CN1306024C - 微生物转化异丁香酚制备香草醛的菌种和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株从土壤中筛选获得的纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)CGMCC1347(SW-B9)及其培养发酵，并用于转化异丁香酚制备香草醛的方法。在优化条件下发酵培养，发酵液或游离细胞或其固定化细胞用于异丁香酚转化24～96小时，转化液中含香草酸2～4g/L；在水-有机溶剂双相体系中进行转化反应72小时，有机相中香草醛浓度达到最高32.5g/L。转化液中的香草醛用树脂吸附和乙酸乙酯等溶剂萃取，得到淡黄色粉状结晶香草醛，提取得率为87%，产品纯度为98.1%。用树脂吸附和正己烷洗脱方法回收未反应的异丁香酚，回收率为93.4%。

Description

微生物转化异丁香酚制备香草醛的菌种和方法

技术领域

本发明涉及一株从土壤中筛选获得的纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)CGMCC1347(SW-B9)及其培养发酵，并用于转化异丁香酚制备香草醛的方法。

背景技术

香草醛是工业中应用最广泛的香料之一，大量用于食品工业，可作为香气修饰和定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、烟草中；在医药化工中作为重要的原料或中间体，可用于制造治疗高血压、心脏病、皮肤病及消除口臭、利尿的常用药物；在化学工业中可作为化学助剂，用于塑料制品的抗硬化剂以及Ni，Cr，Cd等金属的电镀光亮剂；在农业生产上，香草醛可作为作物增产剂和催熟剂，并用之制备除草剂和昆虫引诱剂等，需求量很大。香草醛目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以从香子兰的花荚中提取，但用植物组织提取的方法生产的天然香草醛量少而价高，不能满足日益增长的需求。

随着世界各国对食品安全越来越重视，对天然香草醛的需求越来越大。天然香料是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、溶剂萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通过传统的食品加工方法(包括干燥、焙烤、发酵)加工后用于人类消费的物质。根据欧洲和美国立法，利用动植物资源通过物理方法、酶法或微生物法得到的物质才能称为天然物质(Muheim Andrea.US6,235,507.2001)。用生物法生产的香草醛，属天然产品，可以生物降解，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用生物转化技术生产生物香兰素，是一种有效的、很有前途的替代方法。

用生物转化法生产生物香草醛的研究已经有十余年的历史，研究中采用了多种生物材料，包括真菌(Laurence Lesage Meessen et al.US 05866380，1999；US06162637.2000)、细菌(Rabenhorst Jurgen & Hopp Rudolf.US 6133003，2000)、放线菌(Audrs & More.WO 9634971，1996；Rabenhorst & Hopp.EP0761817，1997；Muller.EP 0885968，1998)基因工程菌(Overhage J，et al.Journal ofBiotechnology，2000)、植物细胞(Podstolski A & Havkin-Frenkel D.WO 9903975，1999)及提取得到的酶(Frost JW.WO 0017319，2000)。研究者在细胞、酶学、基因水平上进行了广泛的研究，并取得了很多研究成果。随着研究的深入，不少研究者开始致力于实现生物香草醛的工业化生产，并且已有成功的例子，如法国Laurence Lesage-meessen(Lesage-Meessen，L.，et al.J.Biotechnol，1996)研究的利用阿魏酸作为底物的二步法，先用黑曲霉(Aspergillus niger)将阿魏酸转化为香草酸，再用朱红密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)或黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)将香草酸还原成香草醛，在发酵培养中添加大豆磷脂、盐酸硫胺素等促生长剂，6～7天，香草醛的浓度达到1,575mg/L。本发明者的研究小组也在这方面取得了成功(孙志浩.CN 1421523A，2002)。在研究起始原料制备天然香草醛的新方法的过程中，我们发现，由于阿魏酸的价格较高，因此用这种方法生产的香草醛价格也比较高，而丁香酚、异丁香酚可在工业规模上从丁香油中提取，价格低廉，容易得到。并且近10年前也已陆续有一些用微生物或酶转化丁香酚或异丁香酚进行生物转化的研究(Markus Paul Henry.EP 0542348A2，1993；Mane J & Zucca J.WO 9402621，1994)，本发明者的研究小组也对利用大豆粗酶转化异丁香酚生成香草醛方法进行了探索(孙志浩.CN 03157579.X，2003)。

在过去的十年里报道了许多用微生物法或酶法生产香草醛的方法，一般都是通过微生物或酶将合适的前体转化为香草醛。可利用的前体有阿魏酸、丁香酚、异丁香酚、姜黄素等，产物浓度与转化率通常很低。2000年，Shimoni E等人(ShimoniE，et al.Journal of Biotechnology.2000)从土壤中分离到一株枯草芽孢杆菌，它能以12.4％的摩尔转化率转化异丁香酚为香草醛，产物浓度为0.61g/L，其无细胞萃取液能产生0.9g/L香草醛。在微生物代谢系统中，不易得到高产量的香草醛，主要原因是由于香草醛具有细胞毒性，其浓度超过1g/L就会阻止微生物生长，而且，香草醛为代谢中间产物，经微生物系统中存在的多种代谢途径，易进一步转化为香草醇或香草酸等。因此，筛选一种合适的微生物菌种，开发合适的转化体系解除产物抑制及产物的进一步转化是提高香草醛浓度的关键。

发明内容

本发明的目的是筛选出一种能有效转化异丁香酚为香草醛的新菌株纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)CGMCC1347，并提供一种新的生物转化反应生成香草醛的方法。

本发明的一株从土壤中筛选获得的微生物菌种SW-B9，其特征为能耐受高底物浓度，可将异丁香酚转化为香草醛，经鉴定该菌株为纺锤芽孢杆菌Bacillus fusiformisSW-B9(CGMCC1347)。

本发明的微生物菌种Bacilus fusiformis SW-B9的培养方法，包括以下步骤：

(1)斜面培养基为葡萄糖营养琼脂培养基；

(2)种子培养基组成为：葡萄糖0.1％～1％；玉米浆1％～10％；尿素0.1％～2％；K₂HPO₄·3H₂O 0.01％～0.5％；KH₂PO₄ 0.01％～0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.01％～0.5％；pH 7.0；

(3)发酵培养基组成为：玉米浆1～10％；K₂HPO₄·3H₂O 0.1％～0.5％；尿素0.1％-0.5％；MgSO₄7H₂O 0.1％-0.5％；pH7.5；

(4)培养与发酵条件为：温度37℃，摇床转速180r/min。

本发明的一种生产香草醛的生物转化方法，包括以下步骤：

(1)将微生物菌种进行培养所得到的发酵液或进一步得到的湿菌体、冻干菌粉或固定化细胞作为细胞生物催化剂；

(2)将异丁香酚与水按0.1％～99.9％的比例配制成混合液作为生物转化底物反应液；

(3)将(1)获得的细胞生物催化剂，加入(2)的底物反应液进行转化反应；

(4)提纯与精制。

当细胞生物催化剂为湿菌体时，转化反应条件为：底物浓度范围为0.1％～99.9％，微生物湿菌体对底物溶液的用量为10～80g/L，初始pH 4.0～8.0，转化反应温度为20～42℃，转化反应时间为24～96h。

所述的提纯与精制是将反应液有机相分离，加D202、D031、HZ004、HZ801、HD-8或HD-2树脂进行吸附，再使用有机溶剂对吸附树脂进行洗脱，洗脱产物香草醛用结晶法精制，未转化底物异丁香酚回收用于再次转化。

以下是本发明方法的详细描述。

微生物菌株的筛选与鉴定：

本发明从被不同香料污染的土层中采集土样，将取得的各种土样悬浮于0.9％NaCl溶液中进行富集培养，并连续转接不含葡萄糖的筛选培养基3～4次，再涂布以异丁香酚为唯一碳源的选择性平板进行初筛，分离获得能在选择平板上生长菌株转至反应液转化，薄板层析法(TLC法)定性香草醛。将初筛得到的菌株进一步进行复筛，并对其进行香草醛降解实验，以HPLC法定量测定香草醛浓度，最终筛选出目标菌株B9。

本发明中涉及的B9菌株能在以1％异丁香酚为唯一碳源的培养基上生长。在琼脂培养基中形成白色菌落，革兰氏染色阳性，VP反应阴性，按伯杰氏手册第8版生理生化特性鉴定及精编分子生物学实验指南进行16S rDNA序列分析，确定其属于纺锤芽孢杆菌Bacillus fusiformis，拟命名为Bacillus fusiformis SW-B9。此菌株已于2005年4月8日保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保存号CGMCC No.1347。

微生物菌株的培养与发酵：

斜面培养基为常规葡萄糖营养琼脂培养基(LB培养基)。种子培养基组成为：葡萄糖0.1％～1％；玉米浆1％～10％；尿素0.1％～2％；K₂HPO₄·3H₂O 0.01％～0.5％；KH₂PO₄ 0.01％～0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.01％～0.5％；pH 7.0；种子培养条件：用250mL三角瓶装25～70mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30～45℃，180r/min摇床振荡培养12～24小时作为种子培养液。发酵培养基组成为：玉米浆1～10％；K₂HPO₄·3H₂O 0.1％～0.5％；尿素0.1％～0.5％；MgSO₄·7H₂O 0.1％～0.5％；pH 7.5；发酵条件：250mL三角瓶中装25～70mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30～45℃，180r/min摇床振荡培养12～24小时后添加1mmol/L香草醛作为诱导剂继续培养8～20小时，细胞培养液可直接用于转化，或离心后得到湿菌体、或制成冻干粉加入反应液进行转化，也可用海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质等载体包埋、或者用树脂共价结合或吸附、戊二醛交联等方法固定化，制得固定化细胞。以此作为生物催化剂进行生物转化，固定化细胞可反复回用，进行多次生物转化反应。

生物转化反应：

用上述方法制得的发酵液、湿菌体(游离细胞)、冻干菌粉、或固定化细胞等作为生物催化剂，以异丁香酚为底物，含量为0.1％～99.9％，加湿菌体量为底物溶液的10～80g/L，初始pH 4.0～8.0，转化反应温度为20～42℃，转化反应时间为24～96h。在此条件下所得的转化液用高压液相色谱分析(HPLC)测定产物量。

固定化细胞反复分批转化法是一批转化结束后，过滤，回收固定化细胞，作为下一次转化反应的催化剂，加入新配制的底物继续转化。固定化细胞分批转化试验表明可以连续反复进行多次。

可以用添加溶剂或助溶剂改善底物溶解度的方法等，改进生物转化反应效果。添加表面活性剂可以增加底物跟细胞的接触，可以增强生物转化反应效果。

以底物异丁香酚作为有机相溶剂进行水-溶剂双相反应，生成的产物及时转入有机相，既可以避免产物对微生物菌体的抑制作用，又可以减少产物在水溶液中不稳定而导致进一步转化生成副产物香草酸。

香草醛和异丁香酚测定方法：

参考文献报道方法(何新亚等，分析实验室，1999)用硫代巴比妥酸比色法(TBA法)测香草醛。薄层色谱法(TLC法)可同时测定香草醛和异丁香酚，展开剂：正己烷-氯仿-无水乙醚-冰醋酸4∶3∶2∶0.1(v/v/v)，显色剂：碘蒸汽结合2，4-二硝基苯肼，即先用碘蒸气使香草醛和异丁香醛同时显色，再用2，4-二硝基苯肼使香草醛特异性地显色以排除其它杂质的干扰，扫描条件：228nm单波长反射矩齿扫描，狭缝0.4×0.4mm，SX＝3，灵敏度中等。高效液相色谱法(HPLC)也可同时测定香草醛和异丁香酚，固定相：Lichrospher 100RP-18，5μm，250mm×4mm，流动相：用甲醇和0.01％的冰醋酸水溶液，甲醇/0.01％冰醋酸水溶液65/35，非梯度洗脱：流速1ml/min紫外270nm检测。

香草醛的分离、提取：

分离、提取方法是以树脂吸附香草醛，然后以正己烷等有机溶剂洗脱异丁香酚，使未转化底物异丁香酚与产物香草醛分离，最后以乙酸乙酯洗脱香草醛。

上述转化反应所得转化液的有机相异丁香酚中含高浓度香草醛，将转化液静止使两相分层并分出有机相(异丁香酚层)，加入1～10倍体积去离子水，再加入D202或D031、HZ004、HZ801、HD-8、HD-2等树脂吸附溶于异丁香酚的香草醛，树脂上同时也黏附了部分异丁香酚，滤出树脂，用树脂体积1～10倍的有机溶剂如正己烷、氯仿等洗脱1～5次，萃取未转化底物异丁香酚，使之与产物香草醛分离。旋转蒸发回收有机溶剂；回收得到的异丁香酚可以回收利用继续作为底物用于下一批转化反应。

回收了异丁香酚后的树脂，再用树脂体积1～10倍的乙酸乙酯、无水乙醇等洗脱1～5次，过滤收集滤液，加无水硫酸钠等方法进行脱水，真空蒸发，回收溶剂。将真空浓缩至接近油状的浓缩浆液干燥，即得淡棕色粉末香草醛(粗品)。将香草醛粗品加约1～10倍量纯水10～100℃溶解，冷却至室温，将先析出的棕色油状物除去，再冷却至0～5℃结晶，抽滤，30～60℃干燥，即得到精制香草醛成品。

本发明的生产香草醛的生物转化方法，包括以下步骤：

(1)以本发明筛选获得的菌株纺锤芽孢杆菌SW-B9作为菌种；

(2)培养、发酵获得的纺锤芽孢杆菌SW-B9完整细胞作为生物催化剂；

(3)以异丁香酚作为生物转化底物及有机相；

(4)在水-异丁香酚双相体系中进行生物转化反应，生成香草醛；

(5)未转化底物异丁香酚可回收用于再次转化；

(6)产物香草醛用树脂吸附、正己烷和乙酸乙酯分步洗脱进行分离提取。

本发明生物转化法相对于传统的化学合成法或从香兰属植物中提取的方法具有以下优点：①产品香草醛的有害物质含量极低，安全无毒副作用；②可进行大规模生产，不受季节影响；③生产操作简便，产品收得率高；④与香子兰荚提取法相比成本费用大大降低，甚至比微生物转化阿魏酸方法成本也有很大降低；⑤作为生物催化剂的微生物细胞易于培养且安全无毒，生物转化反应条件温和，环境友好。

本发明的特点是分离出了一株高度耐受底物毒性的菌株，该菌株能高效转化异丁香酚生成香草醛，转化后的产物纯度高，代谢副产物香草酸、甲氧基氢醌、香草醇等含量很低，未转化的异丁香酚容易回收，可用于再次转化，对底物总摩尔转化率高。本发明的转化工艺可以直接用微生物细胞发酵液添加异丁香酚进行转化，也可以用制备的冻干粉或其固定化细胞加异丁香酚底物溶液进行转化，固定化细胞可反复利用多次。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

以下是菌株纺锤芽孢杆菌SW-B9进行转化异丁香酚制备香草醛的实施例，用于说明本发明的方法，但本发明并不限于所列出的几个实例。

实施例1

从无锡某香料有限公司采集被不同香料污染的土样，将取得的各种土样各称取约10g，分别悬浮于0.9％NaCl溶液中，用8层纱布过滤去除较大的杂质颗粒，接种至富集培养基(异丁香酚0.2％；葡萄糖0.5％；酵母膏0.5％；蛋白胨0.5％；K₂HPO₄·3H₂O 1.4％；KH₂PO₄ 0.5％；MgSO₄·7H₂O 0.2％；pH 7.0)，培养24h后，连续转接筛选培养基(不含葡萄糖，其他同富集培养基)4次，涂布选择性平板(组分同筛选培养基，含琼脂2％)。经过初筛，共分离获得14株菌能在以异丁香酚为唯一碳源的平板上生长，经镜检观察均为芽孢杆菌，分别将之转至反应液转化3天，经TLC法定性香草醛，发现绝大部分能生成部分香草醛，选取14株进一步进行复筛，并进行香草醛降解实验，以TBA及HPLC法定量测定香草醛浓度，结果见表1和表2，综合产香草醛能力与香草醛降解情况，最终选定SW-B9作为出发菌株。

                     表1各菌株转化异丁香酚生成香草醛能力

菌株	SW-B1	SW-B2	SW-B3	SW-B4	SW-B5	SW-B6	SW-B7
								香草醛(g/L)	0.54	1.08	1.01	0.36	1.09	0.36	0.59
菌株	SW-B8	SW-B9	SW-B10	SW-B11	SW-B12	SW-B13	SW-B14
								香草醛(g/L)	1.10	1.17	0.81	0.77	0.78	0.85	0.41

                                       表2各菌株降解香草醛情况

菌株	对照*	SW-B1	SW-B2	SW-B3	SW-B4	SW-B5	SW-B6	SW-B7
									残留香草醛％	96.13	99.71	90.41	83.98	93.75	95.89	98.99	96.61
菌株	SW-B8	SW-B9	SW-B10	SW-B11	SW-B12	SW-B13	SW-B14
									残留香草醛％	90.41	95.26	100.00	98.99	94.70	98.04	100.00

^*对照：未接菌种，其他反应条件相同。

实施例2

对筛选的SW-B9菌株按伯杰氏手册第8版进行生理生化特性鉴定，结果见表3。并按精编分子生物学实验指南的方法进行16S rDNA鉴定，结果见表4。实验结果可确定其属于纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)，拟命名为Bacillus fusiformis SW-B9(CGMCC1347)。

                    表3生理生化特性鉴定结果对照表

生理生化特性	SW-B9	枯草芽孢杆菌	纺锤芽孢杆菌	球形芽孢杆菌
					形态：细胞单生	-	+	-	+

芽孢圆形芽孢端生淀粉水解酪氨酸水解马尿酸盐水解明胶液化1μg/mL四环素抗性2μg/mL四环素抗性D-葡萄糖产酸D-蔗糖产酸D-木糖产酸D-乳糖产酸D-麦芽糖产酸5℃生长17℃生长30℃生长37℃生长50℃生长pH6.8生长pH5.7生长2％NaCl生长5％NaCl生长7％NaCl生长10％NaCl生长革兰氏染色厌氧生长葡萄糖产气VP试验甲基红试验吲哚试验过氧化氢酶脲酶硝酸盐还原

++---+--------+++-+++++-+-----++-

--+--++++++-+-+++++++++++--+--+-+

+D---+---D----+++-+DDD+-+-----DD-

+D--D++D------+++-+D+D--+----D--

+.90％以上阳性：-.90％以上阴性：D.11％～89％阳性。

                       表4SW-9菌株的16S rDNA序列(1525bp)

1    GACGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC GAACAGAGAA GGAGCTTGCT61   CCTTCGACGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGGC AACCTACCTT ATAGTTTGGG121  ATAACTCCGG GAAACCGGGG CTAATACCGA ATAATCTGTT TCACCTCATG GTGAAACACT181  GAAAGACGGT TTCGGCTGTC GCTATAGGAT GGGCCCGCGG CGCATTAGCT AGTTGGTGAG241  GTAACGGCTC ACCAAGGCGA CGATGCGTAG CCGACCTGAG AGGGTGATCG GCCACACTGG301  GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTA GGGAATCTTC CACAATGGGC361  GAAAGCCTGA TGGAGCAACG CCGCGTGAGT GAAGAAGGAT TTCGGTTCGT AAAACTCTGT421  TGTAAGGGAA GAACAAGTAC AGTAGTAACT GGCTGTACCT TGACGGTACC TTATTAGAAA481  GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA541  ATTATTGGGC GTAAAGCGCG CGCAGGTGGT TTCTTAAGTC TGATGTGAAA GCCCACGGCT

601   CAACCGTGGA GGGTCATTGG AAACTGGGAG ACTTGAGTGC AGAAGAGGAT AGTGGAATTC661   CAAGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATTT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTATC721   TGGTCTGTAA CTGACACTGA GGCGCGAAAG CGTGGGGAGC AAACAGGATT AGATACCCTG781   GTAGTCCACG CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGGGG GTTTCCGCCC CTTAGTGCTG841   CAGCTAACGC ATTAAGCACT CCGCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA901   ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA961   CCTTACCAGG TCTTGACATC CCGTTGACCA CTGTAGAGAT ATGGTTTCCC CTTCGGGGGC1021  AACGGTGACA GGTGGTGCAT GGTTGTCGTC AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC1081  CCGCAACGAG CGCAACCCTT GATCTTAGTT GCCATCATTT AGTTGGGCAC TCTAAGGTGA1141  CTGCCGGTGA CAAACCGGAG GAAGGTGGGG ATGACGTCAA ATCATCATGC CCCTTATGAC1201  CTGGGCTACA CACGTGCTAC AATGGACGAT ACAAACGGTT GCCAACTCGC GAGAGGGAGC1261  TAATCCGATA AAGTCGTTCT CAGTTCGGAT TGTAGGCTGC AACTCGCCTA CATGAAGCCG1321  GAATCGCTAG TAATCGCGGA TCAGCATGCC GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC1381  ACCGCCCGTC ACACCACGAG AGTTTGTAAC ACCCGAAGTC GGTGAGGTAA CCTTTTGGAG1441  CCAGCCGCCG AAGGTGGGAT AGATGATTGG GGTGAAGTCG TAACAAGGTA GCCGTATCGG1501  AAGGTGCGGC TGGATCACCT CCTTA

其中，组成为A 25％；C 23％；G 31％；T 21％。

实施例3

用纺锤芽孢杆菌CGMCC1347(SW-B9)菌株进行培养发酵，斜面培养基为常规LB培养基，种子培养基组成为：葡萄糖0.3％；玉米浆5.5％；尿素0.3％；K₂HPO₄·3H₂O 0.09％；KH₂PO₄ 0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.1％；pH 7.0；用250mL三角瓶装25mL培养基，于37℃，180r/min摇床振荡培养12小时作为种子培养液。

发酵培养基组成为：玉米浆5.5％；K₂HPO₄·3H₂O 0.2％；尿素0.1％；MgSO₄·7H₂O0.1％；pH 7.5；250mL三角瓶中装50mL培养基，于37℃，180r/min摇床振荡培养12小时后添加1mmol/L香草醛作为诱导剂继续培养8小时，最终获得含细胞干重为6.9g/L的发酵液。

将发酵液经3000r/min离心10min，得到湿菌体量0.36g，在250mL三角瓶中装异丁香酚0.4mL，加入自来水定容至20mL，初始pH 7.0，于37℃，180r/min振荡转化72小时，测得转化液中香草醛浓度为4.11g/L。

实施例4

按实施例3方法得到的湿菌体0.36g，在250mL三角瓶中装12mL异丁香酚，8mL自来水，0.02mL吐温-80，初始pH 4.0，37℃，180r/min振荡转化，转化过程中每隔12小时取样，用高效液相色谱法测定转化液有机相异丁香酚中的香草醛，结果如表5。反应72小时，有机相中香草醛浓度达到最高32.5g/L。

                              表5水-有机溶剂双相体系中的转化结果

取样时间(h)	12	24	36	48	60	72	84
								有机相中香草醛浓度(g/L)	10.2	15.1	20.0	26.4	30.5	32.5	27.2

实施例5

按实施例3方法得到的湿菌体1g，用10mL生理盐水调制成10％菌悬液。另用0.9g海藻酸钠，20mL生理盐水，配制成3％浓度的海藻酸钠溶液，煮沸溶解，冷却至45℃左右，与菌悬液混合搅拌均匀，用胶头滴管滴入100mL 0.1mol/L的CaCl₂溶液中，于4℃下浸泡硬化4小时后即可作为固定化细胞用于生物转化。

按实例4方式用3g固定化细胞与0.36g游离细胞对照进行转化，反复分批转化结果如表6所示。

   表6固定化细胞反复分批转化结果

	香草醛(g/L)
			次数	游离细胞	固定化细胞
1	17.88	21.97
			2	19.38	21.21
3	17.39	20.63
			4	13.24	20.33

实施例6

按实施例4的方法，得到有机相中香草醛浓度为22.8g/L的转化液，取其有机相5mL，其中含香草醛总量为114.00mg，加入50mL水后加20g树脂HD-8进行吸附24h后离心分离树脂；用50mL正己烷洗脱树脂上的异丁香酚，静止洗脱12h后再分离树脂重复洗脱一次，合并两次正己烷洗脱液，旋转真空蒸发回收溶剂正己烷，蒸后回收得到异丁香酚3958mg，异丁香酚回收率为93.4％。然后用50mL无水乙醇洗脱回收异丁香酚后的树脂中的香草醛，再次以30mL无水乙醇第二次洗脱，合并两次乙醇洗脱液，旋转真空蒸发回收溶剂乙醇，蒸后得到香草醛99.19mg，其香草醛提取率为87％。

将99.19mg香草醛粗品，加约10mL去离子水加热至85℃溶解，冷却至室温，将先析出的棕色油状物除去，再冷却至0～5℃结晶，抽滤，35℃干燥，得到淡黄色粉状结晶52mg，HPLC测定其纯度98.1％。

Claims (5)

1.一株从土壤中筛选获得的微生物菌种SW-B9，其特征为能耐受高底物浓度，可将异丁香酚转化为香草醛，经鉴定该菌株为纺锤芽孢杆菌Bacillus fusiformisSW-B9，保藏号为CGMCC1347。

2.如权利要求1所述Bacillus fusiformis SW-B9的培养方法，包括以下步骤：

(1)斜面培养基为葡萄糖营养琼脂培养基；

(2)种子培养基组成为：葡萄糖0.1％-1％；玉米浆1％-10％；尿素0.1％-2％；K₂HPO₄·3H₂O 0.01％-0.5％；KH₂PO₄ 0.01％-0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.01％-0.5％；pH7.0；

(3)发酵培养基组成为：玉米浆1-10％；K₂HPO₄·3H₂O 0.1％-0.5％；尿素0.1％-0.5％；MgSO₄·7H₂O 0.01％-0.5％；pH7.5；

(4)培养与发酵条件为：温度37℃，摇床转速180r/min。

3.一种生产香草醛的生物转化方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的微生物菌种按权利要求2所述的方法进行培养所得到的发酵液、或进一步得到的湿菌体、冻干菌粉或固定化细胞作为细胞生物催化剂；

(2)将异丁香酚与水按0.1％-99.9％的比例配制成混合液作为生物转化底物反应液；

(3)将(1)获得的细胞生物催化剂，加入(2)的底物反应液进行转化反应；

(4)提纯与精制。

4.如权利要求3所述的生产香草醛的生物转化方法，当细胞生物催化剂为湿菌体时，转化反应条件为：底物浓度范围为0.1％-99.9％，微生物湿菌体对底物溶液的用量为10-80g/L，初始pH 4.0-8.0，转化反应温度为20-42℃，转化反应时间为24-96h。

5.根据权利要求3所述的生产香草醛的生物转化方法，其特征在于，所述的提纯与精制是将反应液有机相分离，加D202、D031、HZ004、HZ801、HD-8或HD-2树脂进行吸附，再使用有机溶剂对吸附树脂进行洗脱，洗脱产物香草醛用结晶法精制，未转化底物异丁香酚回收用于再次转化。

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