CN103805639A - 一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法。该方法以环状芽孢杆菌HG12菌株为生产菌种，其特征为，将HG12菌株的液体种子接种到液体发酵培养基中，发酵，制得发酵液，将发酵液过滤，收集滤出液；向滤出液中接种酒香酵母菌株的液体种子，发酵，制得含有4-乙基愈创木酚的发酵液；将发酵液过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，制得含有4-乙基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙基愈创木酚。本发明可以实现4-乙基愈创木酚生产的连续化、规模化；并且4-乙基愈创木酚的生产工艺简便，生产周期短，生产成本低，极具工业化应用前景。
Description
（一） 技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法。
（二） 背景技术
4-乙基愈创木酚（4-Ethylguaiacol，简称4-EG）又名2-甲氧基-4-乙基苯酚，分子式为C9H12O2，分子量为152.19Da，密度为1.067×103kg/m3，熔点为15℃，沸点为234-236℃。4-EG为无色至淡黄色的油状液体，具有温暖的辛香口味，属酱香型香料，是酱油的主要香味成分，也是酱香型白酒的一种重要风味物质，它不仅赋予产品特定的风格和口感，而且具有清除自由基的功能，可抗衰老及预防众多疾病的发生。目前4-乙基愈创木酚已广泛应用于酱油、酒类、饮料、食品、香精、饲料等行业以及医药、香料和染料等产品的合成，具有广阔的市场前景。
4-乙基愈创木酚的生产方法有植物提取法和化学合成法。植物提取法是从各种含有4-EG的植物中提取得到，如中国专利文献CN 102659534A（申请号201210105766.7）公开了一种从稻草生物油中提取4-乙基愈创木酚的方法，具体步骤如下：1）将稻草生物油碱洗，过滤，取滤液备用；2）在滤液中加入酸，进行酸化处理；3）采用有机溶剂萃取，得到油相产物；4）油相产物经减压蒸馏，除去有机溶剂，得到粗产品；5）粗产品减压蒸馏，得到4-乙基愈创木酚。但由于植物中的4-EG含量较低，导致提取工艺成本较高而难以实现大规模生产。
化学合成法是生产4-EG的常用方法，如陈恩治（香料香精化妆品，2010.3）在进行4-乙基愈创木酚的合成研究时，以香荚兰乙酮为原料，采用改良的还原法合成了4-乙基愈创木酚，得率为72%。如中国专利文献CN 1631862A（申请号200310122614.9）公开了一种4-乙基愈创木酚的合成方法，其工艺包括以固体酸为催化剂，在加热、加酸条件下，由愈创木酚和乙烯反应制得4-乙基愈创木酚，反应温度为30-200℃，反应压力为20-100kg/cm3，催化剂的用量为愈创木酚重量的1-10％重量百分数，反应产物经提取后精馏得产品。但化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对生产设备要求较高，生产工艺复杂，产品收率低；并且由于产品中含有原料、副产物、溶剂等物质的残留物，因此该方法得到的4-EG不能直接应用到食品中。
随着人们对绿色产品要求的日益提高，利用生物工程技术生产4-EG的方法具有产品绿色天然、安全可靠、反应条件温和、环境污染小等优点而受到人们的重视。与植物提取法和化学合成法相比，生物技术法具有原料来源广泛、副产物少、产品收率高、生产成本低、易于实现工业化的特点，是一种经济有效和极有产业化前景的4-乙基愈创木酚生产方法。
生物技术法是通过培养微生物细胞生产4-EG的方法。许多微生物能够利用培养基中的营养物质产生4-乙基愈创木酚，但由于这些微生物细胞内的相关酶活性较低，产生的4-EG含量较低（一般在2.0-5.0mg/L），因而不能满足工业化生产的要求。
（三） 发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种产率高、成本低、可规模化生产的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，以菌种保藏编号为CGMCC No.8044的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株为生产菌种，包括如下步骤：
（1）将环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子按体积比为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，在37-40℃、160-200r/min下，发酵36-60h，制得发酵液，将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，调pH值为5.0-6.0，制得含有4-乙烯基愈创木酚的滤出液；
（2）向滤出液中接种体积比为5-10%接种量的酒香酵母菌株的液体种子，在28-30℃下，发酵12-36h，制得含有4-乙基愈创木酚的发酵液；
（3）将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，混合均匀，静置分相，制得含有4-乙基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙基愈创木酚。
本发明涉及的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株是从中国白酒厂生产酱香型白酒用的高温大曲中分离，并经过紫外线诱变筛选获得，已于2013年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.8044。
本发明的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株的微生物学特征是：菌落呈乳白色、有褶皱、无光泽、表面不光滑；菌体呈杆状、直或接近直、单个或成链状，细胞大小约为（0.6-1.0）μm×（1.8-3.8）μm，产芽孢、孢囊膨大、芽孢椭圆形、芽孢中生到端生；革兰氏阳性、兼性厌氧、有机化能异养菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，V-P反应阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐，在培养温度为55℃下生长；可发酵小麦麸皮、小麦、大麦、高粱的一种或几种组合制成的液体培养基和固态培养基，产生明显的酱香香气。
本发明的更优方案为：
步骤（1）中，环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子的制备步骤为，取蒸馏水1000mL，加入葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、NaCl 5.0g，混合均匀，调溶液的pH值为7.0，将溶液在121℃下、灭菌20min，制得液体种子培养基；从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到液体种子培养基中，在35-40℃、120-160r/min下，培养12-16h，制得活化后的液体种子。
步骤（1）中，液体发酵培养基的制备步骤为，取小麦麸皮300g，加水1000mL，混合均匀，于100℃下、蒸煮10-20min，调pH值为6.0-6.5，121℃下、灭菌30min，降温至35-40℃，加入木聚糖酶和阿魏酸酯酶，保温20-24h，制得液体发酵培养基；木聚糖酶的用量为20.0U/g麸皮，阿魏酸酯酶的用量为10.0U/g麸皮。
步骤（2）中，酒香酵母菌株的液体种子的制备步骤为，取蒸馏水1000mL，加入葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、酵母膏10.0g、KH2PO4 2.0g、MgSO4 1.0g，混合均匀，调溶液的pH值为6.0，将溶液在121℃下、灭菌20min，制得液体种子培养基；从试管斜面上挑取1-2环酒香酵母菌株接种到液体种子培养基中，在28-30℃、100-200r/min下，培养20-24h，制得活化后的液体种子。
步骤（2）中，酒香酵母菌株为间型酒香酵母（Brettanomyces intermedius）CICC32929、酒香酵母属（Brettanomyces sp.）CICC31575或异型酒香酵母（Brettanomyces anomalus）CICC32915，以上菌株均保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），可以通过购买的方式获得。
步骤（1）和（3）中，微孔滤膜的工作压力均为0.05-0.1MPa，微孔滤膜的孔径均为0.2-0.6μm。
步骤（3）中，萃取剂为乙酸丁酯或乙酸戊酯，其用量为滤出液体积百分比的20-30%。
本发明使用的环状芽孢杆菌HG12菌株来源于酱香型白酒高温大曲并经过紫外线诱变选育获得；HG12菌株含有高活性阿魏酸脱羧酶，能将发酵液中的阿魏酸脱羧生成4-乙烯基愈创木酚且生成率高；HG12菌株发酵性能优良，其发酵液中的4-乙烯基愈创木酚的浓度高。
本发明使用的酒香酵母细胞内含有乙烯基愈创木酚还原酶，能将环状芽孢杆菌HG12菌株产生的4-乙烯基愈创木酚转化成4-乙基愈创木酚且转化率达95%以上，其发酵产物4-乙基愈创木酚符合相关食品安全法规，安全无毒害，属于绿色安全食品。
本发明采用小麦麸皮为原料，小麦麸皮中含有丰富的阿魏酸，在高温蒸煮以及木聚糖酶和阿魏酸酯酶的共同作用下，其含有的阿魏酸能全部释放到发酵液中，为4-乙基愈创木酚的生产提供了天然原料；小麦麸皮营养丰富，含有25-30%的淀粉、15%左右的蛋白质以及多种微量元素，能充分满足HG12菌株和酒香酵母菌株的生长要求；小麦麸皮来源广泛、价格低廉，用其为原料发酵生产4-乙基愈创木酚的生产成本低。
本发明可以实现4-乙基愈创木酚生产的连续化、规模化；并且4-乙基愈创木酚的生产工艺简便，生产周期短，生产成本低，极具工业化应用前景。
（四） 具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
本发明中4-乙基愈创木酚含量的测定步骤如下：
精密称取4-乙基愈创木酚标准品25mg，用1%冰乙酸溶解并定容到25mL，制得浓度为1.0mg/mL的标准母液。用1%冰乙酸将标准母液稀释，制得4-乙基愈创木酚质量体积浓度依次为0.02、0.2、1.0、2.0、4.0μg/mL的标准溶液。将上述标准溶液分别用0.22μm的有机滤膜过滤，过滤液分别用高效液相色谱仪（购自上海天普分析仪器有限公司）进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、浓度值（X，μg/mL）为横坐标，制作4-乙基愈创木酚标准溶液的标准曲线。根据标准曲线获得该曲线的回归方程为：y=3.862x+8.416 （R2=0.9996），其中：y为峰面积，x为4-乙基愈创木酚的质量浓度（μg/mL），R2为相关系数。峰面积Y的变化与4-乙基愈创木酚的质量浓度成线性关系，其拟合度达0.9996。
发酵液中4-乙基愈创木酚含量的测定：将含有4-乙基愈创木酚的发酵液在8000r/min下、离心20min，取上清液，用0.22μm的水性滤膜过滤，将过滤液稀释成质量浓度为0.01-4.0μg/mL的样品溶液，用高效液相色谱仪进样测定，得到样品溶液的峰面积，根据回归方程计算出4-乙烯基愈创木酚的浓度。
高效液相色谱仪的测定条件为：C18色谱柱（Agilent HC-C18，250mm×4mm，5μm），流动相为水：甲醇：磷酸=540：450：10（v/v/v），流速为lmL/min，进样量为15μL，操作温度为30℃。荧光检测器条件为激发波长270nm、发射波长315nm。
原料来源：小麦麸皮市售，4-乙基愈创木酚标准品购自美国Sigma公司，冰乙酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司，乙酸丁酯、乙酸戊酯均购自上海谱振生物科技有限公司，阿魏酸酯酶购自爱尔兰Megazyme公司，木聚糖酶购自诺维信公司。
实施例1-6所用的环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子的制备步骤为：取蒸馏水1000mL，加入葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、NaCl 5.0g，混合均匀，调溶液的pH值为7.0，将溶液在121℃下、灭菌20min，制得液体种子培养基。从试管斜面上挑取1环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到液体种子培养基中，在37℃、150r/min下，培养14h，制得活化后的液体种子。
实施例1-6所用的液体发酵培养基的制备步骤为：取小麦麸皮300g，加水1000mL，混合均匀，于100℃下、蒸煮15min，调pH值为6.0，121℃下、灭菌30min。降温至40℃，加入6000U的木聚糖酶和3000U的阿魏酸酯酶，保温24h，制得液体发酵培养基。
实施例1-6所用的酒香酵母菌株的液体种子的制备步骤为：取蒸馏水1000mL，加入葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、酵母膏10.0g、KH2PO4 2.0g、MgSO4 1g，混合均匀，调溶液的pH值为6.0，将溶液在121℃下、灭菌20min，制得液体种子培养基。从试管斜面上挑取2环酒香酵母菌株接入液体种子培养基中，在28℃、150r/min下，培养24h，制得活化后的液体种子。
实施例1
一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，包括如下步骤：
（1）将环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子按体积比为5%的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，在40℃、200r/min下，发酵60h，制得发酵液。将发酵液在0.1MPa压力下用孔径为0.2μm的微孔滤膜过滤除菌，收集滤出液，调pH值为5.0，制得含有4-乙烯基愈创木酚的滤出液。
（2）向步骤（1）制得的滤出液中按体积比为10%的接种量接种酒香酵母的液体种子，在30℃下，发酵36h，制得含有4-乙基愈创木酚的发酵液。
（3）将步骤（2）制得的发酵液在0.05MPa压力下用孔径为0.6μm的微孔滤膜过滤除菌，收集滤出液，向滤出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量为滤出液体积百分比的30%（v/v），混合均匀，静置分相，制得含有4-乙基愈创木酚的萃取液，将萃取液在100℃、667Pa下蒸发，制得4-乙基愈创木酚0.232g。
经检测发酵液中4-乙基愈创木酚的含量为1.16g/L。
步骤（2）中，所述的酒香酵母（Brettanomyces）菌株为间型酒香酵母（Brettanomyces intermedius）CICC32929（中国工业微生物菌种保藏管理中心保存）。
实施例2
如实施例1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，不同之处在于：
步骤（1）中，将环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子按体积比为3%的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，在37℃、160r/min下，发酵36h，调滤出液的ph为6.0。
步骤（2）中，向步骤（1）制得的滤出液中按体积比为5%的接种量接种酒香酵母的液体种子，在28℃下，发酵12h。
步骤（3）中，向制得的滤出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量为滤出液体积百分比的20%（v/v）。
经检测发酵液中4-乙基愈创木酚的含量为1.01g/L。
在此条件下制得4-乙基愈创木酚0.202g。
实施例3
如实施例1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，所述的酒香酵母（Brettanomyces）菌株为酒香酵母属（Brettanomyces sp.）CICC31575（中国工业微生物菌种保藏管理中心保存）。
经检测发酵液中4-乙基愈创木酚的含量为1.15g/L。
在此条件下制得4-乙基愈创木酚0.230g。
实施例4
如实施例2所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，所述的酒香酵母（Brettanomyces）菌株为酒香酵母属（Brettanomyces sp.）CICC31575（中国工业微生物菌种保藏管理中心保存）。
经检测发酵液中4-乙基愈创木酚的含量为1.04g/L。
在此条件下制得4-乙基愈创木酚0.208g。
实施例5
如实施例1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，所述的酒香酵母（Brettanomyces）菌株为异型酒香酵母（Brettanomyces anomalus）CICC32915（中国工业微生物菌种保藏管理中心保存）。
经检测发酵液中4-乙基愈创木酚的含量为1.12g/L。
在此条件下制得4-乙基愈创木酚0.224g。
实施例6
如实施例1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，向制得的滤出液中加入乙酸戊酯，乙酸戊酯的用量为滤出液体积百分比的25%（v/v）。
制得4-乙烯基愈创木酚0.228g。
Claims (7)
1.一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，以菌种保藏编号为CGMCC No.8044的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）HG12菌株为生产菌种，其特征为，包括如下步骤：（1）将环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子按体积比为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，在37-40℃、160-200r/min下，发酵36-60h，制得发酵液，将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，调pH值为5.0-6.0，制得含有4-乙烯基愈创木酚的滤出液；（2）向滤出液中接种体积比为5-10%接种量的酒香酵母菌株的液体种子，在28-30℃下，发酵12-36h，制得含有4-乙基愈创木酚的发酵液；（3）将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，混合均匀，静置分相，制得含有4-乙基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙基愈创木酚。
2.根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，其特征在于：步骤（1）中，环状芽孢杆菌HG12菌株的液体种子的制备步骤为，取蒸馏水1000mL，加入葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、NaCl 5.0g，混合均匀，调溶液的pH值为7.0，将溶液在121℃下、灭菌20min，制得液体种子培养基；从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到液体种子培养基中，在35-40℃、120-160r/min下，培养12-16h，制得活化后的液体种子。
3.根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，其特征在于：步骤（1）中，液体发酵培养基的制备步骤为，取小麦麸皮300g，加水1000mL，混合均匀，于100℃下、蒸煮10-20min，调pH值为6.0-6.5，121℃下、灭菌30min，降温至35-40℃，加入木聚糖酶和阿魏酸酯酶，保温20-24h，制得液体发酵培养基；木聚糖酶的用量为20.0U/g麸皮，阿魏酸酯酶的用量为10.0U/g麸皮。
4.根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，其特征在于：步骤（2）中，酒香酵母菌株的液体种子的制备步骤为，取蒸馏水1000mL，加入葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、酵母膏10.0g、KH2PO4 2.0g、MgSO4 1.0g，混合均匀，调溶液的pH值为6.0，将溶液在121℃下、灭菌20min，制得液体种子培养基；从试管斜面上挑取1-2环酒香酵母菌株接种到液体种子培养基中，在28-30℃、100-200r/min下，培养20-24h，制得活化后的液体种子。
5.根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，其特征在于：步骤（2）中，酒香酵母菌株为间型酒香酵母CICC32929、酒香酵母属CICC31575或异型酒香酵母CICC32915。
6.根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，其特征在于：步骤（1）和（3）中，微孔滤膜的工作压力均为0.05-0.1MPa，微孔滤膜的孔径均为0.2-0.6μm。
7.根据权利要求1所述的利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，其特征在于：步骤（3）中，萃取剂为乙酸丁酯或乙酸戊酯，其用量为滤出液体积百分比的20-30%。
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