养基的组成为：葡萄糖1％、可溶性淀粉2％、酵母抽提物0.3％。麦芽浸粉0.8％、聚蛋白胨0.5％、黄豆饼粉0.2％和CaCO3 0.2％，所述的百分比为相对于培养基总体积的质量体积百分比，单位为g/L，调节pH至6.2。所述种子培养基于121℃灭菌20分钟后冷却备用。
(1)、将冻存的编号为NBRC-33096的PF1022菌株接种于斜面培养基上，在26℃培养箱中活化6天，选择生长良好的菌落，得活化的菌株。所述的斜面培养基为PDA培养基，所述PDA培养基购自上海源聚生物科技有限公司。
(2)、铲取2cm2步骤(1)所得活化的菌株，接种于种子培养基，然后置于26℃、200rpm的摇床上培养3天得种子液。
(3)、将步骤(2)所得的种子液按10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，然后置于26℃、200rpm的摇床上培养8天，得发酵液。
(4)、发酵结束后向步骤(3)所得的发酵液中加入等体积的甲醇后超声20min，得超声的发酵液。所述超声的温度为20℃、频率为90HZ。将超声的发酵液过滤取上清液，所得的上清液中即含PF1022A。HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为413mg/L。HPLC的结果参见图1，图1中显示一个单一的高峰，说明所得的上清液中确实含有纯度较高的PF1022A。
其中，所述HPLC的条件为：色谱柱为Hypersil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为乙腈：水，体积比80:20；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长为220nm；进样量为20μl；出峰时间为7.47min。
对比例1
发酵培养基的组成为：淀粉浆3.0％、大豆油1.0％、麦芽0.8％、大豆饼1.0％、干酵母1.0％、碳酸钙0.3％、0.2％硫酸镁(七水化合物)和0.2％氯化钠，灭菌前将该培养基pH调至7.0。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为354mg/L。
可见，实施例1较对比例1相比，PF1022A的产量提高了16.7％。
实施例2
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.5％、NaCl 0.2％和CaCO3 0.3％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为772mg/L。可见，实施例2较对比例1相比，PF1022A的产量提高了118.1％。
实施例3
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇7％、可溶性淀粉3.5％、酵母抽提物0.3％、花生饼粉3％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为659mg/L。可见，实施例3较对比例1相比，PF1022A的产量提高了86.1％。
实施例4
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、乳糖3％、可溶性淀粉3.5％、酵母抽提物1％、花生饼粉3％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％,和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为534mg/L。可见，实施例4较对比例1相比，PF1022A的产量提高了50.8％。
实施例5
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、乳糖6％、可溶性淀粉3.5％、花生饼粉5％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为698mg/L。可见，实施例5较对比例1相比，PF1022A的产量提高了97.1％。
实施例6
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、乳糖8％、可溶性淀粉3.5％、酵母抽提物1.5％、花生饼粉2％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为651mg/L。可见，实施例6较对比例1相比，PF1022A的产量提高了83.9％。
实施例7
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇4％、可溶性淀粉3.5％、酵母抽提物2％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为617mg/L。可见，实施例7较对比例1相比，PF1022A的产量提高了74.3％。
实施例8
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉6％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为812mg/L。可见，实施例8较对比例1相比，PF1022A的产量提高了129.4％。
实施例9
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、酵母抽提物2％、花生饼粉1％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为428mg/L。可见，实施例9较对比例1相比，PF1022A的产量提高了20.9％。
实施例10
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉6％、NaCl 0.1％、CaCO3 0.2％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为765mg/L。可见，实施例10较对比例1相比，PF1022A的产量提高了169.7％。
实施例11
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇2％、可溶性淀粉3％、花生饼粉6％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为812mg/L。可见，实施例11较对比例1相比，PF1022A的产量提高了129.4％。
实施例12
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.5％、NaCl 0.2％和CaCO3 0.3％，分别调节pH至5.2、5.4、5.7、6.0、6.2、6.3、6.4、6.6、7.0和8.0。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果如表1所示。表1说明，发酵培养基的pH值在5.7～6.6之间时，PF1022A的产量较高。尤其是pH值在6.0～6.4之间时，PF1022A的产量最高。
表1 HPLC测定不同pH条件下PF1022A的发酵单位
pH 5.2 5.4 5.7 6.0 6.2 6.3 6.4 6.6 7.0 8.0
发酵单位(mg/L) 353 424 557 697 836 749 737 590 481 279
实施例13
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇2％、可溶性淀粉3％、麦芽糖2％、花生饼粉3.5％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.2％、FeSO4 0.1％和MgSO4·7H2O0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为785mg/L。可见，实施例13较对比例1相比，PF1022A的产量提高了121.7％。
实施例14
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇2％、可溶性淀粉3％、麦芽糖1％、甘油1％、花生饼粉3.5％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％、FeSO4 0.05％、CuCl2 0.05％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为739mg/L。可见，实施例14较对比例1相比，PF1022A的产量提高了108％。
实施例15
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇2％、可溶性淀粉2％、乳糖3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.4％、酵母粉0.05％、黄豆饼粉0.05％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为675mg/L。可见，实施例15较对比例1相比，PF1022A的产量提高了90.7％。
实施例16
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇2％、可溶性淀粉3％、花生饼粉2.5％、酵母抽提物0.4％、酵母粉0.1％、NaCl 0.3％和CaCO3 0.4％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为568mg/L。可见，实施例16较对比例1相比，PF1022A的产量提高了60.4％。
实施例17
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.5％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
(4)、将步骤(3)所得的二级种子液15％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，然后置于200rpm的摇床上培养8天，培养的温度分别控制在23℃、25℃、26℃、27℃、28℃、30℃和32℃，得发酵液。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果如表2所示。表2说明，发酵时的培养温度在25～28℃之间时，PF1022A的产量较高。
表2 HPLC测定不同培养温度条件下PF1022A的发酵单位
发酵温度(℃) 23 25 26 27 28 30 32
发酵单位(mg/L) 446 808 825 758 561 201 142
实施例18
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.5％、泡敌0.1％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
一级种子培养基和二级种子培养的组成均为：葡萄糖1.5％、可溶性淀粉2％、酵母提取物0.5％、麦芽浸粉0.4％、聚蛋白胨0.6，黄豆饼粉0.2％、CaCO3 0.2％，pH6.2。
(1)、将冻存的编号为NBRC-33096的PF1022菌株接种于斜面培养基上，在26℃培养箱中活化6天，选择生长良好的菌落，得活化的菌株。所述的斜面培养基为PDA培养基，所述PDA培养基购自上海源聚生物科技有限公司。
(2)、铲取2cm2步骤(1)所得活化的菌株，接种于一级种子培养基，然后置于26℃、200rpm的摇床上培养3天得一级种子液。
(3)、将步骤(2)所得一级种子液按10％(v/v)接种于二级种子培养基，然后置于26℃、200rpm的摇床上培养3天得二级种子液。
(4)、在5L玻璃发酵罐中，将步骤(3)所得的二级种子液按15％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中。培养温度26℃，初始搅拌转速200rpm，溶氧DO控制在20％(v/v)以上，通气量为1vvm。发酵至72小时一次性补入麦芽糖至终浓度为0、1％、2％、2.5％、3％、4％。发酵至192小时时终止发酵。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果如表3所示。表3说明，补入麦芽糖后，PF1022A的发酵单位有了一定的提高，在2～4％之间PF1022A的产量提升较明显。
表3 HPLC测定不同麦芽糖浓度条件下PF1022A的发酵单位
麦芽糖终浓度 0 1％ 2％ 2.5％ 3％ 4％
发酵单位(mg/L) 948 1037 1259 1386 1481 1442
对比例2
发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.5％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为372mg/L。
对比例3
发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、玉米浆干粉3.5％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％，调节pH至6.2。
其余所有条件均与实施例1完全一致。
HPLC测定所得的上清液中PF1022A的发酵单位，结果为289mg/L。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种生产PF1022A的发酵培养基，其特征在于，其包括，
(i)7～13.5％有机碳源，所述有机碳源为选自山梨醇与乳糖中的一种或两种、葡萄糖和可溶性淀粉，
(ii)0.5～0.7％无机盐，所述无机盐包括NaCl和CaCO3，和
(iii)有机氮源，所述有机氮源为以下(1)～(3)中的一种：
(1)1～6％的花生饼粉；或者，
(2)0.3～2％的酵母提取物；或者，
(3)3～4％有机氮源，所述有机氮源包括花生饼粉和酵母提取物，
所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述有机碳源的含量为8.5～11.5％；所述葡萄糖的含量为1～2％；所述可溶性淀粉的含量为3～3.5％；所述山梨醇的含量为2～7％；所述乳糖的含量为3～8％；所述NaCl的含量为0.2～0.3％；和/或，所述CaCO3的含量为0.2～0.4％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
3.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述有机氮源为2～5％的花生饼粉，较佳地为3～3.5％的花生饼粉；或者，所述有机氮源为0.5～1.5％的酵母提取物；或者，所述有机氮源为花生饼粉和酵母提取物，所述有机氮源的含量为3～4％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
4.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述有机碳源的含量为10～10.5％；所述山梨醇的含量为4～5％；和/或，所述乳糖的含量为6～8％,所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
5.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述无机盐还包括硫酸镁，所述硫酸镁的含量为0.2％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比；和/或，所述的发酵培养基还包括消泡剂。
6.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述的消泡剂为泡敌；和/或，所述消泡剂的含量为0.05～2％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
7.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖2％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉6％、NaCl 0.2％、CaCO3 0.3％和MgSO4·7H2O 0.2％；或者，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖1％、山梨醇5％、可溶性淀粉3％、花生饼粉3.5％、酵母抽提物0.5％、NaCl0.2％和CaCO3 0.3％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
8.如权利要求1～7中任一项所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基的pH为5.2～8；较佳地为5.7～6.6。
9.一种发酵生产PF1022A的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：将半知菌无孢霉菌Rosellinia sp.PF1022接种于如权利要求1～7中任一项所述的发酵培养基中发酵，从发酵液中获得PF1022A。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵的容器为发酵瓶或发酵罐；较佳地，所述发酵在发酵罐中进行，其还包括如下的步骤：在所述发酵的时间为第3天时，加入麦芽糖；所述麦芽糖的浓度为0～5％，较佳地为2～4％，更佳地为2～3％，所述百分比为占所述发酵培养基的总体积的质量体积百分比。
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