CN104561135B - 里氏木霉生产芳香物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生产β‑苯乙醇和/或苯乙醛的方法，该方法可以通过对里氏木霉提供廉价碳源（如麸皮和脱脂米糠粕）进行发酵来生产天然香味物质，如β‑苯乙醇和苯乙醛。利用本发明的方法生产β‑苯乙醇，可以降低生产成本，还可对农产品副产物比如麸皮和脱脂米糠粕加以利用，减少废料处理成本。

Description

里氏木霉生产芳香物质的方法
技术领域
本发明涉及通过里氏木霉来生产天然香味物质的方法。具体而言，本发明涉及利用里氏木霉生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。
背景技术
β-苯乙醇（2-Phenylethanol，简称2-PE）是一种芳香烃的衍生物，其广泛存在与于自然界中，最早是作为玫瑰花中特征性的香气化合物被发现的。其是一种令人愉悦的具有玫瑰花香味的挥发性物质，能从许多种花（如玫瑰、康乃馨、风信子、阿勒颇松树、橙花、铃兰及天竺葵）的精油里分离得到，并因其玫瑰花的香味而成为香水和化妆品领域中广泛使用的香料化合物。
β-苯乙醇可以与乙酸（或乙酐）转化成乙酸苯乙酯，该产物具有玫瑰蜜甜香和桃香，可用于调配花香香精和食用香料。此外，β-苯乙醇与丙酸、丁酸、戊酸、苯甲酸等生成的酯类化合物也是贵重的香料产品。在食品、化妆品、烟草和日化用品中添加β-苯乙醇对其他香气成分有增效作用，因而其可作为多种香型的底香组分。此外，β-苯乙醇还作为香精广泛应用在食品行业中，如饮料、面包、饼干、口香糖等。另外，β-苯乙醇在医药上也是传统的抑菌剂（ZHU Y J,ZHOU H T,HU Y H,et al.Antityrosinase and antimicrobialactivitiesof2-phenylethanol,2-phenylacetaldehyde and2-phenylacetic acid[J].Food Chem,2011,124(1):298-302），对护肤品保存有重要作用。
现有技术中，可以通过直接提取法、微生物转化法和化学合成法来获得β-苯乙醇。其中，直接提取法存在成本高、且提取量非常有限的缺点。化学法合成的β-苯乙醇产品纯度较低，纯化难度较大，且产物中往往混合一些难以除去的副产物以及有毒有害的重金属催化剂等杂质，如果进行进一步的分离纯化又会大大增加生产成本。因此利用微生物转化法生产β-苯乙醇产量成为人们关注的方向。
微生物转化法可以以多种物质（比如米酒、氟苯丙氨酸等）为底物，通过微生物发酵来转化合成β-苯乙醇。从产物中分离β-苯乙醇可以通过萃取或离子交换树脂吸附分离等方法进行。目前主要采用酵母属菌株以L-苯丙氨酸为底物转化成β-苯乙醇。例如，美国SUBBIAHVEN公司公开了一种发酵生产β-苯乙醇的方法，其中以L-苯丙氨酸为原料通过微生物啤酒酵母菌Saccaromyces cerevisiae和克鲁维酵母Kluyveromyces sinensis发酵培养和采用离子交换树脂吸附分离法来制取天然级苯乙醇香料。
近年来还通过两相发酵法等原位转移技术来提高微生物转化的效率，但仍与人们的期许相差甚远。瓶颈主要存在于，在酵母中以L-苯丙氨酸转化成β-苯乙醇的过程依赖于该代谢过程在菌体内的转化效率，且该过程只有当L-苯丙氨酸为唯一氮源时才可以发生，使得生产苯乙醇的初始原料受限，且L-苯丙氨酸原料贵，发酵成本较高。
基于以上技术现状和问题，有必要尝试不同来源的生产菌株，从而提供能够降低发酵成本和/或提高产率的β-苯乙醇微生物合成技术。
发明内容
基于以上技术现状和问题，本发明进行了一系列研究并且发现，里氏木霉能够在发酵条件下比如在摇瓶水平和发酵罐水平上产生β-苯乙醇。此外，本发明的发明人发现里氏木霉在发酵过程中还能够产生苯乙醛。本发明是基于以上发现而完成的。
本发明提供一种利用里氏木霉生产β-苯乙醇的方法。根据本发明的方法，可以利用里氏木霉在不添加转化底物如L-苯丙氨酸的情况下进行发酵而产生β-苯乙醇。用于培养里氏木霉的可发酵底物中可含有常规用于实验室培养的葡萄糖作为碳源，也能使用廉价碳源（包括但不限于麸皮、脱脂米糠粕）进行发酵来生产β-苯乙醇这种天然香味物质。另外，当根据本发明使用里氏木霉生产β-苯乙醇时，也可向可发酵底物中添加转化前体L-苯丙氨酸，以提高β-苯乙醇的产量。
根据本发明的方法生产β-苯乙醇，可以降低生产成本，同时对农产品副产物比如麸皮和脱脂米糠粕加以利用，减少废料处理成本。此外，发明人在研究过程中，发现根据本发明的方法，还能利用里氏木霉以廉价碳源作为营养物质来合成苯乙醛。因此，本发明还提供利用里氏木霉发酵生产苯乙醛的方法。
里氏木霉（Trichoderma reesei或anamorph或Hypocrea jecorina）作为具有重要经济价值的工业丝状真菌，具有多样化的代谢能力、对人体没有毒性以及生长快、无性繁殖等竞争性生长的重要特征。按照本发明的方法来发酵生产β-苯乙醇和/或苯乙醛，可以利用里氏木霉的以上优点，从而在实际生产中节约成本并缩短生产时间，由此提高经济效益。
根据本发明的一个实施方式，提供一种利用里氏木霉NBRC31326（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉GIM3.498（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉GIM3.538（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉CBS383.78（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉CICC40358（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉CICC40360（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉CICC40929（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉CICC41491（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
根据本发明的另一个实施方式，提供一种利用里氏木霉CICC41493（广东省微生物菌种保藏中心）对可发酵底物进行发酵来生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法。其中，该可发酵底物可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
另外，本发明还提供里氏木霉用于发酵产生β-苯乙醇和/或苯乙醛的用途。在一个具体的实施方式中，里氏木霉可以选自保藏号为NBRC31326、或GIM3.498、或GIM3.538、或CBS383.78、或CICC40358、或CICC40360、或CICC40929、或CICC41491、或CICC41493的里氏木霉菌。用里氏木霉进行发酵所使用的可发酵底物中可以含有麸皮或者脱脂米糠粕或葡萄糖等等作为碳源。并且，用来进行发酵的底物中可以含有或者可以不含L-苯丙氨酸。优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上；更优选地，添加到可发酵底物中的L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
另外，本发明还提供一种处理麸皮和/或脱脂米糠粕的方法，其特征在于，使用里氏木霉对麸皮和/或脱脂米糠粕进行发酵。在一个具体的实施方式中，里氏木霉可选自保藏号为NBRC31326、或GIM3.498、或GIM3.538、或CBS383.78、或CICC40358、或CICC40360、或CICC40929、或CICC41491、或CICC41493的里氏木霉菌。
在本发明的一个实施方式中，在不高于40℃的温度下进行里氏木霉的发酵以生产β-苯乙醇和/或苯乙醛。优选地，里氏木霉进行发酵的温度为15℃以上。更优选地，里氏木霉进行发酵的温度在20℃～35℃的范围内。更优选地，里氏木霉进行发酵的温度在25℃～30℃的范围内。在一个具体的实施方式中，里氏木霉进行发酵的温度为28℃。
在根据本发明利用里氏木霉生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法中，用于培养里氏木霉的培养基可以是天然培养基、合成培养基或者半合成培养基。例如，培养基可以是本领域公知的PDA培养基、LB培养基、TB培养基等等。更具体地，培养基可以是实施例1-4中详细说明的那些培养基。本领域技术人员可以理解，也可以根据需求设计或选择不同的培养基，从而为里氏木霉的生长提供合适的条件（可参见Mary Jo Zimbro;David A Power等,Difco&BBL Manual:Manual of Microbiological Culture Media,2009；李影林等.《培养基手册》.吉林科学技术出版社.1991年版；等）。
具体实施方式
下面将详细地描述本发明的示例性实施方式，以使本领域的普通技术人员能够容易地实施本发明。尽管将结合示例性实施方式描述本发明，但应当理解，本说明书无意将本发明局限于这些示例性实施方式。相反，本发明不仅要涵盖这些示例性实施方式，还要涵盖由权利要求所限定的本发明的精神和范围内的各种替代形式、修改、等效形式和其它实施方式。
在本发明的上下文中，除非明确有相反说明，术语“包括”和例如“包含”的变形可理解为表示包含了所述的组分或成分，但是并非要排除任何其它的组分或成分。并且该术语是开放式的，允许有列举之外的对象存在，只要所述的基本的或新的特征没有被所列举之外的对象的存在而改变，但排除现有技术的实施方式。
在本发明的上下文中，术语“菌株”包括其种内潜在的遗传性变体或亚型；例如，从特定地点及时采集的菌种分离株，或被确证为在核苷酸水平上与同种其他成员不一致的分离株。
在本发明的上下文中，术语“发酵”是涉及微生物的生命活动的过程。进一步地，“发酵”是指利用微生物生产代谢产物或分解有机物的过程。微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体。
在本发明的上下文中，术语“可发酵底物”是指能为微生物所利用，比如作为能源物质为微生物所利用或者其中含有可被微生物转化的物质。概括而言，参与微生物的代谢活动的各种物质或其与其它物质的组合物均可称为可发酵底物。可发酵底物中可以包含，比如廉价碳源，如麸皮或者脱脂米糠粕，但不限于此。在一个具体的实施方式中，可发酵底物可以包含麸皮作为碳源。在另一个具体的实施方式中，可发酵底物可以包含脱脂米糠粕作为碳源。此外，可发酵底物还可以包含葡萄糖作为碳源。其中，麸皮即为麦皮，其是小麦加工面粉副产物，富含纤维素和维生素。以下将具体说明的实施方式中所用的麸皮均来源于益海嘉里（昆山）食品工业有限公司；脱脂米糠粕为米糠榨油后剩下的副产物，含蛋白质、粗纤维、矿物质及微量元素。以下将具体说明的实施方式中所用的脱脂米糠粕来源于益海嘉里（佳木斯）粮油工业有限公司。这两种可发酵底物成分均来源于粮食加工副产物，富含蛋白质，纤维素，矿物质及维生素等微量元素，在本发明的发酵过程中用作营养物质和碳源。
在本发明的上下文中，术语“碳源”是指能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质。碳源可以是本领域技术人员公知的菌种培养用的碳源（如葡萄糖），也可以是本领域技术人员根据需求适当选择或配置的单一碳源或多种碳源的组合。例如，碳源可以是价格低廉的碳源（廉价碳源），如农副产品加工过程和林业加工过程中产生的废弃物和生物质，如麸皮、稻壳、米糠粕、豆粕、花生粕、果皮、果壳、果核、果渣、蔬菜根茎、玉米芯、秸秆、木屑等等。在本发明中，里氏木霉可利用这些废弃物做为生长的碳源，从而降低发酵过程的成本。
在本发明的上下文中，术语“发酵产物”包括发酵工艺中的任何产物，包括固体、液体或气体产物。
在本发明的上下文中，术语“培养基”是指适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。培养基可包括天然培养基、合成培养基和半合成培养基。可以根据需要配置不同的培养基来培养微生物。
在本发明的上下文中，术语“工程菌”是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株。所述的菌类细胞株可称为受体菌。在本发明中，受体菌可以是本发明的里氏木霉而外源基因是从本发明的里氏木霉以外的微生物中提取的基因。或者，受体菌可以是本发明的里氏木霉以外的微生物而外源基因来源于本发明的里氏木霉。制备工程菌的方法在本领域技术人员的技术范围内，因此在本发明中并不具体叙述。
以下示例说明利用本发明的里氏木霉进行发酵的方法。
在本发明的下述实施例中，使用的里氏木霉均购自广东省微生物菌种保藏中心。
实施例
实施例1 里氏木霉利用麸皮产生β-苯乙醇
发酵培养基（g/L）：麸皮60（益海嘉里（昆山）食品工业有限公司），葡萄糖1，硫酸铵1.84，酵母提取物0.5（OXOID，货号LP0021），磷酸二氢钾0.2，七水合硫酸镁0.5，二水合氯化钙0.03，L-苯丙氨酸添加量为0，1.5、3、4.5、6和7.5g/L，pH自然。
上述培养基分别分装至250mL摇瓶中，每瓶50ml，115℃灭菌20min。
菌株培养：将表1中的9种里氏木霉的孢子分别接种到PDA培养基上，28℃培养7天。PDA培养基配方：200g土豆煮半小时，4层纱布过滤，配成1升。115℃灭菌后，加20g葡萄糖。
孢子悬浮液制备：将在PDA培养平板上培养7天的里氏木霉菌株各自用含0.2%吐温的无菌生理盐水洗涤，用血球计数板计数孢子数后，制成106个/mL的孢子悬浮液后4℃存储备用。
发酵培养：向灭菌后的培养基中接种里氏木霉的孢子悬浮液100微升（孢子数量约为105个），于28℃、200r/min条件下培养72h后，收集发酵液，于4℃8000×g离心后收集上清液。取30mL上清液，对产物进行分析（分析方法参见：芦智远，韩巧艳，徐忠，等.静态顶空气相色谱法测定黄酒中β-苯乙醇的含量[J].中国酿造，2013（11）：167-168）
对发酵液的β-苯乙醇含量分析结果示于表1中。
表1 麸皮培养基中添加不同浓度的L-苯丙氨酸后菌株产苯乙醇含量
Figure BDA0000395908580000081
Figure BDA0000395908580000091
注：表中β-苯乙醇含量单位为mg/L
葡萄糖是一种速效碳源，在发酵过程中属于优先利用的碳源（与麸皮、脱脂米糠粕等相比）。在实施例1的发酵过程中添加1克葡萄糖，以便保证菌体在生长早期能利用速效碳源实现初步生长，之后的碳源营养主要依赖麸皮提供。
如表1所示，在培养基中提供麸皮且没有添加L-苯丙氨酸的情况下，上述里氏木霉产生了不同浓度的β-苯乙醇。该结果表明里氏木霉中存在某些代谢途径，使其能够合成β-苯乙醇；当添加一定量的L-苯丙氨酸后，β-苯乙醇含量均有不同程度的提高，这进一步证实了里氏木霉生产β-苯乙醇的能力，并且表明里氏木霉中合成β-苯乙醇的代谢途径可能利用L-苯丙氨酸作为直接或间接的转化前体。
实施例2 里氏木霉利用脱脂米糠粕产生β-苯乙醇
为进一步考察使用其他廉价碳源培养里氏木霉生产β-苯乙醇的效果，随机选取GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78菌株在以脱脂米糠粕为碳源的培养基上进行发酵。
发酵培养基（g/L）：脱脂米糠粕60（益海嘉里（佳木斯）粮油工业有限公司），葡萄糖1，硫酸铵1.84，酵母提取物（OXOID，货号LP0021）0.5，磷酸二氢钾0.2，七水合硫酸镁0.5，二水合氯化钙0.03，L-苯丙氨酸添加量0，1.5、3、4.5、6和7.5，pH自然。
上述培养基分装至250mL摇瓶中，每摇瓶50mL，115℃灭菌20min。
实验方法同实施例1，除使用的培养基不同外。
对发酵液的β-苯乙醇含量分析结果示于表2中。
表2 脱脂米糠粕培养基中添加不同浓度的L-苯丙氨酸后菌株产β-苯乙醇含量
Figure BDA0000395908580000092
注：表中β-苯乙醇的含量单位为mg/L
同实施例1，在实施例2的发酵培养基中添加1克葡萄糖，以便保证菌体在生长早期能利用速效碳源实现初步生长，之后的碳源营养主要依赖脱脂米糠粕提供。在使用脱脂米糠粕培养基时，选取的里氏木霉在没有L-苯丙氨酸添加的情况下同样也产生了微量的β-苯乙醇。如表2所示，当对发酵底物添加L-苯丙氨酸时，菌株GIM3.498、GIM3.538及CBS383.78发酵后β-苯乙醇含量相比不添加L-苯丙氨酸的结果均有所提高，这与实施例1的趋势也相同。实施例2的结果说明，以脱脂米糠粕作为碳源，里氏木霉也可以转化生产β-苯乙醇。添加L-苯丙氨酸使得β-苯乙醇含量有不同程度的提高，表明里氏木霉中合成β-苯乙醇的代谢途径可能利用L-苯丙氨酸作为直接或间接的转化前体。
结合实施例1和实施例2的结果可见，当使用麸皮或脱脂米糠粕作为碳源利用里氏木霉进行发酵时，可以产生β-苯乙醇。在其它培养条件完全相同的情况下，利用麸皮和脱脂米糠粕作为碳源得到的β-苯乙醇产量结果相差较大，推测可能是以下原因引起。麸皮和脱脂米糠粕分别为小麦和稻谷加工后副产物，成分复杂，在培养基中主要作为营养物质（碳源）提供菌体生长所需营养。不同菌株在分解利用各类天然营养物质时效率不一，因而得到不同的实验结果。在麸皮为主要营养物质的培养基中添加转化底物L-苯丙氨酸，与未添加底物的培养基相比，各菌株产β-苯乙醇的量均有提高；在脱脂米糠粕为主要营养物质的培养基中，添加转化底物L-苯丙氨酸与不添加的相比，产量变化结果相对不明显。
除了实施例中具体示例的这些碳源，采用其他里氏木霉可利用的碳源也可以实现本发明。除了廉价碳源，本发明的发明人还选用了本领域公知的碳源（如葡萄糖）代替麸皮或脱脂米糠粕进行相应的实验，同样得到了β-苯乙醇。下面具体说明利用葡萄糖作为碳源进行发酵的结果。
实施例3 利用发酵菌株CICC40929在7.5L及30L发酵罐中进行发酵
结合实施例1-2，我们证明了CICC40929、BRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC41491、CICC41493可在摇瓶水平上产生β-苯乙醇。通过实施例3，我们进一步在发酵罐水平上验证里氏木霉菌株产苯乙醇的能力，其中随机选取CICC40929分别进行7.5升罐和30升罐的发酵。对于7.5升发酵罐实验，利用的主要碳源为麸皮；30升发酵罐利用碳源为葡萄糖。
(1)CICC40929在7.5L罐的发酵培养
发酵培养基
发酵种子培养基（g/L）：麦芽浸提物20，葡萄糖20，硫酸铵1.84，酵母提取物0.5，磷酸二氢钾0.2，七水合硫酸镁0.5，二水合氯化钙0.03，pH自然
上罐培养基（g/L）：麸皮60，葡萄糖1，硫酸铵1.84，酵母提取物0.5，磷酸二氢钾0.2，七水合硫酸镁0.5，二水合氯化钙0.03，L-苯丙氨酸添加量为3g/L，pH自然。
培养方法
孢子悬浮液制备：将在PDA培养平板上培养7d的里氏木霉菌株用含0.2%吐温的无菌生理盐水洗涤，用血球计数板计数孢子数后，制成108个/mL的孢子悬浮液后4℃存储备用。
种子制备：取4瓶50ml种子培养基，分别接种107个孢子至其中，28℃200rpm培养18h后用于发酵罐接种。
发酵条件
将培养18h的种子培养基接种至7.5L的NBS（BioFlo/CelliGen115）发酵罐中，发酵罐培养基的装样量为3L培养基。在前24h，控制发酵液的pH为5.0，溶氧量为20%以上，使菌体快速生长；24h后不再控制发酵液pH，罐中溶氧量控制在10-20%，培养至48h。
结果
发酵48h后，发酵上清液中β-苯乙醇含量经检测为19.40mg/L（3次测量结果取平均值）。
(2)CICC40929在30L罐的发酵培养
葡萄糖是常用的微生物培养基配方，在本实施例中，30L发酵罐利用葡萄糖作为碳源来生产β-苯乙醇。
1.1种子培养基
葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L；硫酸铵1.4g/L；KH2PO42.0g/L；MgSO4.7H2O 0.3g/L；CaCl2.2H2O 0.3g/L；Mandels微量元素1ml，pH5.5。
Mandels微量元素：FeSO4.7H2O 5g/L；MnSO4.H2O 1.6g/L；ZnSO4.7H2O 1.4g/L；CoCl22g/L。
1.2发酵培养基
葡萄糖60g/L；酵母膏（一种酵母提取物）5g/L；硫酸铵1.84g/L；KH2PO40.2g/L；MgSO4.7H2O 0.5g/L；CaCl2.2H2O 0.00132g/L；L-苯丙氨酸6g/L，pH5。
1.3培养方法
1.3.1种子液制备
从新鲜平板上挑取一环菌，接种到装有250ml种子培养基的2.5L挡板三角瓶中，置于双层旋转摇床中于28℃，200rpm下培养40小时。
1.3.2发酵条件
将上述培养好的种子液按照8%（V:V）接种于装有20L发酵培养基的30L罐中，初始搅拌转数为300rpm，通风0.6L/min，温度28℃，过程中溶氧不低于20%，pH用氢氧化钠溶液（1mol/L）控制为5.5。
结果：
经24小时发酵后，在发酵液上清中的β-苯乙醇含量为51.75mg/L（3次测量结果取平均值），此外，在发酵液中还检测到苯乙醛，具体见实施例4（检测方法参见：芦智远，韩巧艳，徐忠，等.静态顶空气相色谱法测定黄酒中β-苯乙醇的含量[J].中国酿造，2013（11）：167-168）。
实施例4 β-苯乙醇和苯乙醛的提取和纯化
苯乙醇检测方法
1样品预处理
用风味顶空瓶准确称取5g发酵液样品，混合均匀。
2色谱分离条件
仪器：Agilent5973
柱子：HP-5MS（60m×0.25mm×320μm）
方法：静态顶空，进样量500μL，平衡温度100℃，顶空注射器温度150℃。
GC-MS条件：进样口温度250℃，载气流速1.0mL/min，升温程序：100℃1min，5℃/min升至250℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，接口温度280℃，电离电压70eV。
β-苯乙醇、苯乙醛的提取和纯化方法如下：
1.1将实施例3中制备的发酵液使用旋转蒸发仪（海道夫旋转蒸发仪HEI-VAP-VALUE G3）进行减压蒸馏，蒸出易挥发组份。具体为：将发酵液倒入圆底烧瓶中，一级冷阱中倒入液氮冷凝。在40℃、20mbar的真空度下抽提，直至冷凝端无液体留下。提取结束后合并冷阱中的冷凝液，得到总的易挥发性组份。
1.2将所得到的易挥发组份液体进行精馏，根据β-苯乙醇和苯乙醛的沸点，在不同温度、压力下进行精馏，每隔10min收样1次，依次分别得到10瓶产品，收样精馏条件示于表3中。
表3.β-苯乙醇和苯乙醛的精馏条件
Figure BDA0000395908580000131
1.3将得到的10瓶样品进样分析：
GC-MS和GC-FID分析条件
GC-FID分析条件：GC是Angilent6890，毛细管分离柱：DB-1MS,30m×0.25mm×0.25μm，进样量：1μL，分流比：5：1，进样口温度：250℃，氢气流量40ml/min，氧气流量400ml/min，氮气流量25ml/min，FID检测温度：250℃，升温程序：50℃保持5min；以3℃/min的速度从50℃上升至120℃；以5℃/min的速度从120℃上升至250℃；250℃保持5min。
GC-MS分析条件：GC是Angilent6890，毛细管分离柱：DB-1,30m×0.25mm×0.25μm，进样量：1μL，分流比：5：1，进样口温度：250℃，氦气流量1ml/min，MS是Angilent5973，检测温度：250℃，EI（70eV），升温程序：50℃保持5min；以3℃/min的速度从50℃上升至120℃；以5℃/min的速度从120℃上升至250℃；250℃保持5min。
使用外标法和面积归一法依次计算出β-苯乙醇、苯乙醛的浓度：
在旋蒸时，加入了1000ppm浓度的外标五甲基糠醛，精馏后将五甲基糠醛的峰面积带入绘制的五甲基糠醛标准曲线（y=2.8427x+2.8102，R2=1）测算出外标的实际峰面积。将β-苯乙醇的峰面积带入绘制的β-苯乙醇标准曲线（y=3.4823x-0.1688，R2=0.99）测算出实际峰面积。最后由面积归一法得出最后β-苯乙醇的浓度
外标浓度/外标峰面积=β-苯乙醇浓度/β-苯乙醇峰面积。
苯乙醛测试方法同上。
由此分别检测所得样品中β-苯乙醇或苯乙醛的含量，结果如下表4和表5所示：
表4.β-苯乙醇的精馏结果
分离提取样品号 β-苯乙醇浓度（ppm）
1 8909.56
2 87831.36
3 46866.64
4 34713.27
5 26308.53
6 14647.19
7 6348.43
8 2146.26
9 1494.99
10 459.53
表5.苯乙醛的精馏结果
分离提取样品号 苯乙醛浓度（ppm）
1 0.82
2 4556.84
3 1944.33
4 5246.14
5 90.77
6 55.74
7 3425
8 2061.4
9 1129
10 622.86
对里氏木霉发酵上清液中的易挥发组分进行精馏，分别得到了不同浓度的β-苯乙醇和苯乙醛。其中β-苯乙醇最高可得到浓度为87831.36ppm的样品，苯乙醛最高可得到浓度为4556.84ppm的样品。此实施例证明，在实验室水平上，可通过常规技术手段，得到浓度极高的β-苯乙醇及苯乙醛样品，为里氏木霉工业化生产β-苯乙醇或苯乙醛提供了实验参考依据。此外，根据实施例3和4，里氏木霉转化L-苯丙氨酸得到了β-苯乙醇和苯乙醛，而现有技术中已报道里氏木霉外的其他物种代谢途径（如酵母菌）中存在L-苯丙氨酸经苯乙醛转化成β-苯乙醇的代谢途径，据此推测，里氏木霉中可能也存在类似的代谢途径。
已经出于详细说明本发明的目的而描述了以上的实施方式。但本领域技术人员可以理解，以上描述的实施方式仅仅是为了示例说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。本领域技术人员可以在不背离本发明的精神和范围的条件下，设计本发明的其它实施方式和变型。例如，可以使用不同的碳源，不同的L-苯丙氨酸浓度，不同的发酵体系等等。本发明意在覆盖所有这些实施方式和变型。
本申请通篇引用的所有参考资料（包括参考文献、已授权专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请等）的内容特意整体地引入本文以供参考。

Claims (7)

1.一种生产β-苯乙醇和/或苯乙醛的方法，所述方法利用里氏木霉对可发酵底物进行发酵，其中，所述里氏木霉选自保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491和CICC41493的里氏木霉，所述可发酵底物中含有L-苯丙氨酸，所述可发酵底物含有麸皮、脱脂米糠粕、葡萄糖或其组合作为碳源。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
4.里氏木霉用于发酵产生β-苯乙醇和/或苯乙醛的用途，其中所述里氏木霉选自保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491和CICC41493的里氏木霉，所述发酵使用的发酵底物包含麸皮、脱脂米糠粕、葡萄糖或其组合作为碳源，所述发酵底物含有L-苯丙氨酸。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述L-苯丙氨酸的含量为1.5g/L以上。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述L-苯丙氨酸的含量为1.5～7.5g/L。
7.一种处理麸皮和/或脱脂米糠粕的方法，其特征在于，使用里氏木霉对麸皮和/或脱脂米糠粕进行发酵，其中，所述里氏木霉选自保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491和CICC41493的里氏木霉，用来进行发酵的底物中含有L-苯丙氨酸。
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